CN111225608B - 碳纳米管海绵捕获循环肿瘤细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在不使用癌症生物标志物的情况下，捕获来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)的方法。所述方法包括使测试样品与碳纳米管(CNT)海绵接触。所述测试样品包含来自对象的去除血浆并裂解红细胞之后的少量外周血的细胞。所述测试样品中的细胞包含来自所述对象的CTC。所述CNT海绵不含特异性针对癌症生物标记物的试剂。

Description

碳纳米管海绵捕获循环肿瘤细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月28日提交的第62/525,942号美国临时申请的优先权，出于所有目的，其全部公开内容通过引用整体并入本文中。
涉及的美国政府支持
本发明是在美国空军科研办公室(the U.S.Air Force Office of ScientificResearch)的MURI基金号为FA9550-12-1-0035的政府支持下和在美国国立卫生研究院(theU.S.National Institutes of Health)授予的NIGMS-IdeA基金号为U54-GM104941的政府支持下完成的。美国享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明总体上涉及无标志物碳纳米管(CNT)海绵在捕获来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)中的用途。
发明背景
纳米材料的最新进展在生物医药应用(如药物递送、疾病诊断和组织工程)中提供了新的亮点。在动物组织和器官中，胶原蛋白纤维网络构成细胞外环境，在其中细胞可以发挥功能和发展。最近已经开发并表征了各种三维碳纳米管海绵(CNT海绵)。这些纳米材料与生物组织中的胶原蛋白网络具有相似的结构和机械性能。
大多数肿瘤患者死于转移性疾病(90％的肿瘤相关死亡率)。转移通常涉及以下阶段：肿瘤细胞的局部侵袭(例如，淋巴结)、通过血液循环、在远端组织/器官环境中的再分配和继发性肿瘤的形成。在扩散到健康组织之前，循环肿瘤细胞(CTC)可能已经在患者的血液中积累了数月或数年。只有在患者中形成继发性肿瘤之后，才能通过成像技术检测到这些转移性病灶。尽管患者可能已出现症状，但大多数治疗将无效。对CTC阳性/转移病灶阴性患者早期应用化学疗法可以提高化学疗法的有效性并改善预后。此外，几种侵袭性癌症类型(例如三阴性乳腺癌)需要立即开始化学疗法，这可能导致过度治疗。通过液体活组织检查证明成功地消除CTC可以使医生能够改进治疗性治疗计划。
迄今为止，CTC分离方法主要分为两大类：微流体装置和免疫磁性选择装置，它们分别利用CTC的物理特性(例如，大小和密度梯度)和蛋白质表达。由于CTC和白细胞之间重叠的物理特性，基于物理特性的技术面临准确性的问题。免疫磁性技术依赖于肿瘤细胞特异性蛋白的表达(例如，EpCAM)，其并不是对于所有类型的CTC都是阳性的。例如，在免疫磁性技术的操作中通常需要来自对象的至少7.5ml的血液。
随着纳米材料的发展，已经开发了几种纳米工程化器件以通过利用肿瘤细胞在特定纳米材料表面上的高度粘附特性来捕获CTC。这些器件包括纳米柱、纳米线和纳米纤维。碳纳米材料(如碳纳米管和石墨烯)也已被用于帮助捕获CTC。然而，与免疫磁性选择方法类似，这些技术需要额外的肿瘤特异性粘附分子(如用于特异性识别的蛋白)，这既增加了操作成本又限制了可检测的癌症类型。开发CTC-iChip以通过基于白细胞特异性标志物的白细胞的阴性消耗从血液中分离CTC。
仍然需要在不使用任何肿瘤生物标志物的情况下从对象的少量血液中分离CTC的有效且高效的方法。
发明概述
本发明涉及碳纳米管(CNT)海绵在捕获来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)中的用途和所捕获的CTC的用途。
本发明提供了在不使用癌症生物标志物的情况下从对象捕获循环肿瘤细胞(CTC)的方法。该方法包括使测试样品与碳纳米管(CNT)海绵接触不超过60分钟。所述测试样品包含来自对象的去除血浆和裂解红细胞之后的不超过2ml外周血的细胞。所述测试样品中的细胞包含来自对象的CTC。所述CNT海绵不含特异性针对癌症生物标志物的试剂。因此，所述CTC被所述CNT海绵捕获。
所述CTC可能不具有癌症生物标志物。癌症生物标志物可能是特异性针对肿瘤细胞的。对象可能患有肿瘤。肿瘤可以选自乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌。癌症生物标志物可以选自：EpCAM、细胞角蛋白、CD45和HER2。所述测试样品可以包含200-1000个CTC/ml来自所述对象的外周血。
该方法可以包括使所述测试样品与所述CNT海绵接触不超过30分钟。该方法可以包括使所述测试样品与所述CNT海绵接触不超过15分钟。
所述测试样品中至少20％的所述CTC可以被所述CNT海绵捕获。在细胞培养物中，所捕获的CTC中的至少一个可以在7天后仍保持活力。
