JP2017121203A - ジヒドロキシナフタレンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
芳香環水酸化ジオキシゲナーゼやシトクロームP450水酸化酵素に属する水酸化酵素または水酸化酵素複合体を発現している微生物を含む水性溶媒、該微生物の培養物を含む水性溶媒および該培養物の処理物を含む水性溶媒のいずれかの水性溶媒に対して、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸などのヒドロキシナフトエ酸を混合する方法によりヒドロキシナフトエ酸を水酸化してジヒドロキシナフトエ酸を調製する。その後、該ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを生産できる。
【選択図】なし
Description
てジヒドロキシナフタレンを生産することは知られていない。
,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む水溶液を40℃以上に加熱することにより1,3−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、1,3−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出し、工業的に生産されている安価なヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフトエ酸を経由してジヒドロキシナフタレンを効率よく生産できることを実証した。
palustris)CGA009株のシトクロームP450水酸化酵素CYP199A2を、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ATCC17453株が持つフェレドキシンとフェレドキシン・レダクターゼとともに発現する大腸菌を作製した後に、この大腸菌の培養液に対して1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸を加えたところ、1,7−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む水溶液を70℃以上に加熱することにより1,7−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、1,7−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出した。
3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸を加えたところ、3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む水溶液を225℃以上に加熱することにより1,7−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成することを見出した。
水酸化酵素複合体A:以下の(a1)、(a2)または(a3)に示す蛋白質、以下の(
b1)、(b2)または(b3)ならびに、以下の(c1)、(c2)または(c3)に示す蛋白質の3つの蛋白質からなることを特徴とする水酸化酵素複合体。
(a1)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(a2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(a3)配列番号2に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b1)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b2)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b3)配列番号4に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c1)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(c2)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c3)配列番号6に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素D:以下の(d1)、(d2)または(d3)に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
(d1)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(d2)配列番号8に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の7位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(d3)配列番号8に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の7位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素E:以下の(e1)、(e2)または(e3)に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
(e1)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(e2)配列番号10に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の5位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(e3)配列番号10に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有する配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の5位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
シナフトエ酸を用いることができる。好ましくは、工業的に生産されている1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸および6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸を用いることができる。
れぞれのジヒドロキシナフトエ酸から、1,6−ジヒドロキシナフタレン、2,7−ジヒドロキシナフタレン、1,7−ジヒドロキシナフタレン、1,2−ジヒドロキシナフタレン、2,3−ジヒドロキシナフタレン、1,3−ジヒドロキシナフタレンを製造することができる。
また、該蛋白質として、配列番号4のアミノ酸配列と80%以上の同一性、好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能」とは、大サブユニット蛋白質および小サブユニット蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに1位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。より具体的には、大サブユニット蛋白質および小サブユニット蛋白質とともに、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸または6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸または1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci.,
USA, 82, 488 (1985)、Biochem J., 462, 257 (2014) に記載の部位特異的変異導入法を用いて、たとえば配列番号2、4、6、8または10で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において特定の位置に欠失、置換もしくは付加が導入されるように、それぞれコードする配列番号1、3、5、7または9に表わされるDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される1または数個というアミノ酸の数は、目的の水酸化酵素活性が維持される限り特に限定されないが、配列番号2、4または6、8または10のアミノ酸配列との違いの個数以内であることが望ましく、1〜20個が好ましく、1〜10個がより好ましく、1〜5個が特に好ましい。
ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体の蛋白質をコードする組換えDNAを導入することにより該蛋白質を発現させることにより該能力を獲得した形質転換体であってもよい。たとえば、配列番号1に示す2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするDNA、配列番号3に示す2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質および配列番号5に示す2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするDNAを組換えDNA技術を用いてエシェリヒア・コリなどのエシェリヒア属細菌、Pseudoomonas putida(シュードモナス・プチダ)などのシュードモナス属細菌、またはCorynebacterium glutamicum(コリネバクテリウム・グルタミカム)などのコリネバクテリウム属細菌などの宿主細胞に導入した形質転換体であってもよい。また、配列番号7または9に示すシトクロームP450蛋白質などの水酸化酵素蛋白質をコードする組換えDNAを導入することにより該蛋白質を発現させることにより該能力を獲得した形質転換体であってもよい。
