JP2003517313A - コンフォメーションおよびトポロジータンパク質の調節 - Google Patents

コンフォメーションおよびトポロジータンパク質の調節

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Abstract

(57)【要約】 異なる配座異性体として存在することが知られていないタンパク質の新規な配座異性体を同定する方法および組成物が提供される。配座異性体を産生する異なるシグナル配列で天然シグナル配列を置換するキメラ遺伝子を使用することによって、天然タンパク質をキメラ遺伝子の産物と比較することができる。コンフォメーションが異なる場合、抗体の産生、天然および異なる配座異性体のタンパク質に関連するメカニズムの解明、生理学的試料中の異なる配座異性体の存在についてのアッセイ、配座異性体に特異的に結合する化合物、特に薬剤およびその他の同定に異なるタンパク質を使用することができる。配座異性体の形成が疾患状態に関連する場合、化合物を薬剤候補として同定するスクリーンにおいて配座異性体を使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 序論 技術分野 本発明の分野は生物学的モデルおよび療法である。背景 従来、高等真核生物における遺伝子発現は、一般に、ゲノムの中にコードされ
た情報を、転写プロセス、RNAスプライシングおよび輸出、および翻訳により、
タンパク質に変換することを含むと考えられる。新しく合成されたタンパク質の
正しい細胞内区画への局在化、および正しい三次構造へのフォールディングは、
原理的に、遺伝子発現を調節できる、2つの追加のプロセスである。しかしなが
ら、現在まで、前者は忠実度（Song他、Cell（2000）100：333−343）、分解（W
iertz他、Nature（1966）384：432−438）、または他の区画に対するシグナリン
グ（Sidrauski他、Trends Cell Biol.（1998）8：245−249）に関してのみ調
節されるが、発現された遺伝子の情報量に関して調節されないと理解されてきて
いる。同様に、フォールディングはまた遺伝子発現の基本的調節点と見られてき
ていない。一般に、適切にフォールディングされたタンパク質とミスフォールデ
ィングされたタンパク質との間の二分法が受け入れられた（Ellgaard他、Scienc
e（1999）286：1882−1888）。タンパク質が2以上の適切にフォールディングさ
れた状態を有することができかつ細胞が特定の環境または条件下に他のフォール
ディングされた状態に対して1つを選択することができる可能性は、慎重に考慮
されてきていない。これらの可能性のいずれかが真実である場合、ゲノムの情報
量は大きく増加されるであろう。ある発明が1つの情報を他に対して選択可能と
する場合、このような発明は従来不可能であった方法でゲノムの情報量を決定し
かつアクセスするためのプラットフォームであろう。
【０００２】 タンパク質フォールディングに関して、現代的生物学の基本的定説は一次構造
が二次構造を決定することであり、二次構造は関係する翻訳後修飾、例えば、グ
リコシル化と一緒にタンパク質の三次構造を決定する（Anfinsen、Science（197
3）181：223−230）。分子シャペロンが不適切な相互作用を防止し、これにより
適切な最後のフォールディングされた状態を達成するプロセスを促進することに
よって、タンパク質フォールディングの忠実度の増強においてきわめて重要な役
割を演ずるという認識により、前記見解は修正された（EllisおよびHartl、Fase
b J.（1996）10：20−26）。フォールディングが分子の多数の部分において同
時に開始され、この道に沿ったすべての可能性をサンプリングしないで最小のエ
ネルギー状態に連鎖を向かわせるようであるという認識は、タンパク質フォール
ディングの一般的に受け入れられた見解の第2修正を構成した（DillおよびChan
、Nature Struct. Biol.（1997）4：10）。これらの見解のいずれも、1つ対他
の組のタンパク質−タンパク質の相互作用に依存的な1つ対他の経路を進行する
という意味において、フォールディングを調節できるという可能性を考慮してい
ない。これが真相である場合、診断または療法的利益を与えることができる方法
でタンパク質フォールディングを操作することができる。
【０００３】 細胞から分泌される運命にあるタンパク質は一般にアミノ末端にシグナル配列
を含有し、このシグナル配列は成長する鎖を小胞体（ER）膜に向け、転位チャン
ネルを通してER内腔の中に入れる、1系列のタンパク質−タンパク質の相互作用
を開始する（Blobel、PNAS（1980）77：1496−1500）。これらのプロセスにおけ
るシグナル認識粒子およびそのレセプター（WalterおよびJohnson、1996）およ
びヘテロトリマーSec61複合体（GorlichおよびRapoport、Cell（1993）75：615
−630）および他のタンパク質（JungnickelおよびRapoport、Cell（1996）82：2
61−270）の役割が解明された。
【０００４】 内在性膜タンパク質のER膜へのアセンブリーはこの一般的主題に対する複雑な
変形であり、内部のシグナル配列および膜透過停止配列およびハイブリッドシグ
ナルアンカー配列により指令され、種々のERタンパク質とのそれらの相互作用は
ポリペプチドの最終膜貫通配向を指令し、鎖がトランスロケーションチャンネル
から脂質二重層の中へ解放された後、二重層中のタンパク質の定着において引き
続く役割をしばしば演ずる（SkachおよびLingappa、J. Biol. Chem.（1993）2
68：23552−23561；BorelおよびSimon、Cell（1996）85：379−389；Heinrich他
、Cell（2000）102：233−244；Moss他、Mol. Biol. Cell（1998）9：2681−2
697）。
【０００５】 分泌タンパク質の場合において、シグナル配列は通常成長する鎖からER膜関連
シグナルペプチダーゼ複合体により切断され、ER内腔の中に新生鎖を捕捉し（Ma
tlack他、J. Cell. Biol.（1999）270：6170−6180）、切断されたシグナルペ
プチドは細胞質ゾルに戻され、分解されるであろう（Lyko他、J. Biol. Chem.
（1995）270：19873−19878）。細菌および原始真核生物、例えば、酵母におい
て、合成が完結した後、実質的な量のトランスロケーションが起こる（Rapport
他、J. Biol. Chem.（1999）380：1143−1150）。このような翻訳後トランス
ロケーションにおいて、変性状態を維持するための分子シャペロンとしてのシグ
ナル配列の役割が提案された（Liu他、PNAS（1986）86：9213−9217）。しかし
ながら、高等真核生物において、ER膜を横切る大部分のトランスロケーションが
共翻訳的に、すなわち、鎖がまだつくられている間に、起こり、新生鎖はER内腔
に直接的に転移し、ここでフォールディングが開始されることが一般に仮定され
た（ChenおよびHelenius、Mol. Biol. Cell（2000）11：765−772）。
【０００６】 総合すると、ここに提示する研究は、タンパク質フォールディングの現在のパ
ラダイムにおいていくつかの修正が必要であることを示唆する： 第1に、適切にフォールドされたタンパク質と、ミスフォールドされたタンパ
ク質との間の簡単な二分法を捨てなくてはならない。タンパク質フォールディン
グは多数の適切にフォールドされた状態を生ずることができ、これらの状態は異
なる機能を潜在的に促進することができることを認識することが必要である。ほ
とんどの場合において、これらの検出することが極めて困難である。なぜなら、
タンパク質のコンフォメーション変異型を容易に区別するツールは制限され、容
易適用されないばかりでなく、かつまた細胞が所定の時点において望まない変異
型を分解することによって仕事を複雑化するからである。
【０００７】 第2に、細胞は1つのフォールドされた状態（したがって、1つの機能）を1つの
時間に選択する（分解メカニズムに生き残り、細胞の表面に輸送されるかまたは
細胞の中から外に輸送され）が、他のフォールドされた状態（および他の機能）
を他の時間に選択できるメカニズムを有することを認識しなくてはならない。
【０００８】 第3に、ER膜を横切るトランスロケーションに関係する機構および決定因子は
、新しく合成されたタンパク質が進行するフォールディングファンネル（foldin
g funnel）の選択において重要な役割を演じ、そして鎖が細胞質ゾル、膜また
はER内腔中で相互作用するシグナル配列または機構の操作は、選択したフォール
ディングファンネルを変化させ、したがって、タンパク質のコンフォメーション
またはコンフォメーションの組合わせを変化させる方法であることが明らかであ
る。
【０００９】 タンパク質フォールディングのパラダイムの最初の2つの修正の主要な関係は
、ゲノムの情報量を非常に増加させることである。第3の主要な関係は、診断お
よび療法的利点を得るために、この増加したゲノムの情報量をアクセスする手段
を明らかにして、本発明を発生させることである。
【００１０】 背景のこれらの点を解明するほかに、タンパク質の最終一次構造を変化させな
い方法で任意の所定のタンパク質についてフォールディングファンネルの選択を
変更することができるが、タンパク質の最終のフォールドされたコンフォメーシ
ョンまたは形状を劇的に変化させることができる、本発明を我々の研究により証
明する。シグナル配列は成長するポリペプチド鎖が利用するフォールディングフ
ァンネルに影響を及ぼすことができ、これにより、生ずる新しく合成されたタン
パク質の最終のフォールドされたコンフォメーションに影響を及ぼすことができ
ることを我々は証明する。さらに、細胞はシグナル配列仲介調節を通して他の最
終コンフォメーションに対して1つの最終コンフォメーションを選択することが
できる。異なる方法における線形ポリペプチド配列のフォールディングは実質的
に異なる形状を有することができるので、この新しいレベルの調節はゲノムの情
報量および細胞に対して有効な遺伝子発現の調節の可能性を大きく増加させる。
【００１１】 発明の要約 トポグラフィーおよび／またはトポロジー的種が変化するタンパク質を製造し
、キメラタンパク質を提供し、トポグラフィー的および／またはトポロジー的種
の形成に関係する特異的因子を同定する方法および組成物、in vitroおよびin
vivo系のモデル、およびトポグラフィー的および／またはトポロジー的に明確
なタンパク質を同定する方法が提供される。組成が変化するタンパク質は、シグ
ナル配列を変化させ、野生型シグナル配列を既知のメカニズムの配列と置換し、
in vitroトランスロケーションモデル系の中にトランスロコン関連タンパク質
を選択に添加し、コンフォメーション的に明確なタンパク質を研究し、産生する
ために、ターゲットタンパク質のトポグラフィー的産生をモジュレートする、ノ
ックアウトおよび突然変異の小さい実験室哺乳動物を産生し、使用し、生理学的
メカニズムを解明するために、ミクロソームとともに修飾されたライゼイトを使
用することによって、コンフォメーションが変化するタンパク質は製造される。
【００１２】 特定の態様の説明 タンパク質転位系の因子を含む方法および組成物は、この系の成分およびそれ
らの機能を解明し、非天然シグナル配列を用いるキメラ遺伝子を使用するタンパ
ク質のフォールディングをモジュレートして「配座異性体」（少なくとも実質的
に同一のアミノ酸配列を有するが、異なる物理的トポロジーまたはトポグラフィ
ーを有するタンパク質）を形成するために使用される。トポロジーとは、タンパ
ク質の異なる配置、例えば、N−細胞質ゾルに比較してC−細胞質ゾルを意図し、
そしてトポグラフィーは、配座異性体を同定し、これらの目的のためにin vitr
oおよびin vivo系を提供し、そしてトランスロケーション間のタンパク質のコ
ンフォメーションをモジュレートする組成物を同定するときの、外部のコンフォ
メーションまたは形状の変化を意図する。トポグラフィーは、本明細書において
使用するとき、実質的に同一であるか、あるいは類似するアミノ酸配列を有する
が、フォールディング／コンフォメーションが異なるために異なる三次元形状を
有するタンパク質を意味する。本明細書において使用するとき、実質的に同一の
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、タンパク質のコンフォメーションまたは
トポロジーを変更しない、保存的アミノ酸置換（すなわち、それぞれ、小さいま
たは大きい側鎖について小さいまたは大きい側鎖；またはそれぞれ、酸性、塩基
性、極性または疎水性の側鎖について酸性、塩基性、極性または疎水性の側鎖）
を有するポリペプチドである。網状赤血球ライゼイト分画スキームを使用して、
タンパク質生合成間のフォールディングファンネルのシグナル配列仲介選択を調
節する、同義遺伝子産物を同定する方法が提供される。翻訳抽出物を分画し、そ
して特定のトランス作用活性を含有するか、あるいは欠如するサブフラクション
を再構成する可溶化膜を分画する方法は、現存する系を越えたいくつかの利点を
提供する。このプロセスは容易に大規模化することができる；分画に必要な材料
は安価である（普通の化学物質）であるか、あるいは再使用可能である（遠心管
、イオン交換樹脂）；そして最終生成物は、適当に貯蔵するとき、長い貯蔵寿命
を有する。
【００１３】 分画系は現在入手可能なRRLを越えたいくつかの利点を提供し、これらの利点
は下記のものを包含する：アフリカツメガエル（Xenpus）卵母細胞からのS−100
画分にRRLリボソームを単に補充すると、以前の卵母細胞翻訳系（2）よりも1桁
より大きい翻訳効率が得られることを我々は証明した。このような卵母細胞系を
使用して特異的事象、例えば、発生的調節された因子の翻訳抑制を研究すること
ができる；そして、また、イヌ膵臓からの粗面ミクロソーム調製物の中に含有さ
れるリボソームは、DEAE画分に対する翻訳を回復するとき高度に活性であるよう
に思われる。こうして、イヌ膵臓リボソームがタンパク質を翻訳し、イヌ膵臓膜
を横切ってタンパク質を転位させる、本質的に均質な系において、トランスロケ
ーション事象を研究することができる。リボソームとトランスロコンタンパク質
との間の微妙な、調節された相互作用は、異種系に対して相同的系において、い
っそう正確に再現することができる。
【００１４】 この系は他の翻訳系、例えば、コムギ胚芽翻訳系、またはアフリカツメガエル
卵母細胞翻訳系に容易に適合させることができる。ある場合において、分画され
た系は翻訳効率を非常に増加させる（上を参照）。さらに、複数のこのような分
画された系からの成分を混合し、合致させることができるので、ある種のタンパ
ク質の生合成に関係する組織特異的事象を研究することができる。これは、相補
性により、このような組織特異的事象に関係する因子を同定するとき、潜在的に
有効である。このような組織特異的差の例は記載された（WolinおよびWalter、J
. Cell. Biol.（1989）109：2617−2622；Lopez他、Science（1990）248：226
−229）。
【００１５】 問題のタンパク質は、シグナル配列を有し、小胞体中でプロセシングされるタ
ンパク質である。多数のシグナル配列が異なるタンパク質から同定され、広い範
囲の非天然タンパク質に対する複合化に操作可能であるように思われる。シグナ
ル配列は通常N末端であるが、タンパク質またはC末端に対して内部であることが
できる。シグナル配列は産物のコンフォメーションに影響を与えるトランスロケ
ーションのための特異的メカニズムを有することが知られているか、あるいは合
成することができるタンパク質から選択され、ここでトランスロケーションの効
果は既知であるか、あるいは測定される。シグナル配列はトランスロコンと組み
合わせて翻訳されるタンパク質のコンフォメーションに影響を与えることは、現
在知られている。理論により拘束されないで、シグナル配列はリボソームが小胞
体（ER）と堅固な、弛い、または中間の連結を形成するかどうかを指令し、そし
て翻訳されたタンパク質が転位またはプロセシングされるチャンネルおよび付随
するプロセシングタンパク質の選択を指令する。例えば、あるタンパク質のシグ
ナル配列をプレプロラクチンからのシグナル配列で置換すると、堅固な連結が生
ずるが、プレ−β−ラクタマーゼからのシグナル配列は弛い連結を提供する。堅
固な連結を提供するタンパク質は成長ホルモンを包含し；そして弛い連結は免疫
学的重鎖および酵母アルファ−因子を包含し；そして中間の連結はズクチン、カ
ルレチクリン、PrP、アンギオテンシノゲンおよびMDR−1を包含し、ここで異な
る配座異性体間の分割は種々のメカニズムに帰することができる。（リボソーム
−膜連結の効果の説明について、例えば、下記の文献を参照のこと：Hedgeおよ
びLigappa、（1996）Cell 85：217−228）。トランスロケーションのメカニズ
ムの一般的説明について、例えば、下記の文献を参照のこと：Ellgaard他、（19
99）Science 286：1882−1888；Wickner他、（1999）Science 286：1888−189
3；およびIbbaおよびSoll、（1999）Science 286：1893−1897。
【００１６】 シグナル配列は、発現について競合的なライゼイト、ミクロソームおよびプロ
テイナーゼKを使用することによって等級づけることができる。異なるシグナル
配列および普通の遺伝子を使用して発生するタンパク質分解の程度は、リボソー
ムと小胞体との連結の特質を示す。異なる程度の連結の堅固さを有するシグナル
配列を使用することによって、生ずるタンパク質のコンフォメーションを変更す
ることができる。これらの異なる配座異性体は多数の方法において使用すること
ができる。配座異性体は抗体、抗血清または好ましくはモノクローナル抗体の産
生に使用することができる。慣用法において異なるタンパク質配座異性体をアジ
ュバントの存在または非存在下に使用して、宿主、通常モノクローナル抗体の場
合においてマウスを免疫化し、次いで2週またはより長い間隔でタンパク質を追
加的に注射し、抗血清を残すをモニターすることによって、抗血清および抗体を
調製する。モノクローナル抗体について、脾細胞を単離し、永久分裂能化し、ス
クリーニングすることができる。配座異性体間を区別することができる抗血清を
産生するハイブリドーマを拡張する。2つの配座異性体を区別する抗体のライブ
ラリーを産生する。次いで抗体を使用して配座異性体の各々を単離し、タンパク
質の特質に対して適当な生理学的試料を使用して、宿主における異なる配座異性
体についてアッセイすることができる。
【００１７】 また、問題の真性コーディング領域の5'末端におけるシグナル配列をコードす
るトランケーテッド転写物を無細胞翻訳により発現させ、化学的に架橋させると
き、発生した架橋パターンの解析により、シグナル配列を等級づけることができ
る。化学的架橋はリシンおよびシステイン特異的切断可能および切断不可能な架
橋を包含するが、これらに限定されない。免疫沈降およびドデシル硫酸ナトリウ
ム中のポリアクリルアミドゲルの電気泳動および引き続くオートラジオグラフィ
ーにより、架橋パターンを解析することができる。
【００１８】 異なるオリゴペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのマトリックスを使
用することによって、異なる配座異性体をスクリーニングすることができる。例
えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第5,631,734号、米国特許第5,856,102
号および米国特許第5,919,523号。これらのマトリックスは商業的に入手可能で
あり、そして特定の結合パターンに関して調製することができる。このようにし
て、生理学的試料を添加し、どの配座異性体が存在するかを決定し、各々の量を
推定することができる。また、マトリックスを使用して、マトリックスに対する
結合アフィニティーにより特定の配座異性体を単離することができる。マトリッ
クスおよび抗体を組合わせて使用して、他のアッセイを確認し、配座異性体を単
離し、同一アッセイにおいて一緒に使用することができる。アッセイそれら自体
または他のアフィニティー結合アッセイと組合わせたアッセイにおいて、抗体を
検出可能な標識、例えば、蛍光体、発光体、リン光体、酵素、放射性同位体、お
よびその他で標識化することができる。配座異性体を区別できる、特異的エピト
ープを定める多数のプロトコルが入手可能である。ある場合において、2または
それ以上の抗体を使用することが望ましいことがあり、ここで配座異性体を結合
の立体的阻害、異なるアフィニティー定数、またはその他により定めることがで
きる。
【００１９】 配座異性体をオリゴマー、特にオリゴペプチドにより区別できるという事実に
より、これらのオリゴペプチドを異なる配座異性体の同定に使用できる。配座異
性体に結合する部位または他の化合物、特に小さい天然または合成の有機化合物
、5kDalより小さい、通常約2.5kDalより小さい化合物について競合する、他のオ
リゴペプチドを同定する競合アッセイにおいて、オリゴペプチドを使用すること
ができる。次いでこれらの化合物を使用して、その部位に対してより大きいアフ
ィニティーを有する他の化合物を同定することができる。このようにして、他の
配座異性体に比較して、1つの配座異性体に対して特異的である薬剤を同定する
ことができる。種々の結合性実在物をアッセイにおいて使用することができ、こ
こで実在物を標識化して配座異性体に対して結合を同定することができる。
【００２０】 所望ならば、野生型および／またはキメラ遺伝子のランダム突然変異を使用し
て、生ずる遺伝子を発現させることができる。タンパク質を親遺伝子との類似性
および差について分析することができる。ここで突然変異体の作用は配座異性体
を1つのコンフォメーションから他のコンフォメーションに変化させること、ま
たは抗体結合により測定して、エピトープを変化させることである。あるいは、
非変性条件下に化学的修飾因子に対する反応性の変更により決定して、架橋パタ
ーンまたはコンフォメーションの差を発生させることである。修飾因子はN−ス
ルホビオチン、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）、N−エチルマレイミド
（NEM）を包含するが、これらに限定されない。遺伝子またはタンパク質はヒト
患者または動物から発現し、ここで突然変異は自然に発生するか、あるいは遺伝
子の突然変異の結果であり、遺伝子またはタンパク質をランダムに突然変異した
遺伝子および哺乳動物宿主におけるその発現産物と比較することができる。この
ようにして、異なる配座異性体に導く突然変異から生ずる疾患状態を診断し、治
療を開発することができる。
【００２１】 配座異性体は患者の診断および治療を促進する生化学的目的に使用することが
できる。配座異性体は、常態でまたは異なる環境下に異なる比で配座異性体を産
生する、個々の宿主を区別する働きをする。環境の1つは化合物、特に薬剤の存
在、およびターゲットの生理学的に活性な化合物、通常タンパク質、例えば、膜
レセプター、チャンネル、酵素、転写因子、ハウスキーピングタンパク質、細胞
骨格タンパク質、膜、およびその他の結合アフィニティーおよび／または活性の
モジュレーションの存在である。配座異性体は移動性または非移動性タンパク質
であり、膜に結合するか、あるいは溶液中で遊離であることができる。化合物を
異なる配座異性体と、同一または異なる容器中で混合し、配座異性体に対する化
合物の結合を測定する。測定は種々の方法で、競合的または非競合的に実施する
ことができる。溶液の中に残留する化合物の量を測定することができ、ここで量
の減少は配座異性体に対する化合物の結合を示すであろう。選択的に、タンパク
質の特定の領域に関する結合が重要である場合、例えば、酵素およびレセプター
、ならびに特定の部位が生物学的活性に関係づけられる他のタンパク質、例えば
、G−タンパク質、転写因子、DNA結合性タンパク質、およびその他の場合におい
て、配座異性体に結合する標識化化合物を使用することができる。
【００２２】 また、生理学的活性に関する活性の差を測定するとき、配座異性体は有効であ
る。均質または不均質である、アッセイにおいて結合相手に対する結合アフィニ
ティーを測定することができる。これにより、2つの配座異性体の比率に関して
哺乳動物宿主の活性レベルを評価することができる。再び、リガンドとレセプタ
ーとの間、または複合体形成に関係する2またはそれ以上のタンパク質の間の結
合を検出するために、多数のプロトコルが利用可能である。2つのタンパク質の
結合が一緒に蛍光体の波長における放射レベルを減少しかつエネルギーアクセプ
ターのレベルにおける放射を増加するように、2つのタンパク質を蛍光体または
エネルギーレセプターで標識化することができる。選択的に、タンパク質の一方
を表面に結合させ、結合したタンパク質に対する他方のタンパク質の結合レベル
を標識化した第2タンパク質により測定することができる。選択的に、タンパク
質の各々を異なる粒子に結合させることができ、ここで一方の粒子は化合物を産
生し、この化合物は他方の粒子、例えば、LOCIを活性化する。標識化実在物が小
さく、例えば、オリゴマーまたは小さい有機化合物である場合、蛍光体を標識と
して使用し、そして蛍光の偏光を検出に使用することができる。アッセイの例示
は米国特許第5,989,921号、米国特許第4,806,488号、米国特許第4,318,707号、
