JP2015522528A - 慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法および医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療のための方法および組成物に関する。
Description
発明の分野:
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法および組成物に関する。
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法および組成物に関する。
発明の背景:
現在アメリカ合衆国およびヨーロッパにおける第4位の死因である慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、2020年までに第3位の死因になるであろう(Mannino and Buist. Lancet 2007; 370: 765-773)。喫煙が最も重大な原因であり、疾患経過の初期における禁煙は肺機能が失われる速度を下げることができる(Wagena et al. Respir Med 2004; 98: 805-815)。禁煙にもかかわらず持続する肺の異常炎症応答(Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082)がCOPDの特徴である。この炎症は、COPDの病理発生および進行に大きな役割を果たすと考えられている(Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082)。しかし、その特徴は十分には定義されていない。
現在アメリカ合衆国およびヨーロッパにおける第4位の死因である慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、2020年までに第3位の死因になるであろう(Mannino and Buist. Lancet 2007; 370: 765-773)。喫煙が最も重大な原因であり、疾患経過の初期における禁煙は肺機能が失われる速度を下げることができる(Wagena et al. Respir Med 2004; 98: 805-815)。禁煙にもかかわらず持続する肺の異常炎症応答(Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082)がCOPDの特徴である。この炎症は、COPDの病理発生および進行に大きな役割を果たすと考えられている(Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082)。しかし、その特徴は十分には定義されていない。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)を予防または治療するために適切な新薬を開発する必要がある。このように、COPDにおける新しい治療ターゲットの特徴づけが極めて望ましい可能性があることが示唆されている。
細胞老化は、組織再生を制限して加齢過程に関与する不可逆的な成長停止状態である(Campisi. Cell 2005; 120: 513-522)。老化は、連続的な細胞複製の間のテロメア短縮に繋がる、または、過酸化水素もしくはタバコ煙などのストレッサーによってトリガーされる場合がある(Campisi. Cell 2005; 120: 513-522)(それぞれ複製老化および早期細胞老化(accelerated senescence))。両方の種類の老化は、ATM/ATR−p53経路およびp16−網膜芽腫タンパク質(pRb)経路の一方または両方を経由して誘導されうる(Kim and Sharpless. Cell 2006; 127: 265-275)。重要なことに、老化細胞は、遺伝子発現に多数の変化を示し、細胞環境に著しく影響しうる多くの炎症性メディエーターの分泌を含む複合表現型(老化関連分泌表現型、SASP)を獲得する(Coppe et al. Annu Rev Pathol 2010; 5: 99-118)。
肺線維芽細胞の老化は、重症COPDの患者で記載されており(Muller et al. Respir Res 2006; 7: 32)、この過程はCOPDの病理発生に関与すると提唱されている。しかし、COPDにおける線維芽細胞老化のメカニズム(Nyunoya et al. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179: 279-287)およびCOPDと炎症との関係に関して入手可能なデータは不足している。
発明の概要:
本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療に使用するための、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療に使用するための、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
発明の詳細な説明:
COPDに果たすPGE2の役割は、本発明者らによってCOPD線維芽細胞、PGE2、ならびにPGE2レセプターであるEP2およびEP4のアンタゴニストを使用して研究された。本発明者らは、COPD線維芽細胞が、非喫煙者対照よりも高いレベルのPGE2、PGE2合成酵素mPGE2およびPGE2レセプターEP4、ならびに喫煙者対照および非喫煙者対照の両方よりも高いレベルのPGE2レセプターEP2を示すことを見いだした。本発明者らは、また、PGE2が線維芽細胞に早期細胞老化および関連炎症を誘導すること、ならびにPGE2の炎症効果が老化誘導に二次的なこと、ならびにこれらの効果が非喫煙者対照線維芽細胞および喫煙者対照線維芽細胞よりもCOPD線維芽細胞において重要であることを実証した。本発明者らは、また、PGE2がマウス肺に老化および関連炎症を誘導することを実証した。このように、PGE2は、COPDにおける老化および炎症の新しいメディエーターである。したがって、PGE2の合成またはPGE2レセプターの遮断は、COPDにおける老化および炎症を克服するための新しい薬理学的アプローチとなる。
COPDに果たすPGE2の役割は、本発明者らによってCOPD線維芽細胞、PGE2、ならびにPGE2レセプターであるEP2およびEP4のアンタゴニストを使用して研究された。本発明者らは、COPD線維芽細胞が、非喫煙者対照よりも高いレベルのPGE2、PGE2合成酵素mPGE2およびPGE2レセプターEP4、ならびに喫煙者対照および非喫煙者対照の両方よりも高いレベルのPGE2レセプターEP2を示すことを見いだした。本発明者らは、また、PGE2が線維芽細胞に早期細胞老化および関連炎症を誘導すること、ならびにPGE2の炎症効果が老化誘導に二次的なこと、ならびにこれらの効果が非喫煙者対照線維芽細胞および喫煙者対照線維芽細胞よりもCOPD線維芽細胞において重要であることを実証した。本発明者らは、また、PGE2がマウス肺に老化および関連炎症を誘導することを実証した。このように、PGE2は、COPDにおける老化および炎症の新しいメディエーターである。したがって、PGE2の合成またはPGE2レセプターの遮断は、COPDにおける老化および炎症を克服するための新しい薬理学的アプローチとなる。
治療方法および使用
したがって、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療に使用するための、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
したがって、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療に使用するための、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
本明細書に使用される用語「被験者」は、哺乳類を意味する。本発明の好ましい一態様では、本発明による被験者は、COPDに苦しむまたは苦しむリスクのある任意の被験者(好ましくはヒト)を指す。
本発明の方法は、慢性気管支炎(気道閉塞、気腫を伴う、喘息性(閉塞性)、気腫性、);慢性閉塞性(喘息、気管支炎、気管気管支炎);急性下気道感染を伴う慢性閉塞性肺疾患;急性増悪を伴う慢性閉塞性肺疾患;慢性閉塞性肺疾患(慢性気管支炎:喘息性(閉塞性)NOS、気腫性NOS、閉塞性NOS);慢性閉塞性肺疾患(慢性閉塞性:気道疾患NOS、肺疾患NOS)の群より選択される、世界保健機関のCOPD分類(the World Health Organisation Classification of COPD)で改訂されたような任意の種類のCOPDについて実施できる。
特定の一態様では、本発明による化合物は、COPDでの老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDでの老化および炎症の予防または治療に使用することができる。
本明細書に使用される用語「PGE2」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロスタグランジンE2を指す。
用語「PGE−2レセプター」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、PGE−2レセプターEP1、EP2、EP3およびEP4を指す(Narumiya et al. (1999), Physiol. Rev. 79(4): 1193-226)。
用語「COX−2」および「PTGS2」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、PGE−2前駆体であるPGH2の合成を担うシクロオキシゲナーゼ−2を指す(Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7): 849-865)。
用語「PGES」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロスタグランジンE2シンターゼを表す。用語「PGES」は、ミクロソームプロスタグランジンE2シンターゼ(mPGES−1およびmPGES−2)および細胞質プロスタグランジンE2シンターゼ(cPGES)などの、PGE2合成を担う酵素を指す。
遺伝子または核酸の発現の文脈で使用されるときの用語「発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物(例えばmRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAもしくは任意の他の種類のRNA)か、mRNAの翻訳によって産生されたタンパク質かの場合がある。遺伝子産物には、また、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化およびエディティングのようなプロセスによって修飾されたメッセンジャーRNAと、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、ADP−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質(例えばPGE−2レセプターまたはCOX−2)とが含まれる。