该方法还可以包括将捕获的CTC与所述CNT海绵分离。该方法还可以包括在培养基中孵育所捕获的CTC。该方法还可以包括表征所捕获的CTC。
附图简述
图1显示了基于3D CNT海绵的CTC捕获芯片的制备和CTC分离策略。(a)CNT海绵与天然软组织之间的机械和结构相似性。(b)CNT海绵与软骨中胶原蛋白纤维网络之间的相似微结构。(c)捕获过程的方法设计。通过化学气相沉积(CVD)方法制造3D CNT海绵，并且将CNT海绵嵌入载玻片中以用于CTC捕获目的。(d)将细胞悬浮液置于CNT海绵表面上并培养15-60分钟，使得CTC可附着至CNT结构。然后翻转海绵以使未结合的细胞通过重力释放到培养基中。
图2显示了CTC捕获效率。(a)在60分钟内捕获的乳腺癌CTC(b)在60分钟内捕获的肺癌CTC。对于(a)和(b)，所有标尺等于100μm。(n＝3，*P<0.002，**P<0.001，***P<0.0001)。(c)由CNT海绵捕获的CTC的免疫荧光成像。测试了乳腺癌细胞和肺癌细胞。CK和EpCAM的阳性生物标志物证实所有捕获的细胞都是CTC。所有子图中的标尺代表100μm。
图3显示了CTC的临床验证。(a)CNT海绵从临床样品中捕获CTC的方案。(b)和(c)显示了CNT海绵从两种不同的临床样品捕获的细胞。标记EpCAM。在两个免疫荧光图像中，将细胞的细胞核用DAPI(圆形灰色点)染色。标尺代表100μm。(d)来自这两个临床样品的CTC计数。
图4显示了CTC的SEM表征。(a)在CNT海绵和玻璃f上的乳腺癌细胞(细胞系：MDA-MB-231)和肺癌细胞(细胞系：NCI-H322)的细胞形态，在CNT海绵的表面上发现了更圆的形态，而在玻璃表面上大多数细胞具有细长的形态。(b)容纳在CNT海绵(顶部)和平板玻璃(底部)上的CTC的详细形态信息。
图5显示了CNT海绵上细胞运动的统计结果。(a)总结了在CNT海绵和载玻片上的乳腺癌细胞的典型移动轨迹，并且还总结了细胞运动(n＝4，F<0.001)。(b)在长时间胰蛋白酶消化(0.25％，10分钟)后，在CNT海绵和包被有纤连蛋白的玻璃上的残余的乳腺癌细胞(用鬼笔环肽488(Phalloidin 488)染色的F-肌动蛋白)。(c)与用包被有纤连蛋白的玻璃相比，在24小时内，在CNT海绵上的CTC中胶原蛋白和糖蛋白的合成均被显著促进。用MB-488对新合成的胶原蛋白和糖蛋白进行荧光染色。(d)荧光强度代表由乳腺癌细胞合成的ECM的量。(n＝3且***P<0.0001)。所有标尺代表50μm。
发明详述
本发明涉及在不使用生物标志物的情况下通过碳纳米管(CNT)海绵从对象捕获循环肿瘤细胞(CTC)的有效且高效的方法。本发明是基于以下出人意料的发现：即由于肿瘤细胞的侵袭特性以及CNT海绵与天然细胞外基质(ECM)的结构/机械相似性，在CTC和CNT海绵之间具有突出的结合亲和力。通过肿瘤细胞加标(tumor-cell-spiked)的血液样品和临床样品两者的验证，稀少的CTC可以被CNT海绵有效且高效地捕获。所捕获的CTC可以在CNT海绵上保持活力，使得能够进一步表征CTC(例如病理学分析)。作为一种低成本和简单的操作技术，这种基于CNT海绵的捕获方法为使用液体活组织检查早期检测转移性疾病提供了无生物标志物的CTC捕获平台。CNT海绵用作真核细胞附着和增殖的理想人工小生境，为CNT材料在生物医药应用中获得了新的机会。
本文所用的术语“循环肿瘤细胞(CTC)”是指脉管系统或淋巴管系统中的细胞，其来源于对象的原发肿瘤并且在对象体内循环携带。CTC可以积聚在患有肿瘤的对象的血液中，并且可以以1-10个CTC/mL患有肿瘤(例如癌症)的患者的全血存在。从患有肿瘤的患者的血液中分离CTC可以被认为是来自患者的液体活组织检查，提供关于患者的活体信息，例如转移状态、疾病进展和治疗有效性。CTC是CD45阴性的，表明这些细胞不是造血来源的，并且可能具有或可能不具有癌症生物标志物。
CTC可以是传统的CTC、细胞角蛋白阴性的CTC、凋亡的CTC或小CTC。传统的CTC被确认为具有完整、有活性的细胞核并表达细胞角蛋白和癌症生物标志物的癌细胞。细胞角蛋白阴性(CK-)CTC是癌症干细胞或经历上皮-间质转化的细胞，并且表达癌症生物标志物，但不表达细胞角蛋白。凋亡的CTC是传统的CTC，其经历细胞凋亡并显示与细胞凋亡相关的核碎裂或细胞质起泡。在接受治疗的患者中，传统CTC与凋亡CTC的比率的变化提供了治疗在靶向和杀死癌细胞方面的功效的证据。小CTC具有与白血细胞相似的大小和形状，但表达细胞角蛋白和癌症生物标志物。小CTC参与进行性疾病和分化成小细胞癌，其通常需要不同的治疗过程。
本文所用的术语“生物标志物”是指一些生物学状态或状况的可测量的指示物(例如癌细胞上的特殊蛋白)。生物标志物可以是这样的物质，其在生物体中的存在指示生物体中的现象(例如疾病、病况或环境暴露)。生物标志物可以是化合物、生物分子(例如，蛋白质、核酸或液体)，或以上的组合。生物标志物可以存在于细胞中(例如，存在于细胞中或细胞上)，表明细胞的起源或特定特性。生物标志物被广泛用于诊断、治疗或分离具有相同生物标志物的细胞。