ゼーション法またはポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)法などにより、ヒドロキシナフトエ酸の水酸化に関わる酵素または酵素複合体の蛋白質をコードするDNAを含む断片を取得することができる。また、同様の方法により、シュードモナス属細菌、ロドシュードモナス属細菌およびストレプトマイセス(Streptomyces)属細菌から、ナフタレン環を水酸化する酵素に電子を伝達する機能を有する蛋白質をコードするDNAを含む断片を取得することができる。
/またはフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のDNAを宿主細胞中で発現させることによって得られる。
ンビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-8(キアゲン社製)、pET-3(ノバジェン社製)pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)(ストラタジーン社製)、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)等を用いることができる。
生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のpHについても本発明の微生物が生育し得るpHであれば特に制限はない。培養中のpH調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
〜0.05%(W/V)、好ましくは0.005〜0.02%である。
好適な脱炭酸反応が起きるように脱炭酸反応を行う温度を調整することが望ましい。脱炭酸反応に好適な温度は、ジヒドロキシナフトエ酸の濃度や水性溶媒の種類により異なる場合があるので、予め小さなスケールの容器を用いてジヒドロキシナフトエ酸からのジヒドロキシナフタレンの転換効率と加熱温度との関係を調べてから、大量調製に用いる温度条件を決めることが望ましい。
かずさ鎌足2-5-8)に、受託番号NITE P-02165で寄託されている。
バークホルデリア・テラエTNA241株を5mMの2−ナフトエ酸と0.025%の乾燥酵母エキスを含有する5mLのW液体培地に接種し、30℃で3日間振とう培養を行った。培養液から菌体を集めて、該菌体からQIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてTNA241株のゲノムDNAを調製した。
2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質、小サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質をクローニングするために、配列番号17〜23に示すフォワードPCRプライマーとリバースPCRプライマーを設計し、合成した。配列番号17と配列番号18のPCRプライマーセットは大サブユニット蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。配列番号19と配列番号21のPCRプライマーセットと配列番号20と配列番号21のPCRプライマーセットはともに小サブユニット蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。また、配列番号22と配列番号23のPCRプライマーセットはレダクターゼ蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。
上記で造成した4種類の発現プラスミドを大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)、JM109/(pUXPEaLT_LR)、JM109/(pUXPEaLT_LS)およびJM109/(pUXPEaLT_SR)を造成した。これら形質転換株を終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む0.
2mLのLB液体培地〔10g/Lのトリプトン(Difco社製)、5g/Lの乾燥酵母エキス(Difco社製)、10g/Lの塩化ナトリウム〕で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3mLのLB液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。m−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で蛋白質を誘導発現するための培養を3時間行った。吸光度600nmで2.0となる溶液100μLを調製するのに必要な菌体量に相当する培養液を採取し、菌体を集めた。該菌体を50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した後、菌体を1%グルコースを含む99μLの50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁することにより、組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。以下、特記しない限り「組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液」はこの方法を用いて調製した。
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を、終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む0.2mLのLB液体培地で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3mLのLB液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。m−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で5時間培養を行った後に、菌体を集めた。該菌体を50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した後、200μLの50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕に供することにより細胞を破砕した。その後、遠心分離(4℃、15分、15000rpm)を行って上清と沈殿物に分離した後、上清を大腸菌の菌体処理物すなわち粗酵素液とした。ブラッドフォード法に基づいたバイオラッド(Bio-Rad)プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて粗酵素液の蛋白質濃度を計測した。以下、特記しない限り、組換え大腸菌の粗酵素液はこの方法を用いて調製した。
上記2−3で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)をもとに、m−トルイル酸の添加後の蛋白質発現培養の時間を5時間に変更すること以外は、上記2−3で述べた方法を用いて組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。この懸濁液と100mMの3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む溶液1μLを用いて上記2−3で述べた方法により水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には1.31 mMであった3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は1時間の反応で0.16mMに減少し、上記で同定した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の減少量から1.15mMと算出された。なお、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(361nm)で形成されるピークエリアから算出した。
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を上記2−4で述べた方法で誘導培養を行い、該組換え大腸菌の粗酵素液を調製した。水酸化酵素反応は2−ナフトエ酸を終濃度1mMの3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸に、酵素反応時間を1時間から2時間に変更したこと以外は上記2−4で述べた方法で行い、水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には1.24 mMであった3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は2時間の反応で0.64mMに減少し、上記で同定した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の減少量から0.6mMと算出された。なお、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(361nm)で形成されるピークエリアから算出した。