「発現阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害するための生物学的効果を有する天然または合成化合物を指す。
用語「PGE2レセプターアンタゴニスト」は、PGE2レセプターを選択的に遮断または不活性化する化合物を表す。本明細書に使用される用語「選択的に遮断または不活性化する」は、他のサブタイプまたはアイソフォームのPGレセプターファミリーとの相互作用よりもそれぞれ大きな親和性および効力で優先的にPGE2レセプターと結合し、PGE2レセプターを遮断または不活性化する化合物を表す。PGE2レセプターを好むが、部分または完全アンタゴニストとして他のPGレセプターサブタイプも遮断または不活性化しうる化合物が考えられている。「PGE2レセプターアンタゴニスト」は、PGE2と高い親和性および特異性で結合する能力を有する化合物またはPGE2と競合する化合物などの、PGE2レセプターへのPGE2の結合を阻害する化合物にもありうる。典型的には、PGE2レセプターアンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体である。
本発明の一態様では、PGE2レセプターアンタゴニストは、EP1アンタゴニスト、EP2アンタゴニスト、EP3アンタゴニストまたはEP4アンタゴニストより選択される。
本発明の一態様では、PGE2レセプターアンタゴニストには、EP1アンタゴニスト:ONO−8711、SC−19220、AH−6809、SC−51322、ZD−4953、ZD−6416、ZD−6840、国際公開公報第03/084917号に記載のSC−51089;EP2アンタゴニスト:AH6809、PF−04418948および米国特許第11,896,922号、同第11,896,923号、同第12,142,058号、同第12,171,365号に記載の化合物;EP3アンタゴニスト:DG−041(2,3−ジクロロチオフェン−5−スルホン酸、3−[1−(2,4−ジクロロベンジル)−5−フルオロ−3−メチル−1H−インドール−7−イル]アクリロイルアミド)(Heptinstall et al. (2008), Platelets, 19(8): 605-613);ならびにEP4アンタゴニスト:GW627368X、AH23848B、L−161982、AH22921X、EP4RA、ω−置換プロスタグランジンE誘導体、5−チア−プロスタグランジンE誘導体、ONO−AE3−208(4−{4−シアノ−2−[2−(4−フルオロナフタレン−1−イル)プロピオニルアミノ]フェニル}酪酸)、米国特許第10,545,478号、同第12,752,179号、国際特許公報である国際公開公報第00/15608号、国際公開公報第01/42281号、国際公開公報第00/18744号、国際公開公報第00/03980号、国際公開公報第01/10426号、国際公開公報第00/21532号、国際公開公報第00/18405号、国際公開公報第01/72302号に記載のペプチドおよび化合物(Fukuda et al. (2007), Acta Obstet. Gynecol. Scand. 86(11): 1297-302)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一態様では、PGE2レセプターアンタゴニストは、PGE2結合タンパク質(米国特許第12,499,646号)、プロスタグランジンアナログ、または、米国特許第3,749,776号、同第4,004,027号、同第5,449,673号、同第5,393,747号に記載の化合物より選択することができる。
本発明のPGE2レセプターアンタゴニストは、PGE2またはPGE2レセプターに対する抗体または抗体フラグメントからなる場合がある。
PGE2に対する抗体の例は、19C9、4F10、15F10、K1B、K7H、K3A、L11、L21、2B5−7.0、2B5−8.0もしくは2B5−9.0、または、これらの変異体を含むが、これらに限定されない。一態様では、変異体は、米国特許第12,499,646号記載のHu2B5.P1またはHu2B5.P2などのヒト化変異体である。
用語「COX−2阻害剤」は、COX−2の効果を阻止することができる任意の化合物を指す。本発明のCOX−2阻害剤は、COX−2の活性を阻害または低減する化合物である。
一態様では、本発明のCOX−2阻害剤は、COX−2活性の阻害剤である。該COX−2活性の阻害剤は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体(好ましくは内部抗体(intra-antibody))からなる群より選択することができる。
COX−2活性の阻害剤は、Chung et al. (2005), Expert Opin. Ther. Patents 15(1):9-32によって例示されるように、当技術分野において周知である。
本発明の一態様では、COX−2活性の阻害剤は、ニメスリド、4−ヒドロキシニメスリド、フロスリド、メロキシカム、L475 L337、Vioxx、SC58125、セレコキシブ、NS398、DuP697、インドメタシン、バルデコキシブ、メロキシカム、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、スリンダク、ルミラコキシブ、E−522、NS−398ならびに米国特許第10,545,478号および国際公開公報第04/72037号、国際公開公報第04/72057号に開示された化合物からなる群より選択される。
用語「プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤」は、プロスタグランジンE2シンターゼの効果を阻止することができる任意の化合物を指す。本発明のプロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤は、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害または低減する化合物である。
一態様では、本発明のプロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤は、プロスタグランジンE2シンターゼ活性の阻害剤である。該プロスタグランジンE2シンターゼ活性の阻害剤は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体(好ましくは内部抗体)からなる群より選択することができる。
プロスタグランジンE2シンターゼ活性の阻害剤は、Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7):849-865によって例示されるように、当技術分野において周知である。
本発明の一態様では、プロスタグランジンE2シンターゼ活性の阻害剤は、脂肪酸およびプロスタグランジンアナログ、15−デオキシ−PGJ2、LTC4、U−51605、NS−398、スリンダク、MK−886、MF−63、チエノピロール、ベンゾキサゾール、ナフタレンジスルホンアミド、3−ベンズアミドカルバゾールと、Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7): 849-865に開示された化合物とからなる群より選択される。
別の態様では、本発明のPGE2レセプターアンタゴニスト、COX−2阻害剤またはPGE2シンターゼ阻害剤は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替物に相当する分子の1つのクラスである。アプタマーは、実質的に任意のクラスのターゲット分子を高い親和性および特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C.およびGold L.(1990)に記載のランダム配列ライブラリーの試験管内進化法(SELEX)を経て単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、DNAのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的に化学修飾されたユニーク配列の直鎖オリゴマーである。このクラスの分子の予想される修飾、使用および利点は、Jayasena S.D.(1999)に総説されている。ペプチドアプタマーは、大腸菌チオレドキシンAなどのプラットフォームタンパク質によってディスプレイされるコンフォメーション的に束縛されている抗体可変領域から成り、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーより選択される(Colas et al., 1996)。次に、上記のように本発明の化合物に対するアプタマーを産生した後に、当業者は、PGE2レセプター、COX−2またはPGE2シンターゼを阻害するアプタマーを容易に選択することができる。
一態様では、本発明の化合物は、PGE2レセプターの発現阻害剤、COX−2の発現阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現阻害剤である。
本発明に使用するためのPGE2レセプターの発現阻害剤、COX−2の発現阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づく場合がある。アンチセンスRNA分子と、アンチセンスDNA分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼのmRNAに結合することでタンパク質の翻訳を阻止することによってmRNAの翻訳を直接遮断するように作用するか、または、mRNAの分解を増大させることで細胞中のPGE2レセプター、COX−2もしくはプロスタグランジンE2シンターゼのタンパク質レベル、したがって、活性を減少させるように作用する。例えば、PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼをコードするmRNA転写体配列のユニーク領域に相補的な、少なくとも塩基約15個のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技法によって合成し、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に軽減するためにアンチセンス技法を用いるための方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,566,135号;同第6,566,131号;同第6,365,354号;同第6,410,323号;同第6,107,091号;同第6,046,321号;および同第5,981,732号を参照されたい)。
