JP2017018136A - 化合物のスクリーニングのための無細胞翻訳系及び関連用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】約5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞翻訳系により、ウイルスキャプシドに類似した様式で、ウイルスタンパク質、キャプシド集合に必要なタンパク質、及び多タンパク質複合体に組み立てるタンパク質などのタンパク質を発現するための方法が提供される。更に、約5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞翻訳系において、ウイルスタンパク質、ウイルスキャプシド集合、及びその分解が、細菌疾患、寄生体疾患、代謝疾患、腫瘍的疾患、免疫学的疾患、又はCNS疾患を軽減することができる、多タンパク質複合体へのタンパク質の集合を調節する化合物をアッセイするための方法が提供される。
【選択図】図14
Description
本出願は、2011年8月3日に出願された米国仮特許出願第61/514,825号の利益を主張するものであり、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に明らかに組み込まれる。
該当せず。
様々な実施形態において、本発明は、約5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞系及びこれら系を使用してウイルスタンパク質を発現するための方法を提供する。本発明の無細胞系は、ウイルスキャプシドを組み立てるために有用である。更に提供されるものは、本発明の無細胞系を使用して、化合物が細胞機能を調節するかどうかを試験するための方法である。
特に注記しない限り、本明細書で使用される技術用語は、当業者により理解されるような通常の使用法に従う。分子生物学における共通の用語の定義は、基準となるテキスト(例えば、Benjamin Lewin著、Genes V、Oxford University Press出版、1994年(ISBN 0−19854287−9);Kendrewら(編集)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd出版、1994年(ISBN 0−632−02182−9);及びRobert A.Meyers(編集)、Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers,Inc.出版、1995年(ISBN 1−56081−569−8))で見ることができる。
典型的ドメインは、3−シート及びα−へリックスのストレッチなどのより小さい組織のセクションから作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、別個の三次ユニットの非共有結合によって形成される三次元構造を指す。
小麦胚芽の無細胞抽出物は、翻訳に重要なサイトゾル因子を提供し、広範囲のmRNAのタンパク質へのインビトロ翻訳をサポートする。翻訳メカニズムは、無細胞系が高効率で原核細胞及び真核細胞のmRNAの双方を翻訳できるように、十分に保存される。小麦胚芽抽出物の最適濃度は、翻訳されるそれぞれのRNA配列について決定され得る。
本発明はまた、本発明の組成物を使用してタンパク質を発現する方法も提供する。例示的な実施形態では、無細胞系を使用して、キャプシド生合成及び集合を模倣する。無細胞系では、ウイルスキャプシド転写物が、キャプシドタンパク質翻訳及びその後のキャプシド集合に必要とされる可溶性因子を含有する小麦胚芽抽出物の存在下で翻訳される(Lingappaら著、J.Cell Biol 136:567−581(1997年))。小麦胚芽抽出物中に存在するサイトゾルタンパク質及び膜タンパク質の双方が、キャプシド集合及び/又はウイルス複製に関与することができる。組込み型膜タンパク質は膜貫通タンパク質を含有することができる。キャプシド集合に膜タンパク質を必要とするウイルスを利用するこれらの実施形態において、適当な膜が無細胞翻訳混合物に添加されることがある。無細胞翻訳混合物を、例えばキャプシド中間体の集合を容易にすることができるシャペロンタンパク質で補足することも更に可能である。無細胞系におけるキャプシドの集合は、キャプシド集合に関与する特定のウイルスタンパク質(複数可)のみの発現を最小限必要とする。一旦発現されると、ポリペプチドはキャプシドを組み立てるように進み、これは宿主因子によって触媒される。
本発明はまた、本発明の組成物を使用して、非ウイルスタンパク質を発現する方法も提供する。例示的な実施形態では、無細胞系を使用して、ウイルスキャプシドが類似モデルとして働く多タンパク質複合体への集合の経路を模倣する。図14は、合成段階及び集合段階へのDISC1遺伝子を含める、様々なCNS関連タンパク質を分析するための5%の小麦胚芽抽出物の使用を図示する。ウイルスキャプシド集合に関与する宿主タンパク質は、その他の目的で宿主中に存在するに違いないために、これらの内因性集合経路のための基質である非ウイルスタンパク質は、本発明による薬剤スクリーニングに等しく効果的に使用可能であるべきである。したがって、本発明は、CNS疾患にのみならず、限定されないが代謝疾患、腫瘍的疾患、及び免疫学的疾患にも適用可能でなければならない。本発明は、分解される場合、多タンパク質複合体を形成し、細菌又は寄生体疾患を軽減する細菌又は寄生体タンパク質を模倣する。本発明の適用可能性に必要とされることは、問題にしている新たに合成されたタンパク質が、この抽出物中でその他のタンパク質を使用するための能力を共有し、別個の多タンパク質複合体へのそれらの集合を補助又は容易にすることである。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質を含めるタンパク質の調節は、本発明の無細胞系(例えば、約5%の小麦胚芽抽出物を有する)における発現、フォールディング、及び集合に及ぼす化合物の効果を判定することによって評価され得る。他の実施形態ではウイルスキャプシド集合の調節は、本発明の無細胞系(例えば、約5%の小麦胚芽抽出物を有する)を使用して、キャプシド集合に及ぼす効果を判定することによって評価され得る。いくつかの実施形態では、限定されないがキャプシド集合シャペロンタンパク質を含めるキャプシド結合タンパク質の調節は、本発明の無細胞系(例えば、5%の小麦胚芽抽出物を使用する)におけるタンパク質の発現に及ぼす効果を判定することによって評価され得る。調節としては、限定されないが、感染、複製、レセプター結合、細胞の侵入、粒子形成等の調節を更に挙げることができる。
本発明により説明される概念は、タンパク質合成及びタンパク質集合の双方をサポートすることが可能な非小麦胚芽抽出物に等しく適用可能である。したがって、タンパク質のデノボ合成が可能な哺乳動物タンパク質抽出物の最低濃度は、本発明との類似によって、多タンパク質集合のために最も有効な系である可能性が高い。当業者であれば、小麦胚芽抽出物について本明細書で提供された情報を使用して、これを哺乳動物細胞からの抽出物の開発に適用することができるであろう。
