KR20020011420A - 프리온 질환의 모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 PrP 단백질, 및 이 단백질을 코드화하는 핵산을 제공하며, 여기에서 PrP 단백질은 1) 야생형 PrPC의 글리코실화에 대해 상대적인 불완전한 글리코실화 및 2) 적합한 세포 국소화, 즉 세포 표면으로 수송되는 능력을 생체내에서 특징으로 한다. PrP의 정상적 세포 대응부와는 다른 이 신규한 저-글리코실화 PrP는 감염성 프리온과 함께 인큐베이션함으로써 프로테아제-내성 동형으로 전환될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 프리온 장애를 연구하기 위한 시험관내 세포 및 동물 시스템 및 이들 시스템을 사용하는 방법, 예를 들어 프리온-매개 질환 진행에서 메카니즘적 과정의 연구 또는 프리온-매개 장애의 치료를 위한 새로운 치료제의 확인 방법을 제공한다. 그러한 시스템에서, 프로테아제-내성 저-글리코실화 PrP는 새로 생성되며 표준 면역블롯 기법에 의해 검출될 수 있다.
Description
프리온은 인간 및 동물에서 중추신경계 해면상뇌증을 일으키는 감염성 병원체이다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 전혀 다르다. 현재 지배적인 가설은 핵산 성분이 프리온 단백질의 감염성에 필수적이지 않다는 것이다. 더욱이, 어떤 종의 동물(예를 들어, 인간)을 감염시키는 프리온은 다른 종의 동물(예를 들어, 마우스)을 쉽게 감염시키지 않을 것이다.
프리온 및 그것들이 일으키는 질환에 대한 연구에서 주요한 단계는 프리온 단백질("PrP")로 표시된 단백질을 발견하고 정제하는 것이었다(Bolton et al., Sci ence 218:1309-11(1982); Prusiner et al., Biochemistry 21:6942-50(1982); McKin ley et al., Cell 35:57-62(1983)). 완전한 프리온 단백질-코드화 유전자가 클론되고 서열화되어 트랜스제닉 동물에서 발현되어 왔다. PrPC는 단일-카피 숙주 유전자에 의해 코드화되고(Basler et al., Cell 46:417-28(1986)), 정상적으로는 뉴런의 외표면에서 발견된다. 프리온 질환이 PrPC의 PrPSc로 명명된 변형된 형태로의 전환에 기인한다는 것이 선도적인 가설이다.
PrPSc가 동물 및 인간의 전염성 신경변성 질환의 전염 및 발병에 필수적임이 틀림없다. Prusiner, S. B., "Molecular biology of Prion disease," Science 252: 1515-1522(1991) 참조. 동물의 가장 흔한 프리온 질환은 양 및 염소의 스크래피 및 소의 소해면상뇌증(BSE)이다(Wilesmith, J. and Wells, Microbiol. Immunol. 172:2 1-38(1991)). 4가지 인간 프리온 질환이 (1) kuru, (2) 크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3) 거스만-스트라슬러-쉐인케르병(GSS), 및 (4) 치사성 가족불면증(FFI)으로 확인되었다(Gajdusek, D. C., Science 197:943-960(1977); Me dori et al., N. Engl. J. Med. 326:444-449(1992)). 산발성, 유전성 및 감염성 병으로서 인간 프리온 질환의 제시는 처음에 어떤 수수께끼를 던졌으며, 이것은 PrP의 세포 유전 기원에 의해 설명되고 있다.
CJD 케이스 중 대부분은 산발성이지만, 약 10 내지 15%는 인간 PrP 유전자에 있는 돌연변이에 기인하는 상염색체 우성 유전질환으로서 유전된다(Hsiao et al., Neurology 40:1820-1827(1990); Goldfarb et al., Sceince 258:806-808(1992); Kit amoto et al., Proc. R. Soc. Lond. 343:391-398). 의원성 CJD는 사체의 뇌하수체 뿐만 아니라 경막 이식편으로부터 유도된 인간 성장 호르몬에 기인한다(Brown etal., Lancet 340:24-27(1992)). 수십년 동안 뉴기니 고지의 Fore 및 이웃 부족들을 유린했던 kuru는 의례적인 카니발리즘 동안의 감염에 의해 퍼져나간 것으로 여겨진다(Alpers, M. P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol. 1, S. B. Prusiner and W. J. Hadlow, eds. (New York: Academic P ress), pp. 66-90 (1979)).
초기의 실험 영장류로 CJD의 전염은 kuru와 스크래피 사이의 유사성에 대한 William Hadlow의 인지와 함께 시작된 풍부한 역사를 가진다. 1959년에 Hadlow는 kuru로 사망한 환자로부터 제조된 추출물을 비인간 영장류에 접종하고 장기간의 잠복 기간 후 그 동물을 발생이 예상되는 질환에 대해 관찰하는 것을 제안했다(Halow , W. J., Lancet 2:289-290(1959)). 7년 후, Gajdusek, Gibbs 및 Alpers는 18 내지 21개월 범위의 잠복 기간 후 침팬지에서 kuru의 전염을 증명했다(Gajdusek et al., Nature 209:794-796(1966)). kuru의 신경병리학과 CJD의 신경병리학의 유사성 (Klatzo et al., Lab Invest. 8:799-847(1959))은 침팬지를 사용한 유사한 실험을 촉진했으며, 질환의 전염이 1968년에 보고되었다(Gibbs, Jr. et al., Science 161:388-389(1968)). 마지막 25년에 걸쳐서 약 300 케이스의 CJD, kuru 및 GSS가 여러 꼬리 없는 원숭이 및 원숭이에 전염되었다.
그러한 동물 실험의 비용, 희귀성 및 종종 알게된 비인도성은 이런 작업을 제한해 왔으며, 그로 인해 지식의 축적에도 한계가 있었다. 가장 신뢰할만한 전염 데이타는 비인간 영장류를 사용한 연구로부터 나온다고 말해져 오고 있지만, 인간 프리온 질환 중 어떤 케이스는 분명히 보다 덜 규칙적이나 설치류에도 전염되어 왔다(Gibbs, Jr. et al., Slow Transmissible Diseases of the Nervous Systems, Vol.2, S. B. Prusiner and W. J. Hadlow, eds.(New York: Academic Press), pp. 87-110(1 979); Tateishi et al., Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner et al., eds.(London: Ellis Horwood), pp. 129-134(1992)).
소 프리온이 인간에게 전염되어 변종 크로이츠펠트-야콥병(vCJD)이 발생했을 가능성에 의해, PrPC의 PrPSc로의 전환을 이해하는 것의 중요성이 높아지고 있다( G. Chazot et al., Lancet 347:1181(1996); R. G. Will, et al., Lancet 347:921-925(1996)). 더 초기의 연구들은 PrPSc의 N-말단이 스크래피 감염성의 손실 없이 절단될 수 있으며(S. B. Prusiner, et al., Biochemistry 21:6942-6950(1982); S. B. Prusiner, et al., Cell 38:127-134(1984)), 상응하여 PrPSc의 N-말단의 절단이 PrPSc로의 그것의 전환을 허용한다는 것을 밝혔다(M. Rogers, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3182-3186(1993)).
최근의 연구들은 분자 수준에서 PrPC의 PrPSc로의 구조적 전이를 가시화하는 능력을 진전시키고 있다. 예를 들어, PrPC의 N-말단 부분은 상대적으로 비구조적이고 유연하지만, C-말단 부분 내의 구조적 요소를 안정화하는 것을 돕는다(D. G. Donne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13452-13457(1997)). 더욱이, 면역학적 연구는 N-말단 에피토프가 PrPSc에 숨어있다는 것을 증명했으며, 이는 이 영역이 프리온 증식 동안 난해한 형태적 변화를 겪는다는 생각을 지지한다(Peretz et al., J. Mol. Biol. 273:614-622(1997)).
이들 진전에도 불구하고, 병원성 전환 과정에 대한 구조적 생물학의 이해는 많은 방식에 있어 불완전하게 남아있다. 예를 들어, PrPC의 구조적 영역이 형태적 변화가 일어나는데 필수적인지 또는 충분한지는 정확하게 알려지지 않았다. 또한, PrPSc의 영역이 감염성에 필수적인지 또는 충분한지도 알려지지 않았다. 증거는 프리온 계통 현상 및 종 장벽이 상이한 PrP 형태의 결과지만, 이들 형태의 정확한 구조적 결정소는 아직 정확하게 확인되지 않고 있음을 나타낸다(Telling et al., Science 274:2079-2082(1996); Billeter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7281-7285(1997)).
최근 연구들은 PrPC에서 PrPSc로의 형태적 변화를 용이하게 하기 위해 요구되는 추정 인자인 단백질 X와 상호작용한다고 여겨지는 마우스 PrP(MoPrP)의 4개 잔기를 확인했다(Telling et al., Cell 83:79-90(1995)). 4개 아미노산은 모두 함께 재조합 PrIP 90-231 및 PrIP 29-231의 3차 구조에 추정 단백질 X 결합 부위를 형성하게 된다(D. G. Donne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13452-13457 (1997); T. L. James et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10086-10091(1997)). 그러나, PrPC를 결합시키는 단백질에 대한 몇몇 보고에도 불구하고 단백질 X의 확인은 여전히 어렵다. 마지막으로, 재접혀진 재조합 PrP 분자의 구조는 PrPC를 닮을 수도 있지만, PrPSc에 대한 구조적 해답은 여전히 부족하다.
프리온 질환 및 이 질환의 고유한 생리학적 변화를 연구하는 한 방법은 감염된 세포에서 발현되는 PrPC단백질의 물리적 구조를 변경시켜 프리온-매개 장애의 진행에 대한 효과를 시험하는 것이다. 특히, PrPC의 글리코실화 부위가 PcPC의 PrPSc로의 전환에서 그것의 역할을 측정하기 위해 최초로 시험되었다. 2개 NXT 공통 글리코실화 부위(182 및 198)에 있는 Thr이 Ala로 치환된 PrPC돌연변이는 세포에서 돌연변이 구성물의 트랜스펙션 후 프로테이나제 K-내성 형태로의 증가된 산발적 전환을 나타냈으며, 이는 분자가 감소된 형태적 안정성을 가짐으로써 PrPSc로의 전환을 겪기가 더 쉬움을 시사한다. Taraboulos et al., PNAS, 87:8262-8266(1990). 또한, PrPC분자는 이상 세포내 국소화를 나타냈지만, PrPSc로의 전환이 또한 선구 돌연변이 PrPC분자의 위치에 기인될 수 있다는 가설도 있다. 후자의 가설은 트랜스제닉 마우스에서 T183A 글리코실화 돌연변이를 갖는 PrPC의 발현에 의해 강화되었으며, 이것은 변경된 PrPC분포 및 마우스 프리온으로 감염된 후 >500의 잠복 기간을 가져온다. DeArmond et al., Neuron, 19:1337-1348(1997). PrPC의 이 돌연변이 형태의 이상 트래픽킹(trafficking)은 세포체에 PrPC의 축적 및 수지상 수목에 PrPC의완전한 부재를 가져온다. PrPSc형성이 세포 표면상에서 일어난다고 여겨지므로, 이상 트래픽킹은 아마도 이들 트랜스제닉 동물에서 PrPSc형성 및 축적을 방지하여 증가된 잠복 기간을 가져온것 같다.