低分子干渉RNA(siRNA)も、本発明に使用するためのPGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現阻害剤として機能しうる。PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの遺伝子発現は、被験者または細胞を、低分子2本鎖RNA(dsRNA)と、または、低分子2本鎖RNAの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることにより、PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現が特異的に阻害される(すなわちRNA干渉またはRNAi)ことによって低減することができる。配列が公知の遺伝子に適切なdsRNAまたはdsRNAコードベクターを選択するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002);米国特許第6,573,099号および同第6,506,559号;ならびに国際特許公報である国際公開公報第01/36646号、国際公開公報第99/32619号および国際公開公報第01/68836号を参照されたい)。
リボザイムも、本発明に使用するためのPGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現阻害剤として機能しうる。リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素性RNA分子である。リボザイムの作用機作は、相補的ターゲットRNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションに続く、ヌクレオチド鎖内切断を含む。その結果、PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼのmRNA配列のヌクレオチド鎖内切断を特異的および効率的に触媒する改変ヘアピンモチーフ型リボザイム分子または改変ハンマーヘッドモチーフ型リボザイム分子が、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的RNAターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、最初に、典型的には以下の配列、すなわち、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位についてターゲット分子をスキャンすることによって同定される。同定された後に、切断部位を含むターゲット遺伝子領域に対応するリボヌクレオチド約15ないし20個の間の低分子RNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にするおそれのある二次構造などの予測される構造特徴について評価することができる。候補ターゲットの妥当性は、候補ターゲットが相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを達成しやすいことを、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて検査することによっても評価することができる。
PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方は、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアマダイト(phosphoramadite)化学合成などの化学合成のための技法が含まれる。または、アンチセンスRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のin vitroまたはin vivo転写によって産生することができる。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んでいる多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの多様な改変は、細胞内安定性および半減期を増大させる一手段として導入することができる。可能な改変は、分子の5’および/もしくは3’末端にリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、または、オリゴヌクレオチド主鎖内にホスホジエステラーゼ結合よりもホスホロチオエートもしくは2’−O−メチルを使用することを含むが、これらに限定されない。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドsiRNAおよびリボザイムは、単独で、または、ベクターに関連してin vivo送達することができる。「ベクター」は、その最も広い意味で細胞への、好ましくはPGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼを発現している細胞への、アンチセンスオリゴヌクレオチドsiRNAまたはリボザイム核酸の転移を促進することができる任意の媒介物である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じる分解の程度よりも低い分解で、細胞に核酸を輸送する。一般に、本発明に有用なベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドsiRNAまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されている、ウイルスまたは細菌起原の他の媒介物を含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、以下のウイルス:モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルスおよびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス;アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス;SV40型ウイルス;ポリオーマウイルス;エプスタイン−バーウイルス;パピローマウイルス;ヘルペスウイルス;ワクシニアウイルス;ポリオウイルス;およびレトロウイルスなどのRNAウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されない。名前が挙がっていないが当技術分野において公知の他のベクターを容易に採用することができる。
好ましいウイルスベクターは、可欠遺伝子が、関心がもたれる遺伝子により置換されている非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルス(例えばレンチウイルス)が含まれ、レトロウイルスの生活環は、DNAへのゲノムウイルスRNAの逆転写に続く、ホスト細胞DNAへのプロウイルス組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の試験が認可されている。複製欠損のレトロウイルス(すなわち所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染性粒子を製造することができない)が最も有用である。そのような遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、遺伝子のin vivo高効率トランスダクションのために一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコール(プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み、プラスミドを用いたパッケージング細胞系のトランスフェクション、パッケージング細胞系によるリコンビナントレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集およびウイルス粒子を用いたターゲット細胞の感染のステップを含む)が、KRIEGLER(A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990)およびMURRY("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に提供されている。
ある種の用途に好ましいウイルスは、遺伝子療法におけるヒトへの使用がすでに認可されている2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、多種多様な細胞型および種に感染することができる。アデノ随伴ウイルスは、さらに、熱および脂質溶媒安定性;造血細胞を含む多様な系列の細胞での高いトランスダクション頻度;および重感染阻害を欠如することで多系列のトランスダクションが可能などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞DNAに組み込むことができ、それによって挿入突然変異誘発の確率およびレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動性が最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択圧の不在下で100回よりも多い継代の間追跡されており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることが暗に示された。アデノ随伴ウイルスは、染色体外で機能する場合もある。