例示的な実施形態において、本発明は、タンパク質の無細胞発現のためのキットを提供する。様々な実施形態では、キットは、ウイルスキャプシドを組み立てるための用途のものである。本発明の例示的なキットは、約5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、タンパク質の発現に必須である成分のそれぞれとを含有する。キット内に含まれる小麦胚芽抽出物及び成分は、本明細書に記載される通りの小麦胚芽抽出物及び成分である。本発明は、化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するためのキットを更に提供する。いくつかの実施形態では、適切な目的のためにウイルスタンパク質の発現又はキャプシドの集合を変更するために、追加の成分が含まれることができる。キットは、典型的には、タンパク質発現及び/又はキャプシド集合の最適化のための使用説明書を含有する。キットは、必要に応じて、本発明のタンパク質の活性及び/又はキャプシド集合に及ぼす影響についてアッセイする高処理量法を実行するための使用説明書、1つ以上の容器又はコンパートメント(例えば、プローブ、標識等を保持するための)、活性の対照モジュレータ、及び/又はキット成分を混合するための自動電機子等を含有する。
2μLの翻訳抽出物をブロッティングすることによって(3部で)、タンパク質合成を、5%、10%、又は20%の小麦胚芽抽出物の組成で先ず初めに定量化し、C型肝炎ウイルスコアポリペプチドを使用するアルカリ性ホスファターゼ接合二次抗体に基づく比色法を用いて、任意の密度単位としてバンド強度の定量にプロットした。タンパク質合成は、小麦胚芽抽出物の各パーセンテージでほぼ同一であった(図1)。これに加えて、タンパク質合成は、小麦胚芽抽出物供給源又は調製条件に関係なく均一であり(図9〜13)、大きな多タンパク質複合体を形成する生物学的に有意義かつ医学的に重要なタンパク質に選択的であった(図15)。
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、C型肝炎ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い(138〜85;EC50>50μM)から強い(138〜136;EC50=100nM)までの範囲であった(図2A及び6)。薬剤感受性は、10%又は20%の小麦胚芽抽出物においては明確な相関がほとんどなく、5%の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示した(図2B)。
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、インフルエンザウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い(138〜65;EC50 1〜20μM)から強い(150〜120;EC50<0.16〜4nM)までの範囲であった(図3A及び図8)。薬剤感受性は、5%の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示した。相関は10%の小麦胚芽抽出物で消失し、20%である程度まで再び現れたが、感染性ウイルス細胞培養アッセイに対効力との完全な相関関係ではなかった(図3B)。
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、ベネズエラウマ脳炎ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い(158〜80;EC50>20μM)から強い(150〜133;EC50<0.4μM)までの範囲であった(図4A)。薬剤感受性は、5%の小麦胚芽抽出物で最大の相関を示し、10%の小麦胚芽抽出物で大きく低下し、20%の小麦胚芽抽出物で大部分は失われた(図4B)。
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、ヒト免疫不全ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力を図7に示す。薬剤感受性は、5%の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示し、より高い小麦胚芽抽出物濃度で大きく低下し、又は失われる(図5)。
目的のタンパク質をコード化するクローン化cDNAを、SP6バクテリオファージプロモータ及び哺乳動物の5’未翻訳化コード領域の背後で操作し、PCR生成物を発生させ、ゲル精製し、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、無菌水中に溶解し、1mg/mLに調整した。この生成物を使用して転写物を生成した。
ヒトの疾患を引き起こすことが知られるウイルスの科を表1に示し、これらは推定上のキャプシドが組み立てられたアプローチ、及び試験した全てのウイルス科について特定された特徴的な集合中間体を含む経路に従うことができる。細胞培養中の感染性ウイルスに対するこれらウイルスの科の実証のうちの13について、無細胞スクリーンで活性な化合物を探索し−並びに多数の活性なファーマコフォアがすべての場合で特定された。ウイルス科のそれぞれが、本発明の無細胞キャプシド集合系においてキャプシドを組み立てた。
Claims (41)
- 目的のタンパク質を発現するための無細胞系であって、前記無細胞系が、2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物を含み、前記目的のタンパク質の発現に必要な成分を更に含む、無細胞系。
- 前記目的のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項1に記載の無細胞系。
- 前記ウイルスタンパク質が、ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項2に記載の無細胞系。
- 前記目的のタンパク質が、キャプシド結合タンパク質である、請求項1に記載の無細胞系。
- 前記ウイルスタンパク質が、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科、アネロウイルス科、パルボウイルス科及びカリシウイルス科からなる群から選択されるウイルスの科のメンバーであるウイルスによって発現される、請求項2に記載の無細胞系。
- 前記成分が、緩衝液、アミノ酸、核酸転写物及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーを含む、請求項1に記載の無細胞系。
- 前記成分が、検出可能部分、ATP、GTP、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルCoAリチウム塩、RNアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、tRNA及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーを更に含む、請求項6に記載の無細胞系。