현재 이용가능한 시스템의 시간 및 비용 제한 때문에, 본 분야에는 더욱 능률적이고 시간-효과적인 시스템으로 프리온 질환의 병원성 전환 과정을 연구하는 방법에 대한 필요가 있다. 따라서, 본 분야에는 프리온 감염 및 프리온-매개 장애의 진행에 대한 시간-능률 모델을 사용하여 프리온 질환을 연구하는 시스템에 대한 필요가 있다.
(정부 권리)
미국 정부는 국립 건강 연구소에 의해 수여된 수여번호 AG 10770에 따라 본 출원에 대해 어떤 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 일반적으로 신경변성 장애를 연구하기 위한 시스템, 및 특히 프리온-관련 질환의 연구를 위한 시스템에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 PrP 단백질, 및 이 단백질을 코드화하는 핵산을 제공하며, 여기에서 PrP 단백질은 1) 야생형 PrPC의 글리코실화에 대해 상대적인 불완전한 글리코실화 및 2) 충분히 적합한 세포 국소화, 즉 감염을 허용하기에 충분한 양으로 세포 표면으로 수송되는 능력을 생체내에서 특징으로 한다. PrP의 정상적 세포 대응부와는 다른 이 신규한 저-글리코실화(under-glycosylated) PrP는 감염성 프리온과 함께 인큐베이션함으로써 프로테아제-내성 동형으로 전환될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 프리온 장애를 연구하기 위한 시험관내 세포 및 동물 시스템 및 이들 시스템을 사용하는 방법, 예를 들어 프리온-매개 질환 진행에서 메카니즘적 과정의 연구, 또는 프리온-매개 장애의 치료를 위한 새로운 치료제의 확인방법을 제공한다. 그러한 시스템에서, 프로테아제-내성 저-글리코실화 PrP는 새로 생성되며 표준 면역블롯 기법에 의해 검출될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 저-글리코실화 PrP는 세포 배양물에서 발현된다. 세포 배양물에서 발현된 저-글리코실화 PrP의 전환은 4일 정도의 짧은 기간안에 프리온 병에 걸린 동물의 뇌 균등질로 세포의 디쉬를 접종함에 의해 달성될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 저-글리코실화 PrP는 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 발현된다. 바람직한 구체예에서, 저-글리코실화 PrP의 발현은 유도 프로모터에 의해 제어된다.
또한, 본 발명은 프리온-매개 병리학의 연구 및 진단을 위한 비인간 트랜스제닉 동물을 제공하며, 이 트랜스제닉 동물은 본 발명의 외인성 PrP 유전자를 함유하도록 인공적으로 변경된 게놈을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 게놈은 또한 외인성 PrP 유전자의 발현을 행하는 유도원 서열을 함유하도록 변경된다. 이들 트랜스제닉 동물은, 정상적으로 유전적으로 분화한 동물만을 감염시키는 감염성 프리온 제제로 접종된 후, 200일 이하내에 프리온 질환의 증상을 나타내는 능력을 특징으로 한다. 트랜스제닉 동물은 애블레이션에 의해 변경되거나, 또는 키메라 형태의 유전자를 발현하도록 변형된 내인성 유전자를 추가적으로 가질 수 있으며, 이들 변경에 대한 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 래트, 햄스터이거나, 또는 더 바람직하게는 마우스이다. 유전적으로 분화한 동물은 바람직하게는 인간, 암소, 양, 말, 염소, 사슴, 돼지, 개, 고양이, 칠면조 또는 닭이다.
또한, 본 발명은 프리온 오염이 의심되는 물질로 트랜스제닉 비인간 포유류, 바람직하게는 마우스를 접종함에 의해 간단하게 프리온을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 접종된 동물은 본 발명의 저-글리코실화 PrP 유전자를 발현하도록 인공적으로 변경된 게놈, 및 선택적으로 외인성 PrP 유전자의 발현을 행하는 유도원 서열을 함유한다. 프리온 감염성은 운동실조와 같은 프리온 질환의 증상에 대해 트랜스제닉 동물을 관찰함에 의해 측정될 수 있다. 운동실조는 동물의 직접적 시각 관찰에 의하거나, 또는 영향을 받지 않은 동물의 패턴에 대해 상대적인 스크래피병 동물의 패턴을 구별할 수 있는 마우스의 발 아래에 둔 압력-감지 검출기에 의하여 검출될 수 있다. 또는 달리, 감염된 동물로부터의 뇌 균등질이 생성되어 PrPSc의 존재 및/또는 수준에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 목적은 전환시 발행하는 구조적 사건을 연구하기 위한 생체외 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프리온-매개 장애로 고통받을 것이 의심되는 환자의 샘플에서 프리온을 확인하는 생체외 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PrP 활성을 매개하고, PrP와 상호작용하고, 및/또는 PrPC의 PrPSc로의 전환을 용이하게 하는 세포 인자를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 목적은 질환 모델 및/또는 질환을 일으키는 물질의 존재에 대한 분석에 사용되는 트랜스제닉 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 특징은 트랜스제닉 셀라인, 뇌 균등질 및/또는 동물이 감염성 프리온의 계통에 상관 없이 샘플로 감염될 수 있다는 것이다.
본 발명의 이점은 샘플에 있는 프리온의 감염성이 신속히 측정될 수 있다는 것이다.
이들 및 본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징이 아래 충분히 설명된 바와 같은 키메라 유전자, 분석법 및 트랜스제닉 마우스의 상세한 설명을 숙독함에 의해 당업자에게 명백하게 될 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 시스템, 분석법 및 방법을 설명하기 전에 본 발명이 설명된 특정 방법에 한정되지 않으며, 이로써 당연히 다양할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에 사용된 용어가 단지 특정한 구체예를 설명하기 위한 것이며, 한정하도록 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것들과 유사한 또는 동등한 어떤 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 설명되는 것이다. 본원에 언급된 모든 공보는 인용된 공보와 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시 및 설명하기 위한 참고자료로서 본원에 포함된다.
본원에 논의된 공보는 본 출원 제출일 전의 명세서에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 그러한 공보를 선행할 권리를 받을 수 없다는 승인으로서 구성될 수 없다.
정의
용어 "Prnp0/0또는 "Prnp-Ab1"은 2개 대립유전자가 애블레이트(ablate)된 것을 나타내는 "0/0"을 갖는 애블레이트된 PrP 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물을 설명한다. 반면 0/+는 하나만 애블레이트된 것을 나타낸다. 구체적으로, 관련되는 동물은 일반적으로 애블레이트된 PrP 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스, 즉 PrP 녹아웃 마우스이다. PrP 유전자가 분열된다는 점에서, 마우스 PrP 유전자는 발현되지 않는다.
"sCJD"로 약술되는 용어 "산발성 CJD"는 크로이츠펠트-야콥병(CJD)의 가장 흔한 증상을 설명한다. 이 질환은 백만명 당 1명의 비율로 대략 60세의 평균 연령을 갖는 개인에게서 자연적으로 발생한다.
"iCJD"로 약술되는 용어 "의원성 CJD"는 사람이 인간 프리온으로 우연히 감염되는데 기인하는 질환을 설명한다. 그것의 가장 주목되는 예는 아이가 인간 성장 호르몬의 오염된 제제로부터의 인간 프리온으로 우연히 감염되는 것이다.
용어 "가족성 CJD"는 가족에게서 드물게 발생하며 필연적으로 인간 PrP 유전자의 돌연변이에 기인하는 CJD의 형태를 설명한다. 이 질환은 상염색체 우성 유전질환에 기인한다. 돌연변이를 유전한 가족 구성원은 일반적으로 CJD로 죽는다.
"GSS"로 약술되는 용어 "거스만-스트라슬러-쉐인케르병"은 유전되는 인간 프리온 질환의 형태를 설명한다. 이 질환은 상염색체 우성 유전질환으로부터 발생한다. 저-글리코실화 유전자를 유전한 가족 구성원은 일반적으로 GSS로 죽는다.
용어 "프리온"은 암소 및 인간을 포함하는 동물에서 질환(해면상뇌증)을 일으킨다고 공지된 감염성 입자를 의미할 것이다. 용어 "프리온"은 단어 "단백질"과 "감염"의 축약어이며, 이 입자는 PrP 유전자에 의해 코드화되는 PrPSc분자로만 독점적으로 구성되지 않는 경우에는 광범위하게 구성된다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 전혀 다르다. 공지된 프리온은 동물을 감염시켜 양 및 염소의 신경 시스템의 전염성 퇴행성 질환인 스크래피, 뿐만 아니라 소해면상뇌증(BSE) 또는 "광우병" 및 고양이의 고양이해면상뇌증을 일으키는 것들을 포함한다. 인간에게 영향을 미치는 것으로 알려진 4가지 프리온 질환은 (1) kuru, (2) 크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3) 거스만-스트라슬러-쉐인케르병(GSS), 및 (4) 치사성 가족 불면증(FFI)이다. 본원에 사용된 바와 같은 프리온은 사용된 어떤 동물 - 및 특히 인간, 암소 및 다른 가축에서 이들 질환 모두 또는 어느 것, 또는 다른 질환을 일으키는 모든 형태의 프리온을 포함한다.
용어 "PrP 유전자"는 단백질(예를 들어, 1996년 10월 15일자로 간행된 미국 특허 5,565,186의 도 3 내지 도 5에 나타낸 것들) 및, "병원성 돌연변이 및 다형성"의 부제하에 본원에 기재된 것들과 같은 다형성 및 돌연변이를 발현하는 유전 물질을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. PrP 유전자는 본원에 설명된 "숙주" 및 "시험" 동물을 포함하는 어떤 동물, 및 그것의 어떤 및 모든 다형성 및 돌연변이로부터 유래될 수 있으며, 이 용어가 이제부터 발견될 다른 그러한 PrP 유전자도 포함한다는 것이 인정된다.
용어 "PrP 유전자"는 일반적으로 어떤 프리온 단백질을 포함하는 어떤 형태의 PrP 아미노산 서열을 코드화하는 어떤 종의 어떤 유전자를 설명하며, 단백질의 비-질환 형태는 PrPC로 설명되고, 질환 형태는 PrPSc로 설명된다. 통상적으로 공지된 PrP 서열 일부가 Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101(1992) 및 미국 특허 5,565,186에 설명되며, 이것 모두가 그러한 서열을 개시 및 설명하기 위한 참고자료로서 본원에 포함된다.
용어 "프리온 제제", "제제" 등은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 포유류의 뇌조직으로부터 얻어진 프리온을 함유한다고 의심되는 조성물을 설명한다. 표준화된 프리온 제제가 얻어지는 포유류는 프리온 접종의 결과로서, 및/또는 유전적으로 변형된 메이크업, 예를 들어 PrP 유전자의 높은 카피수로 인한 질환의 발생에 기인하는 CNS 기능장애의 임상적 징후를 나타낸다.
