KR101528568B1 - Prp19 및 clic 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법 및 검색된 물질을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PRP(precursor RNA processing)19 단백질과 CLIC(intracellular chloride channel) 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법, 및 상기 방법으로 검색된 담팔수 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 적은 양으로도 신속하면서 대량으로 검색할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 검색된 물질들은 지방의 형성을 저해할 수 있으므로, 비만을 비롯하여 PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용에 의해 매개되는 질병의 치료 및 예방에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

PRP19 및 CLIC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법 및 검색된 물질을 포함하는 조성물{METHOD OF SCREENING A SUBSTANCE CAPABLE OF INHIBITING INTERACTION BETWEEN PRP19 AND CLIC PROTEINS AND A COMPOSITION COMPRISING THE SCREENED SUBSTANCE}

본 발명은 PRP(precursor RNA processing)19 단백질과 CLIC(intracellular chloride channel) 단백질의 상호작용을 저해하는 후보물질을 검색(screening)하는 방법 및 검색된 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

서구식 식습관의 만연으로 비만 인구가 현재 전 세계적으로 10 억명에 달할 정도로 비만은 현대 인류의 큰 위협이 되고 있다. 비만은 몸의 각 부분에 지방이 축적되며 각종 질환을 야기하는데, 대표적인 것으로 당뇨병, 고지혈증, 지방간, 요통, 통풍성 관절염 등이 있다.

지방은 지방세포에서 합성되어 지방체에 축적된다. 지방세포는 음식 섭취로 얻은 열량 중 잉여 에너지를 지방의 형태로 저장하고 운동을 하거나 굶는 경우 등 필요에 따라 지방을 분해하여 에너지를 만들어 내는데, 그 중심에 있는 것이 바로 지방체이다. 지방체는 인산화 지질로 이루어진 층 하나로 되어 있는데 그 주변이 페릴리핀(perilipin), 아디포필린(adipophilin), TIP47(tail interacting protein 47), 카베올린(caveolin), cgi58(comparative gene identification 58), 비멘틴(vimentin), MLDP(myocardial lipid droplet protein) 등의 많은 단백질들로 코팅되어 있으며, 이 단백질들은 각종 신호에 따라 지방을 합성하거나 분해하는 데 관여한다. 예를 들어, 베타-아드레날린성 자극에 따라 PKA(protein kinase A)가 활성화되면 지방체에 존재하는 페릴리핀이 인산화되고 여기에 호르몬 감수성 리파제(hormone sensitive lipase)가 달라붙어 지방을 분해한다 (Gary M. Clifford, J. Biol. Chem , 275(7): 5011-5015 (2000)).

한편, PRP(precursor RNA processing)19 단백질은 지방세포의 분화와 함께 지방체에서 크게 증가하고, RNA 간섭을 통해 PRP19 단백질의 발현을 억제하였을 때 지방의 분화가 억제되며 SCD1(stearyl CoA desaturase-1), S3-12, 페릴리핀, 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(glycerol-3-phosphate acyltransferase) 등의 발현량이 감소하고 결과적으로 지방의 생성량이 획기적으로 감소한다 (J Biol Chem. Jan 26;282(4): 2456-65 (2007)).

본 발명자들은 PRP19 단백질의 세포내 작용을 조절하는 물질을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, PRP19 단백질의 U-box 도메인이 CLIC(intracellular chloride channel) 단백질과 상호작용하여 지방형성을 촉진하는 것을 최초로 밝혀내었으며, 이에 PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 용이하게 검색하는 방법을 개발하였다.

Gary M. Clifford, J. Biol. Chem, 275(7): 5011-5015 (2000) J Biol Chem. Jan 26;282(4): 2456-65 (2007)

따라서, 본 발명의 목적은 PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용을 저해할 수 있는 후보물질을 효과적으로 대량으로 검색(screening)하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 담팔수 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 (1) PRP19 단백질 또는 이의 U-box 도메인과 CLIC 단백질 또는 그의 일부를 후보물질의 존재 또는 부재하에 반응시키는 단계로서, 상기 단백질 중 어느 하나가 검출가능한 표지 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 단계; (2) 상기 반응 후 표지 물질의 양을 측정하는 단계; 및 (3) 후보 물질의 존재시에 측정된 표지 물질의 양을 후보물질의 부재시에 측정된 표지 물질의 양에 비해 감소시키는 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는, PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. ellipticus (Thunb.) Hara) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 검색 방법에 따르면, PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용을 저해하는 물질을 쉽고도 빠르게 검색해 낼 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 검색하여 찾아낸 담팔수 추출물은 지방의 형성을 저해할 수 있으므로, 비만을 비롯한 PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용에 의해 매개되는 질병의 치료 및 예방에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 CLIC(intracellular chloride channel) 단백질과 상호작용하는 PRP(precursor RNA processing)19 단백질의 U-box 도메인을 보여주는 모식도이다.
도 2는 글루타티온-에스-트랜스퍼라제(Glutathion-s-transferase)가 융합된 PRP19 단백질의 U-box 도메인과 녹색 형광 단백질(Green fluorescenceprotein)이 융합된 CLIC 단백질을 전기영동한 결과를 보여준다.
도 3은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에서 사용된 블로킹제의 종류에 따른 분석 결과를 보여준다(bsa: 소혈청알부민, skim: 스킴밀크, cas: 카세인).
도 4는 ELISA 분석에서 PRP19 단백질의 U-box 도메인을 고정화시키는 96-웰 플레이트의 종류에 따른 검출 신호를 보여준다.
도 5는 ELISA 분석에서 PRP19 단백질의 U-box 도메인을 고정화하는 조건에 따른 결과를 보여준다.
도 6은 ELISA 분석에서 PRP19 단백질의 U-box 도메인의 농도에 따른 검출 신호를 보여준다.
도 7은 ELISA 분석에서 담팔수 추출물의 농도에 따른 PRP19 단백질의 U-box 도메인과 CLIC 단백질간의 상호작용 저해 효과를 보여준다.
도 8는 담팔수 추출물로 처리된 세포주를 대상으로 지방체 형성 정도를 확인한 현미경 사진이다
도 9는 담팔수 추출물로 처리된 세포주를 대상으로 중성지방을 정량한 흡광도 분석 결과이다.
도 10은 면역침전반응 및 웨스턴 블럿 분석에 의한 PRP19 및 CLIC 단백질의 상호작용을 보여주는 결과이다.