他のベクターには、プラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えばSANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。最近数年の間に、プラスミドベクターは、抗原コード遺伝子を細胞にin vivo送達するためのDNAワクチンとして使用されている。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターと同じような安全上の懸念を有さないことから、DNAワクチンのために特に有利である。しかしながら、これらのプラスミドは、ホスト細胞と適合性のプロモーターを有するので、プラスミド内に作動するようにコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般に使用されるプラスミドには、pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40およびpBlueScriptが含まれる。他のプラスミドは、当業者に周知である。追加的に、制限酵素および連結反応を使用してプラスミドを特別設計し、DNAの特定フラグメントを除去および付加してもよい。プラスミドは、多様な非経口、粘膜および局所経路によって送達することができる。例えば、DNAプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または、他の経路によって注射することができる。それは、また、鼻腔内スプレーまたは点鼻、直腸坐剤によっておよび経口的に投与することができる。それは、また、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与することができる。プラスミドは、水溶液の状態で投与されるか、金粒子上に乾燥させて投与されるか、リポソーム、デンドリマー、コクリエート(cochleate)およびマイクロカプセル化を含むが、これらに限定されない、別のDNA送達系と関連させて投与されるかの場合がある。
特定の一態様では、本発明の化合物は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるその予防または治療と同時に使用するか、連続して使用するかの場合がある。
別の特定の態様では、本発明の化合物は、COPDにおける老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDでの老化および炎症の予防または治療と同時にまたは連続して使用することができる。
一態様では、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者においてCOPDを予防または治療するための方法であって、該被験者に、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物を投与するステップを含む方法に関する。
特定の一態様では、本発明による方法は、COPDにおける老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDでの老化および炎症の予防または治療に使用することができる。
医薬組成物
本発明の化合物は、医薬組成物中で使用または調製することができる。
本発明の化合物は、医薬組成物中で使用または調製することができる。
一態様では、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療に使用するための、本発明の化合物および薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物に関する。
典型的には、本発明の化合物は、薬学的に許容されうる賦形剤と、場合により、生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて治療用組成物を形成させることができる。
「薬学的に」または「薬学的に許容されうる」とは、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容されうる担体または賦形剤は、無毒な固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、カプセル化物質または任意の種類の製剤化助剤を指す。
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性主薬を単独で、または、別の活性主薬と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤のような経口経路形態、舌下および頬側投与形態、エアロゾル、植込剤、皮下、経真皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経真皮、髄腔内および鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態を含む。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容されうるビヒクルを含有する。これらのビヒクルは、特に等張無菌塩類溶液(リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムおよびこれらに類するものか、これらの塩の混合物)、または、場合に応じて無菌の水もしくは生理食塩水を添加したときに注射液の構成が可能になる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物の場合がある。
注射用途に適切な薬学的形態には、無菌水溶液または分散物;ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および無菌注射液または分散物の即時調製用の無菌粉末が含まれる。その形態は、全ての場合で無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性でなければならない。剤形は、製造および保存の条件で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
本発明の化合物を遊離塩基か薬理学的に許容されうる塩かとして含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散物は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコールと、その混合物と、油とに入れて調製することができる。通常の保存および使用条件で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するために保存料を含有する。
本発明の化合物は、中性または塩形態で組成物に入れて製剤化することができる。薬学的に許容されうる塩には、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)が含まれ、酸付加塩は、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸か、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸かとともに製剤化される。遊離カルボキシル基で製剤化された塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または、水酸化鉄(III)のような無機塩基と、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基とに由来する場合がある。
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど)を含有する溶媒または分散媒、その適切な混合物および植物油でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要とされる粒子径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合で、等張化剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
無菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかとともに適切な溶媒中に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、塩基性分散媒および上に列挙した成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に様々な無菌活性成分を混合することによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分との粉末を、予め濾過滅菌されたその溶液から回収する真空乾燥法および凍結乾燥法である。
製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合性の方法および治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記注射液の種類などの多様な投薬剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。
水溶液状態での非経口投与のために、例えば溶液を必要により適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適する。これに関して、採用できる無菌水性媒は、本開示に照らして当業者に公知である。処置される被験者の状態に応じて、投薬量にいくらかの変動が必然的に起こる。いずれにせよ、投与担当者が、個別の被験者に適切な用量を決定する。
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容されうる形態には、例えば錠剤または経口投与用の他の固形剤;リポソーム製剤;持続放出カプセル;および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
スクリーニング方法
さらなる一局面では、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、i)候補化合物を提供するステップと、ii)PGE2レセプターを遮断する、PGE2レセプターの発現を阻害する、COX−2の活性を阻害する、COX−2の発現を阻害する、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンE2シンターゼの発現を阻害する候補化合物を選択するステップとを含む方法に関する。
さらなる一局面では、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDの予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、i)候補化合物を提供するステップと、ii)PGE2レセプターを遮断する、PGE2レセプターの発現を阻害する、COX−2の活性を阻害する、COX−2の発現を阻害する、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンE2シンターゼの発現を阻害する候補化合物を選択するステップとを含む方法に関する。
さらなる一局面では、本発明は、COPDの予防または治療を必要とする被験者におけるその予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
− PGE2、PGE2レセプター、COX−2、プロスタグランジンE2シンターゼを提供し、PGE2レセプターを発現している細胞、組織試料または生物を提供するステップと、
− 小有機分子、プロスタグランジンアナログ、抗体、ペプチドまたはポリペプチドなどの候補化合物を提供するステップと、
− PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの活性を測定するステップと、
− PGE2レセプターを遮断する、PGE2レセプターの発現を阻害する、COX−2の活性を阻害する、COX−2の発現を阻害する、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンE2シンターゼの発現を阻害する候補化合物をポジティブ選択するステップと
を含む方法に関する。
− PGE2、PGE2レセプター、COX−2、プロスタグランジンE2シンターゼを提供し、PGE2レセプターを発現している細胞、組織試料または生物を提供するステップと、
− 小有機分子、プロスタグランジンアナログ、抗体、ペプチドまたはポリペプチドなどの候補化合物を提供するステップと、
− PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの活性を測定するステップと、
− PGE2レセプターを遮断する、PGE2レセプターの発現を阻害する、COX−2の活性を阻害する、COX−2の発現を阻害する、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンE2シンターゼの発現を阻害する候補化合物をポジティブ選択するステップと
を含む方法に関する。
PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、PGE2レセプターの活性を測定することは、CHO細胞系に安定的にクローニングおよびトランスフェクションされたPGE2レセプターに関するKiを決定すること、または、候補化合物の存在化または不在下でPGE2レセプター(cAMP、PI3K、AKT、PPARγ)の1種または複数のセカンドメッセンジャーを測定することを伴う。
候補化合物がPGE2レセプターアンタゴニストであるかどうかをスクリーニングおよび決定するための検査およびアッセイは、当技術分野において周知である(米国特許第5,393,747号;同第4,004,027号)。in vitroおよびin vivoアッセイは、候補化合物がPGE2レセプター活性を低減する効力および選択性を評価するために使用することができる。
候補化合物の活性と、該候補化合物がPGE2レセプターと結合する能力と、前記候補化合物がPGE2レセプターの活性を阻害する能力とは、PGE2レセプターを発現している単離された線維芽細胞と、ヒトPGE2レセプターによって安定的にクローニングおよびトランスフェクションされたCHO細胞系とを使用して検査することができる。
PGE2レセプター以外の別のレセプターを発現している細胞および線維芽細胞は、候補化合物の選択性を評価するために使用することができる。
本発明を以下の図面および実施例によりさらに例示する。しかし、これらの実施例および図面が本発明の範囲を限定するものとして、決して解釈してはならない。
実施例:COX2/PGE2経路は、慢性閉塞性肺疾患線維芽細胞の老化を維持する
方法
in vitro実験
患者および細胞:初代肺線維芽細胞は、COPDを有する患者25人およびCOPDの臨床的、形態的または機能的徴候を有さない被験者35人(対照)からの肺腫瘍切除について得られた肺標本から、移植片技法(Normand J and Karasek MA. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1995;31: 447-455)によって単離された(表1)。対照を非喫煙者群および喫煙者群に分けた(それぞれNS−C、n=10およびS−C、n=25)。喫煙状態(現在喫煙者または1年よりも長い禁煙によって定義される元喫煙者(Lapperre TS et al., Respir Res 2007;8:85; Savale L et al. Am J Respir Crit Care Med 2009)を、種々の結果の解析で考慮した(表2)。COPDの重症度の分類は、2003年慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ(GOLD)基準に基づいた(Rabe KF et al., Am J Respir Crit Care Med 2007;176:532-555)。全ての患者からインフォームドコンセントを得た。本試験は、「Comite de Protection des Personnes Ile de France IX」によって承認された。
方法
in vitro実験
患者および細胞:初代肺線維芽細胞は、COPDを有する患者25人およびCOPDの臨床的、形態的または機能的徴候を有さない被験者35人(対照)からの肺腫瘍切除について得られた肺標本から、移植片技法(Normand J and Karasek MA. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1995;31: 447-455)によって単離された(表1)。対照を非喫煙者群および喫煙者群に分けた(それぞれNS−C、n=10およびS−C、n=25)。喫煙状態(現在喫煙者または1年よりも長い禁煙によって定義される元喫煙者(Lapperre TS et al., Respir Res 2007;8:85; Savale L et al. Am J Respir Crit Care Med 2009)を、種々の結果の解析で考慮した(表2)。COPDの重症度の分類は、2003年慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ(GOLD)基準に基づいた(Rabe KF et al., Am J Respir Crit Care Med 2007;176:532-555)。全ての患者からインフォームドコンセントを得た。本試験は、「Comite de Protection des Personnes Ile de France IX」によって承認された。
略語:COPD 慢性閉塞性肺疾患;VC 肺活量;FEV1 一秒量;GOLD 慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ。気腫スコアは0〜100%のスケールで評価した。
データは、平均±SEMとして表した気腫スコアを除き、中央値に第1および第3四分位数(カッコ内)を付記したものとして表現する。††p<0.01、†††p<0.001[COPD患者vs対照(NS−CおよびS−C)];***p<0.001[COPD患者vs非喫煙者];‡‡p<0.01[COPD患者vs喫煙者]。
データは、平均±SEMとして表した気腫スコアを除き、中央値に第1および第3四分位数(カッコ内)を付記したものとして表現する。††p<0.01、†††p<0.001[COPD患者vs対照(NS−CおよびS−C)];***p<0.001[COPD患者vs非喫煙者];‡‡p<0.01[COPD患者vs喫煙者]。
略語:COPD 慢性閉塞性肺疾患;VC 肺活量;FEV1 一秒量。年齢、喫煙歴、禁煙期間およびFEV1/VCは、中央値に第1および第3四分位数(カッコ内)を付記したものとして表現し、その他のデータは平均±SEMとして表現する。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001[COPD患者vs対照(NS−C、S−C、ExS−C)];§p<0.05、§§p<0.01[継代7回目(P7)vs継代3回目(P3)];†p<0.05[COPD患者またはS−C vs NS−C];‡p<0.05[S−COPD vs ExS−COPD]。
細胞の処理:線維芽細胞を、PGE2(0.5ないし50ng ml-1)または24時間インキュベーションされた線維芽細胞から収集した馴化培地(CM)のいずれかに曝露した。異なる実験で細胞を、COXの阻害剤、プロスタグランジンレセプターEP2およびEP4のアゴニストまたはアンタゴニスト、抗酸化剤N−アセチルシステイン(NAC)、または、p53転写作用阻害剤ピフィスリン−αで処理した。
線維芽細胞の老化の特徴づけ:老化は、累積集団倍加レベル(PDL)(Holz O et al., Eur Respir J 2004;24:575-579)、テロメア長(Savale L et al., Am J Respir Crit Care Med 2009)、β−ガラクトシダーゼ活性関連老化(SA β−gal)(Dimri GP. Cancer Cell 2005;7:505-512)、ならびにウエスタンブロット、免疫蛍光およびRT−qPCR分析によるホスホ(セリン15)−p53、p16、p21およびカスパーゼ3の発現を測定することによって特徴づけた。Luminex法(Millipore, Molscheim, France)を用いて馴化培地中の29種の可溶性因子のレベルを定量した。
PGE2経路の分析:プロスタグランジンE2モノクローナルEIAキット(Bertin Pharma, Montigny le Bretonneux, France)を使用することによってPGE2を定量した。PGE2合成に関与するPGE2レセプターおよび酵素はRT−qPCRによって定量した。活性酸素種の細胞産生は、DCFH−DAアッセイ(Carter W et al., J Leukoc Biol 1994;55:253-258)によって定量した。
動物実験
C57BL/6バックグラウンドの雄性8週齢マウスおよびp53−/−動物(Tyler Jacks, MIT, Cambridgeにより恵与)にPGE2(1ng・ml-1)またはビヒクル(DMSO、1/10000)のいずれかを気管内に滴下注入した。滴下体積は50μlであった。滴下注入の24および48時間後にマウスを屠殺し、老化マーカーおよびサイトカインの肺mRNA発現の分析を行った。動物の公正な取り扱いに関するINSERMガイドラインを遵守して研究を行った。
C57BL/6バックグラウンドの雄性8週齢マウスおよびp53−/−動物(Tyler Jacks, MIT, Cambridgeにより恵与)にPGE2(1ng・ml-1)またはビヒクル(DMSO、1/10000)のいずれかを気管内に滴下注入した。滴下体積は50μlであった。滴下注入の24および48時間後にマウスを屠殺し、老化マーカーおよびサイトカインの肺mRNA発現の分析を行った。動物の公正な取り扱いに関するINSERMガイドラインを遵守して研究を行った。
統計解析
GraphPad Prism 4.0(La Jolla, CA, USA)でデータを解析した。群間比較は、クラスカル−ワリス ノンパラメトリック分散分析検定で行い、有意差が検出された場合は続いてマン−ホイットニーU検定とともに2×2比較を行った。スピアマンの順位相関係数を用いて相関を解析した。p<0.05を統計的に有意と見なした。