용어 "인공 PrP 유전자"는 용어 "키메라 PrP 유전자" 뿐만 아니라, 숙주 동물(예를 들어, 마우스)의 게놈에 포함될때, 이 포유류를 자연적으로 유전적으로 분화한 시험 포유류, 예를 들어 인간, 소 또는 양만을 감염시키는 프리온에 감염되기 쉽게 만드는 다른 재조합적으로 구성된 유전자를 포함하도록 본원에서 사용된다. 일반적으로, 인공 유전자는 상이한 코돈 - 바람직하게는 유전적으로 분화한 포유류(인간과 같은)의 상응하는 코돈으로 대체되는 천연 서열의 하나 이상(모두는아니며, 일반적으로 40 미만)의 코돈으로 유전적으로 변경되는 포유류의 PrP 유전자의 코돈 서열을 포함할 것이다. 유전적으로 변경된 포유류는 유전적으로 분화한 포유류만을 감염시키는 프리온용 샘플을 분석하는데 사용된다. 인공 유전자의 예는, 동일한 위치에서 마우스 코돈을 대체하는 인간, 암소 및 양에 대한 미국 특허 5,565,186의 도 3, 도 4 및 도 5에 나타낸 코돈으로부터 선택된 하나 이상의 상이한 대체 코돈을 갖는, 이들 도면에 나타낸 바와 같은 서열을 코드화하는 마우스 PrP 유전자이다. 단, 모든 마우스 코돈이 상이한 인간, 암소 또는 양 코돈으로 대체되는 것은 아니다. 본 발명의 인공 PrP 유전자는 PrP 분자의 글리코실화에 영향을 미치는 돌연변이, 및 유전적으로 분화한 동물의 코돈; CJD와 같은 유전적 프리온 질환에 관련된 코돈 및/또는 코돈 서열; 그리고 동물에 삽입됐을때 이 동물을 정상적으로 유전적으로 분화한 동물만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉽게 만드는 것을 제외하고 어떤 자생 PrP 유전자에도 관련되지 않는 코돈 및 서열을 갖는다. 인공 PrP 유전자의 도입은, 특히 세포 트랜스펙션 분석에 있어 안정적 또는 일시적일 수 있다. 예를 들어, 인공 PrP 유전자는 바이러스성 벡터를 사용하여 도입될 수 있다. 이 방식에서, PrP 유전자는 특정한 조직 또는 세포 종류, 예를 들어 CNS 조직에 도입될 수 있다.
용어 "키메라 유전자", "키메라 PrP 유전자" 등은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 인간, 암소 또는 양과 같은 유전적으로 분화한 시험 동물로부터의 상응하는 코돈으로 대체되는 하나 이상의 코돈을 갖는 마우스와 같은 숙주 동물의 코돈을 함유한 인공적으로 구성된 유전자를 의미한다. 본 발명의 키메라 PrP 유전자는 모두 생체내에서 PrP의 글리코실화 수준을 감소시키는 돌연변이를 추가적으로 함유한다. 한 구체적 예에서, 키메라 유전자는 숙주 종 포유류(예를 들어, 마우스)의 PrP 유전자의 출발 및 종결 서열(즉, - 및 C-말단 코돈)로 구성되며, 또한 제 2 종 시험 포유류(예를 들어, 인간)의 PrP 유전자 중 상응하는 부분의 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 키메라 유전자는 숙주 종 포유류의 게놈에 삽입될때 이 포유류를 정상적으로 제 2 종 포유류만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉽게 만들 것이다. 본원에 개시된 바람직한 키메라 유전자는 마우스 PrP 유전자의 출발 및 종결 서열, 및 마우스 PrP 유전자와는 상이한 방식으로 단백질이 발현됨으로써 9개 잔기가 다르게 된 인간 서열로 대체되는 비-종결 서열 영역을 함유하는 MHu2M이다.
용어 "프리온과 관련된 유전 물질"은 프리온으로 감염되는 동물의 능력에 영향을 미치는 어떤 유전 물질을 커버하도록 의도된다. 따라서, 용어는 어떤 "PrP 유전자", "인공 PrP 유전자", "키메라 PrP 유전자" 또는 "애블레이트된 PrP 유전자"를 포함하며, 프리온으로 감염되는 동물의 능력에 영향을 미치는 그것들의 돌연변이 및 변형도 본원에서 정의된다.
용어 "숙주 동물" 및 "숙주 포유류"는 동물내에 자연적으로는 존재하지 않는 유전 물질을 포함시키기 위해서 유전적으로 및 인공적으로 조작된 게놈을 가질 것인 동물을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 숙주 동물은 본 발명의 인공 유전자의 삽입에 의해 변경된 내인성 PrP 유전자를 갖는 마우스, 햄스터 및 래트를 포함한다.
용어 "시험 동물" 및 "시험 포유류"는 숙주 동물의 PrP 유전자와 시험 동물의 PrP 유전자 사이의 차이에 의하여 숙주 동물로부터 유전적으로 분화한 동물을 설명하기 위해 사용된다. 시험 동물은, 주어진 샘플이 시험 동물이 일반적으로 감염되기 쉬운 프리온을 함유하는지의 여부를 측정하기 위해, 분석 시험이 행해지는 어떤 동물일 수 있다. 예를 들어, 시험 동물은 인간, 암소, 양, 돼지, 염소, 사슴, 말, 고양이, 개, 칠면조 또는 닭일 수 있으며, 특정한 샘플이 정상적으로는 시험 동물만을 감염시키는 프리온을 포함하는지의 여부를 측정할 수 있다. 이것은 숙주 동물에 시험 동물의 PrP 유전자 서열을 포함시키고, 정상적으로 시험 동물만을 감염시키는 프리온으로 숙주 동물을 접종함에 의해 행해진다.
용어 "유전적으로 분화한 동물" 및 "유전적으로 분화한 포유류"는 17 이상의 코돈, 바람직하게는 20 이상의 코돈, 가장 바람직하게는 28 내지 40 코돈까지 유전적으로 분화한 시험 동물과 상이한 숙주 동물의 자생 PrP 코돈 서열을 포함하는 동물을 설명하기 위해 사용된다. 따라서, 마우스 PrP 유전자는 인간, 암소 또는 양의 PrP 유전자와 관련하여 유전적으로 분화한 것이지만, 햄스터의 PrP 유전자와 관련해서는 유전적으로 분화한 것이 아니다.
용어 "애블레이트된 PrP 유전자", "분열된 PrP 유전자" 등은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 유전자를 무효로 만드는 방식으로 변경(예를 들어, 뉴클레오티드의 추가 및/또는 제거)된 내인성 PrP 유전자를 의미한다. 비-작용성 PrP 유전자의 예 및 그것의 제조 방법이 본원에 참고자료로서 포함되는 Bueler, H., et al. "Normal development of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein" Nature 356:577-582(1992)에 개시된다. 바람직하게는 유전자의 2개 대립유전자 모두 분열된다.
용어 "혼성체 동물", "트랜스제닉 혼성체 동물" 등은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 애블레이트된 내인성 PrP 유전자를 갖는 제 1 동물과 본 발명의 키메라 유전자 또는 인공 PrP 유전자를 포함하는 제 2 동물의 이종-교배로부터 얻어진 동물을 의미한다. 예를 들어, 혼성체 마우스는 애블레이트된 마우스 PrP 유전자를 갖는 마우스와 저-글리코실화 키메라 PrP 유전자를 함유하는 마우스를 이종-교배시킴에 의해 얻어진다. 용어 혼성체는, 만약 결과의 자손이 정상적으로 유전적으로 분화한 종만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉽고, 감염의 증상이 약 350일 이하, 바람직하게는 250일 이하안에 관찰가능하다면, 2개 혼성체의 동계교배된 자손을 포함하는 어떤 혼성체의 자손을 포함한다.
용어 "감염되기 쉬운", "프리온에 의해 감염되기 쉬운" 등은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 정상적으로 유전적으로 분화한 시험 동물만을 감염시키는 프리온으로 접종된 경우 프리온 질환을 나타내는 본 발명의 트랜스제닉 또는 혼성체 시험 동물을 설명한다. 이 용어는, 키메라 PrP 유전자가 없으면 인간 프리온으로 쉽게 감염되기 않지만(20% 미만의 감염 기회), 키메라 유전자가 있으면 인간 프리온으로 감염되기 쉬운(80% 내지 100%의 감염 기회) 트랜스제닉 마우스 Tg(MHu2M)와 같은 본 발명의 트랜스제닉 또는 혼성체 동물을 설명하기 위해 사용된다. 만약 동물이 특정한 프리온으로 감염되기 쉽다면, 이 프리온으로 접종된 경우 동물은 약 350일 이하, 바람직하게는 250일 이하안에 프리온 질환 감염의 증상을 나타낼 것이다.
용어 "잠복 시간"은 프리온으로 동물을 접종한 때로부터 동물이 감염에 기인하는 질환의 검출가능한 증상을 최초로 나타내는 때까지의 시간을 의미할 것이다. 감소된 잠복 시간은 1년 이하, 바람직하게는 약 200일±50일 이하, 더 바람직하게는 약 50일±20일 이하이다.
본원에 사용된 약어로는 다음이 있다.
CNS : 중추신경계
BSE : 소해면상뇌증
CJD : 크로이츠펠트-야콥병
FFI : 치사성 가족 불면증
GSS : 거스만-스트라슬러-쉐인케르병
Hu : 인간
HuPrP : 인간 PrP
Mo : 마우스
Bo : 소
MoPrP : 마우스 PrP
SHa : 시리안 햄스터
SHaPrP : 시리안 햄스터 PrP
Tg : 트랜스제닉
Tg(SHaPrP) : 시리안 햄스터의 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스
Tg(HuPrP) : 완전한 인간 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스
Tg(ShePrP) : 완전한 양 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스
Tg(BoPrP) : 완전한 암소 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스
PrPSc: PrP의 스크래피 동형
MoPrPSc: 마우스 PrP의 스크래피 동형
MHu2M : 마우스 PrP 유전자의 영역이 9 코돈에서 마우스 PrP와 다른 상응하는 인간 서열에 의해 대체된 키메라 마우스/인간 PrP 유전자
MBo2M : 마우스 PrP 유전자의 영역이 8 코돈에서 마우스 PrP와 다른 상응하는 소 서열에 의해 대체된 키메라 마우스/소 PrP 유전자
Tg(MHu2M) 마우스 : 키메라 MHu2M 유전자를 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 마우스
MHu2MPrPSc: 키메라 인간/마우스 PrP 유전자의 스크래피 동형
PrPCJD: PrP 유전자의 CJD 동형
Prnp0/0: 내인성 PrP 유전자, 예를 들어 MoPrP 유전자의 2개 대립유전자의 애블레이션
Tg(BoPrP)/Prnp0/0: 소 PrP 유전자(BoPrP)를 사용하여 얻어진 트랜스제닉 마우스
Tg(MHu2M)/Prnp0/0: 내인성 마우스 PrP 유전자의 2개 대립유전자가 분열된키메라(마우스/인간) PrP 유전자(MHu2M)을 갖는 마우스
Tg(MBo2M)/Prnp0/0: 내인성 마우스 PrP 유전자의 2개 대립유전자가 분열된 키메라(마우스/소) PrP 유전자(MBo2M)를 갖는 트랜스제닉 마우스
FVB : FVB 마우스의 알이 상대적으로 크고 외인성 DNA의 미세주사를 상대적으로 잘 견디므로, 트랜스제닉 마우스의 생성에 주로 사용되는 마우스의 표준 동계교배 계통
발명의 일반적 양태
본 발명은 세포에서 저-글리코실화 PrPC단백질의 발현이 이들 세포를 프리온에 의해 감염되기 쉽게 만들며, 세포가 프리온을 함유하는 제제에 노출되는 때 이들 세포가 새로 PrPSc를 생성하도록 허용한다는 발견을 기초로 한다. 이전의 PrP의 글리코실화 부위에서 Thr의 Ala로의 치환이 형태적 불안정성을 가져오기는 했지만, 결과의 PrPC분자는 이상 세포 국소화를 나타냈고 트랜스제닉 마우스에서 발현되었을 때 매우 긴 프리온 잠복 기간을 가져왔다. 놀랍게도, 본 발명의 돌연변이, 예를 들어 PrP 글리코실화 부위에 있는 Asn의 Gln로의 돌연변이는 형태적으로 불안정하지만, 감염시 PrPC의 PrPSc로의 전환을 허용하는 양으로 세포 표면에 적합하게 국소화되는 PrPC분자를 가져온다. 저-글리코실화 PrPC의 전환은 신속하며, 이 변이체 PrP를 발현하는 세포에서 프리온의 빠른 검출을 허용하고, 트랜스제닉 마우스의접종이 250일 이하안에 감염의 징후를 나타내도록 허용한다.
