CN103917645B - 用于化合物筛选的无细胞翻译系统和有关的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统,其用于表达蛋白诸如病毒蛋白和病毒衣壳装配所需的蛋白,并提供了以与病毒衣壳类似的方式装配成多蛋白复合物的蛋白。进一步提供了使用包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统表达以下蛋白的方法:诸如病毒蛋白,衣壳装配所需的蛋白,和以与病毒衣壳类似的方式装配成多蛋白复合物的蛋白。进一步提供了在包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统中测定化合物的方法,所述化合物调控病毒蛋白、病毒衣壳装配和蛋白装配成多蛋白复合物,所述多蛋白复合物的分裂可以改善细菌性疾病、寄生物性疾病、代谢疾病、肿瘤学疾病、免疫学疾病或中枢神经系统疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月3日提交的美国临时申请号61/514,825的权益,其内容明确地通过引用整体并入本文用于所有目的。
关于在联邦资助的研究和开发下做出的发明权的声明
不适用
技术领域
本发明涉及用于无细胞翻译所用组合物中的麦胚提取物、使用包括麦胚提取物的组合物表达蛋白的方法、装配病毒衣壳的方法、和检测调控蛋白-蛋白相互作用(包括、但不限于病毒衣壳的装配)的化合物的方法。
背景技术
无细胞翻译系统利用细胞提取物来表达目标蛋白。在该范例中,将体外转录或分离的RNA模板与其它组分(即氨基酸)一起加入细胞提取物中,以实现蛋白合成。
麦胚提取物场被用于无细胞翻译反应,且最初由不同的研究人员进行了描述(例如,Roberts,B.E.和Paterson,B.M.(1973,PNAS70,第2330页))。麦胚提取物是合乎需要的,因为它支持原核RNA、真核RNA和病毒RNA的翻译。已经进一步证实,麦胚提取物可用于被设计成装配病毒衣壳的无细胞系统中(Lingappa等人.J Cell Bio125:99-111(1994);Lingappa等人.J Cell Bio136:567-581(1997);Singh等人.Virology279:257-270(2001);Zimmerman等人.Nature415:88-92(2002);Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009))。病毒衣壳是病毒的保护病毒基因组的蛋白壳,且它的装配是由宿主因子催化的过程,可以靶向该过程来开发抗病毒药物。
有效的蛋白表达需要适当的麦胚提取物浓度。已经一般地证实,对于稳健蛋白表达而言最佳的麦胚提取物浓度是总翻译混合物的约40-50%(Erikson和Blobel,MethodsEnzymology96:38-50(1983))。报道已经指出,为了适当的衣壳装配,最佳地使用占最终反应体积的20%的麦胚提取物(Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009))。
使用无细胞表达系统的抗病毒药开发过程的一个重要方面是,证实抗病毒调节剂类似物在无细胞系统中的有效性的相对比例与在细胞培养物中它们对病毒的活性类似。当前使用的无细胞系统没有表现出治疗剂在体外破坏衣壳装配的能力和这些治疗剂阻止病毒复制的能力之间的有用关联。因此,需要开发这样的无细胞系统:其具有在无细胞系统中实现对药物的最大灵敏度的组分水平和比例,并然后与在细胞培养物中对活病毒的效力相关联。
发明内容
非常令人惊奇地,现在已经发现,在其中将麦胚提取物浓度维持在约5%或低于约5%的无细胞系统会提供药物敏感性和在5%麦胚提取物的传染性病毒药物敏感性之间的显著更好的关联,在10%或20%几乎没有明显关联。本领域迄今为止尚未认识到麦胚提取物浓度和药物敏感性之间的联系,从而推荐使用高浓度的麦胚提取物来使蛋白合成最大化。因而,文献的应当在较高浓度(例如,20%或更高)使用麦胚提取物的教导不会产生为药物筛选提供如本发明提供的在5%麦胚或更低浓度观察到的最适灵敏度的无细胞系统。
