JP2017085909A - 微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株及びその利用 - Google Patents
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株及びその利用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株。
【選択図】なし
Description
(1)微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株。
(2)受領番号NITE AP−02155である、(1)に記載の細胞株。
(3)(1)又は(2)に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
(4)(1)又は(2)に記載の細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
(5)試験化合物を(1)又は(2)に記載の細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
(6)試験化合物を(3)に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、前記試験化合物が投与された前記非ヒト哺乳動物中の前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
(7)ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞用培地。
(8)(7)に記載の培地中で微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養する工程を備える、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法。
(9)ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の培地用添加剤。
(10)(1)又は(2)に記載の細胞株を備える、腫瘍マーカーのスクリーニング用キット。
(11)(1)又は(2)に記載の細胞株を備える、抗癌剤のスクリーニング用キット。
1実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を提供する。
1実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を移植した非ヒト哺乳動物を提供する。本実施形態の非ヒト哺乳動物は、微乳頭構造を有する肺腺癌を研究するモデルとして有用である。
1実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法としては、例えば、次のようなものが挙げられる。
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を免疫源としてモノクローナル抗体を多数作製し、固定した微乳頭構造を有する腫瘍組織や上記ヒト細胞株の染色性を指標として、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を選別することが挙げられる。
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株及び微乳頭構造を有しない肺腺癌に由来するヒト細胞株から、それぞれタンパク質を抽出し、両者を2次元電気泳動法で比較する。得られた電気泳動像に基づいて、発現量に差のあるタンパク質を同定することが挙げられる。このようなタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を無血清培地で培養し、その培養上清中のタンパク質を特定することが挙げられる。例えば、培養上清中のタンパク質をアセトン沈殿法等で析出させ、2次元電気泳動で分離し、得られたタンパク質のスポットを質量分析装置で解析して当該タンパク質を同定することが挙げられる。これらのタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーの候補である。
上記のヒト細胞株が由来する微乳頭構造を有する肺腺癌患者又は微乳頭構造を有する癌患者の血清中の抗体から、上記のヒト細胞株に反応性を示す自己抗体を探索することが挙げられる。
上記のヒト細胞株を対象として、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーをスクリーニングすることが挙げられる。
(第1実施形態)
1実施形態において、本発明は、試験化合物を、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株を移植した上記の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程と、試験化合物が投与された非ヒト哺乳動物中の上記のヒト細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞用培地を提供する。
1実施形態において、本発明は、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する培地中で、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養する工程を備える、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法を提供する。微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株の樹立は困難であるが、本方法により細胞株を樹立することができる。
1実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を備える、腫瘍マーカー又は抗癌剤のスクリーニング用キットを提供する。
(細胞株の樹立)
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を樹立した。具体的には、まず、外科手術で摘出され、病理組織学的に微乳頭構造を有する肺腺癌であることが確認された原発巣腫瘍組織を、ハサミで細かくミンチ状に切断して組織片を得た。続いて、得られた組織片を、I型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ中で培養(初代培養)した。
(微乳頭構造を有する肺腺癌組織及び北里P21LS細胞株の免疫組織化学染色)
微乳頭構造を有する肺腺癌組織及び北里P21LS細胞株の免疫組織化学染色を行い比較した。より具体的には、肺腺癌組織の微乳頭構造部分及び乳頭構造部分の組織切片、並びに北里P21LS細胞株の付着細胞部分及び浮遊細胞部分のホルマリン固定標本を、ヘマトキシリン・エオジン(HE);上皮性細胞のマーカーである、サイトケラチン、E−カドヘリン、Epithelial cell adhesion molecule(EpCAM)及びMucin 1, cell surface associated(Muc−1)に対する抗体;肺腺癌のマーカーであるThyroid Transcription Factor−1(TTF−1)に対する抗体;上皮間葉転換のマーカーであるN−カドヘリン及びビメンチンに対する抗体で染色した。また、微乳頭構造を有する肺腺癌組織としては、北里P21LS細胞株が由来する組織を使用した。
図10(a)〜図10(h)は、実験例1と同様にして3次元培養した北里P21LS細胞株の染色結果を示す顕微鏡写真である(倍率20倍)。
(培地の違いによる北里P21LS細胞株の増殖の検討)
I型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ(直径約35mm)を用いて、北里P21LS細胞株を組成の異なる培地で培養し、細胞の増殖を検討した。培地としては、10%ウシ血清を添加したRPMI1640培地(以下、「10%FCS培地」という。)、実験例1で使用した血清代替品(商品名「N−2サプリメント」、サーモフィッシャーサイエンティフィク社)を添加したRPMI1640培地(以下、「N2培地」という。)、並びに10%ウシ血清及び「N−2サプリメント」を添加したRPMI1640培地(以下、「10%FCS+N2培地」という。)を使用した。
(北里P21LS細胞株における付着細胞及び浮遊細胞の増殖の検討)
I型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ中で、10%FCS+N2培地を用いて北里P21LS細胞株を培養し、付着細胞及び浮遊細胞の細胞数をそれぞれ計測し、各細胞の増殖を検討した。
(EGFRエクソン19の塩基配列の解析)
北里P21LS細胞株について、上皮成長因子受容体(EGFR)のエクソン18〜21の塩基配列を解析した。塩基配列の解析には、Genetic Analyzer3500Dx(サーモフィッシャーサイエンティフィク社)を使用した。その結果、北里P21LS細胞株は、EGFRのエクソン19にE746−A750の欠失変異(EGFRのアミノ酸配列の第746〜750番目をコードする塩基配列の欠失変異)を有することが明らかとなった。
(北里P21LS細胞株を移植した非ヒト哺乳動物)
5×106個の北里P21LS細胞株を、マトリゲル(型式「354234」、コーニング社)を添加したリン酸バッファー(PBS)に懸濁し、免疫不全マウスであるNOD−scidマウスの皮下に注射し、腫瘍組織を形成することができるか否かを検討した。
Claims (11)
- 微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株。
- 受領番号NITE AP−02155である、請求項1に記載の細胞株。
- 請求項1又は2に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
- 請求項1又は2に記載の細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
- 試験化合物を請求項1又は2に記載の細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
- 試験化合物を請求項3に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、前記試験化合物が投与された前記非ヒト哺乳動物中の前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
- ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞用培地。
- 請求項7に記載の培地中で微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養する工程を備える、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法。
- ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の培地用添加剤。
- 請求項1又は2に記載の細胞株を備える、腫瘍マーカーのスクリーニング用キット。
- 請求項1又は2に記載の細胞株を備える、抗癌剤のスクリーニング用キット。
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AM. J. PATHOL., 2010, 177(5), PP.2191-2204, JPN6018018713, ISSN: 0003872040 * |
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