현재, 프리온 감염에 대한 가장 민감한 생물학적 분석인 내뇌 접종은 PrP를 과발현하는 트랜스제닉 마우스가 내뇌 접종을 위한 래시피언트 동물로서 사용되는 경우조차도 수개월간 계속된다. 전염성은 운동실조와 같은 특징적 증상 및, 뇌를 시험했을 때 공포형성, 성상교증 및 신경 세포 손실과 같은 병에 걸린 뇌조직의 전형적인 신경병리학적 특징의 출현에 의해서만 진단된다. 웨스턴 블롯상의 프로테아제-내성 PrP 존재의 검출과 같은, 병에 걸렸다고 의심되는 뇌에서 프리온 질환을 진단하는 시험관내 방법은 면역학적 분석의 민감성에 의해 한정된다. 본 발명은 동물 생물학적 분석의 민감성 및 특이성과 웨스턴 블롯 과정의 신속성을 조합한, 생체외 검출 방법을 제공한다.
저-글리코실화 PrPC를 발현하는 세포 시스템은 특정 셀라인에서 저-글리코실화 PrP를 일시적 또는 영구적으로 과발현하는 방법, 관심의 조직 현탁액 또는 체액과 함께 이들 세포를 인큐베이션하는 방법, 및 현재 이용가능한 생물학적 분석에서 발견된 제한 없이 샘플에서 프리온의 검출을 허용하는 웨스턴 블롯과 같은 종래의 방법으로 새로 형성된 프리온을 시험하는 방법을 제공한다. 저-글리코실화 PrP를 과발현하는 이 셀라인에서 프리온의 신속한 복제는 다양한 조직에 존재하는 미소량의 프리온을 증폭하는데 사용된다.
한 구체예에서, PrP는 글리코실화 부위에 있는 2개의 아스파라긴이 다른 아미노산으로 치환되는 이중 돌연변이를 코드화한다. 바람직한 구체예에서, 2개의 아스파라긴은 글루타민(N180Q/N196Q)으로 치환된다. 저-글리코실화 PrP는 글리코실화를 여전히 방지하는 한편, 세포 트래픽킹 문제를 극복한다. 이 저-글리코실화 PrP의 그것의 야생형 대응물과 동일한 구획으로의 정확한 수송이 면역형광 및 공통-트랜스펙션 연구에 의해 실험적으로 밝혀졌다.
셀라인에서 이용가능한 생물학적 분석은 특정한 프리온 계통에 한정되어 있었고, 세포-체류 PrP를 전환시키는데 적어도 4주가 필요했으므로, 이런 신속한 생물학적 분석은 프리온 질환을 진단하는데 있어 주요한 개선이다. 또는 달리, 이용가능한 트랜스제닉 마우스의 접종은 사용된 프리온의 종에 따라 2 내지 9개월이 필요하다(Fischer et al., 1996; Prusiner, 1997; Telling et al., 1994). 본 발명의 저-글리코실화 PrP는 셀라인이 탁월한 신속성과 함께 계통에 상관 없이 프리온 병에 걸린 동물의 뇌 균등질로 감염될 수 있다는 점에서 선행 기술의 이들 제한을 극복한다.
PrP 핵산 조성물
본 명세서 내에 사용된 바와 같은 용어 "저-글리코실화 PrP"는 일반적으로 PrP의 정상적 세포 형태에 대해 상대적인, 글리코실화되는 능력과 관련하여 변경된 단백질을 코드화하는 PrP 유전자를 표시한다. 이 용어는 어떤 종으로부터의 PrP, 예를 들어 래트, 소, 인간, 마우스, 기니아피그 등으로부터의 동족체 및 그것들의 다른 형태를 포함한다. 일반적으로 사용되는 경우, 이 용어는 저-글리코실화 단백질의 세포 분포에 영향을 미치지 않는 한, 상이한 동형, 다형성, 돌연변이 및 변이체 서열을 포함한다. 또한, 이 용어는 특이적 저-글리코실화 폴리펩티드, 인트론,및 코딩 영역을 넘어서 약 1kb까지 그러나 어느 한쪽 방향으로는 더 가능한, 발현의 조절에 관여되는 인접한 5' 및 3' 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 의미하도록 의도된다. PrP를 코드화하는 DNA 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 그것의 단편일 수 있다. 유전자는 염색체외 보존 또는 숙주로의 통합을 위해 적합한 벡터에 도입될 수 있다.
본 발명의 관심의 게놈 서열은 자생 염색체에 정상적으로 존재하는 모든 인트론을 포함하여, 기재된 서열에 정의된 바와 같은, 개시 코돈과 정지 코돈 사이에 존재하는 변경된 핵산을 포함한다. 그것은 성숙한 mRNA에서 발견되는 3' 및 5' 미번역 영역을 더 포함할 수 있다. 그것은 전사된 영역의 5' 또는 3' 단부에, 약 1kb 그러나 그 이상도 가능한, 측면 게놈 DNA를 포함하는 프로모터, 인핸서 등과 같은 특이적 전사 및 번역 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 게놈 DNA는 100kb 또는 더 작은 단편 및 실질적으로는 측면 염색체 서열이 없는 상태로 분리될 수 있다.
측면 프로모터 영역 및 코딩 영역을 포함하는 저-글리코실화 PrP 서열은 본 분야에 공지된 다양한 방식으로 추가적으로 저-글리코실화되어, 프로모터 강도, 코드화된 단백질의 서열 등에 목표의 변화를 생성할 수 있다. 서열 변화는 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 결실은 도메인 또는 엑손의 결실과 같은 더 큰 변화를 포함할 수 있다. 관심의 다른 변형은, 예를 들어 FLAG 시스템, HA 등을 사용한 에피토프 태그화를 포함한다. 준세포 국소화에 대한 연구에서, 녹색 형광 단백질(GFP) 과의 융합 단백질이 사용될 수 있다. 그러한 저-글리코실화 유전자는 프리온 폴리펩티드의 구조-작용 관계를 연구하거나, 또는 단백질의 작용 또는 조절에 영향을미치는 단백질의 성질을 변경하는데 사용될 수 있다.
클론된 유전자의 시험관내 돌연변이 유발을 위한 기법이 공지되어 있다. 돌연변이를 스캐닝하기 위한 프로토콜의 예는 Gustin et al., Biotechniques 14:22 (1993); Barany, Gene 37:111-23(1985); Colicelli et al., Mol Gen Genet 199:537 -9(1985); 및 Prentki et al., Gene 29:303-13(1984)에서 알 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발을 위한 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, pp. 15.3-15.108(1989); Weiner et al., Gene 126:35-41(1993 ); Sayers et al., Biotechniques 13:592-6(1992); Jones and Winistorfer, Biote- chniques 12:528-30(1992); Barton et al., Nucleic Acids Res 18:7349-55(1990); Marotti and Tomich, Gene Anal Tech 6:67-70(1989); 및 Zhu, Anal Biochem 177:12 0-4(1989)에서 알 수 있다.
본 발명의 PrP에 존재하는 돌연변이는 어떤 유전적 바탕안에 도입될 수 있으며, PrP 유전자 자체는 질환 상태에 관련된 다형성 또는 특이적 돌연변이를 얼마든지 가질 수 있다. 상이한 종의 PrP 유전자와 관련하여 나타나는 다수의 돌연변이 및 다형성이 있다. 다수의 돌연변이 및 다형성이 아래 제공된 "돌연변이 표"에 기재된다. 추가의 돌연변이 및 다형성이 PrP 유전자의 범위내에 있는 모든 종에 존재한다고 여겨진다. 특정한 포인트에서 이형접합인 PrP 유전자를 갖는 동물이 그 포인트에서 이형접합인 다른 동물과 교배되어, 원하는 종류의 동형접합 PrP 유전자를 갖는 것들을 포함하는 자손을 생성할 수 있다. PrP 트랜스젠에서는 동물을 프리온 감염되기 쉽게 만든다고 공지된 위치에 있는 아미노산과 생화학적으로 아주 다른아미노산으로 치환될 수 있다. 따라서, 만약 염기성 및/또는 극성 아미노산이 중요한 부위에 존재하는 경우, 그 부위는 산성 및/또는 비극성 아미노산으로 대체될 수 있다. 마음속의 이들 기준에 있어서, 어떤 시도 및 오류가 필요할 것이다. 산성 아미노산은 염기성 아미노산으로 치환되어야 하며, 그 반대도 마찬가지이다. 극성 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환되어야 하며, 그 반대도 마찬가지이다. 그러한 돌연변이는 본원에 설명된 사용을 위한 트랜스제닉 동물의 감수성을 증가시킬 수 있다.
인간 PrP 유전자에는 다수의 공지된 병원성 돌연변이가 있다. 더욱이, 인간, 양 및 소 PrP 유전자에는 공지된 다형성이 있다. 다음은 그러한 돌연변이 및 다형성의 리스트이다.
돌연변이 및 다형성을 증명하는 상기 챠트에 더 이상의 의미를 제공하기 위해서, PrP 유전자의 공개된 서열을 참조할 수 있다. 예를 들어, 닭, 소, 양, 래트 및 마우스 PrP 유전자가 개시되고, Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101(1992)에 공개된다. 시리안 햄스터에 대한 서열은 Basler et al., Cell 46:417-428(1986)에 공개된다. 양의 PrP 유전자는 Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2476-2480(1990)에 공개된다. 소의 PrP 유전자 서열은 Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72:201-204(1991)에 공개된다. 닭 PrP 유전자의 서열은 Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7664-7668(1991)에 공개된다. 밍크의 PrP 유전자 서열은 Kretzschmar et al., J. Gen. Virol. 73:2757-2761(1992 )에 공개된다. 인간 PrP 유전자 서열은 Kretzschmar et al., DNA 5:315-324(1986)에 공개된다. 마우스의 PrP 유전자 서열은 Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376(1986)에 공개된다. 양의 PrP 유전자 서열은 Westaway et al., Gene Dev 8:959-969(1994)에 공개된다. 이들 간행물은 모두 PrP 유전자 및 PrP 아미노산 서열을 개시 및 설명하기 위한 참고자료로 본원에 포함된다.