本发明一般地涉及使用不超过约5%麦胚提取物来表达蛋白的无细胞系统。因此,要求保护的主题提供了可用于表达蛋白和用于测定病毒蛋白和衣壳装配的调节剂的组合物和方法。
在一个示例性实施方案中,提供了用于表达目标蛋白的无细胞系统。所述系统包含不超过约5%麦胚提取物,且进一步包含目标蛋白的表达所必需的其它组分。在一个示例性实施方案中,所述目标蛋白是病毒蛋白。在不同的实施方案中,所述病毒蛋白是病毒衣壳蛋白。在一个选择的实施方案中,所述目标蛋白是衣壳相互作用蛋白。在一个选择的实施方案中,所述目标蛋白是以与衣壳蛋白类似的方式(即最可能由于细胞质中的其它蛋白催化特定多蛋白复合物的形成)发生装配的宿主蛋白。
在一个示例性实施方案中,所述蛋白是形成多蛋白复合物的非病毒蛋白。在选择的实施方案中,所述多蛋白复合物参与疾病,包括中枢神经系统障碍、代谢障碍、肿瘤学障碍或免疫学障碍。在一个示例性实施方案中,所述目标蛋白是细菌或寄生物蛋白。
所述病毒蛋白可以来自任意病毒或病毒科。在一个示例性实施方案中,所述病毒蛋白是来自这样的病毒,所述病毒是选自以下的病毒科的一个成员:黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、布尼安病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、细小RNA病毒科(Picornaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)。
除了不超过约5%麦胚提取物以外,本发明的一种示例性组合物另外包括,确保所述表达系统以期望的量和/或形式表达期望的蛋白所需的或有用的组分。在一个示例性实施方案中,所述组合物的其它组分包括缓冲液、氨基酸和核酸转录物中的一种或多种。在不同的实施方案中,所述组合物进一步包含可检测的部分、ATP、GTP、磷酸肌酸、标记的氨基酸、肉豆蔻酰辅酶A锂盐、RNA酶抑制剂、肌酸激酶和tRNA中的一种或多种。在一个示例性实施方案中,所述标记的氨基酸包含[35S]甲硫氨酸。在一个示例性实施方案中,所述核酸转录物源自体外转录反应。在一个示例性实施方案中,所述核酸转录物编码病毒蛋白,例如,病毒衣壳蛋白。在一个示例性实施方案中,所述核酸转录物编码病毒衣壳相互作用蛋白。在一个实施方案中,所述缓冲液包含选自以下的成员:乙酸钾、精胺和二硫苏糖醇或其它还原剂和它们的组合。
在另一个实施方案中,提供了使用如本文中所述的无细胞系统表达目标蛋白的方法。在一个示例性实施方案中,所述目标蛋白是病毒蛋白,例如,病毒衣壳蛋白。在一个示例性实施方案中,所述目标蛋白是病毒衣壳相互作用蛋白。
在另一个实施方案中,本发明提供了使用本发明的无细胞系统装配病毒衣壳的方法。
在一个示例性实施方案中,本发明提供了在多蛋白复合物中装配非病毒蛋白的方法。在选择的实施方案中,所述方法装配参与疾病的多蛋白复合物,所述疾病包括中枢神经系统障碍、代谢障碍、肿瘤学障碍或免疫学障碍。在一个示例性实施方案中,所述方法装配细菌或寄生物蛋白的多蛋白复合物。
在不同的实施方案中,提供了试验化合物是否调控细胞功能的方法。一种示例性的方法包括:将所述化合物引入本发明的无细胞系统中,和确定细胞功能是否受到调控。
本发明也提供了试验化合物是否由于对宿主蛋白或对病毒衣壳蛋白本身的作用而调控病毒衣壳装配的方法。所述方法包括:将所述化合物引入本发明的无细胞系统中,和确定病毒衣壳(或其它蛋白)装配是否受到调控。
在另一个实施方案中,提供了用于蛋白的无细胞表达的试剂盒。一种示例性的试剂盒包含:无细胞混合物,其包含不超过约5%麦胚提取物、蛋白的表达所必需的组分;和对于在无细胞表达实验中使用所述试剂盒而言足够的说明书。
在另一个实施方案中,提供了用于装配病毒衣壳的试剂盒。所述试剂盒包含:无细胞混合物,其包含不超过约5%麦胚提取物、病毒衣壳装配需要的蛋白的表达所必需的组分;和对于在无细胞表达实验中使用所述试剂盒而言足够的说明书。
在另一个实施方案中,提供了用于确定化合物是否调控蛋白表达的试剂盒。所述试剂盒包含:无细胞混合物,其包含不超过约5%麦胚提取物、蛋白的表达所必需的组分;和对于使用所述无细胞混合物确定所述化合物是否调控蛋白表达而言足够的说明书。