CLIC 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지며, PRP19 단백질의 U-box 도메인과 상호작용하여 지방세포에서 지방의 생성량을 증가시키는 작용을 한다.

이에, 본 발명은 (1) PRP19 단백질 또는 이의 U-box 도메인과 CLIC 단백질 또는 그의 일부를 후보물질의 존재 또는 부재하에 반응시키는 단계로서, 상기 단백질 중 어느 하나가 검출가능한 표지 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 단계; (2) 상기 반응 후 표지 물질의 양을 측정하는 단계; 및 (3) 후보 물질의 존재시에 측정된 표지 물질의 양을 후보물질의 부재시에 측정된 표지 물질의 양에 비해 감소시키는 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는, PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 후보물질은 PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 결합을 직접적으로 방해하거나 CLIC 단백질을 불활성화시키는 물질일 수 있다.

본 발명의 검색방법에서 사용되는 PRP19 단백질 또는 CLIC 단백질은 검출가능한 물질로 표지될 수 있다. 이러한 검출가능한 표지 물질은 PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용을 유지할 수 있는 한 당 분야에 공지된 어떠한 표지 물질도 사용할 수 있다. 구체적으로는, 형광단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)), 형광물질, 양고추냉이 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase, AP) 같은 표지 또는 이러한 표지가 결합된 항체(예를 들면, CLIC 단백질에 대한 항체)를 예시할 수 있다.

상기 본 발명의 검색 방법에서 표지 물질의 양을 측정하는 방법으로는 당 분야에서 단백질을 정량적으로 분석하기 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들어, PRP19 단백질 또는 CLIC 단백질에 결합된 표지 물질의 양을 확인하는 방법에는 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석 및 면역 조직화학염색(immunohistochemical staining) 등이 있으며, 표지 물질로 표지된 CLIC 단백질에 대한 항체(또는 표지 물질에 대한 항체)를 사용하는 ELISA 방법이 바람직하다. 바람직하게는, ELISA는 블로킹제로서 스킴밀크(skim milk), 단백질 고정 플레이트로서 그레이너(Greiner) 웰 플레이트와 같은 폴리스티렌 재질의 웰 플레이트를 사용하여, 4℃에서 대략 14시간 동안 단백질을 고정화시켜 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 PRP19 단백질과 CLIC 단백질은, 예를 들어 쥐 유전자의 mRNA를 추출한 후 역전사시켜 cDNA를 얻고 이를 발현 벡터에 클로닝하여 적절한 숙주세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 그러나, PRP19 유전자와 CLIC 유전자가 반드시 쥐의 유전자로부터 유래한 것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 발현 시스템으로서는 대장균과 같은 박테리아, 효모, 곤충세포, 포유류세포 등 임의의 세포 및 이에 적합한 임의의 발현벡터라도 PRP19와 CLIC 단백질을 이들 각각의 기능 및 구조를 유지하고 있는 형태로 발현시킬 수 있는 한 어떠한 것이라도 사용할 수 있다.

상기 검색방법으로 찾아낸 담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. ellipticus (Thunb.) Hara) 추출물은 지방 세포의 분화 및 지방체 생성을 억제한다. 따라서, 본 발명은 담팔수 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

담팔수 추출물은 전초, 줄기, 뿌리, 잎, 꽃 또는 이들의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 담팔수 추출물은 줄기로부터 제조될 수 있다.

담팔수 추출물을 얻기 위해 사용되는 용매로는 극성 용매, 구체적으로 메탄올, 에탄올, 부틸렌글리콜 등의 알코올류, 에틸 에테르 등의 에테르류, 아세톤 등의 케톤류, 초산에틸에스테르 등의 에스테르류 등의 극성 유기용매, 또는 물을 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

담팔수 추출물은 상기 극성 용매로 추출한 추출물을 비극성 용매로 다시 추출하여 수득할 수도 있다. 사용가능한 비극성 용매로는 에틸 아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름이 이용될 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

담팔수 추출물은 추출물 또는 추출액 그 자체, 추출물 또는 추출액의 농축물 또는 건조물일 수 있으며, 이들의 혼합물일 수도 있다.

담팔수 추출물은 예를 들어 하기와 같은 방법으로 얻어질 수 있다. 먼저, 담팔수에 약 1 내지 15배의 극성 용매를 가한 다음, 약 20 내지 100℃에서, 1 내지 48 시간 동안 가열하면서 1 내지 5회 추출한다. 수득된 추출액을 감압여과하여 고형상이 제거된 추출액을 감압증류하여 용매가 완전히 제거된 건조물 형태의 담팔수 추출물을 얻을 수 있다. 추출 효율을 높이기 위해, 상술한 바와 같이 극성 용매를 이용하여 추출한 후 용매를 일정량 제거하고 추출액의 1 내지 4배의 비극성 용매를 가한 후, 상온에서 1 내지 48 시간 동안 방치하여 층을 완전히 분리한 다음, 상층액을 모아 이를 다시 감압증류하여 원하는 담팔수 추출물을 수득할 수 있다.