또한, 본 발명의 저-글리코실화 PrP 핵산은 이 서열의 발현 영역안에 삽입되는 폴리히스티딘 또는 c-myc 에피토프 태그와 같은 공지의 에피토프를 코드화할 수 있다. 에피토프는 삽입됨으로써 프레임내에 있게 되고, 이로써 적합하게 번역된다. 에피토프 서열은 전길이 단백질의 다양한 부위에서 프레임내에 추가될 수 있다. 바람직하게는, 외인성 에피토프가 번역된 PrP 폴리펩티드의 말단에서 카르복시 프레임내에 삽입된다.
에피토프 태그 서열은 코드화된 PrP의 용해성을 또한 변경시킬 수 있으며, 이 능력은 위치 의존성일 수 있다. 따라서, 부위를 변화시키는 것은 전길이 단백질의 용해성, 형태 및 활성을 변경시킬 수 있다.
현재 본 분야에 공지된 어떤 에피토프가 사용될 수 있지만, 바람직하게는 사용되는 에피토프는 하전된 잔기로 구성되며, 더 바람직하게는 폴리히스티딘 태그이다. 에피토프 태그는 바람직하게는 알기닌 또는 리신과 같은 극성 약염기성 잔기로 구성되며, 더 바람직하게는 히스티딘이다. 어떤 종류의 극성 잔기는 용해성을 증가시키는데 유용할 것이다.
본 발명의 세포 시스템
본 발명은 프리온-매개 질환의 연구 및 진단을 위한 세포 시스템, 및 그러한 세포 시스템을 사용하는 방법을 제공한다. 세포 시스템은 동물 모델을 사용하지 않는 프리온 감염 및 질환에 관여되는 메카니즘의 연구를 허용한다. 본 발명의 세포 시스템은 그것들이 동물 시스템 보다 비용이 저렴하다는 점에서 이점을 제공하고, 동물 시스템 보다 더 빠른 결과를 제공하며, 그것들이 질환 진행의 세포 메카니즘을 연구하는데 동물의 희생을 필요로 하지 않으므로 더욱 인간적이다.
스크래피 감염성이 새로 생성되는 조건에 대한 지식은 PrPSc의 생성을 억제할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 분석법의 개발에 유용하다. 생체외에서 PrPC의 PrPSc로의 전환을 억제할 수 있는 화합물은 위험한 상태에 있는 동물 및 인간 환자에서 프리온-매개 질환의 치료 및 방지에 유용할 수 있다. 그러한 세포 시스템은 조사를 위한 많은 방법을 제공하며, 이것은 질환의 생리학적 기초 및 진행을 연구하기 위한 생체외에서의 메카니즘, 예를 들어 프리온 감염 및 프리온-매개 질환의 진행에 관여되는 분자 상호작용; PrPC및/또는 PrPSc와 상호작용하는 세포 인자를 확인하는 방법; 진단 과정에서 동물의 희생 없이 잠재적으로 프리온으로 감염되는 동물로부터의 샘플의 진단; 및 프리온 감염 및/또는 프리온-매개 장애의 진행을 차단하는 잠재적 치료제의 효능 및 독성을 시험하기 위한 분석법을 포함한다. 프리온 감염의 세포 모델에 대한 이들 및 다른 사용이 본 명세서를 숙독함에 의해 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 PrP는 대장균과 같은 원핵 세포, 및S. cerevisae, D. melanogast er, X. laevis로부터의 세포, 조류 세포, 포유류 발현 시스템 등을 포함하는 진핵 세포를 포함하는 어떤 세포 종류에서 발현될 수 있다. 본 발명의 PrP의 발현은 CHO 및 COS 세포와 같은 포유류 세포를 사용하는 특정한 사용을 발견하며, 이것은 이들 세포가 포유류 세포 성분을 갖고, 특히 프리온-매개 장애의 연구 및 진단에 유용하기 때문이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 시스템에서 사용하는 세포는 뉴런성 포유류 세포이고, 더 바람직하게는 N2a 세포이다. 세포는 일시적으로 트랜스펙션될 수 있거나, 또는 더 바람직하게는 안정하게 트랜스펙션되고 장기간 배양물에 보존될 수 있다. PrP 핵산으로 세포를 트랜스펙션하는 방법의 실례는 Sambrook et al., Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual(3rd ed.)에서 알 수 있으며, 이것은 이들 기법에 있어 당업자를 돕기 위해 본원에 참고자료로서 포함된다.
본 발명의 한 구체예에서, 샘플은 시험되는 샘플을 저-글리코실화 형태의 PrP를 발현하는 세포 시스템에 노출시키고, 충분한 잠복 시간을 허용한 후 프리온의 존재에 대해 배양물을 분석함에 의해 감염성 프리온의 존재에 대해 분석될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 PrP는 분석되는 샘플의 세포안에 직접 트랜스펙션되고, 이들 세포에 있는 프리온의 수준이 적합한 잠복 기간 후 측정된다. 감염성 형태의 PrP로 쉽게 형질전환하는 본 발명의 PrP의 능력은 일차 배양물이 그러한 세포안에 저-글리코실화 PrP의 트랜스펙션 후 직접 조작 및 분석되는 것을 허용한다.
샘플에 있는 프리온 단백질의 검출
일단 샘플은 본 발명의 생체외 시스템에서 시험되고, 여러가지의 공지된 기법에 의해 분석될 수 있다. 본원에 제시된 실시예 및 비교예는 1998년 2월 20일자로 공개된 PCT 공보 WO 98/37411의 범위내에서 개시 및 설명된 종류의 형태-의존성 면역분석법(CDI)을 이용한다. 그러나, 다른 종류의 단백질 검출 분석법이 이용될 수도 있다. 예를 들어, 샘플은 1998년 12월 8일자로 간행된 미국 특허 5,846,533의 범위내에서 개시 및 설명된 종류의 항체를 사용하여 분석될 수 있으며, 이것은 본 발명에 따라서 제조된 샘플에 대해 사용될 수 있는 특이적 종류의 분석법을 개시 및 설명하기 위해 그 전체가 참고자료로서 본원에 포함된다.
방법은 2개 부분으로 나눠진 샘플을 사용하여 시작할 필요가 있다. 샘플의 제 1 부분은 결합 파트너와 접촉된다. 결합 파트너는 제 1 형태의 단백질에 대해그것이 제 2 병원성 형태의 단백질에 대해 갖는 것 보다 더 높은 친화성을 갖는다. 결합 파트너는 전형적으로 표지된 3F4와 같은 항체이다. 결합 파트너가 제 1 형태의 단백질에 결합하도록 허용한 후, 결합 파트너/단백질 복합체의 농도가 측정된다.
다음에, 샘플의 제 2 부분이 제 2 형태의 단백질에 대한 결합 친화성이 결합 파트너와 관련하여 증진되도록 하는 방식으로 처리된다. 이 처리는 여러가지 상이한 방법을 포함할 수 있으며, 주로 제 2 병원성 형태의 단백질이 더욱 릴랙스됨으로써 결합 파트너에 더 결합하기 쉽도록, 샘플을 충분한 조건하에 충분한 기간 동안 프로테아제에 노출시키는 것을 포함한다.
다음에, 처리된 제 2 부분은 결합 파트너와 접촉된다. 단백질과 결합 파트너 사이의 결합 후, 이 제 2의 처리된 부분에서 형성된 결합 파트너/단백질 복합체의 농도가 측정된다.
만약 샘플이 제 2 병원성 형태의 단백질을 함유하지 않는다면, 다음의 처리는 거의 효과가 없을 것이다. 그러나, 이 처리는 제 1 형태의 단백질에 대해 어떤 효과를 가지며, 다소 작은 정도로 결합 파트너에 대한 그것의 결합 친화성을 증가시키는 것 같다. 따라서, 제 2 농도가 조정되어 조정 농도를 제공해야 하며, 이 조정은 처리에 기인하는 결합 파트너에 대한 제 1 형태의 단백질의 증가된 친화성을 보상한다.
제 1 농도 및 조정 농도를 얻은 후, 이 2개가 서로 비교된다. 만약 조정 농도가 제 1 농도 보다 더 크다면, 그것은 원래의 샘플에 제 2 병원성 형태의 단백질이 존재한다는 표시이다.
변형된 형태-의존성 면역분석법을 수행하는 것이 가능한다. 공개된 PCT 출원 WO 98/37411에 상세히 설명된 한 변형은 원래의 샘플이 제 1 및 제 2 부분으로 분할될 필요가 없다. 처리 과정은 한 샘플에 대해 수행되며 농도가 측정된다. 다음에, 이 농도가 시험되는 샘플이 프리온을 함유하는지의 여부를 측정하기 위해서 공지된 표준(샘플 중 통계적으로 중요한 군에 대해 미리 얻어진)과 비교된다.
그러나, 본 발명은 그러한 단백질 분석 방법의 사용에 한정되지 않는다는 점이 지적된다. 다른 분석법도 사용될 수 있고, 정확한 결과를 얻기 위해서 본 발명에 따라 제조된 샘플을 이용할 수 있는 다른 분석법이 필시 개발될 것이다.
PrP
C
또는 PrP
Sc
와 상호작용하는 화합물의 확인
한 양태로서, 본 발명은 PrPC에 결합한 PrP 펩티드에 기인하는 PrPSc-유사 복합체의 형성에 대한 억제제를 확인하는데 유용한 신규의 분석법을 제공한다. 본 발명의 생체외 분석법은 다수의 방식으로 형성되기는 하지만, 바람직한 형태로서, 시험 화합물은 저-글리코실화 PrPC를 발현하는 세포와 접촉된다. 세포는 면역침전법을 포함하여, 많은 방식으로 프리온 단백질 복합체에 대해 시험될 수 있다. 침전 퍼센트, 프로테아제 내성 및 형태가 아래 설명된 방법과 같은 본 분야에 공지된 방법에 의해 측정된다. 시험 화합물 존재하의 PrPSc-유사 복합체의 형성이 시험 화합물 부재하(대조군)의 복합체 형성과 비교된다.
복합체 형성을 억제하는 것으로서 본 발명의 분석 방법에 의해 확인된 화합물은 PrPSc-매개 질환의 동물 모델에서 시험되고, 생체내에서 PrPSc유도를 억제하거나, 또는 PrPSc-매개 질환을 치료하는 화합물의 능력이 측정될 수 있다. 상기 정의된 바와 같이, PrPSc-매개 질환의 치료는 PrPSc-매개 질환으로 고통받는 환자에 대한 치료적으로 검출가능하고 유리한 효과를 얻는 것을 포함한다.
문헌에 기록된 PrPC와 PrPSc사이의 상호작용에 대한 항-PrP 단일클론 항체 3F4의 경쟁은 프리온 유도를 차단할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 분석법에 대한 다른 전략을 제공한다. 한 구체예에서, PrPC는, 예를 들어 스트렙토아비딘과 함께 유도되고, 고체 지지체, 예를 들어 96-웰 플레이트의 웰 바닥에 고정된다. 후보 화합물이 PrPC로부터 3F4를 치환하는 능력에 대해 시험된다. 결합이 표준 측정을 통해, 예를 들어 자유 항체의 양을 측정함에 의해 정량된다. 이 분석법의 변형은 재조합 공급원으로부터의 다양한 PrPC-유사 분자의 사용을 포함한다.