在另一个实施方案中,提供了用于确定化合物是否调控病毒衣壳装配的试剂盒。所述试剂盒包含:无细胞混合物,其包含不超过约5%麦胚提取物、病毒衣壳装配需要的蛋白的表达所必需的组分;和对于确定所述化合物是否在无细胞混合物中调控病毒衣壳装配而言足够的说明书。
在另一个实施方案中,提供了用于确定化合物是否调控多蛋白装配的试剂盒。所述试剂盒包含:无细胞混合物,其包含不超过约5%麦胚提取物、非病毒蛋白的表达所必需的组分;和对于确定所述化合物是否调控多蛋白装配而言足够的说明书。
附图说明
图1解释了通过一式三份地在26℃对2μL翻译提取物进行蛋白质印迹法,定量5%、10%或20%麦胚提取物的组合物的蛋白合成,并在使用基于碱性磷酸酶缀合的第二抗体的比色法定量带强度以后,绘制为任意密度单位。在麦胚(WG)无细胞蛋白合成系统中进行无细胞翻译,在没有(DMSO对照)或有化合物存在下,在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中,用编码丙型肝炎病毒核心多肽的mRNA程序化,所述化合物的效力已经在细胞培养物中针对传染性病毒进行了评估,并发现代表从弱至强的效力等级。通过2uL翻译提取物的蛋白质印迹法(一式三份)来定量在每个麦胚百分比的蛋白合成,并在使用基于碱性磷酸酶缀合的第二抗体的比色法定量带强度以后,绘制为任意密度单位。结论:在每个麦胚百分比的蛋白合成水平大致相同,但是在5%麦胚稍微低于10%或20%。
图2解释了对丙型肝炎病毒(HCV)的化合物效能之间的灵敏度和关联,所述丙型肝炎病毒在没有(DMSO对照)或有化合物存在下在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中合成。(A)化合物效力范围从极弱(化合物138-85)至最有效(化合物138-136)。结论:在细胞培养物中化合物对传染性病毒的效能范围从弱(EC50>50uM)至强(EC50=100nM)。(B)在每个麦胚百分比在平板筛选中的药物效能与对传染性病毒的药物效能的关联。结论:药物敏感性显示出在5%麦胚提取物时与传染性病毒药物敏感性的最大关联,在10或20%几乎没有明显关联。因而,文献的应当在20%或更高浓度使用麦胚提取物的教导会错过药物筛选的最适灵敏度点,该点如如本发明提供的在5%麦胚或更低浓度观察到。
图3解释了对流感病毒(FLUV)的化合物效能之间的灵敏度和关联,所述流感病毒在没有(DMSO对照)或有化合物存在下在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中合成。(A)化合物效力范围从极弱(化合物138-165)至最有效(化合物150-120)。(B)在每个麦胚百分比使用平板筛选的药物效能与对FLUV的药物效能的关联。如关于FLUV可见,关于前一个图中的HCV,对传染性病毒的化合物效能和在平板筛选中的化合物效能之间的灵敏度和关联是在5%麦胚为最大,且在10%麦胚浓度丧失,并且在20%在一定程度上再现,但是没有与对传染性病毒的效能完全关联。因而,在图1中关于HCV做出的点也在显著程度上适用于FLUV。
图4解释了对委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的化合物效能之间的灵敏度和关联,所述委内瑞拉马脑炎病毒在没有(DMSO对照)或有化合物存在下在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中合成。(A)化合物效力范围从极弱(化合物158-80)至最有效(化合物150-133)。(B)在每个麦胚百分比使用平板筛选的药物效能与对VEEV的药物效能的关联。如关于VEEV可见,关于前一个图中的HCV,对传染性病毒的化合物效能和在平板筛选中的化合物效能之间的灵敏度和关联是在5%麦胚为最大,且在10%麦胚浓度减小,并且在20%麦胚浓度在很大程度上丢失。因而,在图1中关于HCV做出的点也适用VEEV。
图5解释了对人免疫缺陷病毒(HIV)的化合物效能之间的灵敏度和关联,所述人免疫缺陷病毒在没有(DMSO对照)或有化合物存在下在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中合成。(A)化合物效力范围从极弱(化合物6027)至最有效(化合物6051)。如关于HIV可见,关于图1-4中表示的前3个病毒科,平板筛选的灵敏度在5%麦胚时为最大,在该浓度观察到与对传染性病毒的效能的最大关联。在更高的麦胚浓度,该灵敏度和关联减小或丢失。因而,在所有4种情况下,如在图1-4中证实的,无细胞系统在低麦胚浓度表现出最大药物敏感性和与对传染性病毒的效能的最好关联。