상기 방법으로 수득된 담팔수 추출물의 비만치료 효과를 알아보기 위하여, 미분화 지방세포주인 3T3-L1을 분화시킨 다음 담팔수 추출물을 처리한 결과 지방형성 정도가 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하고 있음이 발견되어 비만 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

이에, 본 발명은 담팔수 추출물을 유효성분으로 함유하는, 슬리밍 효과를 위한 화장료 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 담팔수 추출물은 화장료 조성물의 총 중량(건조 중량)을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%의 양으로 함유될 수 있다. 담팔수 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 그 효과를 기대할 수 없고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 제형을 유지하기가 어렵다.

본 발명에 따르면, 담팔수 추출물은, 추출물 또는 추출액 그 자체, 추출물 또는 추출액의 농축물 또는 건조분말을 화장품 제형으로 제조하여 그대로 도포하는 것이 적합하나, 통상의 내복 또는 외용의 제제로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 슬리밍 효과를 위한 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류, 클렌징 제품, 세안제, 비누, 미용액 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 담팔수 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다. 즉, 본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 로션, 연고, 게르 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 비누, 분무제 등과 같은 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 위한 각각의 제형에서, 담팔수 추출물 이외의 다른 성분들은 기타 화장료 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 쉽게 선택하여 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 상술한 담팔수 추출물 이외에 통상 화장료조성물에 추가되는 다른 성분들, 예를 들어 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 본 발명의 목적 및 효과에 상승 작용을 할 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 슬리밍 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 또한 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

이외에도, 본 발명의 화장료 조성물에는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 또는 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 정제수 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 담팔수 추출물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 담팔수 추출물은 약학 조성물의 총 중량(건조 중량)을 기준으로 0.0001 내지 100 중량%의 양으로 함유될 수 있다.

담팔수 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 그 효과를 기대할 수 없지만 100 중량%의 원액을 그대로 사용하더라도 무방하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 담팔수 추출물 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 경우에 따라 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐(rat), 생쥐(mouse), 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 이 때, 비경구 루트로는 경피투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소 도포가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물 제형의 투여량은 지방형성 억제가 필요한 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 투여 방법에 의해 상이할 수 있으나, 외용제의 경우는 환부에 따라 적당량을 1일 수회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 바람직하다.

경구형 제형의 경우도 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 담팔수 추출물을 0.1 mg 내지 200 mg/kg의 양으로 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 증상의 중증도, 환자의 연령, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 지방세포 분화 유도, 및 PRP19 유전자 및 CLIC 유전자의 클로닝

<단계 1> 지방세포 분화 유도

쥐(Mus musculus)의 미분화 지방세포주인 3T3-L1(ATCC CL173)을 250 ml의 조직배양 플라스크(falcon)에 분주하여 10% 우혈청이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) 배지에서 90% 이상 자랄 때까지 48시간 동안 10% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이후, 상기 세포를 10% 우태아 혈청, 0.5mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(Sigma), 1μM 덱사메타손(Sigma), 및 167 nM 인슐린(Novo-Nordisk)을 포함한 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였고, 다시 10% 우태아 혈청 및 167 nM 인슐린을 포함한 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였으며, 다시 10% 우태아 혈청만을 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 동안 더 배양하여 분화된 지방세포를 얻었다.

<단계 2> PRP19 유전자 및 CLIC 유전자의 클로닝

Rneasy 미니 키트(Qiagen 74104)을 이용하여 단계 1에서 얻어진 지방세포로부터 RNA를 추출한 후 onestep RT-PCR 키트(Qiagen 210210)를 사용하여 cDNA를 합성하고 이를 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 이때, 하기 표 1에 수록된 서열번호: 1 내지 4의 서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였다.

PCR은 La taq(TAKARA RR002A)를 이용하여 다음의 조건에 따라 수행되었다: 94℃에서 5분간 반응; 94℃ 30초, 49℃ 30초, 및 69℃ 50초의 30회 반복; 및 69℃에서 10분간 최종연장.

상기 PCR 과정에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 암호화하는 유전자를 pGEX2T 벡터(GE Healthcare)의 BamHI/EcoRI 부위에 클로닝하였고, CLIC 유전자는 CLIC 단백질의 C-말단에 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP)이 붙도록 GFP 유전자가 도입된 pET21b 벡터(Merk)의 BamHI/BamHI 부위에 클로닝하였다. PRP19의 U-box 도메인이 도 1에 도시되어 있다. PRP19의 U-box 도메인과 CLIC의 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호: 5 내지 8로 기재되어 있다.