3−1.1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の大量調製
上記2−3で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3.0mLのLB液体培地で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む100mLのLB液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。m−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で5時間培養を行った後に、菌体を集めた。該菌体を10mLの50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した後、99mLの1%グルコースを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。この懸濁液を30℃、290rpmの条件で5分間加温した。その後、1mLの0.5M 3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記2−4で述べた方法を用いて行った。その結
果、反応開始前には5.54 mMであった3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.13mMに減少し、上記で同定した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の減少量から5.41mMと算出された。なお、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(361nm)で形成されるピークエリアから算出した。
1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む20mLの溶液に0.3mLの6N塩酸を加えて混合し、塩化ナトリウムで飽和した酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5.0mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した14.0mLの酢酸エチル溶液に対して減圧乾燥処理を施して溶媒を蒸発させた。残留物に対して水と水酸化ナトリウムを加えて1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の抽出液を作製した。該抽出液の容量は20.0mLであり、pHは7.02であった。
上記3−2で調製したpH7.02の1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む溶液に塩酸を加えて、pH5.73, 3.65, 1.49の時にそれぞれ1.5 mLを分取した。各pHの溶液50 μLを1.7mLチューブ7本に分注し、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃で30分間加温した。加温後、メチルスルホキシド(以下、DMSOと略す)を全量で100 μLになるように加えて撹拌した。この溶液から4μLを分取し、16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。上記1−2に記載した方法を用いてLC−TOF型質量分析計による分析を行った。その結果、図1に示すように、30℃でも1,3−ジヒドロキシナフタレンの生成が確認され、上記3−2の工程でも脱炭酸反応が起こることが示唆された。また、1,3−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加すること、ならびに同一温度条件下でもpHを下げることにより、1,3−ジヒドロキシナフタレンの生成量が増加することも判明した。なお、生成した1,3−ジヒドロキシナフタレンは東京化成工業株式会社より購入した標品の1,3−ジヒドロキシナフタレンとHPLCの保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、1,3−ジヒドロキシナフタレンの定量は1,3−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長(286nm)で形成されるピークエリアから算出した。
上記1−2で述べた方法と同じ方法を用いて、バークホルデリア・テラエTNA241株を培養し、集菌した後、上記1−2で述べた方法を用いてTNA241株の休止菌体の懸濁液を調製した。この休止菌体の懸濁液99.6μLを30℃、1000rpmで5分間振とうした。0.4μLの0.5M 6―ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を加え、30℃、1000rpmの条件で反応を行った。経時的に反応液を2μLずつ採取し、それぞれの採取液2μLに対して8μLのアセトニトリルを加えて懸濁し、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、390μLの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表1に示す条件でLC−TOF型質量分析計による分析を行った。6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の同定は東京化成工業株式会社より購入した6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸と比較して、HPLCのピークの保持時間と特異吸収波長ならびに質量分析計で測定した精密質量値を合わせて行い、定量は特異吸収波長(305nm)で形成されるピークエリアから算出した。その結果、反応開始前には2.0mMであった6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は2
4時間の反応で検出限界以下になり、ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の蓄積が検出された。このジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は後述する実施例6−3に示すように、脱炭酸反応により1,6−ジヒドロキシナフタレンが生成することにより、1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸であることが判明した。
5−1.大腸菌休止菌体による1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)をもとに、上記2−3で述べた方法を用いて誘導培養を行い、組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を上記2−4で述べた方法で誘導培養を行い、該組換え大腸菌の粗酵素液を調製した。水酸化酵素反応は2−ナフトエ酸を終濃度1mMの6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸に、酵素反応時間を1時間から2時間に変更したこと以外は上記2−4で述べた方法で行い、水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には0.85 mMであった6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は2時間の反応で0.75mMに減少し、実施例4で述べた1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の減少量から0.1mMと算出された。なお、6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(305nm)で形成されるピークエリアから算出した。
6−1.1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の大量調製
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を用いて6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の大量調製を行った。該組換え大腸菌の培養、2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体の誘導発現および休止菌体の調製などは上記3−1で述べた方法と同じ方法で行った。調製した休止菌体の懸濁液を30℃、290rpmの条件で5分間加温した。その後、1mLの0.5M 6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間で4μLの反応液に対して16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表1に示す条件でLC−TOF型質量分析計による分析を行った。