本文所用的术语“癌症生物标志物”是指与肿瘤或肿瘤细胞特异性相关的生物标志物。肿瘤是由细胞的异常生长形成的团块。肿瘤可以是良性的、变恶性前的或恶性的。恶性肿瘤也被称为癌症。癌症生物标志物可以存在于肿瘤细胞中或存在于肿瘤细胞上，所述肿瘤细胞是来源于肿瘤(例如癌症)的细胞。示例性的癌症生物标志物包括EpCAM、细胞角蛋白、CD45、HER2和乳腺丝抑蛋白(Maspin)。
本文所用的术语“特异性针对癌症生物标志物的试剂”是指与癌症生物标志物特异性结合的物质。特异性针对癌症生物标志物的试剂可以是化合物、生物分子(例如，蛋白质、核酸或液体)，或以上的组合。在一个实施方案中，特异性针对癌症生物标志物的试剂是与癌症生物标志物特异性结合的亲和结合分子(如抗体或其片段)。特异性针对癌症生物标志物的试剂的实例包括抗EPCAM抗体。
本文所用的术语“碳纳米管(CNT)海绵”是指具有多孔圆柱形纳米结构的碳的同素异形体。适用于本发明的CNT与CTC具有突出的结合亲和力，因为细胞倾向在CNT生长树状突。CNT可以具有或可以不具有特异性针对癌症生物标志物的试剂。根据本发明的CNT海绵和CTC之间的结合不依赖于任何生物标志物或特异性针对癌症生物标志物的试剂。在一个实施方案中，CNT海绵不含抗体或蛋白质。
本文所用的术语“捕获的”是指通过与CNT海绵结合而与样品中的其它细胞分离的某些细胞。至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的CTC可以被CNT海绵捕获。至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的由CNT海绵捕获的细胞是CTC。
本文所用的术语“对象”是指动物，优选哺乳动物。哺乳动物可以是人。对象可以是患有肿瘤(例如癌症)的患者。示例性肿瘤包括囊性肉瘤、胰岛细胞癌、肝细胞瘤和恶性类癌。示例性癌症包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌。在一个实施方案中，对象是患有肿瘤(例如癌症)的患者。
提供了在不使用癌症生物标志物的情况下从对象捕获循环肿瘤细胞(CTC)的方法。该方法包括使测试样品与碳纳米管(CNT)海绵接触不超过约5、10、15、30、45、50、60、90、120或180分钟。测试样品包含来自对象的去除血浆并裂解红细胞之后的不超过0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0ml外周血的细胞。测试样品中的细胞包含来自对象的CTC。CNT海绵不含特异性针对癌症生物标志物的试剂。结果，在不使用癌症生物标志物的情况下CTC被CNT海绵捕获。
CTC可能不具有癌症生物标志物。癌症生物标志物可以是特异性针对肿瘤细胞的，即存在于肿瘤细胞中，但不存在于非肿瘤细胞中。肿瘤可以是乳腺癌、肺癌或结肠直肠癌。癌症生物标志物可以是EpCAM、细胞角蛋白、CD45、HER2，或以上的组合。
测试样品可以包含来自对象的约1-100000、0-10000、1-1000、1-500、1-200、1-100、1-50、1-10或1-5个CTC。在一个实施方案中，测试样品包含来自对象的1-10个CTC。
根据本发明，测试样品中至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的CTC被CNT海绵捕获。在一个实施方案中，至少25％的CTC被捕获。
根据本发明，在细胞培养物中，所捕获的CTC中的至少约1、5、10或50个可以在约1、2、3、4、5、6、7、10或14天后仍保持活力。在一个实施方案中，在细胞培养物中，所捕获的CTC中的至少一个在7天后仍保持活力。在细胞培养物中，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所捕获的CTC可以在约1、2、3、4、5、6、7、10或14天后仍保持活力。
该方法还可以包括将所捕获的CTC与CNT海绵分离。可以翻转海绵，使得未附着在CNT海绵上的细胞通过重力从海绵中释放。可以将由CNT海绵捕获的CTC通过细胞散开化学物质(例如胰蛋白酶或EDTA)来分离。分离的CTC可以在具有培养基的陪替氏培养皿中在约15-40℃、20-37℃、25-37℃或约25℃或37℃的温度下培养至少约0.5、1、2、3、6、12、18或24小时。至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所捕获的CTC可以仍保持活力。所捕获的CTC中的至少约1、5、10或50个可以仍保持活着。
该方法还可以包括在培养基中孵育所捕获的CTC。培养基可以是最小必需培养基、血清、抗生素，或以上的组合。可以在约15-40℃、20-37℃、25-37℃或约25℃或37℃的温度下培养所捕获的CTC。在细胞培养物中，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所捕获的CTC可以在1、2、3、4、5、6、7、10或14天后仍保持活力。所捕获的CTC中的至少约1、5、10或50个可以在细胞培养物中在约1、2、3、4、5、6、7、10或14天后保持活力。在一个实施方案中，在细胞培养物中，所捕获的CTC中的至少一个在7天后仍保持活力。