실시예 2: PRP19 단백질 및 CLIC 단백질의 발현 확인

실시예 1의 단계 2에서 얻어진 각각의 벡터를 대장균(E. coli BL21)과 혼합한 후 42℃에서 92초 동안 열충격을 가하여 대장균에 형질전환시켰다. 이후, SOC 배지(Merk)를 첨가하고, 37℃에서 45분간 배양한 다음, 100 ppm의 앰피실린이 들어있는 LB 플레이트에 균일하게 도포하였다. 형질전환된 대장균을 선별하여 100 ppm 앰피실린이 들어있는 LB 배지 300 ml에서 배양시킨 후 OD(optical density)값이 1이 되었을 때 IPTG 300 uM을 가하여 4 시간 동안 발현을 유도하였다. 대장균을 원심분리(6000xg, 10분)로 얻은 후 배지를 버리고, 얻어진 대장균에 30 ml 버그버스터(bugbuster) 단백질 추출 용액(Novagen)을 가해 상온에서 단백질이 추출되도록 15분간 방치했다. 이후, 결과물을 에펜도르프(Eppendorf) 5810R 원심분리기로 4℃에서 12,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액만 취하였다. 이렇게 추출된 단백질을 4-12% NuPAGE 겔(Invitrogen)에서 전기영동한 후 브릴런트 블루 알 시약(briliant blue R, Sigma)을 사용하여 발색시켜 관찰하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 글루타티온-에스-트랜스퍼라제(glutathione-s-transferase)가 융합된 U-box 도메인과 GFP가 융합된 CLIC 단백질의 발현을 확인할 수 있다.

실시예 3: PRP19 U- box 도메인의 정제

실시예 2에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 함유한 추출물 30 ml에 글루타티온 세파로스 수지 4 패스트 플로우(glutathione sepharose resin 4 fast flow, GE healthcare) 5 ml를 가하여 단백질과 수지간에 결합이 일어나도록 4℃에서 5 시간 동안 반응시켰다. 이후, 에펜도르프(Eppendorf) 5810R 원심분리기로 4℃에서 6000 rpm으로 5분간 원심분리한 다음, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 10 ml의 PBS (phosphate buffered saline, pH 7) 완충액을 가하여 재부유시켰다. 동일한 방법을 2회 더 반복하여 침전물을 세척한 후 상등액을 제거하였다. 마지막으로, 얻어진 침전물에 글루타티온(glutathione) 15 mM이 용해된 PBS 완충액을 10 ml 첨가하여 PRP19의 U-box 도메인을 분리하였다. 이러한 단백질 분리과정을 2회 더 반복하였다. 이렇게 얻은 단백질을 4-12% NuPAGE 겔(invitrogen)에서 200V로 전기영동한 후 브릴런트 블루 알 시약(briliant blue R, Sigma)을 사용하여 발색시켜 관찰하였다.

실시예 4: 효소 결합 면역흡착 분석( ELISA )을 위한 최적의 조건 확인

(1) 블로킹제

실시예 3에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 0.1M 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.4)을 이용하여 100배 희석하고, 그레이너(Greiner) 96-웰 플레이트의 각 웰에 0 내지 100 ㎕의 농도로 분주한 다음, 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. PBS 완충액 200 ㎕를 가해 웰을 4회 세척한 후 블로킹제로 사용된 소혈청알부민(BSA), 스킴 밀크(skim milk), 및 카세인(casein)을 0.5%로 녹인 PBS 완충액 200 ㎕씩을 각각의 웰에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 방치한 후 다시 PBS 완충액 200 ㎕를 첨가하여 웰을 4회 세척하고, 실시예 2에서 얻어진 GFP가 융합된 CLIC 단백질을 블로킹 완충액(blocking buffer)(0.5% PBS, pH 7)에 200배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. 양고추냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase)가 부착된 GFP 항체(ab chem)를 PBS 완충액으로 6000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하고 TMB 기질 용액(Biorad)을 100 ㎕씩 각각의 웰에 가하여 상온에서 10분간 발색시켰다. 결과가 도 3에 도시되어 있다. 도 3에 나타난 바와 같이, 신호 대 잡음비가 스킴밀크를 사용했을 때 가장 좋은 것을 알 수 있다.

(2) 96-웰 플레이트

실시예 3에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 0.1M 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.4)을 이용하여 100배 희석한 다음 그레이너(Greiner) 또는 눈크(nunc) 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. PBS 완충액 200 ㎕를 가해 웰을 4회 세척한 다음 스킴밀크 0.5%를 녹인 PBS 완충액 200 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 방치한 후 다시 PBS 완충액 200 ㎕를 첨가하여 4회 세척한 다음, 실시예 2에서 얻어진 GFP가 융합된 CLIC 단백질을 블로킹 완충액(blocking buffer) (0.5% skim milk, PBS)으로 100배 희석하여 0, 20, 50, 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. 양고추냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase)가 부착된 GFP 항체(ab chem)를 PBS 완충액으로 6000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. TMB 기질 용액(Biorad)을 각 웰에 100 ㎕씩 가하여 상온에서 10분간 발색시켰다. 20% 인산용액 70 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4에 나타난 바와 같이, 그레이너 웰 플레이트가 눈크 웰 플레이트보다 신호 대 잡음비가 더 우수함을 알 수 있다.

(3) 고정화(immobilization) 조건

실시예 3에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 0.1M 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.4)을 이용하여 100배 희석한 다음 그레이너(Greiner) 또는 눈크(nunc) 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 14시간 동안 또는 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS 완충액 200 ㎕를 가해 웰을 4회 세척한 후 스킴밀크 0.5%를 녹인 PBS 완충액 200 ㎕씩을 각 웰에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 방치한 후 다시 PBS 완충액 200 ㎕를 첨가하여 4회 세척한 다음, 실시예 2에서 얻어진 GFP가 융합된 CLIC 단백질을 블로킹 완충액(0.5% skim milk, PBS)으로 100배 희석하여 0, 20, 50, 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. 양고추냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase)가 부착된 GFP 항체(ab chem)를 PBS 완충액으로 6000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 4회 세척하였다. TMB 기질 용액(Biorad)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 20분간 발색시켰다. 20% 인산용액 70 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과가 도 5에 도시되어 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, 4℃에서 14시간 동안 고정화시켰을 때가 상온에서 2시간 동안 고정화시키는 것보다 좋은 결과가 얻어짐을 알 수 있다.