上記6−1で調製した1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む20mLの溶液に0.3mLの6N塩酸を加えて混合し、これに飽和量となる塩化ナトリウムを加えた後、酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5.0mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した酢酸エチル層の総量は14.0mLである。
上記6−2で抽出した1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む酢酸エチル溶液を0.2mLずつ7本の1.7mLチューブに分注した後に、減圧乾燥処理を施して溶媒を蒸発させた。残留物に0.2mLの水を加え、ボルテックスミキサーで5分間撹拌して残留物を溶解した後に、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃の温度で1時間、加温した。加温後、0.2mLのDMSOを加えて撹拌した。この溶解液から4μLを分取し、16μLのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表1に示す条件でLC−TOF型質量分析計による分析を行った。その結果、図2に示すように、80℃以上で加温することにより1,6−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。1,6−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した1,6−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の1,6−ジヒドロキシナフタレンのHPLCの保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、1,6−ジヒドロキシナフタレンの定量は1,6−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長(286nm)で形成されるピークエリアから算出した。
7−1.シトクロームP450・CYP199A2遺伝子とロドコキシン(rhodocoxin)遺伝子をコードするDNAの増幅
シトクロームP450・CYP199A2遺伝子を得るため、ロドシュードモナス・パルストリスCGA009株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(以下、ATCCと略記す)から製品番号ATCC・BAA−98として入手した。本菌株をTryptic Soy Broth(BD Difco社製)で培養した後、菌体を集菌し、QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてゲノムDNAを調製した。
CRプライマーセットならびに、配列番号28と29のPCRプライマーセットを設計した。これら3組のPCRプライマーセットは、それぞれCYP199A2遺伝子の前半部、中央部および後半部のDNA領域を増幅するためのPCRプライマーセットである。ロドコキシン遺伝子を含むDNAを得るために配列番号30と31のPCRプライマーセットを設計した。なお、PCRプライマーの合成は株式会社ファスマックに外注した。上記で調製したゲノムDNAを鋳型に上記2−2と同じ方法でDNAの増幅を行った。
上記7−1で配列番号24と配列番号25、配列番号26と配列番号27、配列番号28と配列番号29の各PCRプライマーセットを用いて増幅させたCYP199A2遺伝子の一部をコードするDNA断片をそれぞれ制限酵素PacIと制限酵素HindIII、制限酵素HindIIIと制限酵素NdeI、制限酵素NdeIと制限酵素NotIでそれぞれ消化し、大腸菌発現ベクターであるpUXPEaLT19(特開2014−50373を参照)のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT_CYP199A2を造成した。上記7−1で配列番号30と配列番号31のPCRプライマーセットで増幅させたロドコキシン遺伝子をコードするDNA断片をTaq DNAポリメラーゼによってDNA断片の3'末端にA残基を付加した後、DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue由来のTベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_rhodocoxinを造成した。
シトクロームP450・CYP199A2を活性化させるための電子伝達系としてP450camの電子伝達系であるプチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子を利用することにした。両遺伝子を保持しているシュードモナス・プチダATCC17453株は理化学研究所微生物系統保存施設よりJCM6157として入手した。本菌株をLB培地で培養し、菌体を集菌した後、該菌体からQIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてゲノムDNAを調製した。
シュードモナス・プチダATCC17453株のプチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子の塩基配列については、NCBIのGBデータベースから、GBアクセッション番号NG_036907における塩基番号16111〜16434の配列(配列番号13)と塩基番号14787〜16055の配列(配列番号15)として得た。プチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子を含むDNAを得るにあたり、配列番号32と配列番号33のPCRプライマーセットおよび配列番号34と配列番号35のPCRプライマーセットを用いた。なお、PCRプライマーの合成は株式会社ファスマックに外注した。上記7−3で調製したゲノムDNAを鋳型に上記2−2と同じ方法でDNAの増幅を行った。
配列番号34と配列番号35のPCRプライマーセットを用いたPCR反応により得られたプチダレドキシン・レダクターゼをコードするDNAは制限酵素PacIと制限酵素NotIで切り出し、大腸菌低コピー発現ベクターであるpRTCXP19のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pRTCXP_Redを造成した。なお、大腸菌低コピー発現ベクターであるpRTCXP19はプラスミドベクターpRTC_SfiI(特許公開番号:WO2012081084084を参照)の制限酵素SfiIサイトの中に配列番号36で表されるDNAを挿入して構築した。なお、配列番号36に示すDNAは、シュードモナス・プチダmt−2株が持つPmプロモーターとXylS遺伝子を持っている。また、pRTCPmc8_lacZ(特開2014−50373を参照)のlacZ遺伝子を含むDNAをPacIとNotIで切り出し、pRTCXP19のPacI部位と
NotI部位の間に組み込むことにより、pRTCXP_lacZを造成した。
上記7−2で造成したCYP199A2発現プラスミドpUXPEaLT_CYP199A2を大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2)を造成した。
1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の生成が観察された。この結果から、大腸菌K−12株は保有する電子伝達系でもシトクロームP450・CYP199A2の活性化が起こることが示された。なお、1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(340nm)で形成されるピークエリアから算出した。
8−1.1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の大量調製
上記7−6で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPdrx)を用いて、上記3−1で述べた方法と同様の方法を用いて、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の代わりに1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸を原料として、1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を大量に調製した。
上記の反応で生成した1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を以下のようにして抽出した。1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む6mLの溶液に0.15mLの6N塩酸を加えて混合し、この溶液に飽和量となる塩化ナトリウムを加えた後、酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した酢酸エチル溶液の容量は14.0mLであった。