시험관내에서 약물 효능 평가
본 발명의 세포 시스템은 프리온-매개 장애에 지정된 치료제의 잠재적 효능을 측정하는데 사용될 수 있다. 화합물은 본 발명의 저-글리코실화 PrP를 발현하는 세포와 접촉되고, 감염성, 질환의 진행, 아밀로이드 용균반의 형성 등에 대한 화합물의 효과가 측정될 수 있다. 약물은, 만약 그것이 (1) 해로운 단백질이 약물이 없는 마우스의 시스템으로부터 제거되는 속도와 비교하여, 해로운 단백질이 시스템으로부터 제거되는 속도를 증가시키고; (2) 초기 프리온 감염을 방지하고; 및/또는 (3) 프리온 발생의 진행을 지연시키거나 또는 정지시킨다면, 효능이 있다고 측정될 수 있다. 시험관내 시스템에서 유망하다고 나타난 화합물은 생체내에서의 그것의 효능을 측정하기 위해 더 연구될 수 있다.
트랜스제닉 동물
용어 "트랜스젠"은 살아있는 동물에 이식하기 위한 세포, 특히 포유류 세포의 게놈에 삽입되어 있거나, 또는 인공적으로 삽입되려고 하는 유전 물질을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 트랜스젠은 세포를 형질전환하기 위해 사용되며, 영구적인 또는 일시적인 유전적 변화, 바람직하게는 영구적인 유전적 변화가 외인성 DNA의 결합 후 세포에서 유도됨을 의미한다. 영구적인 유전적 변화는 일반적으로 세포의 게놈에 DNA를 도입함에 의해 달성된다. 안정한 통합을 위한 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스 및 다른 동물 바이러스, YAC 등을 포함한다. 관심있는 것은 트랜스제닉 포유류, 예를 들어 암소, 돼지, 염소, 말 등이며, 특히 설치류, 예를 들어 래트, 마우스 등이다.
트랜스제닉 동물은 염색체외 요소로서 존재하거나, 또는 그것의 세포, 특히 생식 세포의 일부 또는 모두에 안정하게 통합된 외인성 핵산 서열을 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 트랜스제닉 동물은 생식계 서열에 안정한 변화를 포함한다고 가정될 것이다. 초기 동물 구성 동안, "키메라" 또는 "키메라 동물"이 생성되며, 이것에서는 단지 세포의 부속조만이 변경된 게놈을 갖는다. 키메라는 원하는트랜스제닉 동물을 생성하기 위해서 교배의 목적으로 일차적으로 사용된다. 이형접합성 변경을 갖는 동물이 키메라의 교배에 의해 생성된다. 수컷 및 암컷 이형접합체가 전형적으로 교배되어 동형접합 동물을 생성한다.
외인성 PrP 유전자는 생성된 저-글리코실화 PrP 단백질의 적합한 세포 국소화를 유지하는 한편, 분자의 완전한 글리코실화를 방지하도록 변경된다. 이들 특징을 달성하기 위한 돌연변이가 어떤 적합한 유전적 바탕안에 있을 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 부위에서의 돌연변이는 야생형 바탕, 자연 발생적 다형성을 갖는 바탕, 또는 유전적으로 조작된 서열, 예를 들어 코딩 또는 비-코딩 영역의 결실, 치환 또는 삽입을 갖는 바탕안에 있을 수 있다. 도입된 저-글리코실화 PrP 코딩 서열은 보통 구성성 또는 유도성일 수 있는 프로모터 및 숙주 동물의 발현을 위해 필요한 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"은 DNA 서열 및 조절 서열(들)이 적합한 분자, 예를 들어 전사 활성인자 단백질이 조절 서열(들)에 결합되는 때, 유전자 발현을 허락하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다. 어떤 경우에서, 외인성 트랜스젠 서열은 결국 게놈으로부터 결실되어 자생 서열에 순 변화를 남긴다.
본 발명에서, 트랜스제닉 녹아웃은 내인성 PrP 유전자의 1개 또는 2개 대립유전자에서 부분적 또는 완전한 작용 손실을 추가적으로 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자 발현이 검출불가능하거나 또는 미미하게 된다. 내인성 PrP 유전자의 녹아웃은 PrP 단백질의 작용이 실질적으로 감소되고, 이로써 발현이 검출불가능하거나, 또는 단지 미미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다. 이것은 여러가지 메카니즘에 의해 달성될 수 있으며, 코딩 서열의 분열, 예를 들어 하나 이상의 정지 코돈의 삽입, DNA 단편의 삽입 등, 코딩 서열의 결실, 코딩 서열용 정지 코돈의 치환 등의 도입을 포함한다. 상이한 접근법이 "녹아웃"을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 미국 특허 5,464,764, 5,627,059 및 관련 특허 및 공보(Capecchi 등) 참조. 비-코딩 영역, 특히 프로모터 영역, 3' 조절 서열, 인핸서의 결실, 또는 PrP 유전자의 발현을 활성화하는 유전자의 결실을 포함하여, 자생 유전자 모두 또는 일부의 염색체 결실이 유도될 수 있다. 또한, 작용성 녹아웃이 자생 유전자의 발현을 차단하는 안티센스 구성물의 도입에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Li and Cohen, Cell 85:319-329(1996) 참조). 또한, "녹아웃"은 조건부 녹아웃, 예를 들어 표적 유전자 변경을 촉진하는 기질에 동물의 노출, 표적 유전자 부위(예를 들어, Cre-lox 시스템의 Cre)에서 재조합을 촉진하는 효소의 도입, 또는 출생후적으로 표적 유전자 변경을 지시하는 다른 방법에 의해 표적 유전자의 변경이 발생하는 경우를 포함한다.
상동성 재조합을 위한 DNA 구성물은 원하는 유전적 변형을 갖는 PrP 유전자 중 적어도 일부를 포함할 것이며, 표적 유전자좌에 대한 상동성 영역을 포함할 것이다. 무작위 통합을 위한 DNA 구성물은 재조합을 매개하기 위해 상동성 영역을 포함할 필요가 없다. 편리하게는, 양성 및 음성 선택을 위한 마아커가 포함된다. 상동성 재조합을 통해 목표의 유전자 변형을 갖는 세포를 생성하는 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 포유류 세포를 트랜스펙션하는 다양한 기법은 Keown et al., Methods in Enzymoloy 185:527-537(1990) 참조.
배간(ES) 세포에 있어서는, ES 셀라인이 사용될 수 있거나, 또는 배세포가 숙주, 예를 들어 마우스, 래트, 기니아피그 등으로부터 신선하게 얻어질 수 있다. 그러한 세포는 적합한 섬유아세포-공급층상에서 성장되거나, 또는 백혈병 억제 인자(LIF)와 같은 적합한 성장 인자의 존재하에 성장된다. ES 세포가 형질전환되는때, 그것들은 트랜스제닉 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스제닉 동물을 만드는 방법에 대한 미국 특허 5,387,742, 4,736,866 및 5,565,186 참조. 형절전환 후, 세포는 적합한 배지중에서 공급층위에 플레이트된다. 이 구성물을 함유하는 세포가 선택적 배지를 사용함에 의해 검출될 수 있다. 콜로니들이 성장하기 위한 충분한 시간 후, 그것들은 채집되어 구성물의 상동성 재조합 또는 통합의 발생에 대해 분석된다. 다음에, 양성인 콜로니들이 배 조작 및 배반포 주입을 위해 사용될 수 있다. 배반포는 4 내지 6주된 인공배란 암컷으로부터 얻어진다. ES 세포는 트립신화되고, 변형된 세포가 배반포의 포배강안에 주입된다. 주입 후, 배반포는 가임신 암컷의 각 자궁각으로 되돌려 보내진다. 다음에, 암컷은 출산예정일에 이르러 구성물을 갖는 돌연변이 세포에 대해 스크리닝된 결과의 새끼를 낳는다. 상이한 배반포 및 ES 세포의 표현형이 제공됨에 의하여, 키메라 자손이 쉽게 검출될 수 있다.
키메라 동물은 변형된 유전자의 존재에 대해 스크리닝되고, 변형을 갖는 수컷 및 암컷이 교미되어 동형접합 자손을 생성한다. 만약 유전자 변경이 발생의 어떤 시점에서 치사성을 일으킨다면, 조직 또는 기관은 동종 또는 유사 유전자형 이식편 또는 이식조직으로서 보존되거나, 또는 시험관내에서 배양물중에 보존될 수있다.
유도성 내인성 서열을 갖는 트랜스제닉 동물
발생의 어떤 시점에서 해로울 수 있는 유도성 내인성 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물이 유도 프로모터 아래에 저-글리코실화 PrP를 둠으로써 본 발명의 목적을 위해서 조작될 수 있다. 그러한 시스템을 사용한 PrP 발현의 예는 참고자료로서 본원에 포함되는 USSN 09/052,963 참조. 그러한 동물은 분석을 위해 필요할 때까지 저-글리코실화 PrP 유전자를 발현하지 않을 것이며, 따라서 동물이 그러한 발현이 필요하지 않을 때는 트랜스젠의 어떤 잠재적 효과를 억제하도록 허용한다. 예를 들어, 저-글리코실화 PrP 대립유전자의 발현이 발생 동안 억제될 수 있고, 다음에 PrP 유전자의 발현이 성숙한 동물에서 질환의 진행을 진전시키기 위해 사용될 수 있다. 잠재적 발생의 문제는 없지만 오염된 샘플에 반응하여 프리온을 신속하게 형성하는 능력을 갖는 트랜스제닉계의 수립은 샘플에서 프리온을 검출하는 분석법에 있어 주요한 이점이다.
변경된 내인성 PrP 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물의 창조는 Weissmann의 미국 특허 5,698,736에 설명된다. 그것은 프리온-매개 질환의 발생 및 진행을 방지하기 위해 동물에 있는 내인성 PrP 유전자를 완전히 분열시킬 것을 제안하고 있다. 본 발명의 PrP를 코드화하는 트랜스젠은 PrP0/0바탕을 갖는 동물에 도입될 수 있으며, 따라서 저-글리코실화 PrP는 단지 트랜스제닉 동물에서 발현된 PrP로서만 남는다. 저-글리코실화 PrP 유전자는 상이한 계통의 프리온에 의한 감염을 허용하고,따라서 종-특이적 트랜스젠은 불필요할 것이지만, 저-글리코실화 PrP는 시험되는 종에 따라서 맞추어 만들어 질 수도 있다. 예를 들어 인간 시험에서는 저-글리코실화 인간 PrP 트랜스젠이 사용될 수 있고, 소 시험에서는 저-글리코실화 소 트랜스젠이 사용될 수 있으며, 특히 특이적 다형성 및/또는 돌연변이가 특정한 프리온-매개 장애를 연구하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간 CJD에서 발견된 돌연변이가 트랜스젠에서 변경될 수 있다.