该方法还可以包括表征所捕获的CTC。例如，可以用特异性针对癌症生物标志物的试剂标记CTC，以检测所捕获的CTC中或所捕获的CTC上的癌症生物标志物的存在。可以检测和分析所捕获的CTC合成细胞外基质分子(例如胶原蛋白和糖蛋白)。来自患者的所捕获的CTC的特征可被用于确定患者的转移状态、疾病进展和治疗有效性。
如本文所用的术语“约”当涉及可测量的值(如量、百分比等)时，意指涵盖与指定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化是合适的。
实施例1.使用无标志物碳纳米管海绵高效捕获循环肿瘤细胞
外周血中循环肿瘤细胞(CTC)的鉴定对判断肿瘤患者转移的风险具有重要意义。为了从少量外周血中捕获CTC，设计了一种基于3D碳纳米管(CNT)海绵的新的CTC捕获芯片。在没有肿瘤特异性分子的情况下，该CTC捕获芯片可以在60分钟内从1ml外周血中高效地捕获CTC。所捕获的CTC可以从CNT海绵上分离并且在长期体外细胞培养中保持活力。所捕获的CTC显示出在CNT海绵上的高结合亲和力和细胞外基质(ECM)的积极合成。这种基于3D CNT海绵的CTC捕获芯片是下一代无标志物CTC分离装置的理想候选者。
材料和方法
受ECM(其是转移小生境的关键成分并且对CTC具有突出的结合亲和力)的天然结构的启发，3D CNT海绵被用于模拟肿瘤细胞小生境并且从外周血捕获CTC。这种考虑是基于基于天然ECM的结缔组织的相似结构和机械行为(图1a)。在图1b中阐明了该CTC分离技术的过程，其包括CTC捕获芯片的制造和CTC捕获过程。通过化学气相沉积(CVD)方法制造3D CNT海绵，然后将CNT海绵嵌入载玻片中以用作捕获芯片。除临床样品外，将各种密度的肿瘤细胞加标至去除血浆之后的新鲜人血液样品中。给予细胞15至60分钟以附着于芯片表面。然后，翻转芯片，使得未附着的细胞通过重力被释放回到培养基中(图1c)。
CNT海绵的制造
使用二茂铁和1,2-二氯苯为催化剂前体和碳源，通过化学气相沉积(CVD)方法合成了CNT海绵。将二茂铁粉末溶解在二氯苯中，然后通过注射泵连续注入(0.13ml/min)电阻炉中的2英寸石英管中。反应温度为860℃。Ar和H2的混合物分别以2000ml/min和300ml/min的速率流动。将石英片置于反应区中作为生长基片。在CVD过程之后从石英基片收集海绵状产物。
将CNT海绵在5％ HCl中处理3天以去除催化剂并保持在DI水中。在使用之前，将海绵在高压灭菌器中灭菌以降低细胞培养物中污染物的风险。使用活组织检查打孔器从大块CNT海绵中打出直径为1.5mm的圆柱形样品，并将其嵌入到具有预钻孔的一块玻璃中，以便在以下实验中容易操作。
细胞培养物
除非另有说明，组织培养试剂购自Sigma-Aldrich(圣路易,MO)。MDA-MB-231细胞系购自Sigma-Aldrich，并在补充有15％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺溶液的L-15培养基(Leibovitz)中培养。NCI-H322细胞购自Sigma-Aldrich，并在补充有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺溶液的RPMI-1640培养基中培养。
对于在陪替氏培养皿中的2D细胞培养，当陪替氏培养皿充满80％时，用0.25％的胰蛋白酶(Gibco)进行亚传代，并将接种密度保持在～3×104个细胞/cm2。对于悬浮培养，根据实验设计制备细胞密度(例如105个细胞/ml)。将细胞悬浮培养基转移到旋转瓶中(ChemGlass,CLS-1410-25)，将其置于细胞培养培养箱(ThermoFisher)中的60rpm旋转速度的磁力搅拌器(IKA,微型MR)上，以。亚传代后的细胞可以在24小时内完全恢复。
患者血液样品
在美国特拉华州纽瓦克市的Christiana医疗卫生系统的机构审查委员会(theinstitutional review board of Christiana Care Health System,Newark,Delaware,U.S)的监督下，根据批准的方案获得患者血液样品。在样品收集时，从任一患者获得知情签署的同意书。样品被去识别化，并且去除了所有受保护的健康信息和患者识别码。在递送后立即处理血样，包括血浆去除和RBC裂解。将残余血液内容物(理想地包括白细胞和可能的CTC)滴到嵌入有CNT海绵(作为CTC捕获芯片)的1.5ml圆锥形小瓶中。60分钟后，轻轻洗涤CNT海绵表面以除去未附着的细胞。
肿瘤细胞加标血液样品
可以从美国特拉华州纽瓦克市的特拉华大学(the University of Delaware,Newark,Delaware,U.S)获得使用去识别化的人血液样品的许可。去识别化的新鲜人血液样品是购买的(Zen-Bio,U.S.)。通过在2000g下离心血液10分钟去除血浆。然后将癌细胞(MDA-MB-231和NCI-H322)以设计的浓度加标至无血浆的细胞悬浮液(RPMI 1640,Sigma-Aldrich)中。
细胞标记