米国特許第4,255,329号、米国特許第4,233,402号、および米国特許第4,199,559
号に記載されているアッセイである。
【００２３】 生理学的試料のスクリーニングにおいて配座異性体の存在を決定するとき、試
料は血液、細胞、csf、唾液、尿、毛、およびその他であることができる。試料
を前処理する、例えば、クエン酸塩を血液に添加し、赤血球を凝固し、分離し、
希釈し、抽出し、およびその他を実施することができる。こうして、配座異性体
は特定の適用に関連して同定することができ、適用は疾患、薬剤に対する応答、
物理的性能、細胞変性、アポトーシス、およびその他に関することができる。
【００２４】 本発明の力の例示はプリオンの研究である。シグナル配列を変化させることに
よって、天然のコンフォメーションsecPrP、および他の2つのコンフォメーショ
ン、NunPrpおよび神経変性CunPrPを変化量で得ることができることが発見された
。これは野生型の形態に比較して神経変性形態の形成比率が変化するメカニズム
の決定を促進する。類似する方法で、シグナル配列を有する他のタンパク質につ
いてのシグナル配列を変化させることができ、ここでタンパク質は疾患状態また
は能力の低下に関連することが推測される。次いで、タンパク質を変化するコン
フォメーションで産生することができるかどうかを決定することができる。前述
したように、異なる配座異性体が見出される場合、疾患を有するか、あるいは能
力が低下した患者に比較して、異なる配座異性体の存在は健康な正常の患者にお
いて確立される。次いで、前述したように、薬剤を望ましくない配座異性体に対
してスクリーニングすることができる。
【００２５】 さらに、異なるシグナル配列を使用することによって、所望の配座異性体と望
ましくない配座異性体との間の比率の変化についての基準を研究することができ
る。それと組み合わせて、それに加えてまたはその代わりに、配座異性体を形成
するER関連患者の役割を研究するために、in vitroライゼイトを使用すること
ができる。トランスロケーションのために必須なタンパク質を除いてすべてのタ
ンパク質を欠如するミクロソームを調製する。次いで個々のタンパク質を個々に
または組合わせて置換して、配座異性体の形成に対する1またはそれ以上のタン
パク質の存在の効果を決定することができる。いったん配座異性体の形成に関係
する1またはそれ以上のタンパク質が決定されると、健康な患者および異常な患
者を配座異性体の形成に関係する1またはそれ以上のタンパク質の存在について
スクリーニングし、突然変異または異なる配座異性体の存在を決定することがで
きる。このようにして、トランスロコン中でタンパク質がフォールディングする
メカニズムを解明するばかりでなく、かつまた療法の新しいターゲットを確立す
る。
【００２６】 無細胞タンパク質翻訳混合物について、種々の系を使用することができる（Er
icksonおよびBlobel、Methods Enzymol. 96：38−50（1983）；Merrick、Meth
ods Enzymol. 101：606−615（1983））。例示は商業的供給会社、例えば、プ
ロメガ（Promega、ウイスコンシン州マディソン）から入手可能であるコムギ胚
芽抽出物およびウサギ網状赤血球抽出物、ならびにそれらの高速度上清である。
他の参考文献は次の通りである：米国特許第5,998,163号、米国特許第5,998,136
号および米国特許第5,989,833号。このような系は、翻訳機構（tRNA、リボソー
ム、およびその他）を含有する無細胞抽出物に加えて、エネルギー源（ATP、GTP
）、およびアミノ酸の完全な補体を含む。この分野において知られている方法を
使用して、例えば、反応間にアミノ末端方向ヌクレオチドエネルギー源を添加す
るか、または選択的エネルギー源、例えば、リン酸クレアチン／クレアチンホス
ホキナーゼを添加することによって、タンパク質合成を維持するために十分なエ
ネルギーレベルを維持する。標準翻訳混合物の中に存在するATPおよびGTPは一般
に約0.1〜10mM、より通常0.5〜2mMの範囲の濃度であろう。一般に、ヌクレオチ
ドの量は、少なくとも約5ピコモルの生成物、好ましくは少なくとも約10ピコモ
ルの生成物を提供するために十分であろう。
【００２７】 また、リンパ球はPrPを形成し、物質、例えば、化合物を候補の薬剤の作用の
ためのスクリーンとして、または環境変化たは物理的障害に対する個体の応答の
ためのスクリーンとして使用することができる。リンパ球を環境変化に対して暴
露される。環境変化は化学的変化、例えば、化合物の添加、物理的変化、例えば
、pH、およびその他の変化であることができ、ここで変化に対する特定の細胞の
感受性はPrPの特質を変化させることによって環境変化に対して応答する個体の
性向の測度として測定されるであろう。汚染物質、農薬、およびその他を含むこ
とがある、環境変化に対する応答を測定することによって、化合物が一般的脅威
であるか、あるいは特異体質の人にのみ影響を与えるかどうかを決定することが
できる。また、細胞を使用して、正常の個体に比較してリンパ球中のCtm−PrPの
存在および／またはレベルを測定することによって、神経変性疾患に対して症候
性である患者がCtm−PrP関係疾患を有するかどうかを決定することができる。本
明細書に記載するように多数のアッセイを使用して、Ctm−PrPのみ存在およびレ
ベルを測定することができる。神経変性疾患の性向を検出することによって、神
経変性疾患の確率を増加させることがある化合物の活性または暴露から離れる方
向に患者を向けることができる。さらに、類似する方法で応答する他の疾患に対
する活性に関する代替作用として、Ctm−PrPに対する化合物の作用を使用するこ
とができる。また、細胞を個々の患者について使用して、種々の薬剤に対する個
体の応答を評価し、Ctm−PrPの産生に対する薬剤の作用を決定することができる
。
【００２８】 前述したように、多数のタンパク質は異なるトランスロケーションの結果を有
する。トランスロケーション経路において代替物を有することが知られているタ
ンパク質、例えば、2つの異なる配座異性体の中に存在するもの、f−Metとして
選択することができる異なるメチオニンの存在、鎖の中に約15〜20アミノ酸の疎
水性領域を有し、推定上のトランスメンブラン配列であることができるが、分泌
されたタンパク質として利用可能であるか、あるいは分泌されるトランスメンブ
ランである、異なるシグナル配列を生ずる、タンパク質をトランスロケーション
の結果に対する化合物の作用のマーカーとして使用することができる。例示的タ
ンパク質は、ズクチン、カルレチクリン、MDR−1、およびPrPを包含する。
【００２９】 多数のタンパク質はトランスロケーションプロセスにおいてERに関連し、しば
しばER一部分であり、そして新生タンパク質がER内腔に輸送されるチャンネルに
関連する。これらのタンパク質は、リボソーム、シグナル認識粒子（SRP）のタ
ンパク質、α、β、およびγ−サブユニットとのヘテロトリマーSec61複合体、
転位鎖関連膜タンパク質（TRAM）、シグナルペプチド（5つのタンパク質の複合
体）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（3−タンパク質複合体）、ER内腔
タンパク質、例えば、BiP、GRP94、カイネキシン（CNX）、ERGIC−53、タンパク
質ジサルファイドイソメラーゼ（PDI）、Erp57、Erp72、シャペロン、例えば、H
sp90、hsp47、Hsp60またはGroELファミリー、Hsp70またはDnakファミリー、Hsp1
00またはClpファミリー、および熱ショック同族体70、タパシン、ミクロソーム
トリグリセリド転移タンパク質、保護的タンパク質／カテプシンA、β−カテニ
ン、エガシン、コシャペロン、例えば、DnaJファミリーからのタンパク質、酵素
、例えば、ウリジン5'−ジホスフェート（UDP）−グルコース：糖タンパク質グ
リコシルトランスフェラーゼ（GT）、グルコシダーゼII、プロリル−ヒドロキシ
ラーゼおよびカルボキシエステラーゼを包含する。
【００３０】 ERおよびトランスロケーション産物のトランスロケーションに関連する補助的
タンパク質は、文献に記載されている方法によりライゼイトから除去することが
できる。（Gorlich他、（1992）Nature 357：47−52；GorlichおよびRapoport
、（1993）Cell 75：615−630；およびHanein他、（1996）Cell 87：721−732
。
【００３１】 問題のタンパク質中のシグナル配列を変化させることによって、哺乳動物宿主
における発現のための遺伝子を調製することができる。今日、DNA配列を置換し
てキメラ遺伝子を形成する多数の方法が存在する。例えば、下記の文献を参照の
こと：Sambrook他、（1989）、A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring
Harbor Press。簡単に述べると、アミノ酸配列を知り、デジェネレイトプロー
ブを使用して、遺伝子のDNAを単離する。プローブに結合するDNA配列を単離し、
配列決定して、問題のタンパク質をコードする配列の存在を知る。イントロンの
存在を回避しようとする場合、mRNAを単離し、逆転写し、PCRにより増幅するこ
とができる。1対のプライマーを使用する増幅により、いずれの状況におけるシ
グナル配列も異なるシグナル配列で置換することができる。ここで一方のプライ
マーはその5'末端においてシグナル配列を有し、このシグナル配列は天然シグナ
ル配列と隣接する遺伝子の配列に対して相補的である配列に結合されており、他
方のプライマーは第1プライマーに対して相補的である。第2組のプライマーはDN
A配列の他方の末端を提供するであろう。遺伝子のサイズに依存して、修飾され
た5'末端のDNAをコーディング配列の残部に結合するために、好都合な制限部位
を選択することができる。種々の技術を利用することができ、そして特定の合成
に対する各遺伝子の有効性を増強するためのプロトコルの選択は当業者にとって
明らかであろう。
【００３２】 いったん遺伝子が産生されると、それを多数の商業的に入手可能なベクターの
上にの中に導入し、クローニングし、および／またはセンス鎖の5'に転写調節領
域を有する発現ベクターを使用して発現を達成することができる。哺乳動物細胞
を使用することによって、前述したように異なる構築物から配座異性体を産生し
、単離し、アッセイすることができる。このようにして、有意な量の異なる配座
異性体を単離することができる。
【００３３】 初期段階において、異なる分離技術、例えば、HPLC、毛管電気泳動、アフィニ
ティークロマトグラフィー、およびその他により、配座異性体を濃縮することが
できる。初期分離は特定の画分における配座異性体の濃度を増大する働きのみを
するか、あるいは配座異性体を分離することができる。前者の場合において、前
述の技術を使用して、配座異性体をさらに分離することができる。異なる配座異
性体を分離および単離する異なる溶離液とともに、種々の分離媒質、例えば、イ
オン交換、篩媒質、およびその他を使用することができる。種々の手順が開発さ
れてきており、そして変性を最小にして分離を最適化するプロトコルを各組の配
座異性体について使用する。タンパク質精製分野における当業者はこれらのプロ
トコルを容易に決定することができる。次いで、精製された配座異性体をアッセ
イ、例えば、X線結晶学において使用して、構造、異なるエピトープに関連する
アミノ酸、野生型タンパク質が関連するタンパク質との相互作用、ならびに配座
異性体が結合する他のタンパク質、およびその他を同定することができる。
【００３４】 キメラタンパク質の遺伝子がいったん得られると、遺伝子は遺伝子治療、実験
動物の突然変異化、フォールディングに対する突然変異の効果を決定するランダ
ム突然変異化、発現構築物およびタンパク質の大規模生産のための単細胞または
生物、およびその他において使用することができる。実験動物は、齧歯類、ウサ
ギ、鳥類、イヌ、ネコ、ブタ、およびその他を包含する。
【００３５】 ある場合において、ウイルス構築物をつくることができ、ここでキメラ遺伝子
をウイルスキャリヤーの中に導入して細胞の中にランダムに導入するか、あるい
はウイルスが屈性を有する場合、ウイルスが向性である細胞の中に導入すること
ができる。他の配座異性体が存在してさえ、遺伝子が有益な効果を有する場合、
構築物の存在は天然配座異性体から生ずる症状を軽減する働きをすることができ
る。選択的に、非自然配座異性体の導入は、細胞、組織、器官および宿主の生理
学に対する非自然配座異性体の効果の評価を可能とする。
【００３６】 野生型構造と、異なる配座異性体を生ずることが知られている異なるシグナル
配列とを含んでなるキメラ構築物を導入すること、特に野生型遺伝子をそのキメ
ラ構築物で置換することは特に重要である。生殖細胞を使用するか、または引き
続いて生殖細胞に転移される核を使用する相同的組換えにより、1またはそれ以
上の所望の配座異性体を発現させることができる。ヘテロ接合性が関係する場合
、キメラ遺伝子を有する子孫を交配させてホモ接合性子孫を得ることができる。
このようにして、1またはそれ以上の配座異性体の役割、タンパク質が輸送され
る1またはそれ以上の位置が変化するかどうか、このような位置変動の効果、タ
ンパク質機能に対する異なるエピトープまたはトポグラフィーの効果、およびそ
の他を研究することができる。さらに、キメラ哺乳動物を使用して配座異性体に
対する生物学的作用について化合物をスクリーニングし、こうして直接的に、ま
たは配座異性体が経路の中に存在する結果として、特定の適用に向けられる配座
異性体を包含する薬剤を評価することができる。動物モデルを使用して、野生型
配座異性体および形成することがある他の配座異性体に対する効果を識別するこ
とができる。
【００３７】 非自然配座異性体が優性の陰性アレレである状況において、活性の喪失を宿主
の生理学に対する効果に関してモニターすることができる。宿主に対する効果を
、類似する適用が観測される、疾患状態に対して比較することができる。次いで
、適用に関連する既知の機能を有する薬剤、野生型アレレに結合することが知ら
れている化合物または他の治療を使用することによって、治療を評価して、治療
の有効性を評価することができる。非自然配座異性体を有する細胞を、他のタン
パク質の発現に対する非自然配座異性体の効果についてスクリーニングすること
ができる。このような細胞のmRNAをcDNAに変換することによって、非天然遺伝子
をもたない細胞と非天然遺伝子をもつ細胞と間において、この分野において知ら
れている種々の減法技術により、他のタンパク質に対する非天然遺伝子の作用を
決定することができる。選択的に、種々のタンパク質を発現させ、電気泳動、質
量分析またはHPLCのパターンを比較して、異なる配座異性体が宿主の発現パター
ンに影響を与えるかどうかを決定することができる。
【００３８】 上の説明および実験の節に記載する手順、または他の機能的に同等の手順に従
い、本発明は、プリオンタンパク質に関連する疾患および同様な疾患、特にアル
ツハイマー病のようなトポロジー的修飾に関連する疾患の研究を可能とする。示
すように、天然PrP、Ntm−PrPおよびCtm−Prpを発現する発現構築物を調製する
ことによって、異なる形態のタンパク質を産生するように細胞および動物を修飾
することができる。このようにして、種々の候補物質の添加の効果を培養および
in vivoにおいて研究し、培養およびin vivoにおける候補物質の存在下の異な
る配座異性体の形成の変化を決定することができる。同一および異なる細胞にお
ける発現および宿主の生理学に対する異なる配座異性体の効果の発現分析により
、本発明のタンパク質は、異なる配座異性体のコントロールした存在および疾患
の病因学の研究、疾患の病因学に関係する他の実在物を可能とする。天然PrP遺
伝子の存在または非存在下に構築を使用してマウスのモデルを開発することがで
きる。なぜなら、宿主遺伝子をノックアウトし、キメラ遺伝子で置換することが
できるからである。選択的に、突然変異をPrP遺伝子の中に導入し、これにより
フォールディングの修飾、およびトランスロケーションに関連するタンパク質に
依存するか、またはそれと相互作用する修飾を発生させることができる。こうし
て、遺伝子に対して天然またはキメラである、シグナル配列を突然変異させ、ト
ランスロケーションに関係するタンパク質に対する効果を決定することができる
。本発明の使用 本発明は、分子、細胞および生物レベルにおける（すなわち、疾患の解明、診
断または治療における）使用を見出す。特定の用途次の通りである。
【００３９】 1. 記載する本発明を使用すると、抗体の機能および使用を増強するように抗
体を操作することができるであろう。無細胞翻訳系においてシグナル配列を単独
で、または分画・再構成されたまたは変異型膜および細胞質ゾルと組み合わせて
置換することによって、微妙なまたは深遠な方法で、最終生成物それ自体のアミ
ノ酸配列を実際に変化させないで、免疫グロブリンのフォールディング経路を変
更することができる。こうして、結合性構築物が増分的に増加または減少された
、変異型免疫グロブリン、およびエフェクター機能（例えば、Fc領域の結合特異
性）が変化した免疫グロブリンを達成することができる。これらの目的を達成す
る現在のアプローチ（例えば、真性免疫グロブリン鎖の部位特異的またはランダ
ム突然変異誘発により）は、フォールディング経路ばかりでなく、かつまた分子
それ自体の一次構造を変化させるという欠点を有する。我々のアプローチは、実
際に、この2つの型の変化を解離し、他の欠点なしに、診断および／または療法
的実用性を提供する。また、シグナル配列の変動をトランスフェクトした哺乳動
物細胞に適用し、培地を収集し、コンフォメーションおよび機能の差についてス
クリーニングすることができる。
【００４０】 2. その上、サイトカイン、および増殖因子は広い範囲の機能的挙動、ある場
合において、複数のシグナリング経路の活性化に関係づけられた。例えば、シグ
ナルが満足するホルモンとして最初に発見されたレプチンは、骨密度の独立的中
枢レギュレーターとして働き、そして創傷治癒および血圧の調節に関係づけられ
ることが発見された。これらの機能のいくつかは他の非存在下に起こることが明
らかであり、そして大部分の肥満の個体はレプチン耐性であり、骨密度の障害を
もたず、それらがつくるレプチンは満腹促進機能を働かせることができないが、
骨密度を維持する機能をすることができることが示唆される。この種類の不均質
作用がレセプターまたはレセプター機能的の多様性により達成されるとうことが
、従来の仮説であった。しかしながら、リガンドのコンフォメーションの多様性
は、ここで示すPrPおよびプロラクチンからの例において証明されるように、レ
プチンの場合において、結果の不均質性の一部分またはすべてを説明することが
できるであろう。
【００４１】 個々の配座異性体の同定、および個々の配座異性体の発現を増減するか、また
は1つまたは他の配座異性体の作用をブロックする薬剤の開発を可能とすること
によって、ホルモンの機能のあるものを他のものよりも促進する方法で遺伝子発
現を実施することができる。また、特定の遺伝子型および表現型を発現する配座
異性体の混合物をベースとするサブセットに患者を分割することができる。これ
により、引き続いて、特定の時点において発現されている配座異性体混合物を考
慮して、特定の配座異性体または他の配座異性体ならびにサブセットに対して最
も有効であるように設計され、または有効であることが示された異なる薬剤を使
用して、異なる治療を異なる個体に投与することができる。
【００４２】 こうして、シグナル配列の交換、および分画細胞質ゾルおよび分画・再構成さ
れたまたは変異型膜を含有する翻訳系の種々の組合わせにおける合成、および引
き続くスクリーニングプログラムは、満腹感または創傷治癒に影響を与えないで
骨密度を促進または阻害する形態のレプチンの発生を可能とする。同様に、食欲
の抑制においていっそう活性であり、これによりレプチン耐性を克服する形態の
レプチン、肥満のヒトにおいて最も普通に観測される表現型を発生させることが
できる。逆に、レプチン配座異性体の個々のサブセットに対する作用について、
または分泌されるレプチン配座異性体の混合物の変更における作用についてスク
リーニングすることによって、小さい分子の薬剤を開発することができる。こう
して、配座異性体特異的または選択的作用を有し、これにより配座異性体の作用
をブロックまたは増強し、または配座異性体の特定の混合物をつくる能力をブロ
ックまたは増強する薬剤を開発することができる。いかなる方法においても成熟
、真性タンパク質の配列を変更しないで、シグナル配列の操作により変更するこ
とができる特定のレセプターに対するアフィニティーに加えて、他の分子に関連
する半減期、分泌反応速度はパラメーターである。このアプローチは、また、レ
セプターのアフィニティーよりむしろ、基質の代謝回転が関係する機能的一次で
ある、分泌および内在性膜酵素に適用されるであろう。
【００４３】 3. このアプローチをトランスジェニック技術と組合わせて、シグナル配列が
異なる変異型遺伝子を野生型およびノックアウトマウス（内因性遺伝子を欠如す
る）の中に導入することができる。この方法において、現在未知である複雑な分
泌および内在性膜タンパク質の機能についてスクリーニングすることができる。
こうして、野生型嚢胞性繊維症膜貫通レギュレーター（CFTR）の50％は合成され
ると直ちに分解されることが知られている。これは生合成における「エラー」を
表すということが従来の仮説である。本発明が実用性を有する別の解釈は、これ
らの95％が1つの特定の時間に細胞が必要としないが、発生における特定の時間
において分解からレスキューされることができる多数の選択的コンフォメーショ
ンの合計を表すということである。CFTRのシグナル配列は切断されないので、突
然変異を導入しないでフォールディングを変更するという目標をシスよりもトラ
ンスの調節によりもっぱら進行させなくてはならない。こうして、分画・再構成
されたまたは変異型膜および分画・再構成された細胞質ゾルを使用して意図され
る翻訳系におけるCFTRの発現は、主張するように、他の配座異性体に対して1つ
の配座異性体を増強し、引き続いてこれらをモノクローナル抗体の反応性、化学
的修飾、架橋および他の性質により記録し、分類し、次いでトランスジェニック
動物の中に導入し、新規な表現型および障害についてスクリーニングする。ERお
よび／または他の内部および／または原形質膜に関する単一および多スパニング
の両方を包含する、チャンネル形成およびレセプター形成膜タンパク質の各々に
ついて、同様にアプローチを使用することができる。
【００４４】 4. ヒトにおける疾患を治療することが最も困難であるものは、典型的にはホ
ルモン、増殖因子、サイトカインおよびレセプター耐性により発現されるシグナ
リングの障害（また、脱感作またはダウンレギュレーションとして知られている
）である。大部分の疾患の大部分の症例が同定されたメカニズムのためまたは決
定すべき未知のメカニズムのためであるかどうかにかかわらず、多数の異なる耐
性メカニズムが同定されてきている。我々の発表したまたは未発表の研究におい
て要約されるようにPrPを使用する我々の研究に基づいて、コンフォメーション
の調節困不良（配座異性体の不適切な混合物がつくられるか、またはERから出る
ことができる）は疾患の病原性の中枢のメカニズムであると考えられる。これは
分泌タンパク質に対してモノクローナル抗体を発生させ、そして疾患状態におい
てまたは疾患状態を有する患者のサブセットにおいて分泌タンパク質の個々のサ
ブセットが不釣り合いの方法で存在する（かまたは存在しない）ことを証明する
ことによって証明することができる。ヒトを苦しめる主要な疾患の主要な遺伝子
は、病態生理学におけるコンフォメーション調節不良の掛かり合いについてスク
リーニングすることができる、多数の分泌および膜タンパク質を包含する。糖尿
病、高血圧症、肥満、骨粗鬆症、変性関節疾患、癌、アルツハイマー病、および
精神疾患は、この方法に既に関係づけられた、わずかの例である。疾患の研究および治療に対する本発明の適用 上に列挙したように、多数の重要医学的状態は、コンフォメーションの調節が
生理学的および病態生理学的機能の重要な次元であると思われる遺伝子を包含す
る。ここで、特定の疾患をよりよく理解するために本発明を適用する方法を説明
する。
【００４５】 第1に、分泌および内在性膜タンパク質である、主要な疾患に関係する遺伝子
を無細胞系およびトランスフェトされた哺乳動物細胞において分析して、それら
のシグナル配列が入るクラスを特性決定する。マウスおよびヒト（例えば、血液
）からの試料を包含する、in vitroおよびin vivoにおいて、コンフォメーシ
ョンのスコアリング手段として、分類されモノクローナル抗体、化学的修飾およ
び細胞の内部および培地中の他のタンパク質との共関連を使用して、天然タンパ
ク質のコンフォメーションの不均質性を分類する。
【００４６】 第2に、コンフォメーション混合物を合成し、小さい、一時的配座異性体を拡
大し、安定化し、したがって容易に検出し、特性決定し、こうして配座異性体を
通常優性の配座異性体から区別できるようにする。これは2つの一般的方法で実
施することができる。すなわち、切断されるシグナル配列を交換するか、または
トランス作用（または作用の非存在）を通して天然配座異性体混合物を修飾する
分画・再構成された系中でタンパク質を発現させる。
【００４７】 第3に、主要な疾患関係タンパク質を定める座異性体混合物がいったん特性決
定されると、問題の疾患の自然の病歴および表現型のクラスの多様性を表す患者
からの試料を、観測されるこれらのタンパク質の配座異性体の不均質性に関して
、スクリーニングし、カテゴリー化する。この分析から、i）疾患に関係する配