본 발명의 저-글리코실화 PrP 트랜스젠은 동물 모델에서 프리온-매개 장애의 진행에 대한 연구를 허용할 것이며, 이 동물은 그러한 질환의 매우 더 짧은 잠복 기간을 갖는다. 그러한 연구는 생리학적 증상이 나타나기 위해 필요한 발현의 수준, 질환의 초기 단계 후 형태학적 증상의 가역성 등과 같은 생물학적 현상을 시험할 수 있다.
시험 동물
여러가지 상이한 시험 동물이 샘플내에 있는 프리온의 존재를 시험하는데 사용될수 있지만, 바람직한 숙주 동물은 마우스 및 햄스터이며, 트랜스제닉 동물의 생성에 대한 상당한 지식이 존재한다는 점에서 마우스가 가장 바람직하다. 다른 가능한 숙주 동물은 Mus(예를 들어, 마우스), Rattus(예를 들어, 래트), Oryctologus (예를 들어, 토끼) 및 Mesocricetus(예를 들어, 햄스터) 및 Cavia(예를 들어, 기니아피그)로부터 선택된 속에 속하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 사육 및 부양하기 쉬운 정상적으로 다 자란 성인의 체중이 1kg 미만인 포유류가 사용될 수 있다. 숙주 PrP 유전자는 Bos, Ovis, Sus 및 Homo로부터 선택된 속에 속하는 시험 동물의유전적으로 분화한 PrP 유전자로부터의 코돈을 포함하기 위해 변화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스 숙주 PrP 유전자가 인간, 암소 또는 양 PrP 유전자로부터의 코돈을 포함하도록 변화되며, 인간이 가장 바람직하다. 인간이 바람직한 이유는 본 발명의 중요한 목적이, 이 동물을 사용하여 물질이 인간을 감염시키고 인간에게서 CJD와 같은 CNS 질환을 발생시키는 원인이 되는 프리온을 갖는지의 여부를 측정하기 위해 물질의 샘플을 시험하는 것이기 때문이다. 바람직한 트랜스제닉 동물이 1996년 10월 15일자로 간행된 미국 특허 5,565,186 및 1997년 2월 13일자로 공개된 WO 97/04814에 개시되고, 이것은 트랜스제닉 동물 및 그것의 제조 및 사용 방법을 개시하기 위한 참고자료로서 본원에 포함된다.
PrP 유전자를 메이크업하는 유전 물질이 다수의 상이한 동물 종에 대해 공지된다(Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101(1992) 참조). 더욱이, 상이한 포유류에 있는 PrP 유전자 사이에는 상당한 상동성이 있다. 예를 들어, 도 3, 도 4 및 도 5의 인간, 암소 및 양 PrP와 비교된 마우스 PrP의 아미노산 서열 참조(여기에서는 차이만을 나타낸다). PrP 유전자와 관련하여 상당한 유전적 상동성이 있음에도, 어떤 사례에서는 이 차이가 현저하다. 더 구체적으로, 상이한 포유류의 PrP 유전자에 의해 코드화되는 단백질에서의 작은 차이로 인하여, 어떤 포유류(예를 들어, 인간)를 감염시킬 것인 프리온은 정상적으로는 상이한 포유류(예를 들어, 마우스)를 감염시키지 않을 것이다. 이런 "종 장벽"으로 인하여, 특정한 샘플이 정상적으로 인간과 같은 상이한 종의 동물을 감염시키는 프리온을 함유하는지의 여부를 측정하기 위해 마우스와 같은 정상적 동물(즉, 조작된 프리온과관련된 유전 물질을 갖지 않는 동물)을 사용하는 것은 일반적으로 불가능하다.
시험 동물의 내인성 PrP 상태
상업적으로 유용한 트랜스제닉 동물은 바람직하게는 작고 재생성하기 쉬워야 한다. 따라서, 마우스, 햄스터, 기니아피그 및 래트와 같은 숙주 동물이 바람직하며, 마우스가 가장 바람직하다. 트랜스제닉 동물이 유용하기 위해서, 필수적으로 동물은 정상적으로 단지 유전적으로 분화한 시험 동물, 특히 인간, 암소, 사슴, 말, 양, 돼지, 고양이, 개 및 닭과 같은 시험용의 상업적으로 중요한 동물, 가장 바람직하게는 인간만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉬워야 한다. 더욱이, 트랜스제닉 및 혼성체 동물이 실제적 및 상업적 관념에서 유용하기 위해서, 필수적으로 동물은 접종 후 상대적으로 짧은 기간내에 질환의 증상을 증명해야 하고, 매우 높은 퍼센트의 동물이 접종 후 질환의 증상을 증명해야 한다.
시험 동물(인간과 같은)의 전체 PrP 유전자가 숙주 동물(마우스와 같은)에서 작용성이 될 때, 결과의 트랜스제닉 동물(낮은 카피수의 인간 PrP 유전자를 갖는)은 인간 프리온으로 감염되기 쉽지 않다. 감염은 숙주 동물의 내인성 PrP 유전자가 애블레이트되는 경우 일어날 것이다. 더욱이, 만약 숙주와 시험 동물 사이의 차이가 있는 코돈 중 일부만이 전환된다면, 결과의 트랜스제닉 동물은 정상적으로 시험 동물만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉽다.
트랜스제닉 동물에 있는 인공 유전자의 카피수가 증가됨에 따라, 어떤 경우에는 잠복 시간이 감소한다. 이에 더하여, 프리온 질환을 가져오는 어떤 유전적 결함은 트랜스제닉 동물의 PrP 유전자에 상이한 유전적 결함을 가지며, 어떤 트랜스제닉 동물에 있는 결함을 일치시킴에 의해 동물을 병에 걸린 인간으로부터의 프리온으로 더 감염되기 쉽게 만들 것이다.
이런 지식에 의하여, 우리는 숙주 동물의 모든 PrP 유전자가 유도 서열이 부착된 시험 동물의 PrP 유전자로 대체된 트랜스제닉 동물을 생성하고, 이로써 숙주 동물에서 시험 동물의 PrP 유전자의 카피수를 실질적으로 증기시키고, 바람직하게는 또한 내인성 PrP 유전자를 애블레이트함에 의해 정상적으로 시험 동물만을 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉬운 유용한 트랜스제닉 동물을 얻는 것이 가능하다고 추론했다. 카피수는 발생 동안 발현을 정지시킴에 의해 발생한 동물의 생존력에 영향을 미치지 않고 실질적으로 증가될 수 있다.
상기에 기초하여, 바람직한 상태의 내인성 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물은 (1) 키메라 PrP 유전자를 포함하는 마우스, 즉 PrP 유전자의 전부가 아닌 일부만이 저-글리코실화된 글리코실화 부위의 상응하는 부분으로 대체된 마우스와 같은 동물, 또는 (2) 애블레이트된 내인성 PrP 유전자 및, 가장 바람직하게는 인간 PrP 유전자가 분자의 적합한 글리코실화를 방지하는 돌연변이를 갖는, 인간과 같은 다른 동물로부터의 PrP 유전자를 갖는 동물인 것으로 이해될 수 있다. 이들 유전형은 보다 짧은 잠복 기간으로 유전적으로 분화한 동물의 프리온 감염성을 검출하는 유도성 트랜스제닉 시스템의 능력을 증진시킨다. 키메라 PrP 유전자 또는 애블레이트된 내인성 PrP 유전자를 갖는 동물의 구성 및 시험에 관한 상세한 것은 USSN 08/509,261에서 알 수 있으며, 이것은 그 전체가 본원에 포함된다.
생체내에서의 약물 효능 평가
본 발명의 트랜스제닉 동물은 약물의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 그것의 가장 간단한 형태로서, 외인성 유전자가 2개의 마우스에서 발현되며, 약물이 한 마우스에 투여되고, 다른 하나에는 투여되지 않는다. 다음에, 약물이 없는 마우스와 비교하여 질환의 진행을 억제하는데 대한 약물의 효과가 측정된다. 해로운 단백질이 각 마우스의 시스템으로부터 제거되는 속도를 측정하기 위해 2개 마우스에 대해 시간에 따라 측정이 행해졌다. 약물은 만약 그것이 해로운 단백질이 약물이 없는 마우스의 시스템으로부터 제거되는 속도와 비교하여, 해로운 단백질이 시스템으로부터 제거되는 속도를 증가시킨다면 효능이 있다고 측정된다.
소뇌 스크래피 진행의 신속한 진단을 위한 운동 및 운동 조정 결손의 평가
설치류에서 스크래피의 진단은 프리온 질환에 관련된 적어도 2개의 전형적인 신경학적 징후의 검출 뿐만 아니라, 시간에 따른 이들 징후의 진행을 포함한다. 전형적인 임상적 징후는 어그레시비티(agressivity), 운동실조, 운동조정곤란, 떨림, 머리 흔들림, 바로잡기 반사 결핍, 경련, 척추후굴증, 두부후굴, 꼬리 강직, 운동완만, 고유감각 결손, 가면 안면, 심부통 지각 손실, 빙글빙글 돌기 및 마비이다. 본 발명의 시스템의 사용은 유도성이든 아니든 PrP 발현이 소뇌내에 지배적으로 국소화되는 경우, 신경변성에 이어서 소뇌 변성에 관련된 운동실조 또는 운동, 보행, 평형 및 조정의 장애가 기록함에 따라, 프리온 복제의 검출을 용이하게 한다.
보다 짧은 기간안에 스크래피병을 나타내는 동물을 진단하기 위해, 압력-감지 측정 시스템이 접종된 동물의 생리학적 변화, 구체적으로 그것의 운동 기술을 검출 및 기록하기 위해 사용될 수 있다. 보행중의 변화를 모니터링하는데 효과적인그러한 압력 감지 시스템의 한 예는 Gaitway Instrumented Treadmill(Kistler Biom echanics, Winterthut, Switzerland)에 사용되는 것과 같은, 압전 지면 반응력 (GRF) 측정 시스템을 사용하는 플랫폼이다. 그러한 시스템은 수직 지면 반응력 및 완전한 다수의 발 충격에 대한 압력 중심을 측정하는 능력을 갖는다. 또한, 이 시스템은 오른쪽과 왼쪽 충격을 구별하고, 수직력, 압력 중심 및 시간적 보행 파라미터를 측정할 수 있는 통합 소프트웨어 시스템을 갖는다. 데이타베이스는 환자 이름, 식별 번호 또는 다른 사용자-특이적 분류에 의해 시험에 대한 정보를 얻어낼 수 있다. 다수의 시험이 한 그래프상에 오버레이될 수 있고, 한 환자의 진행이 시간에 따라 시험된다. 시간 기준은 절대적 시간, 상대적 시간, 접촉 퍼센트, 스텝 퍼센트 및 보행 사이클 퍼센트로 데이타를 관찰하기 위해 변화될 수 있다.
또한, 스크래피 질환의 초기 검출을 위해 그러한 시스템을 사용하는 것은 그러한 목적을 위해 고안된 기기를 사용하여 시간에 따른 이들 파라미터를 계통적 정량 평가함에 의해 더 이상 달성될 수 있다.
운동 조정을 평가하는 다른 방법은 로토로드(rotorod) 시험(Sakaguchi 등)이다. 동물은 회전수가 10rpm에서 동물이 로드로부터 떨어질때까지 지속적으로 증가되는 로드위에 놓인다. 동물은 10회 시험되고, 그것의 최고 점수가 주어진 날짜의 점수로서 기록된다. 이 시험은 프리온 질환의 진행에 따른 운동 기술의 정량적 측정을 제공하며, 운동성 결손의 초기 검출을 허락한다. 당업자들에게 명백한 바와 같이, 운동 기술 능력을 구별하는 능력을 갖는 다른 시스템이 또한 사용될 수 있다.