为了测量癌细胞移动性，使用活细胞示踪剂(ThermoFisher CellTrackerTM RedCMTPX)在设计的材料表面上对完全附着(对于玻璃表面为4-6小时，对于CNT海绵表面为1小时)后细胞染色。为了使用免疫荧光成像研究细胞形态，将细胞骨架中的F-肌动蛋白用鬼笔环肽(Santa Cruz，CruzFluorTM 488缀合物)染色，并将细胞核用DAPI(Santa Cruz)染色。
对于癌细胞的免疫荧光标记，使用小鼠抗人细胞角蛋白8单克隆抗体和抗小鼠IgG第二抗体(R&D system)处理甲醛固定的细胞。，在通过使用小鼠抗人EpCAM/TROP-1单克隆抗体(R&D system)的第一抗体鉴定EpCAM中采用类似的方案。细胞角蛋白和EpCAM都是癌细胞上的独特标志物。为了鉴定白血细胞，使用小鼠抗人CD45单克隆抗体。第二抗体的选择取决于最终图像中的颜色组合，并且通常采用658nm(红色)和574nm(绿色)的发射波长用于分离目的，同时与DAPI(蓝色核染色)共同使用。
细胞移动性的延时成像
在设计的材料表面上接种24小时后，如上所述用活细胞示踪剂(CMTPX，ThermoFisher)对MDA-MB-231细胞染色。Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜成像系统被用于记录活细胞的运动。在延时模式下，每两分钟记录细胞的荧光图像，持续60分钟。在获得延时图像之后，使用ImageJ(1)中的TrackMate来分配细胞并示踪细胞的运动。
细胞捕获实验
在培养基中以104个细胞/ml的密度制备MDA-MB-231和NCI-H322细胞，并进行如上所述的悬浮培养。培养24小时后，将细胞悬浮培养基小心地注射到具有CNT海绵样品或平板载玻片(具有纤连蛋白覆盖层)的12孔细胞培养板(Corning)中。用2ml细胞悬浮培养基填充每个培养孔，其中每1mm2面积分布～100个细胞。选择15、30、45和60分钟的时间点以测试CNT海绵和纤连蛋白包被的载玻片的时间敏感性。在每个时间点之后，将样品翻转，使得未附着的细胞将通过重力从材料表面落回悬浮培养基中。然后，在Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜成像系统上计数前，将样品转移到新鲜培养基中并再培养24小时。为了确保细胞计数的准确性，使用DAPI对CTC的细胞核进行染色。通过使用10×物镜，成像面积为0.49mm2(700μm×700μm)。为了统计可靠性的目的，用三个不同的样品重复每个实验。
细胞存活力研究
将具有捕获的CTC的CNT海绵或载玻片在培养基中培养长达一周。在第1、3和7天，检查CTC的存活力。将细胞-CNT海绵样品通过与含有0.4μL钙黄绿素-AM/13μL EthD-1(ThermoFisher，活的/死的存活力/细胞毒性试剂盒[L-3224])的1.0mL的PBS在室温孵育30分钟来染色。将Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜成像系统用于获得活细胞和死细胞的图像。
细胞形态的SEM表征
培养一段设计时间后，将细胞在4％甲醛和3％戊二醛溶液中固定过夜。在固定后，将浓度为25％、50％、75％和100％的乙醇溶液(在DI水中)依次施加到样品上，每次15分钟，并再重复最后的100％乙醇处理一次。然后，将浓度为25％、50％、75％和100％的在100％乙醇中的六甲基二硅氮烷(Alfa Aesar)逐渐施加到样品，同时还重复100％六甲基二硅氮烷处理。将样品在化学通风橱中干燥过夜。在金属溅射之后，使用在3kV和10μA下操作的JEOLJSM-7400F场发射扫描电子显微镜来检查材料表面上的细胞。
CNT刚度的机械测试(在细胞培养基中)
通过无限制压缩测试测量3D CNT海绵的机械刚度。测量每个圆柱形3D CNT海绵样品的初始厚度，作为在5g皮重负荷下的上和下装载压板之间的距离。在测试期间，以2μm/s的恒定速度向CNT海绵施加20％应变。在反作用力达到平衡状态后，由记录的力确定样品的杨格模量。在细胞培养基(RMPI 1640培养基+10％ FBS+2mML-谷氨酰胺)中进行机械测试以测量CTC所感知的样品刚度。
GAG和胶原蛋白合成的表征
使用生物正交化学技术荧光标记新合成的GAG或胶原蛋白分子。在亚传代后24小时恢复后，使用点击化学技术荧光标记CTC样品(在玻璃和CNT海绵上)。在该实验中使用非天然氨基酸L-叠氮基高丙氨酸(AHA，ThermoFisher)和四酰基化的N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(Ac4GalNAz-GAL，ThermoFisher)。在点击反应中使用MB488。使用Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜获得培养24小时后的标记结果图像。
荧光强度测量
荧光成像后，用木瓜蛋白酶(ThermoFisher)消化样品，以便通过读取消化溶液的荧光强度来示踪新的GAG或胶原蛋白内容物的量。通过使用酶标仪(Gemini EM,MolecularDevices)读取溶液的荧光强度(在515nm)来测量条件培养基中ECM片段的浓度。
统计分析：
进行单向方差分析以比较来自两个不同组的结果，并且在每个图像中标出相应的显著性水平(P值)。采用F检验策略对3组进行比较，统计结果提供了显著性水平(F值)。
