JP2017075129A

JP2017075129A - Ｔｒｐｖ１活性抑制剤

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Publication number: JP2017075129A
Application number: JP2015204807A
Authority: JP
Inventors: 雅之高石; Masayuki Takaishi; 郁尚藤田; Ikunao Fujita
Original assignee: Mandom Corp
Current assignee: Mandom Corp
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2017-04-20
Anticipated expiration: 2035-10-16
Also published as: JP6948762B2

Abstract

【課題】被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを簡便な操作で、かつ高い再現性で評価する被験物質の評価方法を提供すること。
【解決手段】ＴＲＰＶ１発現細胞を、ＴＲＰＶ１アゴニストと被験物質とメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料それぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＲＰＶ１活性抑制剤に関する。

ＴＲＰＶ１は、カプサイシン、熱などに感受性を有するイオンチャネルである（例えば、非特許文献１参照）。また、ＴＲＰＶ１の活性化は、炎症性疼痛と関連していることが知られている。したがって、炎症性疼痛の鎮痛剤として、ＴＲＰＶ１の活性を阻害する物質の臨床治験が進められている。しかし、従来のＴＲＰＶ１活性阻害剤には熱に対する感覚の低下または発熱をもたらす傾向があることから、より臨床応用に適したＴＲＰＶ１活性阻害剤が求められている。

ところで、メントールは、鎮痛作用を有していることが知られているが、その詳細なメカニズムは明らかになっていなかった。また、メントールは、冷感センサーであるＴＲＰＭ８および鎮痛に関与していることから、メントールの鎮痛効果がＴＲＰＭ８を活性化することによるという報告や、メントールの鎮痛効果がオピオイド受容体を活性化することによるという報告などがあるが、どちらもメントールの鎮痛効果を説明するには不十分であった（例えば、非特許文献１参照）。

中川貴之、「痛みの受容機構と新規鎮痛薬創製の可能性」、生化学、公益社団法人日本生化学会、平成２５年７月２５日、第８５巻、第７号、ｐ．５６１−５６５

したがって、メントールによる鎮痛のメカニズムを明らかにし、当該鎮痛のメカニズムに基づき、前記メントールの鎮痛効果を制御することにより、効率的に鎮痛効果を付与ことが可能になると考えられる。また、本発明者らは、現時点では、メントールとＴＲＰＶ１の活性の抑制との関連性を具体的に記載した文献を発見していない。さらに、メントール単独での鎮痛効果は、十分ではないことから、より優れた鎮痛効果を発揮する処方の開発が求められている。

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＶ１の活性を効果的に抑制することができるＴＲＰＶ１活性抑制剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）ＴＲＰＶ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質とを含有することを特徴とするＴＲＰＶ１活性抑制剤、
（２）前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質がノニオン界面活性剤である前記（１）に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤、
（３）前記ノニオン界面活性剤がポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤である前記（２）に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤、ならびに
（４）前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤が、炭素数１〜６のオキシアルキレン基の平均付加モル数が１０〜５０であるノニオン界面活性剤である前記（３）に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤
に関する。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、ＴＲＰＶ１の活性を効果的に抑制することができるという優れた効果を奏する。

試験例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と活性との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と抑制比率との関係を調べた結果を示すグラフである。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、ＴＲＰＶ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質とを含有することを特徴とする。

本発明者らは、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制する物質について鋭意研究を重ねたところ、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制しないと考えられていたメントールが、意外なことに、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制すること見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質とを含有しているので、ＴＲＰＶ１の活性を効果的に抑制することができる。

通常、鎮痛剤としてメントールを単独で用いた場合、少量では十分な鎮痛効果を得にくい。しかし、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、当該メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質とを含有しているので、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用が増幅されている。

前記ＴＲＰＶ１は、一過性受容体電位チャネルの１つである。前記ＴＲＰＶ１の活性としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤におけるメントールの含有量は、適用対象におけるＴＲＰＶ１の局在部位にＴＲＰＶ１活性抑制剤を送達させる際におけるＴＲＰＶ１活性抑制剤の拡散などを考慮し、適宜設定することが好ましい。本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤におけるメントールの含有量は、ＴＲＰＶ１活性抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、さらに好ましくは１質量％以上であり、メントールを十分に溶解させる観点から、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、さらに好ましくは３質量％以下である。