座異性体、ii) 疾患の実際の発生に先行する座異性体混合物の変化、iii) 疾患
の進行、合併症および自然の病歴の他の面、例えば、薬剤効能の危険の増加また
は減少、副作用および他の反応に関して個体を分割する座異性体混合物の変化を
同定することができる。これらはこれらのプログラムにより見落とされる慣用の
プロテオミックス（proteomics）プログラムのすべての目標であることに注意す
べきである。なぜなら、タンパク質のコンフォメーションの不均質性について、
本発明を支持するために提出された証拠について気づいていないからである。そ
れゆえ、プログラムは問題のタンパク質の選択的配座異性体を見ていない。さら
に、本発明の非存在において、特定の疾患の危険にあるか、あるいは苦しめられ
ている個体において配座異性体の分布または意味を決定することができると同時
に、配座異性体のこれらの変化を系統的に同定し、拡大し、そして特性決定する
手段は現在存在しない。
【００４８】 第4に、上記1〜3からの支配下にある配座異性体の疾患関連性に関して種々の
価値のある情報が得られると、上に概説したアッセイを開発して、望ましくない
配座異性体を最小しかつ保護的であるか、あるいは疾患の進行、薬剤毒性、およ
びその他に関連しない配座異性体を最大とする方法で、座異性体混合物を修飾す
る因子についてスクリーニングすることができる。同様に、化合物の大きいライ
ブラリーの高い処理量のスクリーン、ならびに配座異性体特異的な合理的薬剤設
計により、望ましくない配座異性体を選択的にブロックするか、あるいは所望の
配座異性体の作用を増強する因子を探求することができる。
【００４９】 いくつかの主要な疾患に対する特定の適用を下に概説する。
【００５０】 真性糖尿病： インスリンの主要な遺伝子、インスリンレセプターおよびグル
コーストランスポーターのファミリーの多数のメンバーのすべては、それらをこ
の分析に適用可能とする切断または非切断のシグナル配列を有する。さらに、患
者のケアーに衝撃を与える主要な病態生理学的プロセスはインスリン耐性と命名
する症候群である。通常、これはレセプター機能において障害に帰するが、多く
の場合において、障害の基礎は未知であり、そして障害がレセプターよりむしろ
リガンドに由来する可能性を除外することができない。この場合において、リガ
ンドはインスリンであり、インスリン仲介シグナリングを障害する異常なコンフ
ォメーションはインスリンまたはインスリンレセプターまたはグルコーストラン
スポーターのファミリーの個々のメンバーの特性することがあり、これらは記載
する方法で同定することができる。最後に、任意の所定の時間において、そして
自然の経時的病歴において、慣用のゲノムおよびプロテオミック分析に対して向
けられた多数の研究的努力にかかわらず確認しにくいままであった、個々の表現
型の莫大な不均質性は、本発明に適用可能な、障害された配座異性を強く示唆す
る。
【００５１】 高血圧症： 血圧の調節における多数の主要な遺伝子は、分泌および内在性膜
タンパク質、例えば、なかでも、上皮ナトリウムチャンネル（EnaC）、アンギオ
テンシノゲン、アンギオテンシンレセプター、レニン、アルドステロンおよび他
のステロイドの合成に関係するステロイド生合成の酵素、およびアルファおよび
ベータアンドロゲンレセプターをコードする。高血圧症の病態生理学は大部分が
不明のままであり、それゆえ配座異性体の調節不良がその病因学および病原性に
おいてある役割を演ずる可能性はいかなる方法においても排除することができな
い。臨床的疫学的および観測的研究は、患者が高血圧症誘導状態（例えば、塩感
受性／塩不感受性；病徴的活性、およびその他）の特質に関してばかりでなく、
かつまた薬剤の個々のクラスに対する感受性、それらの薬剤の副作用、および薬
剤に耐える能力に関して不均質性であることを明瞭に示す。
【００５２】 肥満症： 肥満症の調節に関係する主要な遺伝子、例えば、レプチンおよびそ
のレセプター、および今日までに同定された種々の肥満症に関係する遺伝子、例
えば、メラノコルチンおよびマホガニーレセプター、アゴウチレセプター、およ
びその他のすべては、切断または非切断のシグナル配列を含有する。さらに、大
部分の肥満の個体はレプチン耐性であり、レプチンの配座異性体の差がその多様
な生理学的機能（例えば、満腹感、骨密度の維持、創傷治癒の促進、および血圧
の調節）を仲介するという仮説と一致する。
【００５３】 癌： 概念的に、癌は多数の多様なアポトーシス誘発および抗アポトーシス因
子を包含する、細胞の成長および増殖およびこれらのプロセスの生理学的コント
ロールに関係するシグナリング経路の障害である。これらのうちの多数は、切断
または非切断のシグナル配列を有する分泌または膜タンパク質である。多くの場
合において、また、一般にシグナル配列を有する、多数の分泌された増殖因子お
よびサイトカインにより、癌は積極的および消極的に影響を受けることがある。
多数のデータは、これらの因子の多数が多機能的であるか、あるいはより正確に
は、特定のシグナリング経路の促進および阻害の両方に関連するという見解を支
持する。この分野における現在の難問は、1つの因子が1時点においてほぼ1つの
作用を発生し、しかも他の時間に非常に異なる作用を発生できる方法を理解する
ことである。レセプターの相互作用、シグナルトランスダクション、半減期、ア
ソシエーション、およびその他を変更させる1つの配座異性体から他の配座異性
体への切り換えは、癌の発生、免疫監視機構、提示および進行、またはその治療
に対する応答において、癌発生および表現型の変動の1またはそれ以上の経路に
対して重要である。
【００５４】 骨粗鬆症： 骨密度の調節に関係するホルモン、例えば、前述のレプチン、お
よび他のもの、例えば、副甲状腺ホルモン、オステオプロテゲニン（osteoprote
genin）、およびレセプターのすべては、シグナル配列、いくつかの切断された
シグナル配列、いくつかの非切断のシグナル配列を有し、本発明の分析により表
面可能である。骨密度の生理学は複雑であり、十分に理解されておらず、種々の
混同するパラドックスに付される−ある環境下に骨密度を促進する同一因子は他
の環境下に骨を喪失させることがある。シグナリング変化に応答するコンフォメ
ーションの不均質性は、これらの観測に対する潜在的基礎であり、診断および治
療に対して広い可能性を有する。
【００５５】 神経変性： プリオンおよびアルツハイマー病を包含して、脊髄損傷、および
ストロークは、多分配座異性を含む診断および治療について最大の可能性を有す
る領域である。プリオンタンパク質は、プリオン疾患に関係する遺伝子産物であ
り、コンフォメーション調節が証明された最初のタンパク質であった。この場合
において、コンフォメーション調節はトポロジー調節として発現する−3つの検
出可能な配座異性体はトランスメンブラントポロジーが異なり、比較的生ずるに
同定し、区別することができる。アミロイド前駆体タンパク質は、その異常な代
謝物質がアルツハイマー病に関係づけられた遺伝子産物であり、切断可能なシグ
ナル配列を含む、プリオンタンパク質と共通の特徴を有する内在性膜タンパク質
である。軸索誘導に関係する（したがって脊髄損傷からの回復に対して重要であ
る）ネトリン、セミホリンおよび他の遺伝子は、多数の配座異性体の仮説と一致
するパラドックス的活性を有する。
【００５６】 冠状動脈の疾患： アポリタンパク質Bは低密度リポタンパク質代謝に関係す
る複雑な多機能分泌タンパク質であり、そしてコンフォメーションの不均質性の
主要な候補である。体における本質的にすべての内在性膜チャンネルおよびレセ
プタータンパク質は、前述したように分画可能な非切断シグナル配列を有する。
【００５７】 慢性閉塞性肺性疾患： 野生型嚢胞性繊維症膜貫通レギュレーター（CFTR）は
前述の多スパニング内在性膜タンパク質であり、その生合成は一般に受け入れら
れているいっそう複雑な運命を示唆する。CFTRの分解した鎖が、真のミスフォー
ルド鎖よりむしろ、細胞によりその点において不必要である選択的コンフォメー
ションを表すという仮説を受け入れることが困難である1つの理由は、配座異性
の利益となるような我々の証拠の大部分が未発表のままであることである。それ
らの選択的機能は現時点において未知のままであるが、塩化物チャンネルとして
のCFTRの既知の機能は、病原性微生物に対する先天性免疫性に必要な、抗微生物
ペプチド、例えば、デフェンシンに必要な塩環境に影響を与えることが推測され
た。こうして、塩化物チャンネルが喪失されたコンフォメーション調節不良は、
広い範囲の肺および他の障害において観測されるように、肺および他の組織にお
ける感染に対する感受性を増加させることがある。本発明において記載するよう
に、分画無細胞翻訳および転位系を入手可能なスコアリング系、例えば、モノク
ローナル抗体、化学的修飾フィンガープリント、架橋および関連分析、例えば、
スクロース勾配の研究と組み合わせて使用することによって、CFTR、MDR遺伝子
、および他の関係するトランスポーターの選択的コンフォメーションを分類し、
そして感染および他の障害を有する患者の特定のサブセットにおいて、これらの
選択的コンフォメーションが大きいまたは小さい程度に利用されるかどうかを決
定することができる。
【００５８】 精神障害： 神経変性のように、脳の機能的障害はシグナリングおよび／また
はシグナルトランスダクションにおける混乱を含むようである。細胞表面上のレ
セプター、例えば、Gタンパク質カップルドレセプターのファミリーは一般に細
胞対細胞のシグナリングに関係し、そして一般に切断されたまたは他のシグナル
配列を有するので、これらのクラスのタンパク質はコンフォメーション調節のた
めの候補である可能性は高い。
【００５９】 総合すると、前述の例は本発明の広い特質およびシグナル配列を含有するタン
パク質またはレセプターが関係する広い範囲の障害に対する適用可能性を証明す
る。
【００６０】 この出願を伴う関係する原稿は前の出願60／171,012および60／172,350の一部
分として提出され、そしてそれらに特別に記載されているように、引用すること
によって本明細書の一部とされる。これらの原稿はそれらの題名および最初の著
者により識別される：Rutkowski他、″A New Role for the Signal Seque
nce in Translocational Regulation″；Hegde他、″Transmissible and G
enetic Prion Diseases Share a Common Pathway of Neurodegeneratio
n″（発表：Nature（1999）402：822−826）；およびLingappa他、″Conformati
onal Control Through Translocational Regulation：A New View of S
ecretory and Membrane Protein Folding″。
【００６１】 下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきで
はない。
【００６２】 実施例 材料 ウサギ網状赤血球ライゼイト（RRL）およびイヌ膵臓粗面ミクロソームを記載
されているように（HedgeおよびLingappa、Cell（1996）85：217−228、および
その中の参考文献）調製し、使用した。イヌミクロソームと同一の方法で、マウ
ス脳ミクロソームを調製した。また、PKを記載されているように（Hedge他、Cel
l（1998）92：621−631）調製した。抗プロラクチン抗体をUBS（オハイオ州クレ
ブランド）から購入し、そして3F4モノクローナル抗PrP抗体をプルシナー（Prus
iner）研究所から提供された。抗PDIをストレスゲン（StressGen）（Victoria、
BC）から購入した。ジスクイニミジルスベレート（DSS）をピアース（Pierce、
イリノイ州ロックフォード）から購入した。サポニンをカルビオケム（Calbioch
em、カリフォルニア州ラジョラ）から購入し、水中の20％w／v源溶液として溶解
し、10mMのHepes、pH7.2に調節し、1.5mlのカラム（10mlのサポニン当たり）のS
P−セファローズファーストフロー（Amersham Pharmacia；ニュージャージイ州
ピスカタウェイ）および2mlのカラムのQ−セファローズファーストフロー上に通
過させることによって汚染物質を除去した。酵母プレプロ−アルファ因子をコー
ドするクローンはトム・ラポポート（Tom Rapoport）から提供された。
【００６３】 網状赤血球ライゼイトの分画 本明細書に記載する方法は、現在入手可能なウサギ網状赤血球ライゼイト（RR
L）翻訳系に由来する修飾されたin vitro翻訳系を調製する方法である。RRL翻
訳系は、本来JacksonおよびHunt（Methods Enzymol.（1983）96：50−74）によ
り開発され、メッセンジャーRNA（合成または天然）の翻訳のための哺乳動物を
ベースとする抽出競合を提供する。さらに、ミクロソーム膜を補充するとき、分
泌および膜タンパク質の生合成を再構成することができる。RRLを定められた成
分に分画することによって、in vitro翻訳系の柔軟性および潜在的使用を拡張
した。これらの進歩は〓ぁ生物学的現象を扱うためのいくつかの利点を有する（
下文参照）。簡単に述べると、RRLを天然リボソーム、および可溶性タンパク質
画分（S−100）に分離する。S−100をDEAEセファローズ上のアニオン交換クロマ
トグラフィーによりさらに分画する。貫流成分（グロビンのすべてを含有する）
を廃棄し、300mMのKClで細胞を段階的に溶離する。溶出液（関係する翻訳因子を
含有する）を硫酸アンモニウム沈殿および引き続く透析により濃縮する。このDE
AE画分を、リボソームと一緒に、出発RRLと本質的に等しい効率で翻訳を再構成
することができる。1mlのRRLから画分を調製するプロトコルを下に詳述する。そ
れは必要に応じて容易大規模化することができる。カラム緩衝液は20mMのTris−
酢酸塩、pH7.5、20mMのKCl、0.1mMのEDTA、1mMのDTT（新しく添加する）、10％v
／vのグリセロールである。溶離緩衝液はカラム緩衝液と同一であるが、300mMの
KClである。透析緩衝液は20mMのHepes−KOH、pH7.5、100mMのKOAc、0.5mMのMgOA
c、0.1mMのEDTA、1mMのDTT（新しく添加する）、10％v／vのグリセロールである
。分画プロトコル：i）RRLを以前に発表されたプロトコル（JacksonおよびHunt
、前掲）に従うが、ただしそれを脱塩しない。簡単に述べると、貧血ウサギから
の血球を数回洗浄し、細胞質ゾルを低張溶解により解放する。非溶解細胞および
ゴースト（溶解し、細胞質ゾルを解放した細胞）を遠心により除去する。上清は
この分画において使用したRRLである。ii) RRLを1mMのCaCl2に調節し、150U／ml
のミクロコッカスヌクレアーゼで25℃において10分間消化し、EGTAを2mMに添加
することによって、反応を停止させる。RRLを氷上で0℃に冷却し、すべての引き
続く手順を4℃（冷い室）においてまたは氷上で実施した。iii) ヌクレアーゼ処
理したRRLを厚い壁のポリカーボネート管（1mlの容量）中で4℃、100,000RPMに
おいてTL−100.2回転器により20分間遠心する。上清（S−100）を氷上で前もっ
て冷却した2mlのエッペンドルフ管に取出す。ペレットを透析緩衝液中で1回リン
スし、100μlの透析緩衝液の中に再懸濁させる。次いでリボソームをアリコート
で凍結させ、−80℃において貯蔵する。リボソームは活性を喪失しないで少なく
とも1年間安定である。過剰の凍結／融解を回避するが、問題なく少なくとも2〜
3回の使用に対して安定であるように見える。iv) S−100を等しい体積（1ml）の
カラム緩衝液で希釈し、3mlのDEAEセファローズカラムに適用する。最後の微量
の鮮やかな赤色のグロビンが貫流するまで、カラムを追加のカラム緩衝液で洗浄
する。次いでカラムを10mlの溶離緩衝液で段階的に溶離し、溶出液を収集する。
10mlの溶出液に、5.6gの固体硫酸アンモニウムを絶えず撹拌しながらゆっくり添
加する（約80％の飽和にする）。硫酸アンモニウムの添加後、4℃において（ま
たは氷上で）さらに20〜30分間撹拌する。遠心（10,000×g、15分間）により沈
殿を沈降させ、除去し、上清を廃棄し、ペレットを最大1mlの、好ましくは0.5ml
の透析緩衝液中に溶解する。500mlの透析緩衝液に対して4℃において8〜12時間
透析して残留硫酸アンモニウムを除去する（必要に応じて緩衝液を1回交換する
）。試料を透析管から回収し、アリコートを凍結し、−80℃において貯蔵する。
それは活性を喪失しないで少なくとも1年間安定である。過剰の凍結／融解を回
避するが、問題なく少なくとも2〜3回の使用に対して安定であるように見える。
【００６４】 実施例1 プリオンタンパク質 複雑な、高度に調節されたトランスロケーションを有する基質の劇的な例は、
プリオンタンパク質（PrP）、すなわち、いくつかの神経変性疾患の病原性に関
係する35kDの脳糖タンパク質である（Prusiner（1997）Science 278：241−251
）。PrPを3つの選択的トポロジー的形態でERにおいて同時に合成する（Hegde他
、（1998）Science 279：827−834）。これらの形態の1つ、secPrPと命名する
、 はER膜を横切って完全に転位し、in vivoにおいて観測される優勢を占める
形態である。対照的に、反対の向きでNまたはC末端をもつ単一にスパニングする
膜タンパク質として2つの他の形態のPrPをER内腔中でつくる（それぞれ、CunPrp
およびCunPrPと命名する）。PrP生合成は少なくとも3つの明確な、アッセイ可能
な終点に導く複数の工程を含むように思われるので、それをN末端のシグナル配
列の潜在的基質特異的作用のための感受性プローブとして使用した。下記の実験
において、PrPの天然シグナル配列を分泌タンパク質プレプロラクチンおよびプ
レ−β−ラクタマーゼの十分に研究されたシグナル配列と置換した（第1図A）。
ｃｍｆタンパク質（それぞれ、Prl−PrPおよびβL−PrP）を天然PrPと、PrPの特
徴を示すトポロジー的形態の各々でターゲッティングされ、転位し、そして合成
される能力について比較した（第1図B）。プラスミドの構築 すべてのプラスミド構築物の構築において、標準技術を使用した（Sambrook他
、1989）。HindIII部位に挿入されたアフリカツメガエルグロビンの5'UTRを含有
するpSP64（Promega、ウイスコンシン州マディソン）中で、すべての構築物を調
製した。プレプロラクチンのアミノ酸1〜30およびPrPのアミノ酸23〜28をコード
する領域をPCR増幅することによって、Prl−PrPを構築した。生ずるクローンがP
rPの成熟領域に対するプレプロラクチンのシグナル配列の正確な融合物を含有す
るように、PCR生成物をBgl2−PflmI消化した野生型PrPを含有するベクター（PrP
SV12）の中に結合した。すべての他のPrP、AV3、およびG123Pシグナル配列の
置換体を同様に構築したが、ただしPrl−PrP(AV3)を除外して、融合物の部位を
βLシグナル切断部位から3アミノ酸下流で操作した。このクローンは完全な融合
物として構築したPrl−PrP(AV3)と最終トポロジーが同一であった。μLシグナル
配列は位置2にSerよりむしろAspを含有することが見出された。この置換はβL−
PrPトポロジーに対して有意な作用をもたなかった。まずPrP SV12のコドン8に
サイレントNdeI部位を導入し、次いでこれらの突然変異をコードするアニーリン
グしたオリゴをBgl2−NdeIフラグメントとして結合することによって、PrP(R2， 3) ；PrP(R4，5)；PrP(D2，3)；およびPrP(D4，5)を構築した。これらのシグナル
配列をプロラクチン成熟領域に融合するために、プロラクチン成熟領域（アミノ
酸34で開始する）をPCR増幅し、NcoIで消化した。NcoIにおいて消化し、プロラ
クチンの最初の33アミノ酸を効果的に欠失させた野生型プレプロラクチンベクタ
ー（pSP BPI）の中に、このフラグメントを結合した。Thr−Argをコードする、
XbaI部位をアミノ酸34の直ぐ上流において操作し、PrP、プレプロラクチン、プ
レ−β−ラクタマーゼ、およびプレプロ−アルファ因子のシグナル配列を増幅し
、HindIII−SpeIフラグメントとして挿入した。Prl−βLを同一スキームに従い
構築した。すべてのクローンをジデオキシ配列決定により確認した。無細胞翻訳およびタンパク質分解 SP6 RNAポリメラーゼを使用するin vitro転写、RRLを使用する翻訳、および
イヌ粗面ミクロソームの中へのトランスロケーションは記載された（Hedge他、
（1998）Cell 92：621−631およびその中の参考文献）。トランスロケーション
を32℃（または第4図Cにおいて26℃）において20〜45分間実施した。記載されて
いるように（HegdeおよびLingappa、（1996）Cell 85：217−228）、示した膜
を沈降により単離し、生理学的塩緩衝液（PBS）の中に再懸濁させた。0.5mg／ml
のPKを使用して0℃において45〜90分間、タンパク質分解を実施した。12.5mMのP
MSFで反応を停止させ、10体積の1％SDSの中に100℃において移した。ターゲッティング研究 第2図Bにおいて、膜の非存在下の翻訳を32℃において開始し、次いで転写物の
非存在下に30秒間前インキュベートした。32℃に移動後5分に、アウリントリカ
ルボン酸（ATA−Sigma）を75μMに添加した。アリコートをスタッガード間隔で
氷に取出した。最後の試料を収集したとき、1つのアリコートを除外したすべて
に膜を添加した。次いで試料を32℃に30分間戻し、次いでタンパク質分解し、3F
4で免疫沈降させた。第2図Cにおいて、SfuIにおいてトランケートしたPrPをミク
ロソームの存在または非存在下に32℃において翻訳した。5分間インキュベート
した後、ATAを前述したように添加した。翻訳後30分に、試料を氷に取出し、膜
を欠如する試料に膜を添加し、32℃において30分間インキュベートした。翻訳が
完結した後、10mMのEDTAで26℃において10分間鎖を解放させた。次いでタンパク
質分解および免疫沈降を実施した。架橋 架橋すべき試料について、前述したように、翻訳産物を沈降させ、再懸濁させ
、等しいアリコートに分割した。1つのアリコートを取って置き、他のアリコー
トにDSSを1mMに添加し、試料を室温において30分間インキュベートした。50mMの
Tris（pH8.0）、10mMのEDTA、および10μg／mlのRNアーゼ（Sigma、ミゾリー州
セントルイス）の添加により、反応を停止させた。内腔架橋物の単離を望む場合
、0.5％のサポニンをその上添加し、次いでTLA100中で75,000rpm、4℃において1
0分間沈降させた。架橋した物質を免疫沈降するために、前述したようにサポニ
ンを添加し、冷却した架橋反応に抗体を直接添加した。ミクロソーム膜の分画 簡単に述べると、粗面ミクロソーム膜（RMs）を以前に記載されているように
調製した（WalterおよびBlobel、Methods Enzymol.（1983）96：84−93）。内
腔および周辺膜タンパク質を抽出した後、内在性膜タンパク質のサブセットを洗
浄剤で安定化し、ラクトンアフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィー
の組合わせにより分画した。脂質の存在下に洗浄剤を除去することによって、個
々の画分を再構成し、形成するプロテオリポソームを収集し、基質特異的活性の
アッセイに使用した。関係する原理を証明する、画分の最初の組を調製し、特性
決定するプロトコルを下に詳述する。下の節［d］に詳述するように、この最初
の手順をいくつかの方法で変更することができる。
【００６５】 分画プロトコル：i）以前に発表されたプロトコルに従い、RMsを調製する（Wa
lterおよびBlobel、（1983）前掲）。簡単に述べると、最近死亡したイヌ（また
はブタ）からの膵臓組織を均質化し、遠心して破片、核および大きい細胞下構造
物を除去した後、残りの物質を高速遠心する。沈降した物質を再懸濁させ、−80
℃において凍結貯蔵した。特記しない限り、すべての引き続く手順は氷上でまた
は冷い室中で4℃において実施する。ii)50mMのHepes、pH7.4、250mMのスクロー
スを含有する緩衝液で、 RMs（50mMのトリエタノールアミン−酢酸塩、pH7.4、2
50mMのスクロース、1mMのDTT中で）を0.5当量／μlの最終濃度に希釈する。サポ
ニンを20％の源溶液から0.5％の最終濃度に添加する。溶液をおだやかであるが
、十分に混合した後、TLA100.3回転器（Beckman instruments）中で100,000rpm
において10分間遠心することによって、ミクロソームを単離する。500mMのK−酢
酸塩、50mMのHepes、10mMのEDTA、125mMのスクロースを含有する緩衝液中で、ペ
レットを0.5当量／μlの濃度で再懸濁させる。ミクロソームを再び遠心（TLA100
.3回転器中で100,000rpmにおいて20分間）により単離し、抽出緩衝液［350mMのK
−酢酸塩、50mMのHepes、pH7.4、5mMのMgCl2、15％w／vのグリセロール、5mMの2
−メルカプトエタノール、EDTA不含プロテアーゼインヒビター（Roche Molecul
ar Biochemicals）および0.8％のデオキシ−BigCHAP（Calbiochem）］中で1当
量／μlにおいて再懸濁させる。氷上で10分間抽出した後、不溶性物質をTLA100.