结果与讨论
选择具有不同基因型的两种常见肿瘤细胞系(乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和肺癌细胞(NCI-H322))作为体外捕获靶标。我们的捕获策略被设计为对癌症类型是非选择性的，这与CTC的独特免疫化学特性无关。因此，没有生物标志物或配体被用于处理3D CNT海绵。使用两种癌细胞系研究捕获效率、准确性和所捕获的细胞的表型。收集来自三阴性乳腺癌(TNBC)患者的外周血样品并测试以验证该方法在临床应用中的可行性。
CTC捕获效率
首先，制备密度为105个细胞/ml的乳腺癌细胞或肺癌细胞的细胞悬浮培养基，并使用旋转瓶悬浮培养24小时。这种高浓度不对应于患者的生理状况，并且仅被设计用于研究捕获效率，其中大的CTC数可以提供更高的统计可靠性。然后将细胞悬浮培养基滴到海绵上并留在捕获芯片上15、30、45或60分钟。然后，翻转海绵并用细胞培养基轻轻洗涤。为了区分CNT海绵的CTC捕获能力，测试包被有纤连蛋白的玻璃基底作为对照组(倍称为玻璃f)。为了可视化和计数所捕获的细胞，用DAPI(蓝色)对细胞核染色。在激光共聚焦显微镜(10×物镜，Zeiss LSM 510)上拍摄所捕获的细胞的荧光图像，并呈现在图2a和2b中。3D CNT海绵对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和肺癌细胞(NCI-H322)均敏感，并且仅在15分钟内由海绵捕获显著量的CTC，而在玻璃f载玻片上没有发现CTC。通过将所捕获的CTC的数目(nc)除以每个图像范围的细胞的接种数目(nt)来计算捕获百分比(pc)。在30分钟内，CNT海绵可以从悬浮培养基捕获50-70％的CTC，而玻璃f载玻片仍然几乎不捕获任何CTC。当接种时间为45分钟或更长时，可以在玻璃f载玻片上观察到有限数量的CTC。对于两种类型的肿瘤细胞和所有接种时间，CNT海绵所捕获的CTC显著多于玻璃f载玻片所捕获的CTC(n＝3，P<0.001)。
购买(ZenBio，美国)、健康成人(52岁，男性，西班牙)的去识别化的新鲜人血样。在去除血浆和红细胞裂解后，如图1b中所示，在细胞培养基中稀释白细胞团。将肿瘤细胞(MDA-MB-231或NCI-H322)以103个细胞/ml的密度(其在生理水平内)加标至血细胞悬浮液中。将具有混合细胞的培养基滴到CNT捕获芯片上，然后是60分钟的接种时间。按照建立的染色方案，对所捕获的细胞进行细胞角蛋白(CK)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)表达的染色，这表明恶性肿瘤。DAPI被用于代表细胞核，而CK和EpCAM用与荧光剂缀合的IgG标记。在几乎所有捕获的细胞上，都可以发现CK和EpCAM(图2C)，证明它们是肿瘤细胞而不是血细胞。
将具有捕获的细胞的CNT芯片在实验室中培养额外的7天，然后通过活的/死的染色试剂盒检测细胞存活力。大多数所捕获的CTC(约80％)在7天后仍保持活力，这允许根据特定临床或研究要求对所捕获的CTC进行进一步的免疫细胞化学研究。
临床样品验证
还测试了临床样品以验证该CTC捕获芯片在临床应用中的可行性。在美国特拉华州纽瓦克市的Christiana医疗卫生系统的机构审查委员会的监督下，在获得知情同意书的情况下获得患者样品。利用来自TNBC患者的两个血液样品。患者I(T2BN1M0)的病理学报告显示被涉及的区域淋巴结，而患者II(T1CN0M0)具有较小的肿瘤大小并且没有受影响淋巴结。在图3a中提供了从临床样品中捕获CTC的详细步骤。在红细胞裂解后，允许细胞(包括白细胞和可能的CTC)附着在CTC捕获芯片上60分钟。EpCAM和细胞核被单独染色，并且在图3b-c中提供了免疫荧光图像。可以发现，可以从患者I捕获许多CTC(295EpCAM阳性细胞，图3d)，而在患者II的血液中没有发现CTC，这与病理学报告的结论一致。
通过3D CNT海绵捕获CTC的生物物理学
将具有肿瘤细胞的CNT海绵和玻璃f载玻片处理用于SEM表征(图4a)。附着的肿瘤细胞的形态主要可分为两类：细长的和圆形的形状。在玻璃f载玻片上的乳腺癌细胞和肺癌细胞都稳定在细长的形态，而CNT海绵的大多数肿瘤细胞最终具有圆形形态。细长的和圆形的形态分别对应于不同的肿瘤侵袭模式(间充质型运动和变形运动)。CTC的圆形形状或变形运动表明由结缔组织细胞引起的肿瘤的高机率，导致高转移率，这与我们的主要假设(即CNT海绵为CTC的发展提供了模拟结缔组织环境)一致。在图4b中提供了CTC边缘和基底材料(CNT海绵和玻璃f)之间的详细相互作用。对于乳腺癌细胞和肺癌细胞，细胞体或质膜的边缘包含多个CNT，而在包被有纤连蛋白的载玻片上不能实现这种相互作用。与健康细胞相比，肿瘤细胞的侵袭是转移的基本特征。在圆形肿瘤细胞的边界附近的CNT海绵上存在显著的分裂(图4b，在细胞周围标记为灰色)，这反映了肿瘤细胞和CNT海绵之间的强相互作用。相反，在玻璃f载玻片上，细胞的扩散主要通过重塑F-肌动蛋白网络来实现，并且细胞通过F-肌动蛋白的极化突起来移动，这与CNT海绵上的CTC(圆形的形状)的侵袭性表型不同。