前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質は、前記メントールとの併用により、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用に対する増幅作用を有する物質である。前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。

前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質の具体例としては、ノニオン界面活性剤などの界面活性剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの物質のなかでは、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させることができることから、界面活性剤が好ましく、ノニオン界面活性剤がより好ましい。

前記ノニオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油などのポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤；グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸アルキロールアミドなどのポリオキシアルキレン鎖を有しないノニオン界面活性剤などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。これらのノニオン界面活性剤のなかでは、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させる観点から、ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤が好ましい。ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤は、ＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していないか、あるいはＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していたとしても単独ではＴＲＰＶ１の活性化に起因する状態を緩和するのに十分に抑制することができない程度のＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していない物質である。しかし、メントールと前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤とを併用することにより、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する状態を緩和するのに十分なＴＲＰＶ１活性抑制作用を得ることができる。

前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤におけるオキシアルキレン基の炭素数は、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させる観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上であり、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤が水などの水系溶媒を含有する場合において、当該水系溶媒に対する溶解性を確保する観点から、好ましくは６以下、より好ましくは５以下である。オキシアルキレン基としては、例えば、オキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシｎ−プロピレン基、オキシイソプロピレン基、オキシｎ−ブチレン基、オキシイソブチレン基、オキシｓｅｃ−ブチレン基、オキシｔｅｒｔ−ブチレン基、オキシｎ−ペンチレン基、オキシイソペンチレン基、オキシｔｅｒｔ−ペンチレン基、オキシｎ−ヘキシレン基、オキシイソへキシレン基、オキシジメチルブチレン基、オキシシクロへキシレン基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記ポリオキシアルキレン鎖は、１種類のオキシアルキレン基を有していてもよく、２種類以上のオキシアルキレン基を有していてもよい。前記ポリオキシアルキレン鎖が２種類以上のオキシアルキレン基を有する場合、前記ポリオキシアルキレン鎖は、２種類以上のオキシアルキレン基がランダム付加したポリオキシアルキレン鎖、２種類以上のオキシアルキレン基がブロック付加したポリオキシアルキレン鎖および２種類以上のオキシアルキレン基が交互付加したポリオキシアルキレン鎖のいずれであってもよい。

前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤におけるオキシアルキレン基の平均付加モル数は、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させる観点から、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上であり、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤が水などの溶媒を含む場合において、当該溶媒に対する溶解性を確保する観点から、好ましくは５０以下、より好ましくは４０以下である。

前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤のなかでも、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させる観点から、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。

前記ポリオキシアルキレンアルキルエーテルは、好ましくはオキシアルキレン基の炭素数１〜６（より好ましくは、２または３）、前記オキシアルキレン基の平均付加モル数が２０〜４０およびアルキル基の炭素数が１０〜２０（より好ましくは、１０〜１６）であるポリオキシアルキレンアルキルエーテルである。前記ポリオキシアルキレンアルキルエーテルのなかでは、特に、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルが好ましい。

前記ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしては、例えば、オキシエチレン基の平均付加モル数が３０であり、かつオキシプロピレン基の平均付加モル数が６であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が２０であり、かつオキシプロピレン基の平均付加モル数が６であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル；オキシエチレン基の平均付加モル数が４０であポリオキシエチレンセチルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルなどのポリオキシエチレンセチルエーテル
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとして、１種のみを用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤における前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質の濃度は、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤におけるメントールの濃度、前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤におけるメントールの濃度、前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤において、メントール１００質量部あたりの前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質の量は、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用をより向上させる観点から、好ましくは１０質量部以上、より好ましくは３０質量部以上であり、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤が水などの溶媒を含む場合において、当該溶媒に対する溶解性を確保する観点から、好ましくは１００質量部以下、より好ましくは５０質量部以下である。

メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用に対する増幅作用は、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料それぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、評価することができる。

前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、例えば、内因性ＴＲＰＶ１を発現している感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などの野生型の細胞であってもよく、ＴＲＰＶ１をコードする核酸として配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸が発現可能にＨＥＫ２９３細胞に導入された外因性ＴＲＰＶ１発現細胞であってもよい。配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位の塩基配列にコードされている。