- 前記標識付けアミノ酸が、[35S]メチオニンである、請求項7に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、インビトロ転写反応で構築される、請求項6に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、ウイルスタンパク質をコード化する、請求項6に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、ウイルスキャプシドタンパク質をコード化する、請求項10に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、ウイルスキャプシド結合タンパク質をコード化する、請求項6に記載の無細胞系。
- 前記緩衝液が、酢酸カリウム、スペルミン、ジチオスレイトール及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項6に記載の無細胞系。
- ウイルスキャプシドを組み立てるための無細胞系であって、前記無細胞系が、2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物と、前記ウイルスキャプシドを含む1つ以上のウイルスタンパク質の発現に必要な成分とを含む、無細胞系。
- 前記ウイルスキャプシドが、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科、アネロウイルス科、パルボウイルス科及びカリシウイルス科から選択されるウイルスの科から得られる、請求項14に記載の無細胞系。
- 前記成分が、緩衝液、アミノ酸、及び少なくとも1種の前記ウイルスタンパク質をコード化する核酸転写物を含む、請求項14に記載の無細胞系。
- 前記成分が、検出可能部分、ATP、GTP、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルCoAリチウム塩、RNアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、tRNAを更に含む、請求項16に記載の無細胞系。
- 前記標識付けアミノ酸が、[35S]メチオニンである、請求項17に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、インビトロ転写反応で構築される、請求項16に記載の無細胞系。
- 前記核酸転写物が、前記ウイルスキャプシドを含むタンパク質をコード化する、請求項16に記載の無細胞系。
- 前記緩衝液が、酢酸カリウム、スペルミン、及びジチオスレイトールからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項16に記載の無細胞系。
- 目的のタンパク質を発現する方法であって、前記目的のタンパク質が、請求項1に記載の前記無細胞系を使用して発現される、方法。
- 前記目的のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項22に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項23に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、ウイルスキャプシド結合タンパク質である、請求項22に記載の方法。
- 請求項14に記載の前記無細胞系を使用して、ウイルスキャプシドを組み立てる方法。
- 化合物が細胞機能を調節するかどうかを試験する方法であって、前記方法が、
(a)前記化合物を請求項1に記載の前記無細胞系に導入することと、
(b)前記細胞機能が調節されるかどうかを判定することと、を含む、方法。 - 前記化合物が、有機小分子及び生物薬剤からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを試験する方法であって、前記方法が、
(a)前記化合物を請求項14に記載の前記無細胞系に導入することと、
(b)前記ウイルスキャプシド集合が調節されるかどうかを判定することと、を含む方法。 - 前記化合物が、有機小分子及び生物薬剤からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- タンパク質の無細胞発現のためのキットであって、
(a)2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
(b)前記タンパク質の発現に必要な成分と、
(c)前記キットの使用に十分な使用説明書と、を含むキット。 - ウイルスキャプシドの集合のためのキットであって、
(a)2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
(b)ウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質の発現に必要とされる成分と、
(c)前記キットの使用に十分な使用説明書と、を含むキット。 - 化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
(a)2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
(b)前記タンパク質の発現に必要な成分と、
(c)前記化合物が前記タンパク質の発現を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。 - 化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
(a)2%以上5%以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
(b)ウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質の発現に必要とされる成分と、
(c)前記化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。 - 化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
(a)2%以上5%以下の細胞抽出物を含む無細胞混合物と、
(b)非ウイルスタンパク質の発現に必要な成分と、
(c)前記化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。 - 前記目的のタンパク質が、多タンパク質複合体を形成する非ウイルスタンパク質である、請求項1に記載の無細胞系。
- 前記多タンパク質複合体が、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する、請求項36に記載の無細胞系。
- 前記目的のタンパク質が、細菌又は寄生体タンパク質である、請求項36に記載の無細胞系。
- 前記目的のタンパク質が、多タンパク質複合体を形成する非ウイルスタンパク質である、請求項26に記載の方法。
- 前記多タンパク質複合体が、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する、請求項39に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、細菌又は寄生体タンパク質である、請求項39に記載の方法。
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