上記8−2で得た1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸抽出液を0.5mLずつ8本の1.7mLチューブに分注した後、減圧乾燥器内で溶媒を蒸発させた。残留物を0.25mLの水に溶解した後、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃の温度で1時間、加温した。加温後、0.25mLのDMSOを加えて撹拌した。各々のチューブの溶液から4μLずつ採取し、それぞれに16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表1に示す条件でLC−TOF型質量分析計による分析を行った。その結果、図3に示すように、70℃以上に加温すると脱炭酸反応が起こり、1,7−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。1,7−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した1,7−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の1,7−ジヒドロキシナフタレンのHPLCの保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、1,7−ジヒドロキシナフタレンの定量は1,7−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長(336nm)で形成されるピークエリアから算出した。
上記7−6で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)を用いて、実施例8で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記7−6で述べた方法を用いて行った。その結果、反応開始前には1.1mMであった3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は20時間の反応で0.02mMに減少し、ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成したジヒドロキシ−2−ナフトエ酸は標品の3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸(東京化成工業株式会社より購入)と、HPLCの保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値で一致していたことから、3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸であることが判明した。なお、各化合物の定量はそれぞれの特異吸収波長(3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸:361nm、3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸:385nm)で形成されるピークエリアから算出した。
10−1.2,6−ジヒドロキシナフタレンの生成条件の検討
標品の3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を用いて、実施例8−3で述べた方法を用いて100℃の加熱により脱炭酸が起こることを確かめたところ、脱炭酸反応は観察されなかった。そこで、以下のようにして、100℃より高温の条件で3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸の脱炭酸が起こるかを調べた。
供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表2に示す条件でLC−TOF型質量分析計による分析を行った。
実施例6−2に述べた方法を用いて、実施例9で調製した20mLの3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む29.8mLの酢酸エチル溶液を調製した後、減圧濃縮法により2.25mLに濃縮した。
上記7−6で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)を用いて、実施例8で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応さ
せた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記7−6で述べた方法を用い、LC−TOF型質量分析計のHPLC分析の条件を表3に示す条件に変更して行った。
実施例6−2に述べた方法を用いて、実施例11で調製した64mLの6,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、6,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む19.8mLの酢酸エチル溶液を調製した後、減圧濃縮法により2.5mLに濃縮した。
トエ酸からの2,3−ジヒドロキシナフタレンの生成が認められ、その生成量は温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した2,3−ジヒドロキシナフタレンの同定は標品の2,3−ジヒドロキシナフタレン(東京化成工業株式会社より購入)のHPLCの保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、2,3−ジヒドロキシナフタレンの定量は2,3−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長(325nm)で形成されるピークエリアから算出した。
13−1.シトクロームP450・CYP199A2・F185L変異体の構築
CYP199A2の185番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基に置換した変異体(CYP199A2・F185L変異体)が2−ナフトエ酸の5位を水酸化できることが報告されている〔非特許文献7:Appl. Environ. Microbiol. Vol. 78, p.6087-6094 (2012)〕。この知見に基づいて、配列番号37と配列番号38で表されるPCRプライマーを用いシトクロームP450・CYP199A2・F185L変異体を以下のようにして構築した。
上記で造成した組み換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を用いて実施例8で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記7−6で述べた方法を用い、LC−TOF型質量分析計のHPLC分析の条件を表4に示す条件に変更して行った。その結果、反応開始前には1.47mMであった1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.41mMに減少し、精密質量数からジヒドロキシ−2−ナフトエ酸と推定される新たな2つの化合物のピークがHPLC保持時間1.54分と1.58分に出現した。保持時間1.58分の化合物は、保持時間、特異吸収波長およびLC−TOF型質量分析計を用いて求めた精密質量値を合わせることにより、1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸であると同定された。また、保持時間1.54分の化合物は、実施例14で後述するように脱炭酸によって1,5−ジヒドロキシナフタレンが生成したことから、1,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸であると同定された。なお、1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(340nm)で形成されるピークエリアから算出した。
16−1.3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸から1,7−ジヒドロキシナフタレンの生成条件の検討
東京化成工業株式会社より購入した3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、上記10−1で述べた方法と同じ方法を用いて3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液の脱炭酸条件を調べた。高温高圧釜の加熱温度は、200℃、225℃、250℃および275℃であり、1時間加温した。室温から各温度までの昇温時間については200℃を60分、225℃を90分、250℃と275℃を120分に設定した。反応後、DMSOを添加して撹拌することにより反応産物を溶解した後、DMSOを追加して溶解液の総量が2mLになるように調整した。続いて、得られた溶解液に含まれる反応産物を上記10−1で述べた方法と同じ方法により分析した。
実施例6−2に述べた方法を用いて、実施例15で調製した25.0mLの3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む29.8mLの酢酸エチル溶液を得た。これを減圧乾燥器で1.25mLにまで濃縮した。