研究了CTC的移动性以评价细胞与CNT海绵之间的结合亲和力，其中活细胞示踪技术与延时激光共聚焦成像方法相结合来示踪细胞的运动。将乳腺癌细胞接种在CNT海绵上并用长期细胞示踪剂标记。在细胞接种后48小时记录细胞的运动。使用共焦显微镜每两分钟记录一小时的细胞延时。使用ImageJ中的TrackMate插件获得细胞运动的统计。在图5a中总结了细胞运动的统计结果。与载玻片上的CTC相比，CNT海绵上的CTC的最终位移显著减少。为了进一步验证结合强度，使用0.25％胰蛋白酶培养基将所捕获的CTC从基底(CNT海绵和玻璃f载玻片)解离10分钟。图5b显示了在胰蛋白酶消化后CNT海绵和玻璃f载玻片上的残余细胞。尽管玻璃f载玻片上不存在细胞，但大部分细胞保留在CNT海绵上，证实CNT海绵和CTC之间的强结合亲和力不会被胰蛋白酶破坏。
在CNT海绵上的CTC的代谢活性提供了关于该方法的主要假设的CNT海绵是否有利于肿瘤细胞生长的重要信息。我们已经开发了一种基于生物正交点击化学的技术以通过细胞可视化新合成的ECM(胶原蛋白和糖蛋白分子)。用无铜荧光染料(DBCO MB488)标记新合成的蛋白质，并用长期活细胞示踪剂(CMTPX)示踪细胞。如图5c中所示，与载玻片上的那些ECM的合成相比，在CNT海绵上显著促进了肿瘤细胞的ECM的合成。用蛋白酶(木瓜蛋白酶)进一步消化新合成的ECM，并获得消化溶液的荧光强度以定量ECM的合成。胶原蛋白和糖蛋白的合成都在3DCNT海绵所捕获的CTC中被促进(图5d)，表明CTC可以制造出有利的微环境以存活并侵入CNT海绵。CTC新ECM的合成可作为肿瘤细胞鉴定的额外证据。由于正常血细胞不具有动物体内ECM制造的任务，因此侵袭性ECM合成可作为所捕获的细胞是肿瘤细胞而不是血细胞的一条另外的证据。
结论和评论
总之，为了促进CTC相关诊断技术在转移性疾病中的应用，我们设计了CTC捕获芯片，其使用不依赖于肿瘤特异性标志物的三维CNT块材料(3D CNT海绵)，并且仅使用少量外周血。该CTC检测工具的可行性、效率、稳定性和准确性已通过肿瘤细胞加标的血液样品和临床样品进行了系统的研究。20-30％的CTC在仅15分钟内被快速捕获，在60分钟内产率达到70-80-90％。所捕获的CTC的存活力和表型可被保存用于进一步的病理学分析。通过提供理想的微环境来实现CNT海绵材料对CTC的快速和可靠的捕获，在该微环境中CTC可以附着和发展。此外，CNT海绵可刺激CTC合成ECM，这不仅证实了我们的主要假设，而且提供了鉴定所捕获的细胞为恶性肿瘤的另外的证据。这种基于3D CNT海绵的CTC捕获芯片代表了下一代无标志物CTC分离装置的理想候选者。
本文所引用的所有文献、书籍、手册、论文、专利、公开的专利申请、指南、摘要和/或其它参考文献通过引用整体并入本文。考虑到本文所公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本说明书和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求书指示。

Claims (14)

1.在不使用癌症生物标志物的情况下捕获来自对象的循环肿瘤细胞的方法，其包括使测试样品与碳纳米管海绵接触不超过60分钟，从而使所述循环肿瘤细胞被所述碳纳米管海绵捕获，其中所述测试样品包含来自对象的去除血浆并裂解红细胞之后的不超过2ml外周血的细胞，其中所述测试样品中的细胞包含来自所述对象的循环肿瘤细胞，其中所述碳纳米管海绵不含特异性针对癌症生物标志物的试剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述循环肿瘤细胞不具有所述癌症生物标志物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症生物标志物是特异性针对肿瘤细胞的。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述对象患有肿瘤。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述肿瘤选自：乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症生物标志物选自：EpCAM、细胞角蛋白、CD45和HER2。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述测试样品包含200-1000个循环肿瘤细胞/ml来自所述对象的外周血。
8.如权利要求1或2所述的方法，其包括使所述测试样品与所述碳纳米管海绵接触不超过30分钟。
9.如权利要求1或2所述的方法，其包括使所述测试样品与所述碳纳米管海绵接触不超过15分钟。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述测试样品中至少20％的所述循环肿瘤细胞被所述碳纳米管海绵捕获。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中在细胞培养物中，所捕获的循环肿瘤细胞中的至少一个在7天后仍保持活力。
12.如权利要求1或2所述的方法，其还包括将所捕获的循环肿瘤细胞与所述碳纳米管海绵分离。