표준화된 프리온 제제
프리온 진행, 감염성 및/또는 프리온 질환에 관여되는 메카니즘적 상호작용을 연구하는데 사용되는 세포 및 동물 분석법에 있어서, 표준화된 프리온 제제가 연구의 변화성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 제제는 어떤 동물로부터도 얻어질 수 있지만, 바람직하게는 시험 동물의 프리온을 함유하는 뇌 물질을 갖는 숙주 동물로부터 얻어진다. 예를 들어, 인간 프리온 단백질 유전자를 함유하는 Tg 마우스는 인간 프리온을 생성할 수 있고, 그러한 마우스의 뇌가 표준화된 인간 프리온 제제를 만드는데 사용될 수 있다. 제제는 상기 과정을 반복함에 의해 더 표준화될 수 있다. 더 구체적으로, 상기 과정마다 프리온 함유 물질 일부를 사용하여 트랜스제닉 동물을 접종해야 한다. 그 프리온 함유 물질의 공급원은 그 자체가 예측불가능할 수 있고, 상이한 방식으로 트린스제닉 마우스를 감염시킬 수 있다. 따라서, 만약 트랜스제닉 마우스가 비표준 물질로 감염된다면, 일부는 상이한 속도로 프리온 질환의 증상을 나타낼 수 있고, 일부는 전혀 증상을 나타내지 않을 수 있다. 만약 동시에 프리온 질환의 증상을 나타내는 마우스의 군이 희생되고, 그것들의 뇌가 추출되어 균질화된다면, 그것은 상대적으로 표준인 프리온 제제를 만들 것이다.
제제가 "표준화"된다는 점에서, 일련의(예를 들어, 100, 1,000 또는 그 이상의 동물) 실질적으로 동일한 동물로부터 얻어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 매우 높은 카피수의 인간 PrP 유전자(모든 다형성 및 돌연변이)를 함유하는 100 마우스는 모두 동시에 질환을 발생시키며, 각각으로부터의 뇌 조직이 조합되어 유용한 표준화된 프리온 제제를 만들 수 있다. 그러한 표준 제제, 및 그러한 표준의 생성에 유용한 동물이 USSN 09/199,523에 개시되고, 이것은 참고자료로서 본원에 포함된다.
포준화된 프리온 제제를 사용함에 의하여, 프리온을 함유하는 극도로 희석된 조성물을 만드는 것이 가능하다. 예를 들어, 1ppm 이하, 또는 심지어 1ppb 이하를 함유하는 조성물도 만들 수 있다. 그러한 조성물은 샘플에서 프리온의 존재를 검출하는데 있어 본 발명의 트랜스제닉 마우스의 민감성을 시험하는데 사용될 수 있다.
프리온 제제는 그것들이 일정한 양의 프리온을 포함하고, 동계 바탕으로부터 추출될 것이라는 점에서 바람직하다. 따라서, 제제에 있는 오염물질은 일정하고 제어가능할 것이다. 또한, 표준화된 프리온 제제는, 다양한 제약, 전혈액, 혈액 부분, 음식, 화장품, 기관, 그리고 특히 살아있거나 죽은 인간으로부터 유도된 기관, 혈액 및 그것의 생성물과 같은 동물(살아있거나 죽은)로부터 유도된 어떤 물질에 서, 만약 있다면 프리온의 존재를 측정하기 위한 생물학적 분석을 수행하는데 있어 대조군으로서 유용할 것이다. 따라서, 표준화된 프리온 제제는 제제가 소량첨가되는 정제 프로토콜 및 특정한 과정에 대해 측정된 적정농도의 감소를 유효화하는데 있어 가치있을 것이다.
다음 실시예들은 당업자에게 본 발명을 어떻게 만들고 사용할 것인지에 대한 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하도록 의도되거나, 또는 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내도록 의도되는 것은 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확보하기 위해 노력했지만, 어떤 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는다면, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1
돌연변이를 인간 PrP 서열에 도입하여 분자의 2개의 공지된 글리코실화 부위를 변경시켰다. 마우스-햄스터 키메라 PrP 트랜스젠(MHM2)을 2개의 글리코실화 부위가 아스파라긴에서 글루타민(N180Q/N196Q)으로 치환되도록 돌연변이를 일으키고, pSPOX 발현 벡터에 클로닝했다. PrP 분자를 불일치 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 PCR 증폭을 사용하여 돌연변이를 일으켰다. 증폭 후, 돌연변이 PrP DNA를 유일한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 pSPOX 벡터에 직접적인 클로닝을 허용했다. 다음에, 이들 발현 벡터를 신경모세포종 세포(N2a 세포)에서 일시적으로 발현시키고, 이어서 실험적으로 스크래피 감염된 마우스로부터의 10% 뇌 균등질로 감염시켰다.
인큐베이션 4일 후, 새로 형성된 프리온의 출현을 세포 분해, 프로테이나제-소화 및 면역블롯 후 확인할 수 있었다. 이 블롯을 제 1 항체로서 3F4(MHM2 구성물을 특이적으로 검출한다)를 사용하여 전개시키고, 검출을 ECL 시스템을 사용하여 수행했다. 새로 형성된 프리온을 저-글리코실화 트랙스펙션 PrP의 에피토프-태그화에 의해 접종의 잔류 프리온과 구별할 수 있다.
PrPSc의 프로테이나제 K-내성 단편을 글리코실화 돌연변이를 발현하는 배양물에서 발견했고, 3개의 상이한 프리온 계통 RML, ME7 및 301V(B)로 감염된 마우스로부터의 균등질에 노출시켰다. 글리코실화되지 않은 PrP의 전환을 Q218K 돌연변이에 의해 차단했다. 결과는 시험된 모든 계통의 마우스 프리온이 글리코실화되지 않은 PrP를 프리온으로 전환시킬 수 있음을 나타냈다. 세포가 뇌 균등질 없이, 또는 정상 마우스(CD-1)로부터의 것들과 함께 인큐베이션되었을 때, 프로테아제-내성 PrP는 확인되지 않았다.
세포가 pSPOX MHM2-PrP(N180Q, N196Q; Q218K)로 일시적으로 트랜스펙션되고, 10% RML 마우스-스크래피 뇌 균등질과 함께 인큐베이션되었을 때, 프로테아제-내성으로의 전환이 확인되지 않았다. C-말단에서의 이런 추가 돌연변이는 필수적 전환 공통-인자인 단백질 X를 차단하는 것으로 생각된다. 추가 Q218K 돌연변이의 효과는 저-글리코실화 PrP의 전환이 공통-인자의 도움으로 야생형 PrP에 관해 수행되며, 형태의 준안정성 또는 프로테아제-내성이 접종물-유도 PrPSc와 저-글리코실화 PrP의 결합에 기인하는 것이 아니라는 것을 증명한다.
세포가 pSPOX MHM2-PrP 야생형으로 일시적으로 트랜스펙션되고, 10% RML 마우스-스크래피 뇌 균등질과 함께 인큐베이션되었을 때, 프로테아제-내성 PrP를 거의 확인할 수 없었다. 1개의 매우 희미한 띠는 야생형 PrP의 상이한 글리코형으로부터 증명되는 저-글리코실화 PrP가 극치일때 두드러지는 듯 하며, 전환되는 것 또한 (매우 덜 효과적임에도) 저-글리코실화 형이다.
이들 실험은 프리온이 세포 배양 시스템에서 신속히 복제 및 증폭되고, 의심되는 조직에서 미량의 프리온을 증폭하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명이 그것의 특정 구체예와 관련하여 설명되지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 다양한 변화가 만들어지고 동등물이 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 이에 더하여, 많은 변형이 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 정신 및 범위에 적합하게 하기 위해 만들어질 수 있다. 모든 그러한 변형은 여기에 첨부된 청구항의 범위내에 있도록 의도된다.
Claims (11)
- 야생형 PrP 단백질에 대해 상대적인 글리코실화의 감소; 및프리온 감염을 허용하기에 충분한 세포 국소화를 특징으로 하는 분리된 PrP 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 적어도 1개의 글리코실화 부위에서 아스파라긴이 상이한 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 PrP 단백질.
- 제 2 항에 있어서, N180Q/N196Q 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 PrP 단백질.
- 야생형 PrP에 대해 상대적인 글리코실화의 감소 및 프리온 감염을 허용하기에 충분한 세포 국소화를 특징으로 하는 PrP 단백질을 코드화하는 분리된 핵산 서열 또는 그것의 보체.
- 제 1 항의 단백질을 코드화하는 외인성 핵산 서열이 유효하게 삽입된 재조합 숙주 세포.
- 야생형 PrP 단백질과는 상이한 아미노산 서열, 야생형 PrP에 대해 상대적인글리코실화의 감소, 및 프리온 감염을 허용하기에 충분한 세포 국소화를 특징으로 하는 단백질을 코드화하는 외인성 핵산 서열이 유효하게 삽입된 재조합 셀라인과 추정적으로 프리온을 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계, 및셀라인을 접촉시킨 후 샘플에서 프리온의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 분석법.
- 제 4 항의 핵산을 포함하는 외인성 PrP 트랜스젠이 유효하게 삽입된 게놈을 특징으로 하는 비인간 트랜스제닉 동물.
- 제 7 항에 있어서, 내인성 PrP 유전자의 적어도 1개 대립유전자가 변경된 게놈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
- 시험될 동물로부터 샘플을 얻는 단계;샘플로 제 8 항의 트랜스제닉 동물을 접종하는 단계; 및프리온 질환의 증상에 대해 트랜스제닉 동물을 관찰하는 단계를 포함하는, 샘플의 프리온 감염성을 검출하는 방법.
- (a) 야생형 PrP 폴리펩티드에 대해 상대적인 글리코실화의 감소 및 적합한 세포 국소화를 특징으로 하는 포유류 PrP 폴리펩티드;(b) 야생형 PrP 폴리펩티드에 대해 상대적인 글리코실화의 감소 및 적합한세포 국소화를 특징으로 하는 포유류 PrP 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 포함하는 세포; 및(c) 야생형 PrP 폴리펩티드에 대해 상대적인 글리코실화의 감소 및 적합한 세포 국소화를 특징으로 하는 포유류 PrP 폴리펩티드를 포함하는 게놈을 갖는 비인간 트랜스제닉 동물 모델로 구성된 군으로부터 선택된 검출 시스템과 후보 제제를 조합하는 단계;프리온 제제로 검출 시스템을 접종하는 단계; 및프로테아제 내성 프리온의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 프로테아제-내성 프리온의 수준이 프리온-매개 장애에 대한 후보 제제의 효과를 표시하는, 프리온-매개 장애의 감염 또는 진행을 조절하는 생물학적 활성 제제를 확인하는 방법.
- a) 환자로부터 세포를 얻는 단계;b) 제 4 항의 PrP 핵산으로 상기 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및c) 세포에서 프리온을 검출하는 단계를 포함하는 프리온-매개 장애를 가질 것으로 의심되는 환자를 진단하는 방법.
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