実施例13で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を用いて、実施例8で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1.5mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は実施例11で述べた方法を用いて行った。その結果、反応開始前には1.49mMであった6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.12mMに減少し、ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸に由来する2つのピークが保持時間1.26分と1.32分に新たに検出された。保持時間1.32分のピークは実施例11で生成させた6,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸と特異吸収波長が一致していることから、6,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸と同定した。なお、6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の定量は6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の特異吸収波長(305nm)で形成されるピークエリアから算出した。
実施例6−2に述べた方法を用いて、実施例17で調製した82mLの5,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、5,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸を含む19.8mLの酢酸エチル溶液を得た。これを減圧乾燥器で1.52mLにまで濃縮した
配列番号1:Burkholderia terrae TNA241株2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするDNA
配列番号2:Burkholderia terrae TNA241株の2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質
配列番号3:Burkholderia terrae TNA241株の2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするDNA
配列番号4:Burkholderia terrae TNA241株の2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質
配列番号5:Burkholderia terrae TNA241株の2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするDNA
配列番号6:Burkholderia terrae TNA241株の2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質
配列番号7:シトクロームP450水酸化酵素CYP199A2蛋白質をコードするDNA
配列番号8:シトクロームP450水酸化酵素CYP199A2蛋白質
配列番号9:CYP199A2・F185変異体の蛋白質をコードするDNA
配列番号10:CYP199A2・F185変異体蛋白質
配列番号11:ロドコキシン蛋白質をコードするDNA
配列番号12:ロドコキシン蛋白質
配列番号13:プチダレドキシン蛋白質をコードするDNA
配列番号14:プチダレドキシン蛋白質
配列番号15:プチダレドキシン・レダクターゼ蛋白質をコードするDNA
配列番号16:プチダレドキシン・レダクターゼ蛋白質
配列番号17:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号18:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号19:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー1
配列番号20:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー2
配列番号21:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号22:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号23:2−ナフトエ酸1位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号24:CYP199A2蛋白質の前半部をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号25:CYP199A2蛋白質の前半部をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号26:CYP199A2蛋白質の中央部をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号27:CYP199A2蛋白質の中央部をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号28:CYP199A2蛋白質の後半部をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号29:CYP199A2蛋白質の後半部をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号30:ロドコキシン蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号31:ロドコキシン蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号32:プチダレドキシン蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号33:プチダレドキシン蛋白質をコードするDNAのPCR増幅用リバース・プ
ライマー
配列番号34:プチダレドキシン・レダクターゼをコードするDNAのPCR増幅用フォワード・プライマー
配列番号35:プチダレドキシン・レダクターゼをコードするDNAのPCR増幅用リバース・プライマー
配列番号36: プラスミドベクターpRTCXP19内の2つのSfiI部位に挟まれた合成DNA由来の塩基配列
配列番号37:CYP199A2・F185L変異体蛋白質の作製用の合成DNA1
配列番号38:CYP199A2・F185L変異体蛋白質の作製用の合成DNA2
Claims (18)
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を含む水性溶媒、該微生物の培養物を含む水性溶媒および該培養物の処理物を含む水性溶媒のいずれかの水性溶媒とヒドロキシナフトエ酸を混合する方法により、ヒドロキシナフトエ酸を水酸化してジヒドロキシナフトエ酸を調製した後に、該ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とするジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- 前記ヒドロキシナフトエ酸が、1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸および6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸からなる群より選択される一種または二種以上のヒドロキシナフトエ酸であることを特徴とする請求項1に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- 前記ジヒドロキシナフタレンが、1,2−ジヒドロキシナフタレン、1,3−ジヒドロキシナフタレン、1,5−ジヒドロキシナフタレン、1,6−ジヒドロキシナフタレン、1,7−ジヒドロキシナフタレン、2,3−ジヒドロキシナフタレンおよび2,6−ジヒドロキシナフタレンからなる群より選択される一種または二種以上のジヒドロキシナフタレンであることを特徴とする請求項1または2に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属細菌、バークホルデリア(Burkholderia)属細菌、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌およびコリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌からなる群より選択される微生物であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が、以下に示す水酸化酵素複合体A、水酸化酵素D、および水酸化酵素Eからなる群より選択される一種または二種以上の酵素または酵素複合体であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
水酸化酵素複合体A:
以下の(a1)、(a2)または(a3)に示す蛋白質、以下の(b1)、(b2)または(b3)ならびに、以下の(c1)、(c2)または(c3)に示す蛋白質の3つの蛋白質からなることを特徴とする水酸化酵素複合体。
