JP6516286B2 - ヒト微乳頭肺腺癌細胞株及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト微乳頭肺腺癌細胞株及びその利用に関する。

原発性肺癌のうち、微乳頭構造を呈する腺癌は、初期から高度のリンパ管侵襲・転移を起こし予後不良であることから、独立した臨床病理学的単位であると考えられている（例えば非特許文献１〜３を参照）。

肺癌の組織分類では、次回の改訂で、微乳頭構造の組織型が追加されることになっている。

微乳頭構造を呈する腫瘍としては、肺癌の他にも、膀胱癌、乳癌、唾液腺癌、卵巣癌等が知られており、共通して高度の脈管侵襲やリンパ節転移が認められ、予後不良である。

Miyoshi T., et al., Early-stage lung adenocarcinomas with a micropapillary pattern, a distinct pathologic marker for a significantly poor prognosis., Am. J. Surg. Pathol., 27, 101-109, 2003. Hoshi R., et al., Micropapillary clusters in early-stage lung adenocarcinomas: a distinct cytologic sign of significantly poor prognosis., Cancer, 102, 81-86, 2004. Kamiya K., et al., Histopathological features and prognostic significance of the micropapillary pattern in lung adenocarcinoma., Mod. Pathol., 21, 992-1001, 2008.

しかしながら、癌組織が微乳頭構造を取る理由、微乳頭構造部位とそうでない部位の相違、高い浸潤・転移能を規定する因子等については未だ不明である。これは、現在まで微乳頭構造を呈する癌細胞株が樹立されていないことが理由の一つであると考えられる。

そこで本発明は、微乳頭構造を呈する癌組織の特徴を研究する手段を提供することを目的とする。より具体的には、細胞株、非ヒト哺乳動物、腫瘍マーカーのスクリーニング方法、癌治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の通りである。
（１）ヒト微乳頭肺腺癌に由来する細胞株。
（２）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７８の（１）に記載の細胞株。
（３）（１）又は（２）に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
（４）非ヒト哺乳動物が免疫不全マウスである（３）に記載の非ヒト哺乳動物。
（５）（１）又は（２）に記載の細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
（６）癌治療薬剤候補物質を（１）又は（２）に記載の細胞株と接触させて、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法。
（７）癌治療薬剤候補物質を（３）又は（４）に記載の非ヒト哺乳動物に投与して、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法。

本発明により、微乳頭構造を呈する癌組織の特徴を研究する手段を提供することができる。より具体的には、細胞株、非ヒト哺乳動物、腫瘍マーカーのスクリーニング方法、癌治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。

（ａ）は、微乳頭構造を呈する癌組織の構造を示す模式図である。（ｂ）は、真の乳頭状構造を呈する癌組織の構造を示す模式図である。 （ａ）〜（ｄ）は、微乳頭構造を呈する癌組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像の例を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、樹立したヒト微乳頭肺腺癌細胞株の写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、無血清培地Ｈ−ＳＦＭで培養したヒト微乳頭肺腺癌細胞株の写真である。 ＳＣＩＤマウスの体内で形成された微乳頭肺腺癌組織の切片のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す写真である。 ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍を用いた免疫染色像を示す写真である。 ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍を用いた免疫染色像を示す写真である。

［細胞株］
１実施形態において、本発明は、ヒト微乳頭肺腺癌（ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ ｐａｔｔｅｒｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（以下、「ＭＰＰＡＣ」という場合がある。）の癌組織に由来する細胞株（ヒト微乳頭肺腺癌細胞株、以下、「ＭＰＰＡＣ細胞株」という場合がある。）を提供する。従来、微乳頭構造を呈する癌に由来する細胞株は樹立された例がなかった。本実施形態の細胞株は、腫瘍の発育・進展様式の解明、腫瘍マーカーのスクリーニング、治療剤のスクリーニング等に利用することができる。