실시예 5: PRP19 단백질의 농도에 따른 PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용 분석

실시예 3에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 0.1M 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.4)을 이용하여 100배 희석한 다음 그레이너(Greiner) 96-웰 플레이트에 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. PBS 완충액 200 ㎕를 가해 4회 세척한 후 스킴밀크 0.5%가 용해된 PBS 완충액 200 ㎕씩을 각각의 웰에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 방치한 후 다시 PBS 완충액 200 ㎕를 첨가하여 웰을 4회 세척한 다음, 실시예 2에서 얻어진 GFP가 융합된 CLIC 단백질을 블로킹 완충액으로 200배 희석하여 얻어진 용액을 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. 양고추냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase)가 부착된 GFP 항체(ab chem)를 PBS 완충액으로 6000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. TMB 기질 용액(Biorad)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 10분간 발색시켰다. 20% 인산용액을 70 ㎕씩 첨가하여 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 도 6에 나타낸 바와 같이, U-box를 100배 희석하여 얻어진 용액 20 ㎕만 있어도 CLIC와의 상호작용을 확인할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6: ELISA 분석을 이용한 담팔수 추출물에 의한 PRP19 단백질과 CLIC 단백질의 상호작용 저해효과 확인

실시예 3에서 얻어진 PRP19의 U-box 도메인을 0.1M 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.4)을 이용하여 500배 희석한 다음 그레이너(Greiner) 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. PBS 완충액 200 ㎕를 가해 4회 세척한 후 스킴밀크 0.5%가 용해된 PBS 완충액을 200 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 방치한 후 다시 PBS 완충액 200 ㎕를 첨가하여 4회 세척한 다음, 실시예 2에서 얻어진 GFP가 융합된 CLIC 단백질을 블로킹 완충액(0.5% skim milk PBS)에 200배 희석하여 얻어진 용액을 100 ㎕씩 첨가하였다. 한국식물추출물은행에서 구입한 담팔수 추출물(002-025)을 0, 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm 농도가 되도록 1 ㎕씩 첨가한 다음 상온에서 1시간 동안 방치한 후 PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 웰을 4회 세척하였다. 양고추냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase)가 부착된 GFP 항체(ab chem)를 PBS 완충액으로 6000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 이후, 상온에서 1시간 동안 방치하고, PBS 완충액 200 ㎕를 가하여 4회 세척하였다. TMB 기질 용액(Biorad)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 20분 동안 발색시켰다. 20% 인산용액을 70 ㎕씩 첨가하여 반응을 종결시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과가 도 7에 도시되어 있다. 도 7에 나타난 바와 같이, 담팔수 추출물의 농도가 증가함에 따라 PRP19 단백질과 CLIC 단백질간의 상호작용 저해 정도가 증가함을 알 수 있다.

실시예 7: 담팔수 추출물에 의한 지방세포의 분화 억제 효과 확인

<단계 1> 지방세포 분화 유도 및 담팔수 추출물 처리

쥐(Mus musculus)의 미분화 지방세포주인 3T3-L1(ATCC CL173)을 12-웰 플레이트에 분주한 다음 10% 우혈청이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) 배지에서 세포가 배지면적의 90% 이상 자랄 때까지 48시간 동안 10% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이후, 상기 세포를 10% 우태아 혈청, 0.5mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(Sigma), 1μM 덱사메타손(Sigma), 및 167 nM 인슐린 (Novo-Nordisk)을 포함한 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양한 다음, 다시 10% 우태아 혈청 및 167 nM 인슐린을 포함한 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 실시예 6에서 사용된 담팔수 추출물을 배지의 1/1000이 되도록 3, 10, 30 ppm씩 처리하였다. 이후 다시 48시간 동안 배양하고 10% 우태아 혈청만을 포함한 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다.

<단계 2> 지방체 형성 억제 확인

단계 1에서 얻어진 세포들을 3.7% 포름알데히드로 고정한 후, PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 지방체를 염색하기 위해 세포를 0.2% 오일레드(Oil red) 용액에서 30분 동안 반응시킨 다음 PBS 완충액으로 15분씩 4회 세척하였다. 염색된 세포를 현미경 영상장치(Axioplan-2, Carl Zeiss)로 관찰하였다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 도 8에서, 붉게 염색된 것이 지방체의 중성지방을 나타낸다. 담팔수 추출물로 처리된 세포(DP 30)에서는 대조군에 비해 지방체 형성이 억제되었음을 알 수 있다.

한편, 단계 1에서 얻어진 세포를 3.7% 포름알데히드로 고정한 후, PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 0.5% 수단(Sudan) II 용액에서 1시간 동안 염색시킨 후, PBS 완충액으로 15분씩 4회 세척하였다. 여기에 비이온성 계면활성제 (Nonidet-P40, 4% NP40) 및 60% 이소프로판올 용액을 500 ㎕씩 넣고 20분 동안 추출하였다. 추출한 용액을 1/10 희석하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과가 도 9에 도시되어 있다. 도 9에서, RA는 지방의 분화를 억제한다고 알려진 레티노산(retinoic acid)으로서 양성대조군으로 사용되었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 담팔수 추출물로 처리된 세포(DP3, DP10, DP30)는 미처리된 대조군 세포에 비해 중성 지방의 양이 감소하였고, 10^-9M의 RA를 사용했을 때와 비슷한 효과를 보여주고 있다.