GraphPad Prism 4.0(La Jolla, CA, USA)でデータを解析した。群間比較は、クラスカル−ワリス ノンパラメトリック分散分析検定で行い、有意差が検出された場合は続いてマン−ホイットニーU検定とともに2×2比較を行った。スピアマンの順位相関係数を用いて相関を解析した。p<0.05を統計的に有意と見なした。
結果
患者の臨床的および人口統計学的特徴
被験者の臨床的および人口統計学的特徴を表1および2に示す。3つの群は年齢が類似していた。喫煙者およびCOPD患者は、類似の喫煙歴を有した。COPDを有する被験者は、GOLDステージIおよびIIによって示されるような軽症〜中等症の疾患(それぞれ被験者9および16人)および最大100に対して気腫スコア42.6±6.5を示した(Bankier AA et al., Radiology 1999;211 :851-858)。
患者の臨床的および人口統計学的特徴
被験者の臨床的および人口統計学的特徴を表1および2に示す。3つの群は年齢が類似していた。喫煙者およびCOPD患者は、類似の喫煙歴を有した。COPDを有する被験者は、GOLDステージIおよびIIによって示されるような軽症〜中等症の疾患(それぞれ被験者9および16人)および最大100に対して気腫スコア42.6±6.5を示した(Bankier AA et al., Radiology 1999;211 :851-858)。
COPD患者からの線維芽細胞は、対照よりも高い複製老化を示した
前記3群の患者の線維芽細胞は、ガン関連線維芽細胞のマーカーを発現しなかった。COPD患者からの線維芽細胞は、非老化継代で対照と差がなかったが、継代5〜7回目に対照よりもよりも低いPDL(図1A)、SA β−gal染色の増大(図1B)、p16のmRNAおよびタンパク質発現の増大(in vitroと、肺スライドでのin situとの両方、図1D)、HO−1のmRNA発現およびROS産生を示した。加えて、COPD線維芽細胞は、継代3回目に比べて継代7回目にp53およびp21のタンパク質およびmRNAの発現増大ならびにテロメア長の減少を示し(図1C)、これらの後2者の結果は、S−Cでも観察された。COPD患者における累積PDLは、FEV1/VCおよびFEV1と正の相関を示した(それぞれr=0.42、p<0.05およびr=0.40、p<0.05)。SA β−gal染色に関するCOPDと対照との間の差は、継代5回目に起こった(図1B)が、一方でp16および累積PDLに関する差は、継代7回目に起こったことに留意しなければならない(図1AおよびD)。そのような解離は、以前に報告され(Zdanov S et al., Exp Cell Res 2007; 313: 3046-3056; Noureddine H et al. Circ Res; 109: 543-553)、異なる老化マーカーを強調している異なるメカニズムに関係しうる(Kurz DJ et al. J Cell Sci 2000; 113 (Pt 20): 3613-3622)。
前記3群の患者の線維芽細胞は、ガン関連線維芽細胞のマーカーを発現しなかった。COPD患者からの線維芽細胞は、非老化継代で対照と差がなかったが、継代5〜7回目に対照よりもよりも低いPDL(図1A)、SA β−gal染色の増大(図1B)、p16のmRNAおよびタンパク質発現の増大(in vitroと、肺スライドでのin situとの両方、図1D)、HO−1のmRNA発現およびROS産生を示した。加えて、COPD線維芽細胞は、継代3回目に比べて継代7回目にp53およびp21のタンパク質およびmRNAの発現増大ならびにテロメア長の減少を示し(図1C)、これらの後2者の結果は、S−Cでも観察された。COPD患者における累積PDLは、FEV1/VCおよびFEV1と正の相関を示した(それぞれr=0.42、p<0.05およびr=0.40、p<0.05)。SA β−gal染色に関するCOPDと対照との間の差は、継代5回目に起こった(図1B)が、一方でp16および累積PDLに関する差は、継代7回目に起こったことに留意しなければならない(図1AおよびD)。そのような解離は、以前に報告され(Zdanov S et al., Exp Cell Res 2007; 313: 3046-3056; Noureddine H et al. Circ Res; 109: 543-553)、異なる老化マーカーを強調している異なるメカニズムに関係しうる(Kurz DJ et al. J Cell Sci 2000; 113 (Pt 20): 3613-3622)。
これらの結果を考えて、それぞれ非老化継代、中間継代および老化継代と見なされる継代3、5および7回目にさらなる研究を行った。線維芽細胞のセクレトームの分析から、老化COPD線維芽細胞が対照よりも多量のIL−6、IL−8、GRO、CX3CL1(フラクタルカイン)、TNF−α、IGFBP−7、FGF−2およびCCL5(Rantes)を分泌したことが示された。
禁煙は、継代3回目および7回目の両方で2群の老化および炎症性セクレトームに影響しなかった。例外的に、COPD線維芽細胞では継代7回目の累積PDLは、現在喫煙者のS−C線維芽細胞よりも元喫煙者の方が有意に高かった(表2、p<0.05)。
これらの結果は、軽症〜中等症のCOPD患者からの線維芽細胞が、対照よりも際立ったSASP関連老化表現型を表すことを示している。
COPD線維芽細胞におけるPGE2経路のアップレギュレーション
次に、本発明者らは、COPD線維芽細胞および対照線維芽細胞におけるPGE2経路を分析した。分泌されたPGE2のレベルおよびPGE2合成における最終酵素の誘導性アイソフォームであるmPGES−1のmRNA発現は、継代3回目でNS−C群よりもS−C群およびCOPD群の方が有意に高くなった(図2AおよびC)。継代7回目では、各群におけるPGE2レベルが継代3回目よりも有意に高く、対照群よりもCOPD群のPGE2レベルの方が有意に高くなった(図2A)。加えて、継代7回目でCOX2のmRNAレベルは対照よりもCOPDの方が有意に高くなった(図2B)。おそらくこの差は、継代3回目で高い値であったこと(対照と統計的な差はないが)および継代3回目に対する増加倍率が対照と同様であったことに起因する。
次に、本発明者らは、COPD線維芽細胞および対照線維芽細胞におけるPGE2経路を分析した。分泌されたPGE2のレベルおよびPGE2合成における最終酵素の誘導性アイソフォームであるmPGES−1のmRNA発現は、継代3回目でNS−C群よりもS−C群およびCOPD群の方が有意に高くなった(図2AおよびC)。継代7回目では、各群におけるPGE2レベルが継代3回目よりも有意に高く、対照群よりもCOPD群のPGE2レベルの方が有意に高くなった(図2A)。加えて、継代7回目でCOX2のmRNAレベルは対照よりもCOPDの方が有意に高くなった(図2B)。おそらくこの差は、継代3回目で高い値であったこと(対照と統計的な差はないが)および継代3回目に対する増加倍率が対照と同様であったことに起因する。
PGE2は、EP1〜4と呼ばれる特異的レセプターを介して作用する(Woodward DF et al., Pharmacol Rev 2011;63:471-538)。継代3回目に、EP2およびEP4のmRNA発現は、対照群よりもCOPD線維芽細胞の方が有意に高くなったものの(図2D)、EP1およびEP3について差は観察されなかった(オンライン追補データの図E7)。継代7回目に4種のPGE2レセプターの発現に有意差は観察されなかった(図2D)。
全体的に見て、これらの結果は、対照線維芽細胞に比べてCOPD線維芽細胞ではPGE2/EP2−EP4経路がアップレギュレーションされていることを示している。
PGE2への単回曝露は、肺線維芽細胞の早期細胞老化および関連炎症を誘導する
本発明者らは、次に、老化線維芽細胞のセクレトームから見いだされた濃度に近い濃度のPGE2への単回曝露が非老化線維芽細胞の老化を誘導することができるかどうかおよび対照細胞よりもCOPD線維芽細胞の方がこの作用に感受性が高いかどうかを問題にした。
本発明者らは、次に、老化線維芽細胞のセクレトームから見いだされた濃度に近い濃度のPGE2への単回曝露が非老化線維芽細胞の老化を誘導することができるかどうかおよび対照細胞よりもCOPD線維芽細胞の方がこの作用に感受性が高いかどうかを問題にした。
非老化線維芽細胞をPGE2とともに24時間インキュベーションすると、SA β−gal、p21およびp16タンパク質を発現している細胞の百分率の用量応答性増加(図3A)と、それに加えて細胞培養上清中のIL−6、CX3CL1、VEGF、FGF2、MMP−2およびTIMP−2のレベル増加とが誘導された。これらの誘導は、対照線維芽細胞よりもCOPD線維芽細胞の方が有意に高かった。切断型カスパーゼ−3の不在およびホスファチジルセリン残基の不検出が3群の患者の線維芽細胞から観察された。
それぞれAH6809およびGW627368Xを用いたEP2レセプターまたはEP4レセプターの遮断は、COPD線維芽細胞においてPGE2が誘導するSA β−galおよびp21の発現を有意に減少させ、両方のアンタゴニストを同時に使用した場合、小規模であるが有意に高い効果があった(図3BおよびC)。両方の対照線維芽細胞では、両方のアンタゴニストを同時に適用した場合にのみ、PGE2が誘導するSA−βgalおよびp21の発現が減少した(図3BおよびC)。したがって、両方のアンタゴニストは、PGE2によって誘導されるIL−6、CX3CL1、FGF2、VEGF、MMP2およびTIMP2の増加を抑制するために必要であった。他のEP2レセプターアンタゴニストおよびEP4レセプターアンタゴニスト(それぞれPF−04418948およびL−161982)を用いたときも、COPD線維芽細胞および対照線維芽細胞においてPGE2が誘導するSA β−galおよびp21の発現に類似の効果が観察された。最後に、それぞれEP2アゴニストおよびEP4アゴニストであるONO−AE1−259−01およびCAY10598は、COPD線維芽細胞および対照線維芽細胞におけるSA β−galおよびp21の発現に対するPGE2の効果を模倣し、両方のアゴニストを同時に使用すると、小規模であるが有意に高い効果が生じた。したがってこれらのアゴニストは、PGE2誘導老化へのこれらのレセプターの関与を確認するものである。
最後に、p21はp53の主要な下流エフェクターであるので(Zhang H. J Cell Physiol 2007;210:567-574)、本発明者らは、PGE2が誘導するSA−βgal、p21の発現および炎症性サイトカインの分泌にp53が果たす役割を検討した。p53核移行阻害剤であるピフィスリン−α(Komarov PG et al., Science 1999;285: 1733-1737)は、対照線維芽細胞およびCOPD線維芽細胞の両方においてSA β−gal、p21の発現(図3BおよびC)ならびにPGE2によって誘導されるIL6、CX3CL1、MMP−2およびTIMP−2のレベル増加を完全に阻止したが、p16の増加を改変しなかった。