前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化および前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、例えば、
ａ）ＦＵＲＡ２−ＡＭをＴＲＰＶ１発現細胞に導入するステップ、
ｂ）前記ステップａ）でＦＵＲＡ２−ＡＭが導入されたＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオンに前記ＦＵＲＡ２−ＡＭを結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を継時的に測定する方法などによって測定することができる。
この場合、前記細胞内カルシウム濃度の変化は、３４０ｎｍにおける蛍光強度および３８０ｎｍにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づいて測定することができる。前記蛍光強度比は、例えば、式（Ｉ）：

に基づいて求めることができる。なお、本明細書において、「蛍光強度_340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度_380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。

前記ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞内では、ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させていないＴＲＰＶ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＶ１を介するＴＲＰＶ１発現細胞外からＴＲＰＶ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が増大する。これに対し、前記ＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させ、かつメントールと接触させていないＴＲＰＶ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＶ１を介するＴＲＰＶ１発現細胞外からＴＲＰＶ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が減少する。メントールと当該メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用に対する増幅作用を有する物質とを併用した場合、ＴＲＰＶ１を介するＴＲＰＶ１発現細胞外からＴＲＰＶ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量がさらに減少する。前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、Δ蛍光強度比_被験物質に基づき測定することができる。前記Δ蛍光強度比_被験物質は、式（ＩＩ）：

に基づいて算出することができる。また、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、Δ蛍光強度比_{メントール}に基づき測定することができる。
前記Δ蛍光強度比_{メントール}は、式（ＩＩＩ）：

に基づいて算出することができる。前記物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用の増幅作用を有することは、Δ蛍光強度比_被験物質およびΔ蛍光強度比_{メントール}に基づいて算出される抑制率_被験物質と抑制率_{メントール}とを比較することによって確認することができる。抑制率_被験物質は、式（ＩＶ）：

に基づいて算出することができる。また、抑制率_{メントール}は、式（Ｖ）：

に基づいて算出することができる。なお、Δ蛍光強度比_{アゴニスト}は、式（ＶＩ）：

に基づいて算出することができる。抑制率_被験物質および抑制率_{メントール}の比較は、例えば、式（ＶＩＩ）：

に基づいて算出される抑制比率を用いて行なうことができる。ここで、前記物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用の増幅作用を有することの判断基準としては、抑制比率が、好ましくは１０５を超え、より好ましくは１２０以上、さらに好ましくは１４０以上であることを用いることができる。

本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、水などの水系溶媒、ｐＨ調整剤、キレート化剤、安定化剤などの他の成分を含有していてもよい。

以上説明したように、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤によれば、ＴＲＰＶ１の活性をより効果的に抑制することができることから、ＴＲＰＶ１の活性化が関与する痛みなどが生じた部位に本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤を適用することにより、より高い鎮痛効果を得ることが期待されるものである。したがって、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、鎮痛作用を有する外用剤、ＴＲＰＶ１の活性化に関連する状態の緩和剤などの開発に用いられることが期待されるものである。

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（製造例１）
ヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔ライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＶ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔ライフテクノロジーズ社製、商品名：ＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔ〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔ライフテクノロジーズ社製、商品名：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。

また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ」ともいう）中において、５×１０^５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。

（製造例２）
メントールをその濃度が５ｍＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、メントール含有試料を得た。

（製造例３）
カプサイシンおよびメントールをカプサイシンの濃度が０．１μＭおよびメントールの濃度が５ｍＭ（０．１質量％）となるように溶媒Ａに溶解させ、カプサイシン−メントール含有試料を得た。
（製造例４）
カプサイシンをその濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕に溶解させ、カプサイシン含有試料を得た。

（実施例１〜４および比較例１〜２）
被験物質とメントールとを、表１および表２に示される濃度となるように混合し、被験試料Ａを得た。また、被験物質とメントールとカプサイシンとを、表３および表４に示される濃度となるように混合し、被験試料Ｂを得た。