실시예 8: PRP19 및 CLIC 단백질간의 상호작용 확인

<단계 1> PRP19 및 CLIC 단백질 단편들의 제조

RPR19 단백질 전체, 이의 N-말단(1-166 아미노산)과 C-말단(167-504 아미노산) 단편, 및 CLIC 단백질 단편을 얻기 위해, 쥐(Mus musculus)의 미분화 지방세포주인 3T3-L1(ATCC CL173) 세포로부터 RNA를 추출한 후 onestep RT-PCR 키트(Qiagen 210210)를 사용하여 cDNA를 합성하고 이를 하기 표 2에 수록된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PRP19 단백질 단편들의 합성을 위해 사용된 프라이머 말단에는 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 서열을 부착하였다.

PCR은 티퍼스널(Tpersonal, Whatman, GmbH) 기구를 사용하여 PCR 반응물(2차 증류수 38 ㎕, 10× 버퍼 5 ㎕, dNTP 5 ㎕(각각 2.5 mM), 각각의 프라이머 0.5 ㎕(100 pmol), 주형 0.5 ㎕, PFU Taq 중합효소 0.5 ㎕(5 U/㎕))에 대해 다음의 조건에 따라 수행되었다: 초기 변성(denaturation)(95℃에서 5분간); 변성 (95℃에서 30초간), 부착(annealing)(55℃에서 30초간), 및 연장(extension) (68℃에서 2분)의 25회 반복; 및 최후 연장(72℃에서 10분간). 얻어진 PCR 산물은 MiniEluteTM PCR 정제 키트(QIAGEN, USA)를 사용하여 정제하였다.

PCR 산물을 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)에 제공된 pCR 2.1-TOPO 벡터로 제조사의 안내에 따라 클로닝하였다. 구체적으로, 4㎕의 PCR 산물, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)에 제공된 1㎕의 염 용액 및 1㎕의 pCR 2.1-TOPO 벡터를 혼합하고 상온에서 5분간 반응시킨 후, 키트에서 제공한 TOP10 대장균(E. coli)에 형질전환시킴으로써 클로닝하였다.

형질전환된 숙주세포로부터 PCR 산물이 클로닝된 pCR 2.1-TOPO-PRP19와 pCR 2.1-TOPO-CLIC 벡터를 수득하여 각각 EcoRI/XbaI 및 XhoI/BamHI 제한효소로 절단한 다음, PCR 산물인 PRP19 및 CLIC DNA 단편들을 분리하여 같은 제한효소로 처리된 pCDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. 수득한 벡터를 pcDNA3.1 PRP19-HA 및 pcDNA3.1/Myc-His-CLIC로 명명하였다. 마크로젠사(Macrogen Inc.)에 서열분석을 의뢰하여 각 클론들의 염기서열을 결정하여 PRP19 및 CLIC DNA의 존재를 확인하였다.

<단계 2> PRP19 및 CLIC DNA를 함유하는 벡터로 형질감염된 인간 배아 신장(human embryonic kidney, Hek) 293 세포의 제조

HeK 293 세포(ATCC CRL-1573)를 10% 우혈청이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양한 Hek 293 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 다음날 형질감염제인 Lipofectamine 2000(Invitrogen)의 존재 하에 상기 세포를 단계 1에서 제작한 pcDNA3.1 PRP19-HA 및/또는 pcDNA3.1/Myc-His-CLIC 발현벡터 4g과 혼합하여 20분간 반응시켰다. 8 시간 후 용액을 제거하고 PBS 완충액(WelGENE Inc.)으로 3회 세척한 후, 10% 우태아 혈청만을 포함한 DMEM 배지로 교환하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 더 배양하여 형질감염된 세포를 수득하였다.

<단계 3> PRP19 및 CLIC 단백질의 면역침전(immunoprecipitation)

단계 2에서 얻어진 세포들을 차가운 PBS 완충액으로 3회 세척한 후, 250 ㎕의 M-PER 포유류 단백질 추출 키트(PIERCE. Rockoford, IL)를 사용하여 5분 동안 흔들어 주었다. 세포 용해물(lysate)을 튜브로 옮기고 16,000xg에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 얻은 후 ProFound Mammalian HA tag Co-IP 키트(PIERCE. Rockoford, IL)를 이용하여 키트에서 제공된 방법에 따라 면역침전반응을 수행하였다.

구체적으로, 앞서 얻어진 세포 상등액 200 ㎕를 Handee Mini-Spin 컬럼에 넣고, 여기에 6 ㎕의 항-HA 아가로스 슬러리를 첨가하여 4℃에서 혼합하면서 16시간 동안 반응시켰다. 이후, 0.05% Tween-20이 포함된 TBS 완충액(25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2/ 500 ml)을 이용하여 3회 세척하고, 25 ㎕ 2X 비환원 샘플 완충액(non-reducing sample buffer: 0.12 M Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 20% 글리세롤)을 첨가한 다음, 95℃에서 5 분 동안 끓이고 10,000xg에서 10초 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다.

다른 한편으로, ProFound Mammalian Myc Tag Co-IP 키트(PIERCE. Rockoford, IL)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 면역침전반응을 수행하였다.