さらに、PGE2が誘導する老化および炎症にp53が果たす役割を、野生型マウスおよびp53−/−マウスで確認した。PGE2の単回器官内滴下注入は、それぞれ24時間および48時間でp53およびp21の肺発現と、in vitroで誘導される同じ炎症性メディエーター(IL−6、CX3CL1、FGF2、VEGF、MMP2)の発現とを誘導したが、p16の発現は無変化であった。加えて、PGE2は、48時間でCOX2のmRNAレベルを増大させた。PGE2によるp21および炎症性メディエーターの誘導は、p53−/−マウスでは観察されず、これらの現象にp53が果たす役割を裏付けている。
ROSは老化の誘導に関与するので(Campisi J. Cell 2005;120:513-522)、本発明者らは、PGE2の効果に対するROSの関与について検討した。COPD患者由来線維芽細胞をPGE2とともにインキュベーションした場合にのみ、細胞内ROS濃度およびオキシダント感受性タンパク質HO−1の発現が用量依存的に増加した。PGE2に曝露されたCOPD細胞ではDNA損傷活性化転写因子ATMの活性化は観察されなかった。EP2/EP4レセプターの両方のアンタゴニスト、チオールアンチオキシダントであるN−アセチルシステイン(NAC)、COX1およびCOX2阻害剤であるインドメタシン、または、COX2阻害剤セレコキシブを用いた線維芽細胞の24時間の前処理により、PGE2によって誘導されるROS、ならびにSA β−galおよびp21の発現の増加が有意に低減した。さらに、外因性PGE2は、内因性PGE2の合成を誘導し、それはセレコキシブ処理によって打ち消された。
まとめると、これらの結果は、PGE2への単回曝露が老化とEP2/EP4、COX2依存性ROSおよびp53カスケードを介した関連炎症とを誘導すること、および、COPD線維芽細胞が対照細胞よりもこれらの効果に対して有意に感受性が高いことを示している。
PGE2は、老化COPD線維芽細胞由来セクレトームのパラクリン老化効果の原因である
本発明者らは、次に、PGE2が老化COPD線維芽細胞由来セクレトームのパラクリン老化促進効果に関与したかどうかを分析した。NS−CおよびS−C線維芽細胞はEPレセプターの発現に関して同様に挙動するので、本発明者らは、これらの実験に対照としてS−C線維芽細胞だけを使用した。
本発明者らは、次に、PGE2が老化COPD線維芽細胞由来セクレトームのパラクリン老化促進効果に関与したかどうかを分析した。NS−CおよびS−C線維芽細胞はEPレセプターの発現に関して同様に挙動するので、本発明者らは、これらの実験に対照としてS−C線維芽細胞だけを使用した。
S−CおよびCOPD患者由来の非老化線維芽細胞(以下にターゲット線維芽細胞と呼ぶ)を、非老化継代および老化継代で得られたそれぞれの群の細胞由来の馴化培地(CM)とともに24時間インキュベーションした。非老化継代で得られたCMとともにターゲット線維芽細胞をインキュベーションすることにより、COPDの場合にのみSA−βgal陽性細胞のパーセンテージ増加が実証された。老化継代で得られたS−C CMおよびCOPD CMの両方が、ターゲット細胞におけるSA−βgal、ホスホ(セリン15)−p53、p21およびp16のタンパク質発現と、IL−6、IL−8、MCP−1およびFGF−2のmRNA発現の百分率とを増加させた。しかし、MCP−1を除き、これらの増加は、S−C CMよりもCOPD CMとともにインキュベーションした後の方が有意に大きかった。老化CMは、切断型カスパーゼ−3の発現を誘導しなかった。
線維芽細胞をCOX阻害剤インドメタシンまたはセレコキシブで処理すると、CM中のPGE2のレベルが60%減少した。ターゲット細胞をこれらの培地とともにインキュベーションすると、SA β−gal陽性細胞およびp21のタンパク質発現のパーセンテージが平行して有意に減少した。
ピフィスリン−αまたはEP2/EP4アンタゴニスト両方とともにターゲット線維芽細胞を前処理することで、S−C老化CMおよびCOPD老化CMによるSA β−gal陽性細胞の増加と、p21タンパク質の誘導とが抑制された。ピフィスリン−αは、CMによって誘導されるIL−6、IL−8およびMCP−1のmRNA発現増加を抑制した一方、FGF−2の増加は改変されなかった。
全体的に見て、これらの結果は、PGE2がパラクリン的に作用して、EP2/EP4−p53カスケードを介してCOPD線維芽細胞に炎症とともに老化を誘導することを示している。
PGE2は、肺線維芽細胞の複製老化および関連炎症を亢進する
PGE2への単回曝露がヒト線維芽細胞およびマウスに老化を誘導したことを実証した後に、本発明者らは、複製老化に及ぼすPGE2への反復曝露の効果を分析した。これらの実験は、S−C線維芽細胞だけで行った。それは、NS−C線維芽細胞およびS−C線維芽細胞の両方が、老化およびPGE2への応答に関して同様に挙動したからである。
PGE2への単回曝露がヒト線維芽細胞およびマウスに老化を誘導したことを実証した後に、本発明者らは、複製老化に及ぼすPGE2への反復曝露の効果を分析した。これらの実験は、S−C線維芽細胞だけで行った。それは、NS−C線維芽細胞およびS−C線維芽細胞の両方が、老化およびPGE2への応答に関して同様に挙動したからである。
継代3回目から9回目まで培養する間に1ng・ml-1のPGE2にS−C線維芽細胞およびCOPD線維芽細胞を反復曝露すると、老化関連累積PDLがさらに減少し、SA−βgal、p21、p16、COX2およびHO−1の発現誘導ならびにIL−6、IL−8、GRO、VEGFおよびCX3CLのレベルが高まったが、一方でMCP3の発現は改変されなかった。これらの現象は、S−C線維芽細胞よりもCOPD線維芽細胞の方が際立っていた。PGE2は、COPD線維芽細胞でのテロメア長の短縮を改変しなかったが、リン酸化ATMの発現を高め、これは、PGE2への反復曝露後にDNA損傷が発生したことを示唆する。
最後に、本発明者らは、内因性PGE2が複製老化に関与するかどうかを検討した。本発明者らは、最初に、連続継代の間にCOPD線維芽細胞およびS−C線維芽細胞をインドメタシンおよびセレコキシブとともにインキュベーションした。各阻害剤は、COPD細胞におけるSA−βgal、p21、p16および累積PDLの増加を阻止し、一方でそれらの阻害剤は、S−C細胞におけるそれらのレベルを改変しなかった。COPD患者における継代5回目および7回目の培養上清では、この効果にIL−6、IL−8、GRO、CX3CL1およびCCL7レベルの平行した減少が続いた。この効果は、S−C患者では観察されなかった。
考察
本発明者らの知るかぎりでは、本研究は、COPDにおける老化肺線維芽細胞によって合成されたPGE2が、老化を誘導、強化および拡大し、EP2レセプターおよびEP4レセプター、COX2依存性ROSシグナル伝達およびp53シグナル伝達経路を介して炎症を起こすオートクリンおよびパラクリン効果を発揮することができることを初めて示すものである。COPD線維芽細胞の方が、喫煙者対照細胞および非喫煙者対照細胞よりもこの現象に対して感受性が高かった。
本発明者らの知るかぎりでは、本研究は、COPDにおける老化肺線維芽細胞によって合成されたPGE2が、老化を誘導、強化および拡大し、EP2レセプターおよびEP4レセプター、COX2依存性ROSシグナル伝達およびp53シグナル伝達経路を介して炎症を起こすオートクリンおよびパラクリン効果を発揮することができることを初めて示すものである。COPD線維芽細胞の方が、喫煙者対照細胞および非喫煙者対照細胞よりもこの現象に対して感受性が高かった。
EP2のmRNAおよびタンパク質の発現は、COPD非老化線維芽細胞でアップレギュレーションされた。これは、特に明白であって、両方の対照群とは異なっていた。これは、おそらくPGE2に対するCOPD細胞の特別な感受性を説明している。この増加は、肺ガンに関係するおそれがあった。というのは、線維芽細胞が腫瘍病理学のために切除された肺の非腫瘍領域から試料採取されたからである(Kreutzer M et al., Oncol Rep 2007; 18: 497-501)。しかし本発明者らは、本発明者らの細胞がガン関連線維芽細胞のどのマーカーもディスプレイしなかったことを慎重に立証した。COPD線維芽細胞におけるEP2の過剰発現は、DNAの低メチル化に関係する可能性があった。それは、DNAメチル化が、EP2発現の負のモデュレーションを行い(Huang SK et al., Am J Pathol 2010; 177: 2245-2255)、加齢およびタバコへの曝露が全体的なDNA低メチル化に関連しているからであった(Smith IM et al., Int J Cancer 2007; 121: 1724-1728; Bollati V et al., Mech Ageing Dev 2009; 130: 234-239)。このエピジェネティック仮説に合致して、複製老化COPD細胞におけるCOX2の発現増加は、平行したmiR146aの発現減少に関係する可能性があった。実際、COX2の発現を負コントロールするこのmiRの発現(Sato T et al., Am J Respir Crit Care Med 2010; 182: 1020-1029)は、複製老化とともに減少する(Vasa-Nicotera M et al., Atherosclerosis 2011; 217: 326-330)。または、PGE2とCOX2の間の正のフィードバックループで、老化COPD線維芽細胞におけるCOX2増加を説明することができた。それは、本発明者らの結果および他の研究から、PGE2がCOX2の発現を誘導しうることが示されたからである(Diaz-Munoz MD et al., Biochem J 2012; 443: 451-461)。
いくつかの線維芽細胞パラメーターが本質的に喫煙と関係し、S−C線維芽細胞で観察された(例えば継代3回目でのPGE2およびEP4の発現増加)ものの、継代3回目での高いEP2発現ならびに継代7回目での大部分の老化マーカーおよび炎症性メディエーター(PGE2、IL−8、GRO、CX3CL1、FGF2、TNF−α、RANTES)の増加は、COPD線維芽細胞だけに観察されるか、または、両方の対照群に比べてCOPD線維芽細胞の方が有意に大きくなった。この増加は、継代7回目での累積PDLを除き、禁煙した後も不可逆的であった。これらのデータおよび対照喫煙者が(彼らの現在の喫煙状況が何であろうと)COPD患者と同じ喫煙歴を有したという事実を考慮すると、肺線維芽細胞老化がCOPDに特異的であるという見込みは非常に高い。本発明者らは、禁煙後のCOPD線維芽細胞において累積PDLだけが可逆的であったことに関する説明をつかんでいない。しかし、COPD線維芽細胞における大部分の老化マーカーおよびSASPマーカーの可逆性の不在は、老化と炎症との間の自己永続化過程に一致し(Acosta JC et al., Cell 2008;133: 1006-1018)、そのことで禁煙後のCOPDにおける炎症持続を説明することができよう(Rutgers SR et al., Chest 2000;117:262S)。