図１（ａ）は、微乳頭構造を呈する癌組織の構造を示す模式図である。図１（ｂ）は、真の乳頭状構造を呈する癌組織の構造を示す模式図である。図１（ｂ）に示すように、真の乳頭状構造を呈する癌組織の切片には、血管結合組織のコアが存在する。これに対し、図１（ａ）に示すように、微乳頭構造を呈する癌組織の切片には、血管結合組織のコアが存在しないという特徴がある。図２（ａ）〜（ｄ）は、微乳頭構造を呈する癌組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像の例を示す写真である。

上記の細胞株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７８である細胞株（以下、「ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株」という場合がある。）であることが好ましい。本細胞株は、今回発明者らが樹立したヒト微乳頭肺腺癌細胞株である。実施例に示すように、本細胞株は、実際の微乳頭肺腺癌組織で見られるものに類似した形態を示す。本細胞株によって微乳頭構造を呈する癌組織について研究するための研究材料が提供される。

なお、本実施形態の「細胞株」は、細胞株を非ヒト哺乳動物の体内で増殖させて得られた「可移植腫瘍組織」を含む。

［非ヒト哺乳動物］
１実施形態において、本発明は、上述したＭＰＰＡＣ細胞株を移植した非ヒト哺乳動物を提供する。上記の非ヒト哺乳動物としては、免疫不全マウスが挙げられる。マウスは、実験動物として様々な研究技術が確立されている。また、免疫不全マウスであれば、ヒト細胞株を移植した場合においても拒絶反応を示さないため、癌組織を形成させることができる可能性が高い。免疫不全マウスとしては、例えば、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）等が挙げられる。

後述するように、発明者らは、マウスに移植したＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株が微乳頭様構造を呈することを確認した。したがって、本実施形態の非ヒト哺乳動物はＭＰＰＡＣの転移や浸潤の解析モデルとして利用することができる。

［腫瘍マーカーのスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、上述したヒト微乳頭肺腺癌細胞に由来する細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法としては、例えば、次のようなものが挙げられる。

（腫瘍特異的モノクローナル抗体の作製）
ＭＰＰＡＣ細胞株を免疫源としてモノクローナル抗体を多数作製し、固定したＭＰＰＡＣの組織やＭＰＰＡＣ細胞株の染色性を指標として、ＭＰＰＡＣ特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を選別することが挙げられる。このようなモノクローナル抗体が認識する抗原は、ＭＰＰＡＣ特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。当該腫瘍マーカーは、ＭＰＰＡＣの診断に利用することができる。また、上記モノクローナル抗体はＭＰＰＡＣの診断や治療に利用することができる。

（２次元電気泳動によるスクリーニング）
ＭＰＰＡＣ細胞株及び微乳頭構造を呈しない肺線癌細胞株から、それぞれタンパク質を抽出し、両者を２次元電気泳動法で比較する。得られた電気泳動像に基づいて、発現量に差のあるタンパク質を同定することが挙げられる。このようなタンパク質は、ＭＰＰＡＣ特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。

微乳頭様構造を呈しない肺線癌細胞株としては、例えばＡ５４９細胞株、ＬＣ２−ａｄ細胞株等が挙げられる。また、本実施形態のスクリーニング方法では、ＭＰＰＡＣ細胞株と微乳頭様構造を呈しない肺線癌細胞株との比較において、発現量に、例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上の差が認められるタンパク質を腫瘍マーカーの候補として選択するとよい。

（培養上清中のセクレトーム解析）
無血清培地でＭＰＰＡＣ細胞株を培養し、その培養上清中のタンパク質を特定することが挙げられる。例えば、培養上清中のタンパク質をアセトン沈殿法等で析出させ、２次元電気泳動で分離し、得られたタンパク質のスポットを質量分析装置で解析して当該タンパク質を同定することが挙げられる。これらのタンパク質は、ＭＰＰＡＣ特異的な腫瘍マーカーの候補である。