3回転器中で100,000rpmにおいて30分間沈降させる。上清をDBC抽出物と命名し、
引き続く工程において使用する。iii) DBC抽出物を1／5〜1／7体積の固定化ConA
（Pharmacia）と一定にかつおだやかに混合しながら4℃において10〜15分間イン
キュベートする。上清（ConA消耗DBC抽出物）を別の管に取出し、氷上で貯蔵す
る（１２時間まで）または延長時間貯蔵し、液体窒素中で凍結させ、、−80℃に
保持する。ConAビーズを5〜7体積の洗浄緩衝液［500mMのK−酢酸塩、50mMのHepe
s、pH7.4、5mMのMgCl2、15％w／vのグリセロール、および0.8％のデオキシ−Big
CHAP］中で5回洗浄し、結合したタンパク質を5体積の抽出緩衝液［500mMのK−酢
酸塩、50mMのHepes、pH7.4、20mMのEDTA、15％w／vのグリセロール、5mMの2−メ
チル−アルファ−D−マンノピラノシド、2mMの2−メルカプトエタノールおよび0
.5％のデオキシ−BigCHAP］で25℃において一定に混合しながら2時間インキュベ
ートすることによって溶離する。溶離した物質（ConA抽出物）を引き続く操作の
ために氷上で冷却する。iv) ConAを1.5体積の希釈緩衝液［50mMのHepes、pH7.4
、15％w／vのグリセロール］で希釈し、イオン交換樹脂とのインキュベーション
のために分割する。希釈したConA抽出物を1／20体積のQ−セファローズ−ファス
トフローまたはS−セファローズ−ファストフロー（両方はPharmaciaから）に添
加し、一定に混合しながら1時間インキュベートする。Q−セファローズ−ファス
トフローおよびS−セファローズ−ファストフローのインキュベーションの非結
合画分を1／20体積のS−セファローズ−ファストフローまたはQ−セファローズ
−ファストフローに添加し、4℃において一定に混合しながら1時間インキュベー
トする。このインキュベーションの非結合物質を取って置く（Q／S−貫流および
S／Q−貫流）。第2インキュベーション（S−セファローズおよびQ−セファロー
ズからの樹脂を10体積の［200mMのK−酢酸塩、50mMのHepes、pH7.4、15％w／vの
グリセロール、0.5％のデオキシ−BigCHAP］を含有する緩衝液中で洗浄し、引き
続いて4体積の1000mMのK−酢酸塩を含有する同一緩衝液中で溶離する。これらの
画分を、それぞれ、Q−FTおよびS−FTと命名する。第1イオン交換インキュベー
ション（Q−セファローズおよびS−セファローズとの）からの樹脂を10体積の［
200mMのK−酢酸塩、50mMのHepes、pH7.4、15％w／vのグリセロール、0.5％のデ
オキシ−BigCHAP］を含有する緩衝液中で洗浄し、引き続いて4体積の500mMのK−
酢酸塩を含有する同一緩衝液中で溶離する。樹脂を第2回目に4体積の1000mMのK
−酢酸塩を含有する同一緩衝液中で溶離する。これらの画分を、それぞれ、Q−5
00、S−500、Q−1000、およびS−1000と命名する。v) 画分を次のようにして再
構成する。第1に、8mgのホスファチジルコリン（PC、10mg／mlの源溶液から）、
2mgのホスファチジルエタノールアミン（PE、10mg／mlの源溶液から）、10mgの
デオキシ−BigCHAP（DBC、100mg／mlの源溶液から）を混合することによって、
脂質を調製し、DTTを1Mの源溶液から10mMに添加する。試料を真空下に（ne hea
t）乾燥し、500μlの緩衝液［50mMのHepes、pH7.4、15％のグリセロール］の中
に再懸濁させる。DBCを100mg／mlの源溶液から添加して、最終濃度をほぼ20mg／
ml（約2％w／vの）にする。脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、必要となるま
で−80℃において貯蔵する。再構成のために、100μlのDBC抽出物またはConA消
耗消耗を100μlのConA溶離緩衝液、ConA溶出液、S−FT、Q−FT、S−500、Q−500
、S−1000、またはQ−1000画分を前述したように調製する。さらに、5μlの脂質
混合物を添加し、試料を十分に混合した後、個々の試料を160mgのバイオビーズ
（BioBeads）SM2（Biorad）に添加する。混合物を4℃において一定に混合しなが
ら12〜18時間インキュベートする。vi）プロテオリポソームを回収するために、
工程（v）からの脂質相をバイオビーズから分離し、新鮮な管に移す。これらの
試料を5体積の氷冷蒸留水で希釈し、混合し、氷上の1.3mlの遠心管に移す。試料
をTLA100.3回転器（1.3mlの管のためのアダプターを有する）中で70,000rpmにお
いて20分間遠心する。上清を廃棄し、30μlの100mMのK−酢酸塩、50mMのHepes、
pH7.4、250mMのスクロースを含有する緩衝液の中にペレットのプロテオリポソー
ムを再懸濁させる。これらを液体窒素中の凍結させ、トランスロケーションアッ
セイにおいて使用するために−80℃において貯蔵する。vii）前述したように（
参照）1μlの工程（vi）からのプロテオリポソーム／10μlの翻訳反応を使用し
て、トランスロケーションアッセイを実行する。PDIpの精製 20,000当量（定義については、WalterおよびBlobel、1983参照）のイヌ膵臓粗
面ミクロソーム膜を、50mMのトリエタノールアミン、250mMのスクロース、0.2mM
のPMSF、5μg／mlのアプロチニン、10μg／mlのキモスタチン、1μg／mlのE64、
5μg／mlのアンチペイン、1mMのDTT中で80mlに調節した。一定に混合しながら、
精製されたサポニンをゆっくり1％w／vの最終濃度に添加し、4℃において15分間
インキュベートした後、70.1Ti回転器（Beckman）中で70,000rpmにおいて2時間
遠心することによって、膜を沈降させた。上清をプールし、5mlのConAセファロ
ーズカラムに6.2ml／時の流速で適用した。25mlの100mMのKAcを含有する上記緩
衝液で15ml／時で洗浄し、追加の25mlのKAcを含有しない緩衝液で洗浄した。カ
ラムを室温において20mlの1Mのα−メチル−マンノピラノシドを含有する上記緩
衝液で3ml／時で溶離した。溶出液を氷上に収集し、4℃において1mlのQ−セファ
ローズ−ファストフロー細胞に適用した。カラムを4mlの50mMのHepes、pH7.4、2
mMのMgAc、1mMのCaCl2、1mMのDTTで洗浄し、2mlの1MのKAcを含有するこの同一緩
衝液で溶離した。溶出液をさらにセファデックス（Sephadex）PG 16／16カラム
（Pharmacia）上で分画し、80×1.5mlの画分を収集した。15μlの画分31〜56の
各々をSDS−PAGEおよびクーマッシー染色により分析する（第4図b）。gp65を含
有するピーク画分をプールし、アリコートを引き続く配列分析のために使用する
（ProSeq、マサチュセッツ州サレム、による）。TRAM再構成膜の調製 記載されているように（Hegde他、1998c）、糖タンパク質消耗膜を調製した。
記載されているように（GorlichおよびRapoport、1993）調製した、精製されたT
RAMを出発膜の中に存在するレベルの4×（イムノブロッティングにより判定して
）で糖タンパク質消耗抽出物に添加した。その他 15％のゲルまたは12.5％または15％のTris／Tricineゲルを使用して、SDS−PA
GEを実行した。バンドをオートラジオグラフィーにより直接的に、またはTransS
creen増強スクリーン（Kodak、ニューヨーク州ロチェスター）の助けにより可視
化した。AGFA ArcusIIフラットベッドスキャナー上の走査およびアドベ・フォ
トショップ（Adobe Photoshop）ソフトウェアを使用するデンシトメトリーによ
り、定量を実行した。記載されているように（ChuckおよびLingappa、1992）、
免疫沈降を実施した。
【００６６】 すべての3つのタンパク質は効率よくターゲッティングされ、ERを横切って転
位されたが、それらはトポロジー的結果が劇的に異なっていた。以前の発見と一
致して、PrPはsecPrPおよびCunPrpのトポロジー的形態で主として合成され、Ctm PrPは少量であるが有意な量（約7％；第1図C）で合成された。対照的に、Prl−P
rPは主としてsecPrPの形態で合成され、次いでCunPrpはより少ない量で合成され
、CtmPrPは本質的に検出不可能であった（＜2％）。逆に、βL−PrPのトポロジ
ーは大きくsecPrPを犠牲にしてCunPrP（約34％）に劇的にシフトした。これらの
結果が示唆するように、異なるシグナル配列は情報をコードし、これは引き続く
トポロジー的事象に劇的に影響を与える。この情報はすべての3つのシグナル配
列に対して追加的でありかつそれらのシグナル配列に共通な基本的ターゲッティ
ング特徴に依存するように思われる。こうして、成熟PrPに融合した細胞質ゾル
タンパク質グロビンのN末端の20アミノ酸から成るキメラタンパク質は、トポロ
ジー的形態のいずれにおいても転位することができない（データは示されていな
い）。総合すると、第1図における実験はPrPのシグナル配列がトポロジー調節に
おいてある役割を演ずることを証明する。
【００６７】 原理的には、前述のトポロジーに対するシグナル配列の影響は、ターゲッティ
ングにおけるシグナル配列の十分に確立された役割に帰することができる。異な
るシグナル配列が異なる速度でERにターゲッティングされた場合、リボソーム−
新生鎖複合体がトランスロコンと相互作用する時間までに、成熟基質のN末端は
変化する長さで合成されるであろう。ターゲッティング工程間の増加する量の合
成の1つの結果は、PrPのトポロジー的形態の1つの合成に好適であることがある
（多分CtmPrP、そのN末端ドメインは転位されない）。この仮説は、PrPターゲッ
ティングの反応速度論の操作がシグナル配列の置換により見られるトポロジーの
シフトを繰り返すことを意味する。この可能性を3つの方法で試験した。
【００６８】 第1に、翻訳反応において存在するER由来イヌ膵臓ミクロソームの量を滴定し
、PrPトポロジーに対する効果を検査した。トランスロケーション機構の全濃度
が減少するとき、合成の開始と、トランスロコンとの相互作用との間の時間は増
加し、ターゲッティング前に合成される新生鎖の量を増加させる。10倍の範囲に
わたってミクロソームの濃度が変化するとき、PrPの異なるトポロジー的形態の
相対比は衝撃を受けないことを我々は発見した（第2図A）。ミクロソーム濃度の
減に伴うトランスロケーション効率の減少は、シグナル切断効率の減少により反
映され、「転位能力」の喪失のためであるように思われる。この「転位能力」は
、リボソーム−新生鎖複合体がトランスロケーション機構と産生的に相互作用す
ることができるときにおける、新生鎖成長における比較的短い期間である（Pera
ra他、Science（1986）232：348−352）。トランスロケーション効率の同様な喪
失は他の基質で観測された（データは示されていない）。
【００６９】 第2アプローチにおいて、5分後開始を阻害することによって翻訳反応を同期化
し、そして後の時間ミクロソームを連続的に添加した。ミクロソーム添加前に翻
訳を起こさせる期間に無関係に、合成されるCtmPrPの百分率は一定に止まること
を我々は発見した（第2図B）。再び、転位能力を喪失したと推定される新生鎖の
百分率が増加したために、シグナル切断の効率は後の時点において減少した。
【００７０】 最後に、ターゲッティング工程それ自体を同期化した。これらの実験において
、PrP mRNAを規定した長さでトランケートし、ミクロソーム膜の非存在下に翻
訳した。生ずるリボソーム関連新生鎖はそれ以上の翻訳の非存在下にトランスロ
ケーションに対してコンピテントに止まり、そして引き続くミクロソームの添加
により同期的にターゲッティングすることができる（Perara他、1986、前掲）。
ターゲッティング後、リボソームを解体し、PrPのC末端の小さい部分のみを欠如
するトランケーテッドPrP鎖により達成されたトポロジーを、共翻訳的にターゲ
ッティングされた同一トランケーテッド産物と比較した。PrPのこの223マーのタ
ーゲッティングの同期化は観測されるトポロジー的形態の相対比に影響を与えな
いことを我々は発見した（第2図C）。その上180マーについて、同様な結果が得
られた（データは示されていない）。総合すると、これらの実験が集合的に示す
ように、PrPのターゲッティング工程の反応速度論の操作は達成される最終トポ
ロジーを変更するために不十分である。これらの発見から、シグナル配列内にコ
ード化されたトポロジー特異的情報はターゲッティングを越えた段階において作
用することを我々は推定する。
【００７１】 ターゲッティングの反応速度論の差はPrPトポロジーに対するシグナル配列の
影響を説明することができないので、シグナル配列の作用の他の部位、ER膜に我
々は転向した。ER膜におけるシグナル配列の認識事象はトランスロケーション間
に初期に起こるように思われ、堅固なリボソーム−膜連結の確立に先行する。プ
レプロラクチンおよびプレ−β−ラクタマーゼのシグナル配列がトランスロケー
ション機構によるそれらの認識メカニズムの先天的差をコードする場合、これら
の差は連結の状態において発現されるであろう。
【００７２】 プレプロラクチンおよびプレ−β−ラクタマーゼの短いトランスロケーション
中間体を、プロテイナーゼK（PK）、すなわち、リボソーム−膜連結の状態のプ
ローブに対する感受性について分析した。以前の報告（Connolly他、J. Cell.
Biol.（1989）108：299−307；JungnickelおよびRapoport、Cell（1995）82：
261−270）と一致して、連結の堅固なシールはプレプロラクチン86マーをタンパ
ク質分解的攻撃から遮断した。対照的に、プレ−β−ラクタマーゼ84マーは消化
に対して非常に感受性であり、開いたリボソーム−膜連結を示した（第3図A）。
この差がシグナル配列の機能に帰するかどうかを決定するために、プレプロラク
チンおよびプレ−β−ラクタマーゼのシグナル配列を交換した（構築物βL−PrP
およびPrl−βL）。βL−Prlの81マーはプロテアーゼ消化に対してアクセス可能
であるが、Prl−βLの93マーはそうでないことを我々は発見した（第3図A）。ほ
ぼ30アミノ酸より長いトランスロケーション中間体を使用して、同様な結果が得
られた（データは示されていない）。これらのデータが示すように、シグナル配
列は分泌タンパク質の初期の生合成間のリボソーム−膜連結の状態に異なるよう
に影響を及ぼすことができる。
【００７３】 上記結果が与えられると、シグナル配列によるリボソーム−膜連結のモジュレ
ーションは、PrPトポロジーの調節についてもっともらしいメカニズムであるよ
うに思われた。そのような場合において、細胞質ゾルにおけるN末端を有するPrP
のトポロジー的形態（CtmPrP）は、トランスロケーションにおける初期に堅固な
リボソーム−膜連結を確立しなかった鎖から発生することを期待することができ
る。この仮説を試験するために、PrP、Prl−PrP、およびβL−PrPの長さが増加
するトランスロケーション中間体をERにおいて組立て、沈降により非ターゲッテ
ッド鎖から分離し、そしてリボソーム−膜連結の状態をPK消化により分析した（
第3図B）。
【００７４】 61マーの野生型PrPに対応する点においてトランケートするとき、すべての3つ
の基質はプロテアーゼに対して完全にアクセス可能であり、こうして堅固な連結
を確立することができなかった。しかしながら、トランスメンブランドメインの
合成前においてさえ、3つの構築物はわずかに52アミノ酸長さのトランスロケー
ション中間体において異なるプロテアーゼアクセス可能性を示す。Prl−PrPは、
非常にわずかのCtmPrPをつくり、この点において消化から非常に遮断されるが、
βL−PrP鎖のより大きい百分率はプロテアーゼに対してアクセス可能である。こ
のトランケーション点において、すべての3つの構築物は高濃度の塩を使用する
膜からの抽出に対して抵抗性であり（0.5Mの酢酸カリウム；データは示されてい
ない）、リボソームがトランスロケーションチャンネルに安定に関連することが
示唆される。さらに、βL−PrP新生鎖は生合成を通じてPrl−PrP鎖よりもいっそ
うPKに対してアクセス可能に止まる。保護されない鎖の大部分は、多分開いた連
結の結果として、それらのシグナル配列を保持する。鎖長さが増加するすべての
3つの基質におけるプロテアーゼ保護の観測される減少は、NunPrpの合成間に連
結が開いていることを反映することが推測される。総合すると、これらの結果が
示すように、リボソーム−膜連結のシグナル配列仲介調節は、引き続くトランス
ロケーション事象について劇的な結果を有することができる。
【００７５】 最終のトポロジーを支配するリボソーム−膜連結の推定上の役割は、連結を調
節するトランス作用性因子がPrP生合成に影響を及ぼすことができることを示唆
する。TRAM糖タンパク質はシグナル配列と相互作用して、リボソーム−新生鎖複
合体とトランスロコンとの間の開始アソシエーションを促進するとことが考えら
れる（Voigt他、J. Cell. Biol.（1996）134：25−35）。いくつかの基質（例
えば、プレプロラクチン）のシグナル配列はトランスロケーションについてTRAM
に依存しないが、大部分（プレ−β−ラクタマーゼを包含する）はTRAM依存性で
ある（Gorlich他、Nature（1992）357：47−52；GorlichおよびRapoport、Cell
（1993）75：615−630；Voigt他、1996、前掲）。TRAMは他の基質のトランスロ
ケーション間のリボソーム−膜連結の調節にさらに関係づけられた（Hegdeら、C
ell（1998）92：621−631）が、こうして機能の研究はPrPトポロジーにおけるTR
AMについての直接的または決定的役割を証明することができなかった（Hegdeら
、Mol. Cell（1998）2：85−91）。こうして、シグナル配列のTRAM依存的特徴
をPrPトポロジーにおけるその役割から解離することが可能であることを我々は
理由づけた。
【００７６】 トポロジーを示差的に修飾するが、TRAMに対して依存的でないPrPシグナル配
列内の突然変異を同定することを我々は探求した。シグナル−アンカータンパク
質のトポロジーに対する電荷の効果の類似性（例えば、Siposおよびvon Heijne
、Eur. J. Biochem.（1993）213：1333−1340；Spiess、FEBS Lett.（1995）
369：76−79）により、PrPシグナル配列中の非保存的突然変異がPrP生合成に影
響を与えることを我々は理由づけた。シグナル配列の疎水性コアを無傷のままに
残して効率よいターゲッティングを可能として、コドン2および3またはコドン4
および5をアルギニンまたはアスパラギン酸のコドンと置換した（それぞれ、PrP (R2 ，3)、PrP(D2，3)、PrP(R4，5)およびPrP(D4，5)；第4図A参照）。PrP(R2，3 ) およびPrP(R4，5)のトポロジーの分析はCtmPrP合成の減少を明らかにしたが、P
rP(D2，3)およびPrP(D4，5)の両方はCtmPrP合成の増加を示した（第4図B）。
【００７７】 これらの突然変異シグナル配列のTRAM依存性を評価するために、それらの各々
をプレプロラクチンに天然プレプロラクチンシグナル配列の代わりに融合した。
精製したTRAMを含有するか、あるいは欠如する糖タンパク質消耗プロテオリポソ
ームの中に転位するこれらの構築物の能力を測定した。TRAMを転位させることを
必要とする鎖の百分率として、TRAM依存性を定義した。すべての4つの突然変異
したシグナル配列は、PrPトポロジーに対する分岐した効果を有するにかかわら
ず、野生型PrPシグナル配列よりもTRAM依存性が低いことを我々は発見した（第4
図C）。こうして、PrPシグナル配列のTRAM依存性はトポロジーの調節におけるシ
グナル配列の役割から解離することができ、シグナル配列がトポロジーに影響を
及ぼす従来未知のメカニズムを示す。
【００７８】 膜スパニングドメインにおける突然変異はPrPのトポロジーに影響を及ぼすこ
とができる（Hegde他、Science（1998）279：827−834）。トランスメンブラン
（TM）ドメインは、シグナル配列と同様に、リボソーム−膜連結の変化を誘発す
ることができる（Liao他、Cell（1997）90：31−41）ので、これらの2つのドメ
インがトポロジーを調節するメカニズムが関係づけられることはもっともらしい
。ちょうどある種のシグナル配列がリボソーム−膜連結を開くように、PrPのTM
ドメインは連結の開口を誘発することができる。このシナリオにおいて、CtmPrP
に好適なTMドメインの突然変異は野生型PrPよりも連結のより大きい開口を誘発
するが、secPrPに好適な突然変異は閉じた連結を維持する作用をするであろう。
我々はシグナル配列およびTMドメインの両方における変化の種々の組合わせを含
有するPrP構築物を分析することによって、この仮説を試験した。
【００７９】 TMドメインにおいて保存されたアラニンをバリンと置換すると、CtmPrPトポロ
ジーで作られたPrPの比率を著しく増加させる（Hegde他、Science（1998）279：
827−834）。これらの突然変異の1つ［分子のほぼ40％をCunPrP形態で発生させ
るPrP(AV3)］を、プレプロラクチンまたはプレ−β−ラクタマーゼのシグナル配
列［Prl−PrP(AV3)およびβL−PrP(AV3)］で操作した。AV3突然変異がシグナル
配列に対して独立にリボソーム−膜連結の開口を引き起こす場合、PrP(AV3)構築
物はPrP(AV3)とほぼ同程度にCunPrPを合成するであろう。驚くべきことには、Pr
l−PrP(AV3)はCtmPrP合成をほとんど検出不可能なレベルに減少させることを我
々は観測した（第5図A、中央のパネル）。逆に、βL−PrP(AV3)はほとんどもっ
ぱらCunPrPをつくる（第5図A、右のパネル）。