なお、前記被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）〔実施例１〕、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）〔実施例２〕、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）〔実施例３〕、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）〔実施例４〕、ポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：１５００）〔比較例１〕およびポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：４００）〔比較例２〕を用いた。

（試験例１）
（１）ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞の調製
製造例１で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭ（ライフテクノロジーズ社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温（２５℃）で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＶ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。

（２）蛍光強度の測定
試験例１（１）で得られたＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の循環定温各チャンバーに入れた。その後、各チャンバー中のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を、溶媒Ａで洗浄した。以下において、循環定温チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＶ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_{３４０ｎｍ}」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_{３８０ｎｍ}」という）を経時的に測定した。

洗浄後のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２で得られたメントール含有試料を循環させた。前記メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を循環させた。前記カプサイシン−メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２２で得られたメントール含有試料を循環させた。前記メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させた。溶媒Ａの循環開始時から１００秒間経過後、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例４で得られたカプサイシン含有試料を５０秒間循環させ、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露した。

また、前記において、製造例２で得られたメントール含有試料を用いる代わりに実施例１〜４および比較例１〜２で得られた被験試料Ａを用いたこと、および製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を用いる代わりに実施例１〜４および比較例１〜２で得られた被験試料Ｂを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、蛍光強度_{３４０ｎｍ}および蛍光強度_{３８０ｎｍ}を経時的に測定した。

（３）活性の算出
実施例１（２）において、製造例４で得られたカプサイシン含有試料を用いてＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度_{３４０ｎｍ}および蛍光強度_{３８０ｎｍ}から、Δ蛍光強度比_{アゴニスト}を算出した。前記Δ蛍光強度比_{アゴニスト}は、式（ＶＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。

また、実施例１（２）において、製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を用いてＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露したときの蛍光強度_{３４０ｎｍ}および蛍光強度_{３８０ｎｍ}から、Δ蛍光強度比_{メントール}を算出した。前記Δ蛍光強度比_{メントール}は、式（ＩＩＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。

算出されたΔ蛍光強度比_{アゴニスト}とΔ蛍光強度比_{メントール}とから、活性_{メントール}を算出した。なお、活性_{メントール}は、式（ＶＩＩＩ）：

に基づいて算出した。

また、実施例１（２）において、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞に実施例１〜４および比較例１〜２で得られた被験試料Ｂを接触させたときの蛍光強度_{３４０ｎｍ}および蛍光強度_{３８０ｎｍ}から、Δ蛍光強度比_被験物質を算出した。前記Δ蛍光強度比_被験物質は、式（ＩＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。

算出されたΔ蛍光強度比_{アゴニスト}とΔ蛍光強度比_被験物質とから、活性_被験物質を算出した。なお、活性_被験物質は、式（ＩＸ）：

に基づいて算出した。

試験例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と活性との関係を調べた結果を図１に示す。図中、レーン１はメントール含有試料（メントールのみ）を用いたときの活性（活性_{メントール}）、レーン２は被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例１で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）、レーン３は被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例２で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）、レーン４はポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）を含む実施例３で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）、レーン５はポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）を含む実施例４で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）、レーン６はポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：１５００）を含む比較例１で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）、レーン７はポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：４００）を含む比較例２で得られた被験試料Ｂを用いたときの活性（活性_被験物質）を示す。

図１に示された結果から、メントール含有試料を用いたときの活性（活性_{メントール}）および被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）〔実施例１〕、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）〔実施例２〕、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）〔実施例３〕およびポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）〔実施例４〕それぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性_被験物質）は、１００％未満であることがわかる。

なお、被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）およびポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）それぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性_被験物質）は、９０％を超えているのに対し、メントール含有試料を用いたときの活性（活性_{メントール}）は、５０％未満であることがわかる。したがって、これらの結果から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）などのポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤は、ほとんどＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していないことが示唆される。これに対し、被験物質としてＰＥＧ１５００およびＰＥＧ４００それぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性_被験物質）は、１００％を超えていることから、ＴＲＰＶ１活性化作用を有していることがわかる。