图6解释了在HCV衣壳蛋白程序化的无细胞系统中观察到的EC50。(A)为了确立基于无细胞翻译的抗-衣壳装配药物筛选的保真度,将在HCV衣壳蛋白程序化的无细胞系统中观察到的EC50相对于在细胞培养中对传染性HCV的EC50绘图。如果在无细胞系统中的活性与对传染性病毒的活性相关,得自构效关系优化的数据点应当投射进右上象限,如观察到的。此外,用蓝色指示对其它病毒科更有效的类似物,其偏离高关联线。(B)来自部分(A)的最有效类似物的放大更清楚地揭示了类似物在右上象限中的投射。
图7解释了在HIV衣壳蛋白程序化的无细胞系统中观察到的EC50。在无细胞系统中类似物对HIV衣壳装配的效力(x-轴)相对于在细胞培养物中对传染性病毒的效力(y-轴)的关联如在图6中关于HCV所示。用红色显示母体化合物,用紫色描绘类似物。用虚线指示构效关系,所述虚线连接包含给定的亚药效团的有关化合物。
图8解释了在FLUV衣壳蛋白程序化的无细胞系统中观察到的EC50。在无细胞系统中类似物对FLUV衣壳装配的效力(x-轴)相对于在细胞培养物中对传染性病毒的效力(y-轴)的关联如在图6中关于HCV和在图7中关于HIV所示。用红色显示母体化合物。用虚线指示构效关系(SAR),所述虚线连接包含给定的亚药效团的有关化合物。关于HIV和FLUV,SAR投射向该图的右上象限,如关于良好的无细胞与真实病毒抗病毒化合物关联所预期的。
图9解释了5%麦胚制品在来源和制备条件下的均匀度。将13个麦胚提取物制品的样品从50μL稀释至1mL,并取20μL,与20μL含有10%aME的SDS凝胶样品缓冲液混合,并在100℃/5min加热。将10μL加载上SDS PAGE。当染料锋线到达底部时,在10%乙酸和50%甲醇中固定凝胶,然后用0.1%考马斯亮蓝染色,并脱色至完成。
图10解释了得自图9的扫描的泳道的定量,其绘制为任意整合密度单位。该分析会定量不同的麦胚制品的组成相似性,并揭示所述提取物的蛋白质含量是高度可再现的,如通过考马斯可染色的蛋白所测得的。
图11解释了5%麦胚制品的A260吸光度谱。所述吸光度谱扫描揭示了在5%麦胚提取物中的主要A260峰。该峰用于定义与图9的13个5%麦胚提取物制品中的每一个有关的吸光度值的范围。
图12解释了图9的13个5%麦胚制品的A280吸光度谱。所述吸光度谱扫描没有揭示在5%麦胚提取物中的主要A280峰,这主要是由于A260吸光度谱的巨大。
图13解释了A260/A280吸光度谱比率。因为得自不同麦胚提取物制品的A260nm和A280nm值的均匀度,不论缓冲液条件的来源和范围,将A260/A280吸光度比率计算为制品均匀度的另一种量度。
图14解释了蛋白生源说的无细胞系统,其应用于中枢神经系统疾病的药物发现。使用5%麦胚无细胞蛋白-合成系统,探究了在不同的中枢神经系统障碍中涉及的6种蛋白(A-F)的生源说。在所有情况下,初产物和终产物(向右,为蓝色)、合成和装配的蔗糖梯度谱解离。在除了C以外的所有情况下,建立了成功地重构高分子量结构形成的条件。对于几种假定的中枢神经系统障碍,在细胞中鉴别和验证了小分子抑制剂。
图15解释了新合成的碳酸酐酶(上图)和α珠蛋白(下图)的蔗糖梯度分析,这2种蛋白的成熟寡聚体状态不会包含>20S的大高分子量结构。左图是如下从SDS PAGE和放射自显影术定量的梯度谱:在26℃/1h进行35S标记的甲硫氨酸合成以后,用嘌罗霉素处理以终止蛋白合成和释放链。右图是随后在34℃/2h温育以后从SDS PAGE和放射自显影术定量的梯度谱。这些新合成的蛋白(其成熟形式限于低分子量寡聚体形式)没有转化成高分子量结构,提示关于病毒衣壳蛋白或已知的寡聚体非病毒蛋白所观察到的装配不是非特异性聚集的一种形式,而是代表底物选择性的装配。因而,该图提示,本发明对生物学上有关的和医学上重要的蛋白的子集是选择性的,但是对许多在装配条件下在无细胞翻译和温育后不形成大多蛋白复合物的蛋白不是选择性的。
具体实施方式
导言