【００８０】 同様に、前述の仮説によれば、secPrP合成に好適なTM突然変異はリボソーム−
膜連結を閉じさせるであろう。secPrPのみをつくるTM突然変異PrP(G123P)のシグ
ナル配列をプレプロラクチンまたはプレ−β−ラクタマーゼのシグナル配列［Pr
l−PrP(G123P)およびβL−PrP(G123P)］で置換したとき、すべての3つの基質はs ec PrPとしてのみ合成されることを我々は発見した。しかしながら、リボソーム
−膜連結の閉鎖は全体のトランスロケーション効率を刺激するであろう。なぜな
ら、閉じた連結を使用して合成された鎖は、リボソームからの出口の唯一のオプ
ションとして、ER内腔を有するからである。その代わりに、βL−PrP(G123P)の
転位はPrP(G123P)およびPrl−PrP(G123P)に比較して比較的劣っていることを我
々は発見した。この結果が示すように、G123P突然変異はそうでなければCtmPrP
となる鎖のトランスロケーションを防止するよりむしろ、リボソーム−膜連結を
閉鎖することによってsecPrPの産生を必要としない。
【００８１】 上記発見が示唆するように、シグナル配列に対して独立に作用するよりむしろ
、TMドメインはシグナル配列の先行する作用により拘束される。TMドメインがシ
グナル配列により支配されるリボソーム−膜連結の状態を担持するかどうか直接
的に試験するために、TMドメインの出現後のある点においてPrl−PrP(AV3)およ
びβL−PrP(AV3)についての連結の状態を分析した。TMドメインの同一性に無関
係に、連結はβL−PrP(G123P)について開口し、そしてPrl−PrP(AV3)について閉
鎖して止まることを我々は発見した。これらの結果が示唆するように、リボソー
ム−膜連結に対するシグナル配列の初期作用は、TMドメイン合成前においてさえ
、引き続くトポロジーの測定に対して決定的である。
【００８２】 TMドメイン合成前にPrP鎖がトランスメンブラントポロジーに付されるという
観測は予期せざることであった。主要な調節工程を合成のこのような初期時点に
配置することがなぜ重要であるか？ 1つの可能な理由は、TMドメインが合成さ
れたとき、生合成における後の時点においてPrPのフォールディングにおけるあ
る初期事象が容易には可逆的でないことである。こうして、これらの初期のフォ
ールディング事象を一時的にかつ空間的に制限された方法で開始することが重要
であることがある（N末端が2つの環境的に異なる区画の1つの中に究極的に存在
できることが与えられると）。この可能性を検査するために、トポロジーが形式
化されてしまう前の時間にトポロジー特異的方法で開始される、PrPとタンパク
質フォールディングの機構との間の相互作用を同定することを我々は探求した。
【００８３】 初期実験において、PrP(G123P)またはPrP(AV3)との優先的アソシエーションを
表示するタンパク質を同定するために架橋を使用した。いくつかのタンパク質は
両方の基質と比較できるほどに相互作用するが、65kDaのタンパク質（p65）はPr
P(AV3)よりもPrP(G123P)により強く架橋する（第6図A）。次いで同一位置におい
てトランケートしたPrl−PrPおよびβL−PrPを同様に分析し、p65はPrl−PrPに
架橋することが見出され、secPrPトポロジーで作られるプロセスにおける新生Pr
P鎖がこの因子と特異的にアソシエートすることを示唆する（第6図B）。PrP生合
成間にこの相互作用が開始されるときを決定するために、Prl−PrPおよびβL−P
rPの初期トランスロケーション中間体をこの架橋の異なる存在について検査した
。顕著には、p65およびわずかにより小さいタンパク質は、野生型PrPのコドン11
3においてトランケートされたPrl−PrPトランスロケーション中間体に優先的に
架橋することを我々は発見した（第6図C）。こうして、生合成の非常に初期にお
ける新生PrP鎖とのp65のアソシエーションは、究極的にsecPrPトポロジーで作ら
れたという基質の性向と相関する。
【００８４】 p65架橋付加物の生化学的性質を利用して、このタンパク質を精製し、同定し
た。この付加物はサポニンにより抽出可能であり、p65の内腔局在化を意味した
；それはスクロース勾配分析により4Sタンパク質として移動し、それがモノマー
であることを示唆した；それはConA−セファローズコロニー上に保持され、p65
がグリコシル化されていることを示した；そしてそれはまたQ−セファローズカ
ラム上に保持され、そうでなければ純陽性PrP分子上のp65により付与される純陰
性電荷を示唆した。これらの性質がイヌ粗面ミクロソームの段階的分画において
組合わされたとき、単一の主要な65kDaのタンパク質が精製された（第6図D）。
このタンパク質の臭化シアン切断により発生したペプチドフラグメントを配列決
定すると、それはシャペロンのタンパク質ジサルファイドイソメラーゼ（PDI）
の膵臓特異的メンバーであるPDIpとして同定された（Desilva他、Cell Biol.（
1996）15：9−16；Elliott他、Eur. J. Biochem.（1998）252：372−377）。 PDIpとしてのp65の同一性は、PDIpに対して発生させた抗体を使用する免疫沈
降により確認された（第6図E）。さらに、わずかにより小さい架橋相手は偏在的
PDIに対する抗体により免疫沈降され、PrPとタンパク質のこのファミリーとの間
の特異的相互作用が示された。免疫沈降の研究により、PDIおよびPDIpの両方は
βL−PrPよりもPrl−PrPに強く架橋することが確認された（第6図E）。また、PD
Iに対するsecPrPを好む構築物の示差的架橋は、PrPを優先的に発現する組織であ
る脳から単離されたミクロソームにおいて観測された。この場合において、偏在
的PDIに対する架橋のみが観測され、PDIpが脳組織において発現されないという
以前の観測と一致した（Desilva他、1996、前掲）。
【００８５】 次に、secPrPが生合成間の初期に任意の他の内腔タンパク質と相互作用するか
どうかを決定することを探求した。サポニン抽出可能な架橋物を検査すると、se c PrPを好む構築物［PrP(R2，3)およびPrP(R4，5)］とほぼ30kDa、60kDa、および
65kDaのタンパク質との間の顕著な相互作用が明らかにされた（第6図F）。CunPr
Pを好む突然変異体［PrP(D2，3)およびPrP(D4，5)］に対する同様な架橋は顕著
に減少した。期待されるように、60kDaおよび65kDaの架橋物は免疫沈降によりPD
IおよびPDIpとして同定された（データは示されていない）。30kDaの架橋相手の
同一性は未知のままである。これらの架橋物は、単にsecPrPの内腔局在化の偶発
的結果として観測されない。なぜなら、プレプロラクチンの初期中間体を使用し
て内腔タンパク質に対する顕著な架橋物は観測されなかったからである。総合す
ると、架橋データが示すように、初期PrP生合成におけるシグナル配列仲介事象
の1つの結果は、新生鎖と、引き続いてその生合成に参加する因子との間の示差
的相互作用を促進することである。
【００８６】 実施例2 プリオンタンパク質の変更されたトポロジーの病原性は 遺伝学的および感染プリオン疾患に対して普通である プリオン疾患は感染性、散在性および遺伝的であることがある（Prusiner、S.
B.、PNAS（1998）95：13363−13383；Weissmann、C.、J. Biol. Chem.（1999
）274：3−6；Johnson、New Eng. J. Med.（1998）339：1994−2004；Horwic
h、Cell（1997）89：499−510）。これらの疾患の感染性形態、例えば、ウシ海
綿状脳症およびクロイツフェルト・ヤコブ病は、通常、伝達可能な病原性の脳内
蓄積、およびPrPScと命名するプリオンタンパク質（PrP）の異常にフォールドさ
れたイソ型により特徴づけられる。しかしながら、PrPのトランスメンブラン形
態であるCtmPrPの好適な合成による研究（Hegde他、Science（1998）279：827−
834）によるよりむしろ、ある種の遺伝したPrP突然変異はPrPScの非存在下に神
経変性を引き起こすように思われる（Brown、Ann. Neur.（1994）35：513−529
；Tateishi、J.他、Neurology 1990、40：1578−1581；Tateishi、Neurology（
1996）46：532−537；Tateishi、J.他、Brain Pathology（1995）5：53−59）
。PrPにおけるある種の突然変異（ヒトプリオン疾患関連A117v突然変異を包含す
る）は小胞体（ER）における生合成を変更し、より高い百分率のPrP分子をトラ
ンスメンブラン形態CtmPrPで合成させる。トランスジェニックマウスにおけるCt m PrPを好む突然変異の発現は、プリオン疾患において観測されるものに類似する
神経変性的変化を生じた（Hegde他、Science（1998）279：827−834）。CtmPrP
を好む突然変異の検出が示唆するように、脅威が増強したCtmPrPは神経変性を引
き起こす（Hegde他、Science（1998）279：827−834）が、この神経変性メカニ
ズムが伝染性プリオン疾患の病原性に関係するかどうかは不明瞭であった。これ
を探査するために、CunPrPを形成する性向が異なる突然変異PrPトトランスジー
ンを使用して問題のマウスを発生させ、引き続いてPrPSc誘導神経変性に対する
マウスの感受性を評価した。
【００８７】 無細胞翻訳およびトランスロケーション SP6ポリメラーゼを使用する関係するコーディング領域の転写、イヌ膵臓から
のミクロソーム膜を含有するウサギ網状赤血球ライゼイト中の翻訳、およびタン
パク質分解は本質的に以前に記載された通りであった（Hegde他、Science（1998
）279：827−834）。翻訳反応を32℃において40分間実施し、0.5mg／mlのPKを使
用してタンパク質分解反応を0℃において60分間実施した。産物をR073抗体を使
用して免疫沈降させ（Rogers、M.他、J. Immun. 1991、147：3568−3574）、1
5％のアクリルアミドゲル上のSDS−PAGEにより分離し、オートラジオグラフィー
により可視化した。
【００８８】
【表１】
【００８９】 以前に記載されているようにを発生させた（Manson他、Neurodegeneration（199
4）3：331−340およびその中の参考文献）。脳組織のホモジネートを13A5mAbで
イムノブロッティングし（Kascsak、R.J.、J. Virology 61：3688−3693）、
正常ゴールデンハムスターの脳組織の連続希釈物と比較することによって、PrP
発現をアッセイした（第8図bおよび表1）。以前に記載されているように、これ
らのマウスを自発的病気の発生について観測した（Prusiner、Ann. Neur.（198
2）11：353−358）。Tg［SHaPrP］／Prnp0/0（系統A3922）9をTg［MoPrP］／Prn
p0/0（系統B4053）に対して交雑させることによって、SHaPrPおよびMoPrPの両方
を発現する二重トランスジェニックマウス（第11図参照）を発生させた（Tellin
g、Genes Dev.（1996）10：1736−1750）。以前に記載されているように、1％
の脳ホモジネート（w／v）をマウス（30μl／動物）またはハムスター（50μl／
動物）に脳内接種することによって、伝染性（第10図参照）を評価した（Prusin
er、Ann. Neur.（1982）11：353−358）。ハムスタープリオンのSc237系統（第
9図において使用した）およびマウスプリオンのRML系統（第11図において使用し
た）は以前に記載された（Marsh、J. Infect. Dis.（1975）131：104−110；C
handler、Lancet（1961）1：1378−1379）。
【００９０】 CtmPrPおよびPrPScについての脳の評価 脳組織（新しく取出したまたは液体窒素中のフラッシュ凍結後に−80℃におい
て貯蔵した）を、PBS（5％w／vまたは10％w／v）中で16、18および20ゲージの針
を連続的に通過させることによって均質化した。CtmPrP検出（「温和な」タンパ
ク質分解条件）のために、試料の17μlのアリコート（25μg／μlの濃度）を1％
のNP−40、0.25mg／mkのPKに調節し（20μlの最終体積）、氷上で60分間インキ
ュベートした。PrPSc検出（「苛酷な」タンパク質分解条件）のために、17μlの
試料（25μg／μlの濃度）を0.5％のNP−40、0.5％のデオキシコレート、0.1mg
／mkのPKに調節し（20μlの最終体積）、37℃において60分間インキュベートし
た。温和な／苛酷な消化条件の間の差は、操作的であるが、インキュベーション
の37℃の温度変化、および非イオン性洗浄剤／非イオン性およびイオン性洗浄剤
の混合ミセルを含むので、微妙ではないことに注意すべきである。PMSFを5mMに
添加し、さらに5分間インキュベートし、試料を5体積の沸騰する1％SDS、0.1Mの
Tris、pH8.9に移すことによって、タンパク質分解反応を停止させた。次いで試
料を製造業者の使用説明書に従いPNGアーゼで消化し、10％トリシン−SDS−PAGE
により分割し、イントロセルロースに移し、3F4または13A5モノクローナル抗体
（Kascsak、J. Virol. 61：3688−3693）、またはR073ポリクローナル抗体（R
ogers、J. Immunol.（1991）147：3568−3574）でプロービングした。結果 ERにおいて合成されるCtmPrPの量を変更するゴールデンハムスター（Sha）PrP
ので4つの突然変異体のin vitroトランスロケーション産物を第8図aに示す。FV
B／Prnp0/0バックグラウンドの中にこれらの突然変異体PrPの各々を発現するト
ランスジェニックマウスを発生させ、特性決定した（表1および第8図b参照）。T
g［SHaPrP（KH→II）H］、Tg［SHaPrP（KH→II）M］およびTg｛SHaPrP（N108I） H ］マウスは、それぞれ、ほぼ60、472、572および312日に神経変性疾患の徴候お
よび病徴を発生することが観測された（第8図cおよび表1）。対照的に、Tg［SHa
PrP（△STE）］マウスおよびより低いレベルの疾患関連トランスジーンを発現す
るマウス｛Tg［SHaPrP（KH→II）L］、Tg［SHaPrP（A117V）L］およびTg［SHaPr
P（N108I）L］｝のいずれも自発的疾患を発生しなかった（表1；データは示され
ていない）。これらの系統のトランスジェニックマウスの各々からの脳組織の生
化学的分析はCtmPrPの増加を明らかにしたが、疾患を発生した系統においてPrPS c を示さなかった（第8図b）。総合すると、第8図中のデータはPrPのCtmPrP形態
の合成の増加が神経変性疾患の発生に関連する点を要約する。
【００９１】 2つの方法において見られる、CtmPrPと疾患の重症度との間の明らかな投与量
応答はいっそう顕著である。第1に、CtmPrP合成がERにおいて好適であることが
いっそう強くなるほど（KH→II＞N108I＞A117V）、自発的疾患の開始はいっそう
早くなる（表1）。第2に、これらの突然変異体の各々の発現レベルが明らかな限
界値より下に低下すると、CtmPrPの発生（第8図dおよび参考文献9）および疾患
の発生（表1）は阻害される。さらに、KH→II突然変異を発現する3つのトランス
ジェニック系統は、それらのそれぞれの発現レベルに逆に相関する時間に疾患を
発生する（表1）。これらの観測により、CtmPrPに好適な量の突然変異およびそ
の発現レベルの両方が神経変性の発生に寄与することが証明される。
【００９２】 CtmPrPを作る異なる性向を有するトランスジェニックマウスのこのパネルを使
用して、CtmPrPとPrPScとの間の関係を分析した。まず、同一レベルのトランス
ジーンを発現するが、CtmPrPを作る性向が異なるトランスジェニックマウスのPr
PScに対する感受性を検査した：Tg［SHaPrP（□STE）］およびTg［SHaPrP（A117
V）H］。Sc237ハムスタープリオンを接種すると、Tg［SHaPrP（□STE）］および
Tg［SHaPrP（A117V）H］マウスは、それぞれ、ほぼ323および54日に病気を発生
することを我々は発見した（第9図a、表1）。疾患開始時において代表的マウス
を生化学的に分析すると、Tg［SHaPrP（□STE）］マウスはTg［SHaPrP（A117V） H ］マウスよりも実質的に多いPrPScを含有することが明らかにされた（第9図b）
。こうして、より高いCtmPrPを発生するトランスジェニック系統はPrPScに対し
ていっそう感受性であり、より低いレベルの全PrPSc蓄積で疾患を発生する。
【００９３】 次に、Tg［SHaPrP（KH→II）L］対Tg［SHaPrP（A117V）H］のSc237に対する感
受性を比較した（第9図c）。突然変異を一定に保持することによって、増殖に対
する潜在的バリヤーに関する発生を回避するが、なお発現レベルをモジュレート
することによってCtmPrPを発生する性向を変化させる。期待されるように、発現
レベルを低下させると、Sc237接種後の疾患に対する潜伏期が増加した。しかし
ながら、より顕著には、KH→IIおよびA117Vの両方の突然変異体を使用すると、
より低いレベルの発現因子は疾患開始時により高いレベルのPrPSCを含有するこ
とを我々は発見した（第9図f）。異なるレベルの野生型PrPを発現するマウスを
使用して、疾患における発現レベルとPrPSCの量との間の同様な逆の関係が観測
された（10参照）。こうして、前述したように、OtmPrPを形成する性向が減少し
たマウスは疾患の開始時により高いレベルのPrPSCを蓄積した。上記接種データ
を単一のプロットに統合するために、Ctm指標と命名する測度を使用してCtmPrP
を発生する相対性向により、異なる系統のトランスジェニックマウスを等級づけ
た（表1参照）。CtmPrPトポロジーで合成された鎖の百分率にトランスジーンの
発現レベルを掛け、こうしてCtmPrP発生に影響を及ぼす2つのパラメーターを組
込むことによって、この指標を誘導する。Ctm指標と疾患開始に蓄積したPrPSCの
量との間に、明瞭な関係が存在することを第9図gは示す。この関係は、疾患を引
き起こすPrPSCの能力がCtmPrPを発生する宿主の性向の関数であることを示唆す
る。
【００９４】 第9図中のデータは2つの重要な点を証明する。第1に、種々の系統のトランス
ジェニックマウスを接種すると、臨床的疾患の開始時に非常に異なるPrPSc蓄積
レベルが観測される。各場合においてマウスの系統が同一であり、唯一の差がPr
Pトランスジーンの特質および発現レベルであるとき、プロテアーゼ耐性PrPScの
蓄積が疾患の最も近い原因でないであろうという結論をこの観測は強調する；引
き続く事象（CtmPrPを明らかに包含する）が関係することが推測される。第2に
、PrPScの蓄積量とCtmPrPの発生をモジュレートする因子との間の関係が存在す
る。このような関係が示すように、CtmPrPおよびPrPScはそれらが直接的または
間接的に互いの代謝に影響を及ぼすことができる経路の一部分である。
【００９５】 第9図g中のデータを調和させる1つの方法は、PrPScの蓄積がCtmPrPの発生を増
加させ、次いでCtmPrPが神経変性を誘発する場合である。こうして、CtmPrPを発
生する性向が増強した（すなわち、Ctm指標が高い）トランスジェニックマウス
は、疾患を引き起こすために必要な限界値を越えてCtmPrP発生が増加する前に、
より少ないPrPScを必要とするであろう。このモデルは第9図gにおいて観測され
る逆の関係を説明し、2つの追加の予測を作る。第1に、CtmPrP形態のPrP合成を
実質的に好むトランスジェニックマウスは神経変性疾患の発生におけるPrPScの
要件を完全に回避するので、このようなマウスからの組織は感染性ではないであ
ろう。第2に、感染性プリオン疾患においてPrPScが蓄積する過程間に、CtmPrPレ
ベルは増加するであろう。これらの予測を試験した。
【００９６】 CtmPrP関連疾患の伝染性を評価するために、臨床的に病気のTg［SHaPrP（KH→
II）M］マウスからの脳ホモジネートを4つの宿主に脳内に接種した：i）低いレ
ベルでKH→II突然変異を発現するTg［SHaPrP（KH→II）L］マウス、ii) 野生型S
HaPrPを過剰に発現するTg［SHaPrP］マウス、iii) PrP遺伝子がホモ接合的に崩
壊したFVB／Prnp0/0マウス、およびiv) ゴールデンハムスター。第10図に示すよ
うに、末期的に病気のTg［SHaPrP（KH→II）H］マウスからのホモジネートは、3
つの独立の宿主において直接的に比較したとき、対照Tg［SHaPrP］ホモジネート
と異なる速度で神経学的病気を誘導しなかった。さらに、接種後625日までにお
いて第10図からの代表的脳組織を生化学的および病理学的に検査すると、実験動
物または対照動物においてPrPScまたは神経学的疾患の証拠は示されなかった（
データは示されていない）。しかも、Sc237を使用するTg［SHaPrP（KH→II）L］
マウスの接種は脳においてPrPScを容易に発生し（第2図c）、これは疾患をTg［S
HaPrP（KH→II）L］およびTg［SHaPrP］マウスに疾患を再び伝染させた（データ
は示されていない）。こうして、PrP（KH→II）ｈａPrPScに形成されることがで
きるが、Tg［SHaPrP（KH→II）H］マウスにおけるCtmPrP関連疾患は検出可能PrP Sc を発生せず、したがって感染性ではない。伝染の欠如は、これらの遺伝学的プ
リオン疾患における神経変性がCtmPrPにより直接的にを引き起こされるという仮
説のための支持を提供する。第9図g中のデータに基づいてなした第2予測は、感
染性プリオン疾患におけるPrPScの蓄積がCtmPrPの発生を増加させ、これは引き