本質的にEP2またはEP4のいずれかを伴うPGE2の効果は、内因性および/または外因性PGE2が、肺線維芽細胞を含む異なる細胞型の増殖を低減したことを示す以前の研究に合致する(Togo et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;178:248-260; Sato et al. Am J Respir Crit Care Med 2010;182: 1020-1029; Walker NM et al., Am J Respir Crit Care Med 2012;185:77-84)。本発明者らは、異なる化学的性質の数種のCOX阻害剤ならびにEP2/EP4レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを使用したので、自らの結果に自信をもっている。最近の論文から、外因性PGE2がヒト真皮線維芽細胞の複製老化をいっそう激化させたことが示された(Yang HH et al., Biogerontology 2011;12: 239-252)。しかし、その研究でPGE2の効果は、本研究のほぼ1500倍の濃度である5μMから観察された。これは、おそらく病態生理学的効果よりも薬理効果を反映している。さらに、その研究でSASPの分析は行われなかった。in vitroデータとin vivoデータを比較することは困難であるが、本研究におけるCOPD線維芽細胞のセクレトームにおけるPGE2濃度は、COPD患者の誘導喀痰から見いだされた濃度と同じ範囲内である(Chen Y et al., Respirology 2008; 13: 1014-1021)。この濃度のPGE2は、非老化COPD線維芽細胞による炎症性メディエーターの分泌を、COPD線維芽細胞のSASPから見いだされたレベルに近いレベルで誘導し、本発明者らの結果の病態生理学的重要性を強調している。その上、内因性PGE2は、COPD線維芽細胞のSASPのオートクリンおよびパラクリン老化効果に直接関与した。しかし、老化COPD線維芽細胞からのSASPが、老化を誘導および増幅することができるIL−6およびIL−8などのサイトカインを含有したので(Acosta JC et al., Cell 2008; 133: 1006-1018; Kojima H et al., Cell Cycle 2012; 11: 730-739)、COX2阻害による老化の抑止が、PGE2ではなくこれらの因子の不在に関係したと主張することができる。本発明者らは、この可能性を完全には排除することができないものの、少なくともIL−8に関してはありそうにないと考えている。というのは、COPD線維芽細胞からCXCR2 mRNAの発現が検出されなかったからである。最後に、文献のデータから、2型肺細胞およびマクロファージが老化COPD線維芽細胞によって産生された範囲内の量のPGE2を産生しうることが示されているので(Cao H et al., Anal Biochem 2008; 372: 41-51; Mundandhara SD et al., Toxicol in vitro 2006; 20: 614-624; Mao JT et al., Clin Cancer Res 2003; 9: 5835-5841)、これらの隣接細胞によって合成されたPGE2が線維芽細胞に対してパラクリン老化促進的な役割を果たすことを排除することはできない。
PGE2への単回曝露によって誘導される老化にp53が果たす役割は、早期細胞老化の仲介にこのタンパク質が果たす、十分に確立した役割に一致し、その一方でp16は、細胞成長を完全に停止させ、細胞を複製老化に駆動するために必要である(Zhang H. J Cell Physiol 2007; 210: 567-574)。それに合うように、PGE2への単回曝露によってp16も増加したが、細胞およびマウスの両方においてp53を阻害したときにp16は改変されなかった。これは、p16がPGE2への単回曝露によって誘導される老化に関与しないことを示唆している。p53は、COX2依存性ROS産生の増加によって活性化されたが、これは、リン脂質を切断し、プロスタグランジンの産生のための前駆体として利用可能なアラキドン酸をもたらす細胞外ホスホリパーゼであるsPLA2が、COX2誘導を介してマウス大動脈中にROSを誘導することを示している以前の結果に沿ったものである(van der Giet M et al., J Mol Med (Berl) 2010; 88: 75-83)。老化マーカーに対する効果とは対照的に、PGE2に単回曝露後のp53が果たす炎症促進的な役割は予想外であった。それは、このタンパク質が、SASPの負のレギュレーターであると繰り返し報告されているからである(Coppe JP et al., Annu Rev Pathol 2010; 5: 99-118)。ただ1つの研究が反対の結果を実証しており、ベンゾ[a]ピレンジオールエポキシド(BPDE)へのWI38ヒト肺線維芽細胞の曝露が、p53およびJNK経路を経由したIL−6、IL−8およびIL−1β分泌に繋がることを示した(Dreij K et al., Carcinogenesis 2010; 31: 1149-1157)。興味深いことに、BPDEはCOX2も誘導したので、COX2を介したp53活性化が炎症促進効果に繋がるという特別な効果を示している。関与するメカニズムが何であれ、本発明者らの結果は、PGE2の炎症促進効果についての新しいメカニズムを実証するものである。このメカニズムは、線維芽細胞をはるかに超えたものである。というのは、その効果が野生型マウスおよびp53−/−マウスの全肺からも実証されたからである。
PGE2へのCOPD線維芽細胞の反復曝露は、単回曝露後に観察されたCOX2/ROS経路の活性化を再現および増強した。実際に、PGE2に反復曝露された線維芽細胞は、継代5回目および7回目にHO−1の発現増加だけでなくATMの活性化も示した。これは、この場合、ROSのレベルがDNA損傷を誘導するために十分であったことを示していた(Banin S et al., Science 1998; 281: 1674-1677)。この現象で、PGE2の単回適用によって誘導されなかったIL−8およびGROなどのいくつかの炎症性メディエーターの誘導を説明することができよう(Rodier F et al., Nat Cell Biol 2009; 11: 973-979)。加えてPGE2は、テロメア長をさらに減少させずにp21およびp16の発現誘導を高めた。したがって、これは、COPD細胞に自然に発生する複製老化のパターンが強化したことを示している。そのような結果は、複製老化の間に適用された他の酸化刺激で以前に実証されたように、複製老化の自然過程に重なったPGE2誘導酸化的シグナル伝達と一致する(Frippiat C et al., Exp Gerontol 2000; 35: 733-745; de Magalhaes JP et al., FEBS Lett 2002; 523: 157-162)。これらの結果に沿って、COX2阻害剤を用いた継代3回目から7回目までのCOPD線維芽細胞の慢性処理は、SA−βgal、p16、p21およびIL−6、IL−8、GRO、CX3CL1、MCP3およびMMP2を対照喫煙者に近いレベルに有意に減少させた。対照的に、これらの阻害剤は、対照喫煙者の線維芽細胞の老化およびSASPを改変しなかったので、PGE2/COX2経路の老化促進効果に対するCOPD線維芽細胞の特別な感受性を強調している。
これらの結果を考慮して、PGE2経路の阻害は、COPDにおける老化および炎症を低減するためのオリジナルのアプローチとなりうる。COX2阻害剤の長期使用は、特にCOPD患者における心血管イベントのリスク増加に繋がるので(Solomon DH et al., Arthritis Rheum 2008; 59: 1097-1104)、EP2/EP4レセプターまたはmPGES−1などのPGE2経路の他の要素の選択的阻害が、代替的なオリジナルのアプローチを構成するはずである。
参考文献:
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を説明している。これらの参考文献の開示内容は、ここで引用により本件開示内容に取り込まれる。
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を説明している。これらの参考文献の開示内容は、ここで引用により本件開示内容に取り込まれる。
Claims (4)
- COPDでの老化および炎症を予防または治療を必要とする被験者においてCOPDにおける老化および炎症を予防または治療するための方法であって、該被験者に、PGE2レセプターアンタゴニスト、PGE2レセプター発現阻害剤、COX−2阻害剤、COX−2発現阻害剤、プロスタグランジンE2シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンE2シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物を投与するステップを含む、方法。
- 前記PGE2レセプターアンタゴニストは、EP2アンタゴニストまたはEP4アンタゴニストから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記PGE2レセプターアンタゴニストは、AH−6809またはGW627368Xから選択され、前記COX−2阻害剤は、インドメタシンまたはセレコキシブから選択される、請求項1記載の方法。
- COPDでの老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるCOPDにおける老化および炎症の予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって:
− PGE2、PGE2レセプター、COX−2、プロスタグランジンE2シンターゼを提供するステップ、PGE2レセプターを発現している細胞、組織試料または生物を提供するステップと、
− 小有機分子、プロスタグランジンアナログ、抗体、ペプチドまたはポリペプチドなどの候補化合物を提供するステップと、
− PGE2レセプター、COX−2またはプロスタグランジンE2シンターゼの活性を測定するステップと、
− PGE2レセプターを遮断する、PGE2レセプターの発現を阻害する、COX−2の活性を阻害する、COX−2の発現を阻害する、プロスタグランジンE2シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンE2シンターゼの発現を阻害する候補化合物をポジティブ選択するステップと
を含む方法。
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