（４）抑制比率の算出
試験例１（３）で算出されたΔ蛍光強度比_{アゴニスト}およびΔ蛍光強度比_被験物質を用い、抑制率_被験物質を算出した。抑制率_被験物質は、式（ＩＶ）に基づいて算出した。また、試験例１（３）で算出されたΔ蛍光強度比_{アゴニスト}およびΔ蛍光強度比_{メントール}を用い、抑制率_{メントール}を算出した。抑制率_{メントール}は、式（Ｖ）に基づいて算出した。算出された抑制率_被験物質および抑制率_{メントール}を用い、抑制比率を算出した。抑制比率は、式（ＶＩＩ）に基づいて算出した。

試験例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と抑制比率との関係を調べた結果を図２に示す。図中、レーン１はメントール含有試料（メントールのみ）を用いたときの抑制比率、レーン２は被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例１で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率、レーン３は被験物質としてポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例２で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率、レーン４はポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）を含む実施例３で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率、レーン５はポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）を含む実施例４で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率、レーン６はポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：１５００）を含む比較例１で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率、レーン７はポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数：４００）を含む比較例２で得られた被験試料Ｂを用いたときの抑制比率を示す。

図２に示された結果から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例１で得られた被験試料Ｂ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）を含む実施例２で得られた被験試料Ｂ、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）を含む実施例３で得られた被験試料Ｂおよびポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）を含む実施例４で得られた被験試料Ｂそれぞれを用いたときの抑制比率は、１０５を超えているがわかる。これらの結果から、メントールと、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）などのポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤とを含有するＴＲＰＶ１活性抑制剤は、ＴＲＰＶ１活性を効果的に抑制することができることがわかる。

なお、図１に示された結果から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）などのポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤は、ほとんどＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していないことが示唆されている。これらの結果から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：３０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０およびオキシプロピレン基の平均付加モル数：６）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：４０）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン基の平均付加モル数：２０）などのポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤は、それ自体がほとんどＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していないにもかかわらず、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅していることがわかる。これに対し、ＰＥＧ１５００を含む比較例１で得られた被験試料Ｂ、ＰＥＧ４００を含む製造例１７で得られた被験試料Ｂそれぞれを用いたときの抑制比率は、８０未満であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＰＥＧ１５００およびＰＥＧ４００は、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅していないことがわかる。

本試験例においては、被験試料におけるメントールの濃度は、被験物質とメントールとを含有する被験試料をＴＲＰＶ１発現細胞に直接接触させるのに適した濃度に設定されている。しかし、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤をヒトの皮膚などに適用する場合、ＴＲＰＶ１の局在部位、例えば、感覚神経などに、ＴＲＰＶ１の活性を効果的に抑制するのに十分な有効量のＴＲＰＶ１活性抑制剤を送達させるために、ヒトの体内におけるＴＲＰＶ１活性抑制剤の拡散を考慮することが好ましい。したがって、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤におけるメントールの濃度は、本試験例で用いられた被験試料におけるメントールの濃度よりも高いことが好ましいと考えられる。

以上説明したように、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質、例えば、ノニオン界面活性剤などとを含有する本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤によれば、ＴＲＰＶ１の活性を効果的に抑制することができることがわかる。したがって、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤によれば、ＴＲＰＶ１の活性をより効果的に抑制することができることから、ＴＲＰＶ１の活性化が関与する痛みなどが生じた部位に本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤を適用することにより、より高い鎮痛効果を得ることが期待されるものである。したがって、本発明のＴＲＰＶ１活性抑制剤は、鎮痛作用を有する外用剤、ＴＲＰＶ１の活性化に関連する状態の緩和剤などの開発に用いられることが期待されるものである。

Claims

ＴＲＰＶ１の活性を抑制する活性抑制剤であって、ＴＲＰＶ１の活性を抑制するための有効成分としてメントールと、メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質とを含有することを特徴とするＴＲＰＶ１活性抑制剤。
前記メントールが有するＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質がノニオン界面活性剤である請求項１に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤。
前記ノニオン界面活性剤がポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤である請求項２に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤。
前記ポリオキシアルキレン鎖を有するノニオン界面活性剤が、炭素数１〜６のオキシアルキレン基の平均付加モル数が１０〜５０であるノニオン界面活性剤である請求項３に記載のＴＲＰＶ１活性抑制剤。