続いて神経変性に導くということである。不都合なことには、この予測の試験は
蓄積するPrPScの生化学的PrPにより妨害される（Meyer PNAS（1986）83：2310
−2314）。その分画において高度にプロテアーゼ耐性でありかつ不均質性である
ことによって、それはすべての細胞下画分を実質的に汚染する傾向がある。さら
に、それはCtmPrP検出のアッセイを妨害し、このアッセイもまたプロテアーゼか
らの保護に基づく。PrPScは細胞により容易には分解されず、非常に高いレベル
に蓄積し12、非常に少量の細胞下画分の汚染であってさえCtmPrPの微妙な増加の
検出を困難とする。こうして、新しく合成されたPrPのトポロジーに対する蓄積
するPrPScの効果をモニターするために別の方法を必要とする（第11図a参照）。
【００９７】 このような実験を設計するために、これらの観測を利用した。第1に、PrPSc変
換に対する種バリヤーがマウスとゴールデンハムスターとの間に存在する（Prus
hiner、Cell（1990）63：673−686；Pattison、Res. Vet. Sci.（1968）9：40
8−410）。第2に、PrPSc形成に対する種バリヤーと対照的に、合成、トランスロ
ケーションまたはトポロジーにおける種特異的差はマウスPrP（MoPrP）とSHaPrP
との間において観測されない（Hegde、Science（1998）279：827−834）。そし
て最後に、SHaPrPに対して高度に特異的なモノクローナル抗体（これはMoPrPと
交差反応しない）は、これらの2つのPrPトランスジーン12の発現を区別するため
に有効である。こうして、このような二重トランスジェニック動物において、マ
ウスPrPScの蓄積の過程間における「リポーター」としてハムスターCtmPrPの形
成を使用することができる。この実験のために、MoPrPおよびSHaPrPの両方を合
成する二重トランスジェニック動物にマウスプリオン（RML系統の）を接種する
。次いで、PrPScの蓄積および疾患の発生の時間過程間の種々の間隔において、
個々のマウスを殺し、全PrPScの蓄積およびハムスターCtmPrPの存在について検
査する（第4図a参照）。この原理は、接種後、MoPrPのみがプリオン複製およびP
rPScの形成のための基質であることである13。細胞が発生する（または発生しな
い）能力に対するこのPrPSc蓄積の効果を、SHaPrPの検査により評価することが
できる。
【００９８】 臨床的疾患はこれらの動物において接種後ほぼ9週に発生することが認められ
る（データは示されていない）。この9週の時間過程間にPrPScはこれらのマウス
において蓄積し、最も早い検出可能な時間はほぼ5〜6週であることを我々は発見
した（第11図b）。期待されるように、この研究における生化学的基準（第11図b
）と以前の研究13における感染性の基準とにより、SHaPrPはPrPScを形成したこ
とが認められなかった。しかしながら、顕著には、SHaPrPを検査すると、CtmPrP
の量の有意な増加が認められた（第11図c）。接種しなかったマウスの平行の組
において、このような増加は観測されなかった（データは示されていない）。こ
れらの発見は、CunPrPが伝染性形態のPrPの非存在下に神経変性を引き起こすこ
とができるという観測（参考文献9、第8図および第10図）と組合わせると、PrPS c の蓄積はCunPrPの合成を新たに誘導することによって疾患を引き起こすことが
できることを示唆する。
【００９９】 本明細書に記載する発見は、PrPSc蓄積、CtmPrP形成および代謝の事象、およ
び神経変性疾患の発生の間の原因となる関係を示唆する。証拠のこれらの相補的
かつ独立的に記載はこの結論をを示す。第1に、CtmPrPの発生をある種の限界値
を越えて増加させる（PrP突然変異と発現レベルとの組合わせをモジュレートす
ることによって）と、PrPSc形成の非存在下に神経変性が生ずる（第8図、第10図
および参考文献9）。第2に、神経変性疾患を引き起こすために必要な蓄積したPr
PScの量は、CtmPrPを発生する宿主の性向により影響を受ける（第9図）。そして
第3に、脳はPrPScの蓄積過程間に増加するレベルのCtmPrPを含有するように思わ
れる（第11図）。総合すると、データはプリオン疾患の病原性における3つの連
続的段階を示唆する（第12図）。
【０１００】 感染性プリオン疾患は、段階Iの工程、PrPScの蓄積を開始することによって働
くことが提案される。遺伝学的プリオン疾患は、原理的には、段階IまたはIIの
いずれかにおいて働くことができるであろう。問題のPrP突然変異がPrPScの自発
的形成生ずる場合、段階Iは開始され、PrPScは複製し、蓄積し、引き続いてCtmP
rPを増加させる（段階II）。このようなメカニズムは、クロイツフェルト・ヤコ
ブ病のある種の遺伝学的変異型を引き起こすと考えられるE200K突然変異16につ
いてもっともらしい。こうして、PrPScはこれらの患者の17において見られ、そ
して疾患は実験動物に対して容易に伝染性である7。選択的に、ある種の他のPrP
突然変異は、CtmPrP発生を直接的に増加させることによって、段階Iを完全にバ
イパスすることができる。ヒトゲルストマン・ストラウセル・シェインケル18病
を生ずるA117V突然変異は、このようなメカニズムにより働くことが推定される
。これはこの疾患が伝染性でない理由6〜8、およびPrPScがこれらの患者の脳組
織において検出されなかった6，9理由を説明するであろう。
【０１０１】 プリオン疾患における第1段階は、CtmPrPが、いったん発生すると、神経変性
疾患に導くメカニズムを包含する。これが起こるメカニズムおよび関係する細胞
内経路は完全に不明瞭のままである。しかしながら、CtmPrPが単にミスフォール
ドされ、ERの中に保持されまたは蓄積するか、あるいは変性されたタンパク質応
答を誘発することはないことが推定される。これはCtmPrPの本質的にすべてがER
を越えて輸送されたしまうという観測9により示唆される。ここでERは分泌経路
におけるタンパク質フォールディングのための現在既知の品質コントロール機構
の部位である19，20。さらに、Tg［SHaPrP（KH→II）M］動物を使用する場合ま
たはA117V突然変異を含有するGSSのヒトの場合におけるように、疾患は病理学的
レベルに密接したレベルで発現されたトランスジーンにより誘発されることがで
きる。こうして、CtmPrPが神経変性を誘導するいっそう選択的な手段は入手可能
なデータにより示唆される。
【０１０２】 第12図に記載するフレームワークは、将来の研究のいくつかの新しいルートを
示唆する。第1に、CtmPrPの生合成および輸送における調節された事象は解明さ
れるべきである。分画に適用可能な無細胞系におけるPrPのトランスロケーショ
ンおよびトポロジーの決定の初期の事象の再構築は、CtmPrP合成を調節するトラ
ンス作用性因子を同定する有望なルートであると思われる21，22。さらに、トポ
ロジーに影響を及ぼすいくつかの突然変異に利用可能性は、CtmPrP輸送の後の事
象を定めることを目的とする研究を促進するであろう。第2に、CtmPrP代謝の研
究から獲得された洞察は、これらの事象がPrPSc蓄積によりトランスモジュレー
トされる方法のよりすぐれた理解を疑いなく可能とするであろう。このような研
究は、PrPSc蓄積およびCtmPrP仲介神経変性の事象間の関係をいっそうよく描写
することが推定される。PrPSc蓄積が細胞のいくつかの代謝機能に対して衝撃を
与えることがわかると23，24，25、これらの1またはそれ以上は疾患を誘発するC tm PrP発生に影響を及ぼすことが推定される。PrPSc蓄積を越えた段階で作用して Ctm PrP仲介神経変性を直接引き起こすPrP突然変異体の入手可能性（参考文献9お
よび第8図）は、プリオン疾患の病原性における下流の事象の分析を促進するで
あろう。
【０１０３】 実施例3 タンパク質コンフォメーションに対するプロラクチン、ベータラクタマーゼ、 および免疫グロブリンG重鎖のシグナル配列の作用 一般に、適切にフォールドされるタンパク質とミスフォールドされるタンパク
質との間において二分法が受け入れられた（Ellgaad他（1999）Science 286：1
882−1888）。換言すると、タンパク質が2以上の適切にフォールドされた状態を
有することができ、さらに異なる時間または環境において他のフォールドされた
状態に対して1つを選択することができるという可能性は考慮されてきていない
。異なる方法でフォールディングする線形ポリペプチド配列は実質的に異なる形
状を有することができるので、この新しいレベルの調節はゲノムの情報含量およ
び細胞に対して有効な遺伝子発現の調節可能性を大きく増加する。この仮説を試
験するために、まず、3つの無関係の、簡単な分泌タンパク質、すなわち、プロ
ラクチン（Prl）、ベータラクタマーゼ（βlac）、および免疫グロブリンG重鎖
（IgG）を選択して、個々のシグナル配列が異なる新生鎖のそれらのようにER膜
を横切るそれら自身のパッセンジャー配列のトランスロケーション（第13図参照
）において等しく効率的であるかどうかを決定した。
【０１０４】 これらのcDNAのアリコートを3つのユニーク制限エンドヌクレアーゼ認識部位
の各々においてトランケートし、こうして転写するときトランケートされたcDNA
がこれらの分泌タンパク質のより長いC末端伸長された長さをコードするRNA転写
物を発生し、最後にミクロソーム膜を補充した無細胞翻訳系中でこれらの転写物
を発現するようにした。第14図において理解できるように、これらのシグナル配
列がそれら自身の新生鎖のトランスロケーションにおいて等しく高度に効率的で
あるという事実にかかわらず、プロテイナーゼKを使用する消化に対する新生ト
ランケーテッド鎖のアクセス可能性により測定して、異なる新生鎖のトランスロ
ケーションのためにラジカル的に異なるリボソーム−膜連結が確立される（第14
図の各パネルの右の絵参照）。
【０１０５】 最初にER膜に対するターゲッティングすると、すべての3つの鎖はプロテアー
ゼに対してアクセス可能に止まる（第14図A〜Cの左のパネル）。短時間後、プロ
ラクチンの場合において、堅固なシールが確立され、この時新生鎖はER内腔に直
接転位する（第14図Aの中央のパネル参照）。しかしながら、ベータラクタマー
ゼおよびIgG重鎖の場合において、リボソーム−膜連結は実質的に後の時点にお
いて開いたままでであり（第14図BおよびCの中央のパネル参照）、非常に後にお
いてのみ、それは効率よく閉鎖する（第14図BおよびCの右のパネル）。これが示
唆するように、異なるタンパク質は顕著に異なるリボソーム−膜連結を介してER
内腔に転位する。プリオンタンパク質（PrP）についての研究により示唆される
ように、シグナル配列がタンパク質フォールディングの調節に関係する場合、新
生鎖がフォールディングを開始する異なる環境を確立することによって、これは
一部分起こることができる。リボソーム−膜連結が開いたままであるとき、第14
図Bおよび第14図Cの中央のパネルにおけるように、鎖は細胞質ゾルの還元性環境
中でフォールディングを開始する；第14図Aの中央のパネルおよび第14図Bおよび
第14図Cの右のパネルにおけるように、リボソーム−膜連結が閉じるとき、フォ
ールドしないまたは部分的にフォールドした鎖はER内腔の酸化性環境に進行して
、フォールディングファンネル選択のプロセスを開始するか、あるいは続ける。
【０１０６】 前述したように（実施例1）プリオンタンパク質（PrP）の場合において、リボ
ソーム−膜連結の開いたおよび閉じた状態は、異なるようにフォールディングさ
れかつ異なるトランスメンブラントポロジー的形態である同一のポリペプチド配
列である、PrPの分泌形態／Ctm形態の合成に相関する。第14図中のデータは、リ
ボソーム−膜連結の状態とタンパク質のフォールディングとの相関を、簡単な分
泌タンパク質、例えば、プロラクチンおよび免疫グロブリン重鎖に拡張する。
【０１０７】 一部分シグナル配列が確立するリボソーム−膜連結の特質により、シグナル配
列がタンパク質フォールディングにおいて仮定した調節の役割を演ずる場合、2
つの異なる分泌タンパク質のシグナル配列の交換は、3つの予測の形態で、劇的
な結果を有するであろう： 第1に、シグナル配列の交換は新生鎖が存在する環境を変化させるであろう（
例えば、プロテイナーゼKでプロービングしてリボソーム−膜連結の変化により
、または新生鎖を化学的架橋により決定されるアソシエートするタンパク質の変
化により評価する）。プロラクチンシグナル配列の背後のプロラクチンの新生鎖
と、IgGシグナル配列の背後のプロラクチンの新生鎖との間の化学的架橋の1例は
第15図に示されている。PrPについて、実質的に同一の結論に到達する。
【０１０８】 第2に、2つのタンパク質のフォールディングは、異なる環境における異なるア
クセサリータンパク質との相互作用により2つの異なるフォールディングファン
ネルに向けられ、困難であることが推定される。これを記録する1つの方法は、
タンパク質コンフォメーションのリポーターとしてグリコシル化部位において操
作し、両方のシグナル配列がタンパク質から究極的に切断されてさえ、同一鎖が
1つのシグナル配列の背後に存在するが、他のシグナル配列の背後に存在しない
とき、同一鎖はグリコシル化されることを証明する方法である。これは第16図に
おいてプロラクチンについて証明されており、ここでそれ自身のシグナル配列（
Prl）または免疫グロブリン重鎖（IgG／Prl）、成長ホルモン（GH／Prl）のシグ
ナル配列の背後において、操作されたグリコシル化リポーターを使用する。第16
図Aにおける各パネルの第5レーンから理解できるように、異なるシグナル配列の
背後で作られた生ずる成熟プロラクチン鎖は、新生鎖にコアN−結合糖を付加す
るオリゴサッカリルトランスフェラーゼの能力により評価して、コンフォメーシ
ョン的に異なる。第16図Bはこの差を定量する。これらの構築物のトランケーシ
ョンの発現により、他に比較して1つのプロラクチンのグリコシル化の差は反応
速度論的現象でないことが明らかにされる。なぜなら、新生鎖を除外してトラン
ケートされ、したがって非成長性鎖の延長したインキュベーションはそれ以上の
グリコシル化を生じなかったからである。第16図Cが示すように、コンフォメー
ションの差は、グリコシル化により記録したとき、種々のシグナル配列の背後の
プロラクチンをコードする対応する構築物でトランスフェクトされたcos細胞の
培地中に分泌された物質から容易に明らかである。こうして、プロラクチンのコ
ンフォメーションは、異なるシグナル配列の背後のその合成により簡単に変化さ
れる。その差はシグナル配列の既知の役割により説明することができない。なぜ
なら、利用するすべてのシグナル配列は、それらの新生基質（第13図参照）およ
び修飾されたプロラクチンコーディング領域によりコードされる基質の両方のタ
ーゲッティングおよびトランスロケーションに対して等しくコンピテントである
からである。さらに、第16図において合成されるプロラクチンのすべてのコンフ
ォメーションは、培地の中へのそれらの分泌により評価して、品質コントロール
機構により適切にフォールディングされると判定される。
【０１０９】 第3の予測は次の通りである。すなわち、交換されたシグナル配列のいくつか
の場合において、シグナルと引き続くパッセンジャーとの間の「ミスマッチ」は
十分に苛酷であるので、完全にターゲッティングされた鎖であってさえER内腔の
中へのトランスロケーションとコンパティブルなフォールディングファンネルを
見出すことができず、その代わりに細胞質ゾルの中に「落下して戻り」、転位す
ることができない。正確には、無傷のER膜を使用して分泌形態でもみ発現される
ことができるPrP突然変異体について、この形態の欠陥は観測され、そして糖タ
ンパク質消耗再構成ミクロソーム膜におけるその発現は鎖の転位を不可能した（
Hegde他、（1998）Mol. Cel. 2：85−91）。
【０１１０】 第13図において、βlacおよびIgGシグナル配列の背後において、プロラクチン
は実質的なトランスロケーション欠陥を表示し（第13図A）、これはIgGの領域か
らの配列をシグナル配列に引き続いて導入することによって改善することができ
ることを我々は証明する（第13図Bおよび第13図C）。さらに、糖タンパク質消耗
再構成膜を横切る突然変異体PrPのトランスロケーションにおける欠陥は、PrPシ
グナル配列をプロラクチンのシグナル配列と交換することによって補正すること
ができ（データは示されていない）、これにより示唆されるように、欠陥は膜お
よび鎖に対して固有でなく、むしろ、特定のシグナル配列−鎖の組合わせの不適
合性を反映し、フォールディングファンネルの選択におけるシグナル配列の仮定
された役割と一致した。
【０１１１】 実施例4 上記から理解できるように、シグナル配列はタンパク質の最終のフォールドさ
れた状態を決定することができる。これは他のシグナル配列ではなく、あるシグ
ナル配列の背後においてタンパク質の中に操作されたグリコシル化部位のアクセ
ス可能性により証明される。成長する鎖は異なるフォールディングファンネルを
進行するので、リボソーム−膜連結の特質および新生鎖とトランスロケーション
機構との間のタンパク質−タンパク質の相互作用に依存して、異なるコンフォメ
ーションが達成される。コンフォメーションの差の結果として、鎖が成長する間
においてさえ、タンパク質の異なるようにフォールドされた形態は修飾酵素に対
して異なるようにアクセス可能である。それゆえ、タンパク質のコンフォメーシ
ョンのリポーターとして働く操作されたグリコシル化部位は、他のシグナル配列
ではなく、1つのシグナル配列が操作されるとき、グリコシル化される。さらに
、リボソーム−膜連結の特質がトランスロケーション前に実質的な鎖フォールデ
ィングを可能とするようなものである極端な場合において、真性の鎖における追
加の情報が出現してリボソーム−膜連結を閉鎖しなくてはならない。このような
情報が存在しないと、IgGシグナル配列の背後のプロラクチンについて証明され
るように、鎖は転位することができない。
【０１１２】 こうして、モデルの分泌タンパク質はプリオンタンパク質について以前になさ
れた観測（実施例1）を反復し、それらの結果が特別の場合でなかったことを示
す。事実、プリオンタンパク質について特別であると思われるものは、その生合
成およびフォールディングの経路ではなく、選択的フォールディング経路がトポ
ロジー的差をし、それらの検出をいっそう容易と発現することである。
【０１１３】 実施例5 トランス作用性因子によりタンパク質フォールディングのモジュレーション 上記実施例1に示すように、伝染性プリオン疾患におけるPrPSc増殖の時間経過
をCtmPrPの発生増加に精密に追跡する。こうして、PrPScの蓄積はCtmPrPの発生
または代謝に関係する事象をトランスモジュレートするように思われる。CtmPrP
は、ER内腔に転位したC末端ドメインを有し、過剰発現されるとき自発的神経変
性を誘発する（Hegde、Science（1998）279：827−834）。実施例2に示すように
、CtmPrPは臨床的徴候開始直前に誘導されるように思われ、それが神経変性への
最終の共通の経路を開始することが示唆される。ER膜の未知糖タンパク質は、se c PrPに導く経路に新生PrP鎖を向けることによって、CtmPrPの発現から正常の脳
を「保護」するトランスロケーションアクセサリー因子（TrAF）として関係づけ
られる（Hegde、Mol. Cel.（1998）2：85−89）。
【０１１４】 新生PrP鎖がトポロジー的形態の中に配分されるメカニズムは複雑なである（R
utkowski、提出された）。PrPシグナル配列それ自体は、新生鎖の少なくとも2つ
の集団を確立することによってある役割を演ずる：あるものは開いたリボソーム
−膜連結を有する；他のものは閉じたリボソーム−膜連結を有する。こうして、
シグナル配列はPrPの出現するN末端ドメインが面する環境を決定することができ
る。細胞質ゾル環境に暴露された鎖のみはCtmPrPとなる可能性を有する。追加の
タンパク質−タンパク質相互作用が最終結果を決定するので、開いたリボソーム
−膜連結は、必要であるが、CtmPrPを作るために十分ではない。トランスメンブ
ランドメインがCtmPrP形成に向けられるのを妨害する突然変異は、細胞質ゾルに
再び向けられる鎖を生じ、細胞質ゾル中でこれらの鎖は分解される可能性が最も
強い。
【０１１５】 secPrPとCtmPrPとの間の区別はトポロジーに基づいてなされる。しかしながら
、非変性洗浄剤溶液中の制限されたプロテアーゼ消化に対する異なる感受性によ
り決定して、同一配列のこれらの2つのポリペプチドもまたそれらのコンフォメ
ーションにおいて異なる。こうして、トランスロケーションの調節は、コンフォ
メーションおよび機能の両方において異なるPrPの多数の形態を発生する手段で
あるように思われる。CtmPrPよりむしろsecPrPを作るように新生PrP鎖を指令す
る機構（すなわち、TrAF）は、脳において検出可能なCtmPrPの量を増加させるス
クラピー感染の能力に基づいて、それ自体調節されることができる。総合すると
、これらの観測は新しい原理に導く：タンパク質のコンフォメーションは、ちょ
うどその一次アミノ酸配列ばかりでなく、かつまた2またはそれ以上の異なる機
能的コンフォメーションの結果のうちのどれが実際に起こるか、あるいは優勢を
占めるに影響を及ぼすタンパク質、例えば、TrAFにより決定される。
【０１１６】 したがって、複雑な分泌タンパク質または内在性膜タンパク質は多数の潜在的
な機能的フォールドされた状態を有することができる。1系列の可能な環境（例
えば、細胞質ゾル、膜、内腔）中で、新生鎖内のリガンドとトランスロコンにお
けるレセプターとの間の組合わせ系列の相互作用により、異なるフォールドされ
た状態は発現するようになる。種々のコンフォメーションの発生／分解の割合は
、任意の所定の時間に発現される特定の基質について可能な最終結果の種類、お
よび数を決定する。これらのプロセスは、特定の直ちの必要性（Chapman、Annu.