（患者血清と細胞株を用いた自己抗体解析）
ＭＰＰＡＣ細胞株の元となった患者又はＭＰＰＡＣ患者の血清中の抗体から、ＭＰＰＡＣ細胞株に反応性を示す自己抗体を探索することが挙げられる。例えば、ＭＰＰＡＣ細胞株から抽出したタンパク質又は上述したＭＰＰＡＣ細胞株の培養上清中のタンパク質を２次元電気泳動し、患者の血清中の抗体と反応させる。反応性が認められたタンパク質のスポットを質量分析装置で解析して当該タンパク質を同定する。患者の血清中の抗体が反応したタンパク質は、ＭＰＰＡＣ特異的な腫瘍マーカーの候補である。

［微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、癌治療薬剤候補物質を上述したＭＰＰＡＣ細胞株と接触させて、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法を提供する。

例えば、化合物ライブラリをＭＰＰＡＣ細胞株の培地に添加し、細胞の増殖に対する影響を検討することが挙げられる。より具体的には、例えば、９６ウェルプレートにＭＰＰＡＣ細胞株を播種し、化合物ライブラリの存在下で１〜５日間程度培養する。その後、例えばテトラゾリウム塩の還元による発色により、生細胞数を解析することが挙げられる。ＭＰＰＡＣ細胞株の増殖を抑制する化合物は、微乳頭肺腺癌治療薬剤の候補である。テトラゾリウム塩としては、市販の３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）等を利用することができる。

（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、上述したＭＰＰＡＣ細胞株を移植した非ヒト哺乳動物に癌治療薬剤候補物質を投与して、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法を提供する。

非ヒト哺乳動物としては、例えば、免疫不全マウスが挙げられる。ＭＰＰＡＣ細胞株を移植した免疫不全マウスに経口投与又は非経口投与で癌治療薬剤候補物質を投与する。続いて、癌細胞増殖抑制を試験して、当該癌治療薬剤候補物質の効果を確認する。癌細胞増殖抑制の試験方法としては、例えば、移植されたＭＰＰＡＣ細胞株に由来する癌組織の大きさ（体積、質量等）を測定すること等が挙げられる。上記癌組織を縮小させる癌治療薬剤候補物質は、癌治療薬剤として利用することができる可能性が高い。

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。また、本研究は、北里大学医学部の倫理委員会に「原発性肺癌に関するプロテオーム解析による診断マーカーの検索」という課題名で申請し承認を得ており、その後も継続申請している（Ｂ倫理０７−０６）。

［実験例１］
（ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株の樹立）
微乳頭肺腺癌患者にインフォームドコンセントを得たうえで胸水を採取した。続いて、採取した胸水中に含まれる腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、継代・維持可能なヒト微乳頭肺腺癌細胞株（ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株）を樹立した。

樹立した細胞株は、通常の肺腺癌、扁平上皮癌と異なり、シート状増殖はせず、小胞巣状に少数の細胞が接着し、その上に細胞が重層して増殖する様式を取った。重層した細胞は小胞巣状で浮遊状態になり増殖した。このような増殖様式は、実際の微乳頭肺腺癌組織で見られるものに類似していた。図３（ａ）及び（ｂ）は、樹立したＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した様子を示す写真である。

ハイブリドーマ用の無血清培地Ｈ−ＳＦＭや、無タンパク質培地ＰＭＨＦ−ＩＩで継代・維持可能な細胞株も合わせて樹立した。これらの細胞は、接着はせず、小塊状・浮遊状態で増殖した。無血清又は無タンパク質培地であるので、分泌するタンパク質の解析が可能である。図４（ａ）及び（ｂ）に無血清培地Ｈ−ＳＦＭで培養したＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株の写真を示す。

樹立したＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株は、上述した各培地を交換することにより、いずれの培地の細胞からでも他の増殖形態（微乳頭構造様、小塊状・浮遊状態）に変換が可能であった。維持が簡単なことから、Ｈ−ＳＦＭ培地で継代・維持されたヒト微乳頭肺腺癌細胞株を独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７８、細胞名「ＫＵ−ＭＰＰＡＣ」）。