<단계 4> 웨스턴 블럿 분석

단계 3에서 얻은 각 상층액 10 ㎕를 8% SDS-PAGE에 전기영동하여 크기별로 분리한 다음, 50Ｖ 조건에서 PVDF 막(Bio-Rad)에 12시간 동안 전이(transfer)시켰다. 그 후, 단백질이 전이된 막을 5% 탈지우유 용액으로 1시간 동안 블로킹(blocking)한 다음, 1차 항체로서 다클론항체인 항-HA 또는 항-Myc을 처리하고, 2차 항체로서 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합된 항-생쥐 IgG(Amersham) 항체를 처리하고서, ECL 키트(enhanced chemiluminescence kit, Amersham)를 이용하여 항체 반응시켰다. 반응된 PVDF 막을 X선 필름(Fuji)에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 10에 도시되어 있다.

도 10의 (a)는 총 세포 용해물(lysate)을 분석한 것이고 (b)는 동일한 샘플에 대해 PRP19에 융합된 HA에 대한 항체를 이용하여 면역침전반응을 수행한 후 CLIC에 융합된 Myc에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다. PRP19 또는 CLIC를 단독으로 발현시킨 경우에는 항-HA를 이용한 면역침전반응에서 아무것도 검출되지 않았다. 반면, 두 단백질을 모두 같이 발현시킨 경우에는 항-Myc에 의해 CLIC가 검출되는 것을 확인하였다. 이는 PRP19 및 CLIC 두 단백질이 세포 내에서 특이적으로 상호작용한다는 것을 보여준다.