Rev. Cell and Dev. Biol.（1998）14：459−485）および細胞の包括的プ
ログラム（Bonafacino、Nature（1990）334：247−251）の両方を有するタンパ
ク質生合成と共同する、細胞表面からのシグナリング経路およびその他の方法に
より統合される。
【０１１７】 これの見解は、分泌および内在性膜の新生鎖が2以上のフォールディングファ
ンネルを進行することを必要とする（または単一の、複雑なフォールディングフ
ァンネル内の異なる末端への異なる通路を取る）。これはTrAFを有する新生鎖中
の離散配列の相互作用またはTrAFがアクセス可能とする環境により達成される。
異なるTrAFは、異なる鎖または所定の鎖のフォールディング状態の異なるサブセ
ットに対して作用する、異なる区画（細胞質ゾル、膜、ER内腔）に局在化し、ま
た、他の機能的フォールドされた形態に対する1つの形態の選択に寄与する。こ
れはタンパク質フォールディングにおける「三次の」複雑度として考えるするこ
とができる。それは分子シャペロンの概念と異なり、可能な構造的結果の各々は
機能的であり−機能または調節のいくつかの面においてちょうど異なる。こうし
て、分泌および内在性膜タンパク質は多数のコンフォメーションで出ることがで
き、各々は明確な機能的意味を有する。
【０１１８】 最後に、可能な選択的フォールディングファンネルの中からの選択を支配する
、TrAFを包含する、トランスロコンおよびその成分は、細胞内シグナリングによ
りそれら自体調節されることができ、タンパク質フォールディングに対して「四
次の」複雑度を提供する。第18図は、トランスロケーションの調節の有効なモデ
ルを要約し、それを四次のフォールディングファンネルに関係づける。
【０１１９】 トランスロケーションの調節をトランスで探査するために、分画・再構成され
た系を開発し、ここで細胞質ゾルまたは膜を操作する結果として、PrPのコンフ
ォメーション混合物を変更することができる。PrPを使用する発見は他の無関係
のタンパク質における研究により再現されること示された（RutkowskiおよびLin
gappa）ので、問題の遺伝子産物を含有する任意のシグナル配列の配座異性体を
検出し、研究するという目標を達成するために、これらの系を操作することがで
きることが明らかである。結果 以前において、トランスロケーションおよびコンフォメーションに影響を与え
るトランス作用性についての証拠は比較的間接的であった（Hegde他、（1998）M
ol. Cel. 2：85−91；Hegde他、（1999）Nat. 402：822−826）。この見解を
いっそう直接的に支持する、2つの新しい系列の証拠を我々は今回発見した。第1
に、分化の前後にマウス赤白血病（MEL）細胞から調製した細胞質ゾル抽出物はP
rPのトランスロケーションに影響を与え、Sec−PrPの利益となるように形態の分
布をシフトすることができること我々は観測した（第19図参照）。第2に、初期
の出産後の発生における種々の時間においてハムスター脳からミクロソーム膜を
調製したとき、TrAF活性は変化し、13日の胚脳における高から、出産後14日にお
ける最下点に行くことを発見し、このプロセスはCtm−PrPを抑制するTrAF活性が
選択した脳領域において減少して、初期齧歯類脳発生のプログラムの一部分とし
て、Ctm−PrPを促進し、ニューロンアポトーシスを誘発するという仮説と一致し
た（第20図参照）。
【０１２０】 前述の結果にかんがみて、他の源からトランス作用性因子を使用する相補性が
可能である方法で、ウサギ網状赤血球ライゼイトを分画する準備をした。リボソ
ームのペレットとDEAE溶出液画分との組合わせは、完全なトランスロケーション
活性を回復するために十分であることを我々は発見した（第21図〜第23図参照）
。
【０１２１】 同様に、我々は以前発表されたプロトコル（GorlichおよびRapoport（1994）C
ell 75：615−630；Hegde他、（1998）Mol. Cel. 2：85−91）を変更して、
以前の調製物に機能的に等しいが、コスト、速度、およびそれ以上の分画に適用
可能である、分画・再構成されたプロテオリポソームを発生させた。このプロト
コルは前述した通りである。
【０１２２】 上記結果から明らかなように、本発明は、生理学的プロセスにおけるトランス
ロケーション系の参加を検出し、拡大し、理解し、そして操作する新規なプラッ
トフォームおよびパラダイム、およびER膜を横切るトランスロケーションのため
のシグナル配列を有する任意の分泌または内在性膜タンパク質、または他のタン
パク質の異なる配座異性体の宿主の生理学に対する効果を提供する。異なる配座
異性体を異なる生理学的結果に導くことができる、タンパク質のフォールディン
グをコントロールすることができることによって、細胞の経路に対する配座異性
体の効果を研究する機会、異なる配座異性体の形成に関係する因子の同定、特定
のコンフォメーションから生ずる悪い結果の処置、および異なる配座異性体の形
成から生ずる細胞のプロセスの理解を達成することができる。新規な薬剤を開発
することができ、そして従来使用されてきているものと異なる観点から疾患を考
慮することができる。
【０１２３】 また、前述の結果が証明するように、異なる遺伝学的組成を有する異なる種か
ら調製されたミクロソーム膜は、通常少量の配座異性体を発現する強力なツール
を提供する。この場合において、ウニミクロソーム膜は高度にトランスロケーシ
ョンコンピテントであることが発見されたが、哺乳動物ミクロソーム膜特に通常
少量の種である形態である、PrP、Ctm−Prpのただ1つの配座異性体を発生させた
。生化学的アプローチを超えた、このアプローチの潜在的な利点は、不安定性成
分が手順により不活性化されている可能性がより少なく、そして異なる膜中の明
確な部分的活性の存在により、多数の成分を区別することができることである。
また、霊長類の生物の組織からの膜調製物は、少なくとも最初のスクリーンにつ
いて、いっそう原価効率がよく、陽性の結果はいっそう高価な、生化学的に純粋
な試薬で確認される。
【０１２４】 分画し、再構成されたプロテオリポソームの調製を提供する、新規なプロトコ
ルは、比較的費用のかからない、イオン交換クロマトグラフィーに対して適合性
である洗浄剤を使用し、ConA消耗再構成において最初に同定された活性成分、な
らびに初期の同定がConA貫流のそれ以上の分画を必要とする活性成分をさらに分
画することができる。本発明において提供される手順の他の新規な利点は、主要
な努力を払わないで、新規なTrAFの初期のスクリーニングを簡単に実施できるこ
とである。これにより、いくつかのTrAF活性成分は2以上の成分を含むことがで
き、そして、ある場合において、過剰の1つの成分が他の成分の欠如を部分的に
補償することができる。
【０１２５】 本発明を理解を明瞭とする目的で例示および実施例により多少詳細に説明した
が、本発明の精神から逸脱しないで種々の変化および変更が可能である。ここに
おいて引用したすべての参考文献は、それらの全体において、引用することによ
って本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第1図は、PrPシグナル配列を置換するトポロジーに対する効果を示す。第1図
（A）は、野生型PrP、Prl−PrP、およびβL−PrPの略線図を示す。ボックスは，
PrP成熟領域に融合した、PrP、プレプロラクチン、およびプレ−ベータ−ラクタ
マーゼからのシグナル配列を表す。第2図（B）は、PrP、Prl−PrP、およびβL−
PrPのトポロジーを示す。各構築物のin vitro翻訳およびトランスロケーション
反応からのミクロソームを沈降により単離し、ゲルの下に示すように1％トリト
ンX−100の存在または非存在下にプロテイナーゼK（PK）を使用する消化のため
に等しいアリコートに分割した。1つのアリコートを未処理のままにした。PrPの
3つのトポロジー的形態は、洗浄剤の非存在下にPKで消化すると、明確なサイズ
のバンドを生じた（Hedge他（1988a）Science 279：827−834）。各バンドの位
置は、それぞれのトポロジーの線図的表示と一緒に、ゲルの左に記載されている
。 Prl−PrPのシグナル配列の切断は非効率的であり、シグナル切断種およびシグ
ナル非切断種の両方によりsecPrPおよびNtmPrPは表わされる。各構築物について
のCtmPrPトポロジーにおける転位した鎖の百分率は3回のこのような実験から定
量され、（C）（平均＋／−SEM）で示される。
【図２】 第2図は、ターゲッティングの反応速度がPrPトポロジーに影響を及ぼさないこ
とを示す。第2図（A）は、x軸上にに示すように変化量のミクロソームの存在下
に翻訳されたPrPを示す。トポロジーについてのタンパク質分解アッセイ後、オ
ートラジオグラフを定量して、シグナル切断された全翻訳産物の百分率（黒塗り
正方形）およびCtmPrPトポロジー中の転位した鎖の百分率（白抜き円）を決定し
た。第2図（B）は、75mMのATAを使用する5分における開始阻害により同期化され
たPrPの翻訳反応を示す。食い違い間隔（x軸上に示すように）において、アリコ
ートを取出し、ミクロソームを添加し、ターゲッティングおよびトランスロケー
ションを30分間進行させた。トポロジーおよびシグナル切断を決定し、第2図（A
）におけるようにプロットした。第2図（C）は、ミクロソームの存在（白抜きバ
ー）または非存在（陰影をつけたバー）下に翻訳された、223マーのPrPをコード
する、StuIトランケーテッドmRNAを示す。5分後、それ以上の開始はATAにより阻
害され、30分において、ミクロソームを欠如する試料にミクロソームを添加し、
両方の反応をさらに30分間インキュベートした。次いで新生鎖を10mMのEDTAでミ
クロソームから解放させた。前述したように、シグナル切断およびトポロジーを
評価し、定量した。
【図３】 第3図は、シグナル配列がリボソーム−膜連結に影響を及ぼすことを示す。第3
図（A）：プレプロラクチン（Prl）、プレ−ベータ−ラクタマーゼ（βL）、βL
−PrlおよびPrl−βLについてのトランケーテッドmRNAを翻訳し、転位させ、そ
してこれらの反応からのミクロソームを沈降により単離した。各試料の1つのア
リコートを未処理のままにし、PKを残部に添加した。PrlおよびβL−PrlをPruII
においてトランケートした。βLおよびPrl−βLをHpaIIにおいてトランケートし
た。これらの構築物のアミノ酸サイズを示す。第3図（B）：Prl−PrP、野生型Pr
P、およびβL−PrPをBstXI（野生型PrPについて61aa）、NdeI（113aa）、XbaI（
135aa）、またはHincII（180aa）においてトランケートし、第3図（A）における
ようにタンパク質分解により分析した。PKによる消化から保護された物質の百分
率を示されたオートラジオグラフのデンシトメトリー定量により測定し、各試料
の下に記載する。図面は右においてシグナル配列（白抜きボックス）およびトラ
ンスメンブランドメイン（灰色ボックス）の両方のリボソームに関する位置を表
す。
【図４】 第4図は、TRAM依存性からのトポロジーの解離を示す。第4図（A）：構築物PrP
、PrP(R2，3)、PrP(D2，3)、PrP(R4，5)、およびPrP(D4，5)のシグナル配列。各
構築物におけるアミノ酸変化に下線が引かれており、そしてシグナル切断部位は
矢じり印で示されている。第4図（B）：第4図（A）に示す構築物を使用して翻訳
およびトランスロケーションをプログラミングし、そして生ずるトポロジーを第
1図Bにおけるようにタンパク質分解により分析した。CtmPrP合成の百分率をオー
トラジオグラフのデンシトメトリーにより定量し、各構築物について示す。各構
築物のシグナル配列をx軸上に示す。Prl−PrPおよびβL−PrPについてCtmPrP合
成を比較のために示す。第4図（C）：第5図Aに示すPrPシグナル配列の突然変異
体をプロラクチン成熟領域に融合した。プロラクチン成熟領域に融合した、プレ
プロ−アルファ因子（依存的）およびプレプロラクチン（独立的）のシグナル配
列を、それぞれ、TRAM依存的およびTRAM独立的シグナル配列として使用した（Vo
igt他（1996）J. Cell. Biol. 134：25−35参照）。精製されたTRAMを含有す
るかまたは欠如するConA消耗プロテオリポソーム（実験手順に記載されているよ
うに調製した）中で、構築を翻訳し、転位した。各反応からのアリコートを取っ
て置いて、翻訳効率が両方の型のプロテオリポソーム中で同一であった。物質の
残部を0.5mg／mlのPKで処理し、抗タンパク質抗体で免疫沈降させた。TRAMを含
有する膜に関してTRAMを欠如するプロテオリポソーム中のプロテアーゼ保護され
た物質の減少百分率として、ここにおいて示す、TRAM依存性を測定した。
【図５】 第5図は、シグナル配列とTMドメインとの間の関係を示す。第5図（A）：構築
物PrP(AV3)、Prl−PrP(AV3)、およびβL−PrP(AV3)を、正確に第1図Bにおけるよ
うに、翻訳し、転位させ、タンパク質分解によりトポロジーについて分析した。
各トポロジー形態の移動を右に示す。第5図（B）：構築物PrP(G123P)、Prl−PrP (G123P) 、およびβL−PrP(G123P)を、正確に第1図Bにおけるように、翻訳し、転
位させ、PKによりトポロジーについて分析した。secPrPのみが観測され、その移
動を右に示す。第5図（C）：PrP、Prl−PrP(AV3)、およびβL−PrP(G123P)の約1
80マーをコードするHincIIトランケーテッドmRNAをミクロソームの存在下に翻訳
し、次いでこれを沈降により単離した。正確に第3図Bにおけるように、リボソー
ム−膜連結の状態を検査するPKによるタンパク質分解を実行した。
【図６】 第6図は、PDIとのSECPrPの相互作用を示す。第6図（A）：PrP(G123P)およびPr
P(AV3)（約180マー）をコードするHincIIトランケーテッドmRNAを翻訳し、そし
て膜を沈降により単離した。1つのアリコートを1mMのDSS（＋XL）で処理し、残
部を未処理のままにした（−XL）。非架橋物質をゲルの下部に示す。分子量マー
カーの移動を右に示す。矢じり印は、PrP(G123P)に優先的に架橋するほぼ65kDa
のタンパク質を示す。第6図（B）：正確に第6図（A）におけるようにPrl−PrPお
よびβL−PrPをHincIIにおいてトランケートし、処理した。等量の全トランケー
ション産物を各レーンに負荷した。（A）において見られる65kDaの架橋を矢じり
印で示す。第6図（C）：正確に第6図（A）におけるようにPrl−PrPおよびβL−P
rPをNdeI（約113マー）においてトランケートし、架橋により分析した。第（A）
図において見られる65kDaの架橋（黒塗り矢じり印）およびまた優先的にPrl−Pr
Pと形成する60kDaの架橋（白抜き矢じり印）を示す。第6図（D）：PDIpの精製。
下記のものが示されている：開始粗面ミクロソーム（RMs）のクーマッシー染色
；サポニン処理により抽出されない（ペレット）または抽出されるタンパク質；
ConA−セファローズカラムからのサポニン抽出物の貫流（FT）および溶出液；Q
−セファローズカラムからのConA溶出液の貫流および溶出液、およびゲル濾過（
GF）カラムからのプールしたピーク画分、ほぼ均質へのp65（矢印）の精製を生
ずる。精製の詳細については実験手順を参照のこと。第6図（E）：Prl−PrPおよ
びβ−PrPを膵臓（上部パネル）または脳（下部パネル）ミクロソームの存在下
に翻訳し、膜を沈降により単離した。１mMのDSSとの架橋後、新生鎖をリボソー
ムから10mMのEDTAで解放させ、0.5％のサポニンを添加して内腔タンパク質を抽
出した。1つのアリコートを取って置き（レーン1、4）、PDIpに対する抗体（レ
ーン2、5）またはPDI（レーン3、6）を免疫沈降のために残留物質に直接的に添
加した。膵臓ミクロソーム中で翻訳されたPrl−PrPはPDIp（黒塗り矢じり印）お
よびPDI（白抜き矢じり印）に対して優先的に架橋するが、脳ミクロソームにお
いてPDI（白抜き矢じり印）に対する架橋のみが観測される。第6図（F）：約113
マーを生ずるようにNdeIにおいてトランケートした、第4図Aからの野生型PrPお
よびシグナル配列点突然変異をコードするmRNA、ならびに100マーを生ずるよう
にMboIIにおいてトランケートした野生型プレプロラクチン（Prl）を、パネル（
A）におけるように翻訳し、架橋により分析した。架橋し、10mMのEDTAで新生鎖
を解放した後、0.5％のサポニンを添加し、膜を沈降させ、内腔タンパク質を含
有する上清を回収した。矢じり印はsecPrP特異的内腔架橋を表示する。各構築物
のシグナル配列をゲルの下に示す。
【図７】 第7図は、シグナル配列の作用についての仮説的モデルを示す。シグナル配列
はリボソーム−膜連結の状態を決定し、引き続いてこれはPrPの場合において最
終のトポロジー的運命に影響を及ぼし、多分転位挙動または他の基質のいっそう
微妙な面に影響を及ぼす。各転位の結果の1例を記載する。
【図８】 第8図は、CtmPrP誘導神経変性の投与量応答を示す。第8図（A）：ERにおける
野生型および突然変異PrP分子のトポロジー。各PrP構築物（ゲルの上に示す）を
コードするin vitro合成転写物を使用して、ER由来ミクロソーム膜およびグリ
コシル化の競合ペプチドインヒビターを含有するウサギ網状赤血球ライゼイト細
胞不含翻訳反応をプログラミングした。翻訳後、試料を未処理のままにするか、
あるいはゲルの上に示すように0.5％のトリトンX−100（「Det」）の非存在また
は存在下にPKで消化した。全長PrP分子、PK消化により発生したNH2末端のフラグ
メント（NunPrPで示す）およびCOOH末端のフラグメント（CunPrPで示す）を右に
マークする。第8図（B）：種々のトランスジェニックマウス系統の発現レベル。
各トランスジェニックマウスからの10％の脳ホモジネートの変化量を13A5モノク
ローナル抗体を使用してPrPについてイムノブロットし、ゴールデンハムスター
の脳ホモジネートの滴定と比較した。第8図（C）：Tg［SHaPrP（A117V）H］（黒
塗り円）およびTg［SHaPrP（N108I）H］（白抜き円）の時間経過。非トランスジ
ェニック対照動物（破線）およびTg［SHaPrP（KH→II）H］（黒塗り正方形；Man
son他（1994）Neurology 46：532−537からのデータ）を比較のために示す。第
8図（D）：方法に記載されているようにCunPrPおよびPrpScについての種々のト
ランスジェニックマウスおよびゴールデンハムスター（ゲルの上に示す）の分析
。Tg［SHaPrP（A117V）H］およびTg［SHaPrP（N108I）H］試料は臨床的に病気の
マウスからのものであり、そしてTg［SHaPrP（A117V）L］およびTg［SHaPrP（N1
08I）L］試料は少なくとも600日齢のマウス（疾患の徴候を示さない）からのも
のであった。「温和な」条件下にPKに対して耐性であるPrPのフラグメント（Cun PrPで示す）は、Tg［SHaPrP（A117V）H］およびTg［SHaPrP（N108I）H］試料に
おいてのみ見られる。いずれの試料においても、PK耐性PrPScは観測されなかっ
た。
【図９】 第9図は、CunPrPとPrPScとの間の関係を示す。第8図（A）、（C）、（E）：Sc
237ハムスタープリオンの接種後における、種々のトランスジェニック系統にお
ける病気発生の時間経過。第9図（B）、（D）、（F）：種々のトランスジェニッ
ク系統における病気時におけるプロテアーゼ耐性PrpScの相対レベル。方法に記
載されているような「苛酷なPK」条件および等量のSDS−PAGE分離した各試料を
使用して、各系統の複製試料を消化した。13A5モノクローナル抗体を使用するイ
ムノブロッティングにより、PrPScの特徴を示すC末端のPrP27−30フラグメント
（括弧で示す）を検出した。未消化の、全長PrPの位置を星印で示す。第9図（G
）：Sc237プリオンの接種後の病気時に蓄積したPrPScの量に対して、各トランス
ジェニック系統についてのCtm指標（表1参照）をプロットした。
【図１０】 第10図は、CtmPrP誘導神経変性疾患の伝染の欠如を示す。末期的に病気のTg［
SHaPrP（KH→II）H］マウス（「KH−II」）および臨床的に正常のTg［SHaPrP］
マウス（「wt」）を殺し、脳組織のホモジネートをグラフの下に示すように種々
の宿主の脳内に接種した。使用した宿主動物はTg［SHaPrP（KH→II）L］［「（K
H−II）L］、FVB／Prnp0/0（「PrPnull」）、Tg［SHaPrP］、およびゴールデン
ハムスターであった。個々の動物が死亡した時間（日）をプロットする。接種そ
れ自体に関係する原因を包含する、すべての原因により死亡をプロットする。実
験を約600日後に停止し、この時残留する動物のいずれも神経学的疾患の徴候ま
たは症状を示さなかった。各実験は、試験すべき3匹の別々の動物から調製した
イノキュラムを注射した10匹の宿主動物の3組を表す。我々の動物ケアー設備に
おいて、ハムスターは日常的にほぼ200〜400日間生きるが、マウスは600日間よ
り長く生き続けることに注意すべきである（データは示されていない）。
【図１１】 第11図は、PrPSc蓄積の時間経過間のCtmPrP発生を示す。第11図（A）：実験表
示の略図。SHaPrPおよびMoPrP（それぞれ、陰影をつけた円および白抜き円で表
す）の両方を発現する二重トランスジェニックマウスに、RMLマウスプリオン（
クロスハッチの正方形）を接種する。経時的に、宿主MoPrPCはMoPrPScに変換さ
れ、蓄積する。この時間経過間に、HaPrPは種バリヤーのためにHaPrPScに変換さ
れず、したがってCtmPrPについてアッセイする。第11図（B）：RMLの接種後の種
々の時間（週）におけるマウス中の全PrPScおよびSHaPrPScの相対量。「苛酷なP
K」条件を使用してホモジネートを消化し、PNGアーゼで処理し、SDS−PAGEによ
り分析し、R073ポリクローナル抗体（全PrPを検出するため）または3F4モノクロ
ーナル抗体（SHaPrPについて選択的にプロービングするため）でイムノブロッテ
ィングした。レーン2および11（これらは1／4を含有する）およびレーン3および
10（これらは1／10を含有する）を除外した、各レーンにおいて等量のホモジネ
ートを分析する。第11図（C）：RMLの接種後の種々の時間におけるハムスターCt m PrP（３４ｍａを使用して選択的に検出した）の相対量。各バーは3回の測定の
平均±SEMを表す。
【図１２】 第12図は、プリオン疾患の病原論の3段階モデルを示す。段階IはPrPScの形成
および蓄積である。これは接種または突然変異したPrPCのPrPScへの自発的変換
により開始することができる。段階IIは、CtmPrPの発生に関係する事象を含んで
なる。これらの事象は、蓄積したPrPScにより現在未知の工程（疑問符を有する
点線）においてトランスで、またはPrPのある種の突然変異体によりシスで影響
を受けることがある。段階IIIは、CunPrP仲介神経変性に関係する事象（現在未
知）を表す。これは第1工程としてER後区画へのCunPrPの脱出を含むようである
。このモデルにおいて、PrPScは疾患を引き起こすことができる（CunPrPを介し
て）が、絶対的に必要ではなく、これに対してCunPrP産生は必要であり、疾患の
発生のために十分である。
【図１３】 第13図は、モデルの分泌タンパク質シグナル配列の効率を示す。プレプロラク
チン（Prl）、プレ−ベータ−ラクタマーゼ（βlac）、およびプレ−IgG重鎖（I
gG）のための全長mRNAを、イヌ膵臓ミクロソーム膜（RM）の非存在または存在下
にウサギ網状赤血球ライゼイト中で翻訳し、そして翻訳された物質の等しいアリ
コートを未処理のままにするか、あるいは1％のトリトンX−100（det）の存在ま
たは非存在下にプロテイナーゼK（PK）で処理した。非処理物質（pPrL、pβlac
、pIgG）の位置、ならびにシグナル切断した物質（Prl、βlac）およびグリコシ
ル化物質（IgG−CHO）の位置を示す。
【図１４】 第14図は、新生分泌タンパク質がリボソーム−膜連結に対して異なるように作
用することを示す。第14図（A）：プレプロラクチンmRNAを連続的位置において
トランケートして、記載する数のN末端のアミノ酸を含有する新生鎖発生させた
。シグナル切断タンパク質のアミノ酸数を括弧内に記載する。正確にRutkowski
他（″A New Role for the Signal Sequence in Translocational Reg
ulations″、参照：前の出願60／171,012および60／172,350）におけるように、
リボソーム−膜連結の状態をタンパク質分解によりアッセイした。第14図（B）
および（C）：βlacおよびIgG mRNAを示した位置において系統的にトランケー
トし、（A）におけるようにタンパク質分解により分析した。各パネルについて
、右の絵は鎖成長間の3点の各々におけるリボソーム−膜連結の状態を描写する
。第14図Aの左のパネルのみおよびBおよびCの左および中央のパネルは「開いた
」リボソーム−膜連結を描写するが、第14図Aの中央および右のパネルおよび第1
4図BおよびCの右のパネル「閉じた」リボソーム−膜連結を描写することに注意
すべきである。
【図１５】 第15図：プロラクチン（Prl）およびIgG／PrlをPruII（各タンパク質のシグナ
ル配列および成熟領域の56アミノ酸をコードする）においてトランケートし、イ
ヌ膵臓粗面ミクロソームの存在下に翻訳した。ターゲッテッド鎖を沈降により単
離した。1つのアリコートを取って置き、他のアリコートを2mMのBM（PEO）3［XL
］で処理した。矢じり印は、Prlに対して優先的に架橋するほぼ35kDaのタンパク
質を示す。10kDaの非架橋物質はパネルの下部に存在する。分子量マーカーの移
動はゲルの左に示されている。
【図１６】 第16図：シグナル配列依存的染色体変化のリポーターとしてのグリコシル化。
第16図（A）：操作されたN末端グリコシル化部位を有する天然プレプロラクチン
（Prl）、またはマウスIgG重鎖（IgG／Prl）、ラット成長ホルモン（GH／Prl）
、またはハムスターPrP（PrP／Prl）のシグナル配列に融合したグリコプロラク
チンをコードするin vitro転写mRNAを、示すようにイヌ粗面ミクロソーム（RM
）の存在または非存在下に、ウサギ網状赤血球ライゼイト系中で翻訳した。また
、グリコシル化の競合インヒビターをいくつかの試料に添加した（AP）。翻訳後
、試料を取って置くか、あるいは1％のトリトンX−100の存在または非存在下に0
.5mg／mlのプロテイナーゼK（PK）と0℃において30分間インキュベートした。次
いで反応物をSDS−PAGE上に展開し、オートラジオグラフィーにより可視化した
。3種のプロラクチンを示す：シグナル切断し、転位させ、グリコシル化したプ
ロラクチン（Prl−CHO）；非シグナル切断のプレプロラクチン（pPrl）；および
シグナル切断し、転位させた、非グリコシル化プロラクチン（Prl）。第16図（B
）：オートラジオグラフ、例えば、第16図（A）に示すオートラジオグラフを走
査し、デンシトメトリー的に解析することによって、各構築物についてグリコシ
ル化を達成するプロラクチン鎖の百分率を3回実験から定量した。第16図（C）：
それ自身のシグナル配列を有するか、あるいはラット成長ホルモンまたはマウス
IgG重鎖のシグナル配列を有するグリコプロラクチンをコードする発現プラスミ
ドで、COS−1細胞を一時的トランスフェクトした。比較のため、グリコシル化部
位を欠如する同一構築物をまたトランスフェクトした（−CHO）。無血清無メチ
オニン培地中で細胞を45分間前インキュベートした後、100μCiの35S−メチオニ
ン／システイン混合物を細胞培地に添加し、細胞を1時間標識化した。これらの
細胞からの培地のアリコートをSDS−PAGE上に直接展開した。グリコシル化形態
および非グリコシル化形態の両方のタンパク質をパネルの右に示す。グリコシル
化GH／PrlおよびIgG／Prlは明瞭に可視であるが、グリコシル化天然プロラクチ
ンは観測されない。
【図１７】 第17図は、トランスロケーションの成功に導く連結領域の要件を示す。第17図