［実験例２］
（ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株を移植した非ヒト動物）
樹立したＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株をＳＣＩＤマウスの皮下に注射することにより、可移植腫瘍を樹立した。この腫瘍組織も、通常の肺腺癌組織とは異なり接着能が低く、微乳頭様構造を取る部分が散見された。図５は、上記のＳＣＩＤマウスの体内で形成された微乳頭肺腺癌組織の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す写真である。

続いて、ＳＣＩＤマウスの体内で形成された上記微乳頭肺腺癌組織から再度細胞株を作製した結果、最初に樹立した細胞株と同様の微乳頭構造様の増殖形態を取ることが確認された。

［実験例３］
（ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍を用いた免疫染色）
ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株、及びＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株をＳＣＩＤマウスの皮下に注射して作製した可移植腫瘍を、１０％ホルマリンで固定後パラフィンに包埋した。続いて、これらの試料を薄切して抗体で染色し、免疫組織化学的に解析した。抗体としては、上皮性細胞のマーカーであるＥ−カドヘリン及び汎サイトケラチン（ＡＥ１／ＡＥ３）；肺腺癌のマーカーであるＴｈｙｒｏｉｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ−１（ＴＴＦ−１）及びＭＵＣ５Ｂ；上皮間葉系転移のマーカーであるＮ−カドヘリン及びビメンチン；神経内分泌癌のマーカーであるｈＡＳＨ−１、クロモグラニンＡ、シナプトフィジン及びＮ−ＣＡＭに対する抗体を用いた。

免疫染色の結果を図６（ａ）〜（ｇ）及び図７（ａ）〜（ｇ）に示す。その結果、上皮性細胞のマーカーであるＥ−カドヘリン（図６（ａ）、（ｂ））及び汎サイトケラチン（図６（ｃ）、（ｄ））；肺腺癌のマーカーであるＴＴＦ−１（図６（ｅ）、（ｆ））は、ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍ともに陽性であった。また、肺腺癌のマーカーであるＭＵＣ５Ｂは可移植腫瘍のみ陽性であった（図６（ｇ））。また、上皮間葉系転移のマーカーであるＮ−カドヘリン及びビメンチンは、ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍ともに陰性であった。また、神経内分泌癌のマーカーであるｈＡＳＨ−１（図７（ａ）、（ｂ））、シナプトフィジン（図７（ｃ）、（ｄ））、クロモグラニンＡ（図７（ｅ）、（ｆ））は、ＫＵ−ＭＰＰＡＣ細胞株及び可移植腫瘍ともに陽性であった。また、神経内分泌癌のマーカーであるＮ−ＣＡＭは可移植腫瘍のみ陽性であった（図７（ｇ））。

本発明により、微乳頭構造を呈する癌組織の特徴を研究する手段を提供することができる。より具体的には、細胞株、非ヒト哺乳動物、腫瘍マーカーのスクリーニング方法、癌治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。本発明のヒト微乳頭肺腺癌細胞株、マウスの可移植腫瘍を用いることにより、微乳頭構造を呈する腫瘍の増殖様式、高い浸潤能を規定する分子の解析が可能となり、様々な実験手法により新たな診断薬、治療薬等の開発に多大な貢献をすると考えられる。

Claims (6)

1. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１９７８である、ヒト微乳頭肺腺癌に由来する細胞株。
2. 請求項１に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
3. 非ヒト哺乳動物が免疫不全マウスである請求項２に記載の非ヒト哺乳動物。
4. 請求項１に記載の細胞株に特異的なタンパク質を同定する工程を含む、ヒト微乳頭肺腺癌特異的な腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
5. 癌治療薬剤候補物質を請求項１に記載の細胞株と接触させて、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法。
6. 癌治療薬剤候補物質を請求項２又は３に記載の非ヒト哺乳動物に投与して、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む微乳頭肺腺癌治療薬剤のスクリーニング法。