13.如权利要求1或2所述的方法，其还包括在培养基中孵育所捕获的循环肿瘤细胞。
14.如权利要求1或2所述的方法，其还包括表征所捕获的循环肿瘤细胞。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102527353A (zh) * 2011-12-21 2012-07-04 深圳市老年医学研究所 一种用于富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球制备
WO2014133467A1 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Agency For Science, Technology And Research Methods and biomarkers for the detection of circulating tumor cells
CN104815360A (zh) * 2015-04-14 2015-08-05 复旦大学 循环肿瘤细胞过滤治疗仪
CN105102978A (zh) * 2013-02-02 2015-11-25 杜克大学 分离循环肿瘤细胞的方法
CN106148315A (zh) * 2015-04-14 2016-11-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种基于壳聚糖纳米粒子的ctc捕获与纯化基底及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8709801B2 (en) * 2009-12-29 2014-04-29 Taipei Medical University Kit and method for the capture of tumor cells
US9926194B2 (en) * 2010-03-11 2018-03-27 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Method and device for detecting cellular targets in bodily sources using carbon nanotube thin film
TW201315679A (zh) * 2011-10-07 2013-04-16 Nat Univ Tsing Hua 奈米碳管海綿的製作方法
CN105198039B (zh) * 2015-09-29 2018-06-15 北京大学 利用碳纳米管海绵电控驱油技术回收油污的方法
US11112410B2 (en) * 2016-04-13 2021-09-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for capturing, isolation, and targeting of circulating tumor cells and diagnostic and therapeutic applications thereof
US11002737B2 (en) * 2016-09-29 2021-05-11 Worcester Polytechnic Institute Micro-array devices for capturing cells in blood and methods of their use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102527353A (zh) * 2011-12-21 2012-07-04 深圳市老年医学研究所 一种用于富集循环肿瘤细胞的纳米磁性免疫微球制备
CN105102978A (zh) * 2013-02-02 2015-11-25 杜克大学 分离循环肿瘤细胞的方法
WO2014133467A1 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Agency For Science, Technology And Research Methods and biomarkers for the detection of circulating tumor cells
CN104815360A (zh) * 2015-04-14 2015-08-05 复旦大学 循环肿瘤细胞过滤治疗仪
CN106148315A (zh) * 2015-04-14 2016-11-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种基于壳聚糖纳米粒子的ctc捕获与纯化基底及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
循环肿瘤细胞富集和检测的纳米技术;白林灵、杨延莲、王琛;生物化学与生物物理进展;第40卷(第10期);955-962 *

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