（A）：プロラクチン成熟領域をそれ自身のシグナル配列（Prl−Prl）に、また
はプレ−ベータ−ラクタマーゼ（βL−Prl）またはプレ−IgG重鎖（IgG−Prl）
のシグナル配列に、シグナル配列切断部位において融合した。これらの基質の全
長mRNAをミクロソーム膜の存在下に翻訳し、第17図Aにおけるように分析した。
各基質について、プロセシングし、転位した状態を達成した全鎖の百分率を定量
することによって、トランスロケーション効率を決定した。各バーは3回の試験
からのトランスロケーションの平均（＋／−SEM）を表す。第17図（B）：Prl−P
rl、βL−Prl、およびIgG−PrlをコードするmRNAをPruIIまたはAflIIにおいてト
ランケートした。成熟プロラクチンからのアミノ酸数を括弧で示す。沈降した鎖
を第15図Bにおけるようにタンパク質分解により分析して、リボソーム−膜連結
を評価した。3回の試験におけるPKに対する各基質の保護の平均百分率をy軸にプ
ロットする。第17図（C）：IgG−Prlキメラの略図。増加する長さのアミノ酸の
プレ−IgG重鎖または非IgGストレッチをプロラクチン成熟領域に対して融合させ
た。シグナル配列の切断部位を矢じり印で示す。IgGからの配列を白抜きボック
スで表し、Prl成熟領域をバーで表し、そして非IgG対照配列をハッチングを施し
たボックスで表す。Prlシグナル配列を陰影をつけたボックスで示す。各構築物
の下の番号は、プレ−IgG重鎖、プレプロラクチンシグナル配列（Prl−Prl）、
または上のIgG配列（IgG−Prl（i−132）Stufferのアミノ酸15〜132）からのア
ミノ酸を表し、開始メチオニンをNo.1で示す。第17図（D）：第17図（C）に示す
基質をミクロソーム膜の存在下に翻訳し、第17図（B）におけるように3回の試験
からのトランスロケーションの平均百分率について分析する。
【図１８】 第18図は、トランスロケーションの調節がコンフォメーションの不均質性に導
く方法の略図を示す。ERにおけるタンパク質生合成の3段階の終点をローマ数字
で左に示す：I、ターゲッティングを含む最も初期の事象；II、トランスロケー
ションそれ自体の事象；およびIII、最終のフォールドされたタンパク質。段階I
Iにおけるトランスロケーション調節の4つの形態が第18図（A〜D）に示されてい
る。トランスロケーション調節は、ここにおいて仮定するように、完結された、
フォールドされたタンパク質において不均質性を達成する（III参照）手段を提
供する。分子シャペロンを黒塗り卵形で示すが、TrAFをハッチングを施した長方
形で示す。第18図（A）において、トランスロコンは分子シャペロンとして働く
。 第18図（B）において、トランスロコンは、還元性環境において、多分分子シ
ャペロンまたは翻訳後修飾の機構に関連して、新生鎖のフォールディングを開始
させる。トランスロコンの内腔ゲートは閉じているが、リボソーム−膜連結を構
成する細胞質側は開いていることに注意すべきである。第18図（C）において、
再び明確な分子シャペロンの絶対的参加で、逆転−閉じた細胞質ゲートおよび開
いた内腔ゲート−が達成される。最後に、第18図（D）はTrAFの作用がタンパク
質トポロジーならびにコンフォメーションを変化であることができることを示す
。一次タンパク質フォールディングは、これらの考えに対して独立である。二次
タンパク質フォールディングは、三次レベルのタンパク質フォールディングの複
雑度を構成するTrAF作用に依存して、異なる方法で発現する（注：第18図B対Cに
おける異なる分子シャペロン）。タンパク質フォールディングの一次複雑度は、
例えば、環境または他の条件の変化に応答して、細胞が図面（A〜D）を選択でき
るようにするシグナリング経路による、TraAFの調節のためである。
【図１９】 第19図：以前に記載されたように（Lopez他、Science（1990）248：226−229
）ジメチルスルホキシドで分化を誘導する前および誘導した4または6日後にマウ
ス赤白血病細胞から調製した細胞質ゾル抽出物の存在下に、PrP cDNAを転写し
、翻訳した。翻訳反応間に35Sメチオニンが存在すると、放射能標識化した新し
く合成したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS−PAGE）中のポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動およびオートラジオグラフィー（AR）により可視化する
ことができる。活性の1単位は、5 A280u／mlの最終濃度でイヌ膵臓ミクロソー
ム膜を補充した10μlの翻訳反応中でsecPrPの利益となるように、PrPトポロジー
的形態を変化させるために必要な抽出物の量である。細胞質ゾル抽出物を調製す
るために、10mMのHepes pH7.5中で細胞を膨潤させた後、細胞を細断して均質化
し、100,000×gにおいて1時間遠心することによって膜を除去した。理解できる
ように、非分化MEL細胞からの細胞質ゾルはsecPrPを促進する活性に富んでおり
、その活性は細胞の経時的分化で失なわれる。この場合において、異なる終点に
ついていくつかのタンパク質が利用すると思われる細胞質ゾル調節活性のリポー
ターとして、PrPは働く。第6日の時点からゲル中にグロビンのバンドが存在し、
これらの細胞におけるマーカーであるグロビンの誘導が示されることに注意すべ
きである。
【図２０】 第20図：以前に記載されているように、示した源からのミクロソーム膜の存在
下に、PrP cDNAの転写および翻訳を実行した。以前に記載されているように、
洗浄剤の非存在または存在下に生成物をプロテアーゼで消化した。洗浄剤の非存
在下に生成物をプロテアーゼで消化すると、Sec−PrP／Ctm−PrP比をSDS−PAGE
およびARにより容易に評価できることが示される。E＝胚日13のハムスター脳か
らのミクロソーム膜；N＝新生児ハムスター脳ミクロソーム膜；7d＝出産後7日の
ハムスター脳からのミクロソーム膜；14d＝出産後14日のハムスター脳からのミ
クロソーム膜；21d＝出産後21日のハムスター脳からのミクロソーム膜；A＝成体
ハムスター脳からのミクロソーム膜；SUE＝ウニ胚ミクロソーム膜（これはTrAF
を欠如し、したがって糖タンパク質消耗の分画し、再構成したプロテオリポソー
ムに対して匹敵するCtm−PrPをもっぱら発生する（Hegde他、（1998）Mol. Cel
l 2：85−91）。上の矢印はSecPrPの位置を示す；下の矢印はCtm−PrPを示す。
下のグラフは、上の示すレーンの各々についての分泌PrP／全PrPの比の定量であ
る。異なる組織および種からの膜、および発生の異なる時間における同一組織お
よび種からの膜は、ラジカル的に異なるTrAF活性を有することができ、トランス
ロケーションがタンパク質生合成の調節の重要な部位であり、かつトランス作用
性因子がトランスロケーションの調節に寄与するという仮説と一致することが証
明される。この場合において、プリオンタンパク質はTrAF活性のリポーターとし
てのみ使用されている。トランスロケーションの調節を見出すすることができる
、すべての遺伝子に、同一原理が適用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｅ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルトコースキー，トーマス ディー． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94143 −0444，サンフランシスコ，パルナサス アベニュ 513，デパートメンツ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィ ジクス，ユニバーシティ オブ カリフォ ルニア，サンフランシスコ (72)発明者 ヘッジ，ラマヌガン エス． アメリカ合衆国，メリーランド 20892， ベゼスダ，ビルディング 36，ルーム １ ディー32，ラボラトリー オブ セルラー オンコロジー，ナショナル インスティ テューツ オブ ヘルス Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 FA18 GA11 HA01 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ08 QR32 QS34 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 CA45 DA86 EA50 FA74

Claims (55)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 天然タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
    と少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するキメラ
    遺伝子の発現により得られたタンパク質のトポグラフィーを比較することを含み
    、ここで前記天然タンパク質はシグナル配列を有する遺伝子によりコードされ、
    そして前記キメラ遺伝子は異なるシグナル配列を有し、ここで前記天然遺伝子の
    発現産物に比較して前記キメラ遺伝子の発現産物のトポグラフィーの変更は前記
    タンパク質が前記天然タンパク質の配座異性体であることを示す、少なくとも2
    つの異なるトポグラフィカル形態を有するタンパク質分子の配座異性体を同定す
    る方法。
  2. 【請求項２】 前記発現がライゼイトである、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ライゼイトが分画したライゼイトである、請求項2に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 前記発現が分画し、再構成したミクロソーム膜を補充した系
    である、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記発現が無傷の細胞である、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記キメラ遺伝子および天然遺伝子の発現から生ずる成熟タ
    ンパク質が同一である、請求項1に記載の方法。
  7. 【請求項７】 天然タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
    と少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するキメラ
    遺伝子の発現により得られたタンパク質で哺乳動物宿主を免疫化することを含み
    、ここで前記天然タンパク質はシグナル配列を有する遺伝子によりコードされ、
    そして前記キメラ遺伝子は異なるシグナル配列を有するので抗体が産生される条
    件下に配座異性体が産生され、前記抗体は前記天然タンパク質に対する前記抗体
    のアフィニティーと異なるアフィニティーで前記配座異性体に結合する、主要な
    正常野生型タンパク質の配座異性体以外の配座異性体に対する抗体を調製する方
    法。
  8. 【請求項８】 免疫化後、前記哺乳動物宿主からのBリンパ球を永久分裂能
    化して、永久分裂能化Bリンパ球スクリーニング抗体を形成し、 主要な正常野生型タンパク質の配座異性体と異なる配座異性体に対する異なる
    アルギン酸塩について前記抗体をスクリーニングして、異なる配座異性体特異的
    抗体を同定し、そして 前記異なる配座異性体特異的抗体を分泌する前記永久分裂能化Bリンパ球を単
    離する、ことをさらに含む、請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記哺乳動物宿主がマウスであり、前記Bリンパ球が脾細胞
    であり、そして前記永久分裂能化が腫瘍形成細胞を使用するハイブリドーマの産
    生である、請求項8に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 天然タンパク質をコードするオープンリーディングフレー
    ムと少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するキメ
    ラ遺伝子の発現により得られた非変性タンパク質を、配座異性体および前記天然
    タンパク質と共通のアミノ酸のアクセス可能な側基を検出可能に修飾する因子と
    接触させて、配座異性体と、修飾された側基を含んでなる天然タンパク質とを産
    生し、ここで前記天然タンパク質はシグナル配列を有する遺伝子によりコードさ
    れ、そして前記キメラ遺伝子は異なるシグナル配列を有するので配座異性体が産
    生され、そして 前記配座異性体と前記天然タンパク質との間のコンフォメーションの差の指示
    として、前記配座異性体と前記天然タンパク質との間の前記修飾された側基にお
    ける差を検出する、ことを含む、タンパク質におけるコンフォメーションの差を
    検出する方法。
  11. 【請求項１１】 前記因子が架橋剤または化学的修飾剤である、請求項10に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記化学的修飾剤がN−スルホビオチンまたはトリニトロ
    ベンゼンスルホン酸である、請求項10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 プロテアーゼに対する前記問題のタンパク質の反応性を評
    価することをさらに含み、ここで前記天然タンパク質に比較して、変更された反
    応性は前記タンパク質におけるコンフォメーションの差を示す、請求項10に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 天然タンパク質をコードするオープンリーディングフレー
    ムと少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するキメ
    ラ遺伝子の発現により得られた非変性タンパク質を、高圧液体クロマトグラフィ
    ーにより分析することを含み、ここで前記天然タンパク質はシグナル配列を有す
    る遺伝子によりコードされ、そして前記キメラ遺伝子は異なるシグナル配列を有
    するので配座異性体が産生され、ここで天然タンパク質に比較して前記問題のタ
    ンパク質のクロマトグラフプロファイルの変更はコンフォメーションの差を示す
    、問題のタンパク質におけるコンフォメーションの差を検出する方法。
  15. 【請求項１５】 疎水性吸着カラムを使用して、前記高圧液体クロマトグラ
    フィーを実行する、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 主要な野生型タンパク質と異なる配座異性体が細胞宿主に
    おいて発現により産生される、配座異性体が同定されなかったタンパク質からの
    、少なくとも2つの異なる配座異性体が存在する、試料中の配座異性体の産物を
    同定する方法であって、 前記野生型配座異性体に比較して前記異なる配座異性体に対して変更されたア
    フィニティーを有する実在物と、前記試料を組合わせ、そして 前記異なる配座異性体の存在の指示として前記実在物の結合を検出する、こと
    を含む前記方法。
  17. 【請求項１７】 前記実在物が抗体である、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記実在物が5kDalより小さい標識化分子である、請求項1
    6に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 非自然シグナル配列に結合されたPrPタンパク質のDNA配列
    を含んでなるDNA構築物。
  20. 【請求項２０】 前記シグナル配列がCtm−PrPの形成を生ずる、請求項19に
    記載のDNA構築物。
  21. 【請求項２１】 請求項19に記載のDNA構築物を含んでなる非ヒト哺乳動物
    。
  22. 【請求項２２】 疾患状態に関連する環境的変化に個体からのリンパ球を暴
    露させ、そして 環境的変化に対する個体の応答の指示として、前記リンパ球におけるCtm−PrP
    の発現変化を測定する、ことを含む、疾患状態に関連する環境的変化に対する個
    体の応答を評価する方法。
  23. 【請求項２３】 対照の細胞、組織、器官または体液におけるCtm−PrPのレ
    ベルに関して、Ctm−PrPに関連する疾患により影響を受けた細胞、組織または器
    官におけるCtm−PrPのレベル、あるいは個体のCtm−PrPに関連する疾患により影
    響を受けた細胞、組織または器官に関連する細胞、組織または器官に関連する体
    液におけるCtm−PrPのレベルについてアッセイするか、あるいは Ctm−PrPに関連する疾患に対する感受性の指示として、正常細胞による外部因
    子に応答するCtm−PrPのレベルに比較して、疾患に関係する細胞における外部因
    子に対するCtm−PrPのレベルの変化についてアッセイする、ことを含む、Ctm−P
    rPに関連する疾患に対する感受性について個体をスクリーニングする方法。
  24. 【請求項２４】 前記疾患が神経変性疾患または筋障害である、請求項23に
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記組織が脳組織または筋組織であり、前記細胞がリンパ
    球であり、そして前記体液が脳脊髄液である、請求項23に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 タンパク質および任意の異なるそれらの配座異性体の形成
    に十分な時間の間、細胞を化合物と組合わせ、そして 前記化合物の非存在下に前記異なる配座異性体の量に比較して前記異なる配座
    異性体の変更量についてアッセイする、ことを含む、タンパク質の異なる配座異
    性体の相対量に対する効果について化合物をスクリーニングする方法。
  27. 【請求項２７】 哺乳動物に化合物を供給し、そして 前記哺乳動物の体液または組織中の前記化合物の非存在下にタンパク質の配座
    異性体の相対量に比較して、タンパク質の配座異性体の相対量の変化を測定する
    、ことを含む、哺乳動物において産生されるタンパク質の異なる配座異性体の相
    対量に対する効果について化合物をスクリーニングする方法。
  28. 【請求項２８】 前記タンパク質がPrPである、請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 キメラ宿主を因子と接触させ、ここで前記キメラ宿主は、
    異なる種からの前記タンパク質をコードする外来遺伝子、あるいは前記タンパク
    質をコードする前記遺伝子と同一の転位メカニズムによりプロセシングされる内
    因性遺伝子以外の外来遺伝子を有するにより特徴づけられ、そして 前記内因性遺伝子の代理として前記外来遺伝子に対する前記因子の効果を決定
    する、ことを含む、内因性タンパク質の配座異性体の相対量に対する因子の効果
    を決定する方法。
  30. 【請求項３０】 分画されたライゼイト中で、天然タンパク質をコードする
    オープンリーディングフレームと少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコー
    ドするDNA配列を有するキメラ遺伝子を発現させ、ここで前記天然タンパク質は
    シグナル配列を有する遺伝子によりコードされ、そして前記キメラ遺伝子は異な
    るシグナル配列を有し、ここで前記タンパク質はCtm−PrP以外であり、これによ
    り変更されたコンフォメーションを有する1またはそれ以上のタンパク質を産生
    させる、ことを含む方法により産生された、変更されたコンフォメーションを有
    する1またはそれ以上のタンパク質。
  31. 【請求項３１】 分画され、再構成された膜を使用して、天然タンパク質を
    コードするオープンリーディングフレームと少なくとも実質的に同一のアミノ酸
    配列をコードするDNA配列を有するキメラ遺伝子を発現させ、ここで前記天然タ
    ンパク質はシグナル配列を有する遺伝子によりコードされ、そして前記キメラ遺
    伝子は異なるシグナル配列を有し、ここで前記タンパク質はCtm−PrP以外であり
    、これにより変更されたコンフォメーションを有する1またはそれ以上のタンパ
    ク質を産生させる、ことを含む方法により産生された、変更されたコンフォメー
    ションを有する1またはそれ以上のタンパク質。
  32. 【請求項３２】 天然タンパク質をコードするオープンリーディングフレー
    ムと少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するキメ
    ラ遺伝子を発現させ、ここで前記天然タンパク質はシグナル配列を有する遺伝子
    によりコードされ、そして前記キメラ遺伝子は異なるシグナル配列を有し、ここ
    で前記タンパク質はCtm−PrP以外であり、これにより前記天然タンパク質に比較
    して変更されたコンフォメーションを有する少なくとも1つのタンパク質を産生
    させる、ことを含む、タンパク質のコンフォメーションを変更させる方法。
  33. 【請求項３３】 前記発現は全ライゼイトまたは分画ライゼイト中で行われ
    、前記ライゼイトは前記天然タンパク質の発現に関連するシグナル配列、新生鎖
    または転位機構が相互作用する1またはそれ以上のタンパク質をコードする変更
    された遺伝子を欠如するかまたは有する1またはそれ以上の生物からの全膜また
    は分画され、再構成された膜が補充されている、請求項32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記生物が天然に存在する、請求項32に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記生物が欠如する遺伝子がトランス作用性因子をコード
    する、請求項32に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記生物がウニ胚である、請求項32に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 請求項31に記載の方法により産生され、Ctm−PrP以外であ
    る、変更されたコンフォメーションを有する1またはそれ以上の突然変異体また
    はキメラタンパク質。
  38. 【請求項３８】 前記異なるシグナル配列が調節可能なシグナル配列である
    、請求項32に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記調節可能なシグナル配列が1またはそれ以上のトラン
    ス作用性因子により調節される、請求項38に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 少なくとも2つの条件下に、各キメラ遺伝子が異なるシグ
    ナル配列を有する、各々がと少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列をコードす
    る配列を有する同義キメラ遺伝子を発現させ、これにより変更されたコンフォメ
    ーションを有する1またはそれ以上のタンパク質を産生させ、ここで前記条件は
    、 a．分画したライゼイト、 b. 分画され、再構成された膜、および c. 前記天然タンパク質の発現に関連するシグナル配列、新生鎖または転位機
    構が相互作用する1またはそれ以上のタンパク質のための変更された遺伝子を欠
    如するかまたは有するか、あるいは前記タンパク質のためのミッシング遺伝子を
    供給する、哺乳動物からの全膜または再構成膜が補充された分画ライゼイト、 d. 前記天然タンパク質の発現に関連するシグナル配列、新生鎖または転位機
    構が相互作用する1またはそれ以上のタンパク質のための変更された遺伝子を欠
    如するかまたはを有するか、あるいは前記タンパク質のためのミッシング遺伝子
    を供給する、非哺乳動物からの全膜または再構成膜が補充された分画ライゼイト
    、 e. 細胞質ゾル混合物、を包含し、 各前記異なるシグナル配列の分類の指示として、前記少なくとも2つの条件下
    に前記同義キメラ遺伝子から得られた発現産物を評価する、ことを含む、シグナ
    ル配列を分類する方法。
  41. 【請求項４１】 プロラクチンのコンフォメーション変化のリポーターとし
    て操作されたグリコシル化アクセプター部位を含んでなるPrPまたはプロラクチ
    ンを前記DNA配列がコードする、請求項40に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 プロテアーゼ処理に対する反応性、高圧液体クロマトグラ
    フィー、側基の修飾から成る群から選択される方法により、前記発現産物を評価
    する、請求項40に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 動物から得られた複数のバイオプシー試料中のタンパク質
    のコンフォメーション分布を比較し、そして 配座異性体の定量分布の変化の指示として、前記複数のバイオプシー試料にお
    いて発現される各コンフォメーションの量を測定する、少なくとも2つの異なる
    形態を有するタンパク質分子の配座異性体の定量分布の変化を同定する方法。
  44. 【請求項４４】 前記複数のバイオプシー試料を前記動物中の異なる組織か
    ら採取する、請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記複数のバイオプシー試料を異なる時間間隔で採取する
    、請求項43に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 疾患関連タンパク質の1またはそれ以上の配座異性体を含
    んでなり、ここで前記前記疾患関連タンパク質の前記配座異性体はCtm−PrP以外
    である、単離された細胞または組換え非ヒト細胞。
  47. 【請求項４７】 前記疾患が神経変性疾患または筋障害である、請求項46に
    記載の単離された細胞または組換え非ヒト細胞。
  48. 【請求項４８】 疾患関連タンパク質の配座異性体がCtm−PrP以外である、
    疾患関連タンパク質の単離されたまたは精製された配座異性体。
  49. 【請求項４９】 請求項1に記載の方法により配座異性体が同定される、疾
    患関連タンパク質の単離されたまたは精製された配座異性体。
  50. 【請求項５０】 疾患関連タンパク質をコードするオープンリーディングフ
    レームと、前記タンパク質に対して自然であるシグナル配列以外のシグナル配列
    とを含んでなる、キメラ遺伝子。
  51. 【請求項５１】 前記疾患関連タンパク質がプリオンタンパク質である、請
    求項50に記載のキメラ遺伝子。
  52. 【請求項５２】 トランス作用性因子に結合した疾患関連タンパク質の新生
    鎖を含んでなる、単離された細胞または組換え非ヒト細胞。
  53. 【請求項５３】 疾患関連タンパク質をコードする遺伝子を含んでなり、こ
    こで前記遺伝子のシグナル配列がトランス作用性因子に結合されている、単離さ
    れた細胞または組換え非ヒト細胞。
  54. 【請求項５４】 前記トランス作用性因子が前記疾患関連タンパク質の配座
    異性体を変更することができる、請求項52または53に記載の単離された細胞また
    は組換え非ヒト細胞。
  55. 【請求項５５】 前記トランス作用性因子がプリオンタンパク質である、請
    求項52または53に記載の単離された細胞または組換え非ヒト細胞。
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