도 10의 (c) 및 (d)는 CLIC에 융합된 Myc에 대한 항체를 이용하여 면역침전반응을 수행한 다음 PRP19에 융합된 HA에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 보여준다. 그 결과, CLIC는 PRP19의 전체 및 N-말단과 상호작용함을 알 수 있다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> METHOD OF SCREENING A SUBSTANCE CAPABLE OF INHIBITING INTERACTION BETWEEN PRP19 AND CLIC PROTEINS AND A COMPOSITION COMPRISING THE SCREENED SUBSTANCE <130> FPD/201410-0025 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding U-box Domain of PRP19 Protein <400> 1 acttgaggat ccatgtccct gatctgc 27 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding U-box Domain of PRP19 Protein <400> 2 acctgaattc ctcaggtggc ggagggagg 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding CLIC Protein <400> 3 ggatccgatg gctgaagaac aacctcagg 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding CLIC Protein <400> 4 ggatcccgtt tgagagccct ggccactt 28 <210> 5 <211> 207 <212> DNA <213> U-box Domain of PRP19 Protein of Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(207) <400> 5 atg tcc ctg atc tgc tcg atc tcc aat gaa gtg cca gag cac ccg tgc 48 Met Ser Leu Ile Cys Ser Ile Ser Asn Glu Val Pro Glu His Pro Cys 1 5 10 15 gtg tcc cct gtc tct aat cat gtg tat gag cgg cga ctc att gag aag 96 Val Ser Pro Val Ser Asn His Val Tyr Glu Arg Arg Leu Ile Glu Lys 20 25 30 tac att gca gag aat ggc aca gat cct atc aac aac cag cct ctc tca 144 Tyr Ile Ala Glu Asn Gly Thr Asp Pro Ile Asn Asn Gln Pro Leu Ser 35 40 45 gag gag cag ctc atc gac atc aaa gtt gct cac cca atc cga ccc aag 192 Glu Glu Gln Leu Ile Asp Ile Lys Val Ala His Pro Ile Arg Pro Lys 50 55 60 cct ccc tcc gcc acc 207 Pro Pro Ser Ala Thr 65 <210> 6 <211> 69 <212> PRT <213> U-box Domain of PRP19 Protein of Mus musculus <400> 6 Met Ser Leu Ile Cys Ser Ile Ser Asn Glu Val Pro Glu His Pro Cys 1 5 10 15 Val Ser Pro Val Ser Asn His Val Tyr Glu Arg Arg Leu Ile Glu Lys 20 25 30 Tyr Ile Ala Glu Asn Gly Thr Asp Pro Ile Asn Asn Gln Pro Leu Ser 35 40 45 Glu Glu Gln Leu Ile Asp Ile Lys Val Ala His Pro Ile Arg Pro Lys 50 55 60 Pro Pro Ser Ala Thr 65 <210> 7 <211> 726 <212> DNA <213> CLIC of Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(723) <400> 7 atg gct gaa gaa caa cct cag gtc gaa ctg ttc gtg aag gct ggc agt 48 Met Ala Glu Glu Gln Pro Gln Val Glu Leu Phe Val Lys Ala Gly Ser 1 5 10 15 gat ggt gcc aag att ggg aac tgc ccc ttc tcc cag aga ctg ttc atg 96 Asp Gly Ala Lys Ile Gly Asn Cys Pro Phe Ser Gln Arg Leu Phe Met 20 25 30 gtg ctc tgg ctc aag gga gtc acc ttc aac gtt acc act gtg gac acc 144 Val Leu Trp Leu Lys Gly Val Thr Phe Asn Val Thr Thr Val Asp Thr 35 40 45 aag aga cgg aca gag act gta cag aag ctc tgc ccc ggt ggg cag ctg 192 Lys Arg Arg Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Cys Pro Gly Gly Gln Leu 50 55 60 ccg ttc ttg ctc tat ggc acc gaa gtg cac aca gac acc aac aag atc 240 Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr Glu Val His Thr Asp Thr Asn Lys Ile 65 70 75 80 gag gaa ttc ctg gag gcc atg ctg tgc cct ccc agg tac cca aag ctg 288 Glu Glu Phe Leu Glu Ala Met Leu Cys Pro Pro Arg Tyr Pro Lys Leu 85 90 95 gct gcc ctg aac cct gag tcc aac acc tcg gga ctg gac ata ttt gca 336 Ala Ala Leu Asn Pro Glu Ser Asn Thr Ser Gly Leu Asp Ile Phe Ala 100 105 110 aag ttt tct gcc tac atc aag aac tca aac cca gcc ctc aat gac aac 384 Lys Phe Ser Ala Tyr Ile Lys Asn Ser Asn Pro Ala Leu Asn Asp Asn 115 120 125 cta gag aag gga ctc ctg aaa gcc ctg aag gtt cta gac aat tac ctg 432 Leu Glu Lys Gly Leu Leu Lys Ala Leu Lys Val Leu Asp Asn Tyr Leu 130 135 140 aca tcc ccc ctc cca gaa gaa gtg gat gaa acc agc gcc gaa gat gag 480 Thr Ser Pro Leu Pro Glu Glu Val Asp Glu Thr Ser Ala Glu Asp Glu 145 150 155 160 ggc atc tct cag agg aag ttt ctg gac ggc aat gag ctc acc ctg gct 528 Gly Ile Ser Gln Arg Lys Phe Leu Asp Gly Asn Glu Leu Thr Leu Ala 165 170 175 gac tgc aac ctg ctg cca aag ctt cac ata gta cag gtg gtg tgc aaa 576 Asp Cys Asn Leu Leu Pro Lys Leu His Ile Val Gln Val Val Cys Lys 180 185 190 aag tac aga ggc ttc acc atc cca gag gca ttc cgt gga gtg cat cgg 624 Lys Tyr Arg Gly Phe Thr Ile Pro Glu Ala Phe Arg Gly Val His Arg 195 200 205 tac ttg agc aac gct tat gcc cgg gaa gaa ttt gcc tcc acc tgt cca 672 Tyr Leu Ser Asn Ala Tyr Ala Arg Glu Glu Phe Ala Ser Thr Cys Pro 210 215 220 gat gat gaa gag ata gag cta gcc tat gag caa gtg gcc agg gct ctc 720 Asp Asp Glu Glu Ile Glu Leu Ala Tyr Glu Gln Val Ala Arg Ala Leu 225 230 235 240 aaa tga 726 Lys <210> 8 <211> 241 <212> PRT <213> CLIC of Mus musculus <400> 8 Met Ala Glu Glu Gln Pro Gln Val Glu Leu Phe Val Lys Ala Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Ala Lys Ile Gly Asn Cys Pro Phe Ser Gln Arg Leu Phe Met 20 25 30 Val Leu Trp Leu Lys Gly Val Thr Phe Asn Val Thr Thr Val Asp Thr 35 40 45 Lys Arg Arg Thr Glu Thr Val Gln Lys Leu Cys Pro Gly Gly Gln Leu 50 55 60 Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr Glu Val His Thr Asp Thr Asn Lys Ile 65 70 75 80 Glu Glu Phe Leu Glu Ala Met Leu Cys Pro Pro Arg Tyr Pro Lys Leu 85 90 95 Ala Ala Leu Asn Pro Glu Ser Asn Thr Ser Gly Leu Asp Ile Phe Ala 100 105 110 Lys Phe Ser Ala Tyr Ile Lys Asn Ser Asn Pro Ala Leu Asn Asp Asn 115 120 125 Leu Glu Lys Gly Leu Leu Lys Ala Leu Lys Val Leu Asp Asn Tyr Leu 130 135 140 Thr Ser Pro Leu Pro Glu Glu Val Asp Glu Thr Ser Ala Glu Asp Glu 145 150 155 160 Gly Ile Ser Gln Arg Lys Phe Leu Asp Gly Asn Glu Leu Thr Leu Ala 165 170 175 Asp Cys Asn Leu Leu Pro Lys Leu His Ile Val Gln Val Val Cys Lys 180 185 190 Lys Tyr Arg Gly Phe Thr Ile Pro Glu Ala Phe Arg Gly Val His Arg 195 200 205 Tyr Leu Ser Asn Ala Tyr Ala Arg Glu Glu Phe Ala Ser Thr Cys Pro 210 215 220 Asp Asp Glu Glu Ile Glu Leu Ala Tyr Glu Gln Val Ala Arg Ala Leu 225 230 235 240 Lys <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding Whole PRP19 Protein <400> 9 gaattctatg tccctgatct gctcg 25 <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding Whole PRP19 Protein <400> 10 tctagactaa agagcgtaat ctggaacatc gtatgggtac agactgtaga atttgag 57 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding N-terminal of PRP19 Protein <400> 11 gaattctatg tccctgatct gctcg 25 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding N-terminal of PRP19 Protein <400> 12 tctagactaa agagcgtaat ctggaacatc gtatgggtac accagctcac ccaaatc 57 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding C-terminal of PRP19 Protein <400> 13 gaattctatg ggaatgaccc ctgagatt 28 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding C-terminal of PRP19 Protein <400> 14 tctagactaa agagcgtaat ctggaacatc gtatgggtac agactgtaga atttgag 57 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Gene Encoding CLIC Protein Fragment <400> 15 ctcgagcggc atggctgaag aacaacctca ggtc 34 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Gene Encoding CLIC Protein Fragment <400> 16 ggatccgttc ttgatgtagg cagaaaactt 30

Claims (2)

1. 담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. ellipticus (Thunb.) Hara) 추출물을 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 담팔수 추출물이 화장료 조성물의 총 중량(건조 중량)을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 슬리밍용 화장료 조성물.

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