(a1)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(a2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(a3)配列番号2に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b1)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b2)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b3)配列番号4に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c1)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(c2)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c3)配列番号6に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素D:
以下の(d1)、(d2)または(d3)に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
(d1)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(d2)配列番号8に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の7位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(d3)配列番号8に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の7位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素E:
以下の(e1)、(e2)または(e3)に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
(e1)配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(e2)配列番号10に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の5位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(e3)配列番号10に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有する配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の5位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。 - ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の1位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる1,3−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、40℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより1,3−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の1位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる1,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、80℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより1,6−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素複合体Aであることを特徴とする請求項6または7に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の7位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる1,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、70℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより脱炭酸反応により1,7−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の7位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる3,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、200℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより2,6−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項
に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。 - ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の7位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる6,7−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、225℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより2,3−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素Dであることを特徴とする請求項9〜11のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の5位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により1−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる1,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、70℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより1,5−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の5位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られ3,5−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、225℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより1,7−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸の5位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸から得られる5,6−ジヒドロキシ−2−ナフトエ酸をもとに、250℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより1,2−ジヒドロキシナフタレンを生成することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素Eであることを特徴とする請求項13〜15のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
- 下記(a1)、(a2)または(a3)に示す蛋白質、(b1)、(b2)または(b3)、ならびに(c1)、(c2)または(c3)に示す蛋白質からなる水酸化酵素複合体A。
(a1)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(a2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(a3)配列番号2に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b1)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b2)配列番号4に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(b3)配列番号4に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列
からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c1)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(c2)配列番号6に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
(c3)配列番号6に示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の1位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。 - 請求項17に記載の水酸化酵素複合体Aを構成する3種類の蛋白質をコードするDNAで形質転換された微生物。
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