在不同的实施方案中,本发明提供了包含不超过约5%麦胚提取物的无细胞系统和使用这些系统表达病毒蛋白的方法。本发明的无细胞系统可用于装配病毒衣壳。也提供了使用本发明的无细胞系统来试验化合物是否调控细胞功能的方法。
无细胞系统通常可用于衣壳装配,因为多种操作是可能的。例如,在所述系统内的反应可以分离成蛋白合成阶段和装配阶段。这会减慢天然存在的衣壳装配阶段,并允许进行操作以确定病毒蛋白合成和衣壳装配的最佳调控。在无细胞系统中减慢衣壳装配的一个优点是,这允许在细胞培养物中的活病毒的已知调节剂的效力与相同调节剂在无细胞系统中的效力之间的关联。另一个优点是,可以鉴别暂时靶标(例如催化地起促进衣壳形成的作用的宿主蛋白)。
本发明令人惊讶地证实,显著低于在本领域中长期以来被接受为标准和必需浓度的浓度的那些麦胚提取物浓度是非常有效的。在本领域中长期以来接受的是,在无细胞表达系统中应当以高于20%的浓度使用麦胚提取物(参见例如,Erikson和Blobel,MethodsEnz96:38-50(1983);和Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009))。根据本发明的组合物和方法,衣壳装配在5%麦胚提取物时与在20%时一样稳健。但是,在本文中证实了,在细胞培养物中对活病毒的抗病毒效力与在无细胞系统中使用20%麦胚提取物抑制衣壳装配的能力之间几乎没有或没有关联。人们希望实现的是,合成水平和因子的量之间的最佳平衡。重要的是,在本文中证实了,在无细胞系统中抗病毒化合物的效力与在细胞培养物中使用5%的麦胚提取物浓度时的病毒灵敏度最密切相关在大于5%时,药物敏感性降低。
定义
除非另外指出,在本文中使用的技术术语是根据本领域技术人员所理解的常规用法。在分子生物学中的常见术语的定义可以参见标准教科书(例如Benjamin Lewin,GenesV,Oxford University Press于1994年出版(ISBN0-19854287-9);Kendrew等人(编),TheEncyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd于1994年出版(ISBN0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.于1995年出版(ISBN1-56081-569-8))。
本文中使用的短语“无细胞系统”表示,在没有活细胞存在下,能够在体外合成蛋白的任意类型的系统。一种示例性的系统是源自麦胚提取物的无细胞蛋白合成系统。
本文中使用的术语“表达”表示蛋白、肽或核苷酸序列的产生,且包括转录成RNA产物、转录后修饰和/或从编码产物的DNA翻译成蛋白产物或多肽、以及可能的翻译后修饰。
术语“多肽”或“肽”或“蛋白”在本文中可互换地使用,表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物:其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。可以以不同组构水平的方式描述大分子结构诸如多肽结构。关于该组构的一般讨论,参见,例如,Alberts等人,Molecular Biology of the Cell(第3版,1994),以及Cantor和Schimmel,Biophysical Chemistry Part I:The Conformation of BiologicalMacromolecules(1980)。“一级结构”表示特定肽的氨基酸序列。“二级结构”表示在多肽内局部地有序的三维结构。这些结构通常被称作结构域,例如,酶结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和细胞质尾巴结构域。结构域是形成多肽的紧凑单元的多肽部分,且长度通常是15-350个氨基酸。示例性的结构域包括具有酶活性或其它功能活性的结构域。典型的结构域由更少组构的段(诸如β-折叠和α-螺旋的段)组成。“三级结构”表示多肽单体的完全三维结构。“四级结构”表示通过独立的三级单元的非共价结合形成的三维结构。
本文中使用的“目标蛋白”、“期望的多肽”、“期望的蛋白”或“靶蛋白”是可互换的,且表示全蛋白分子,包括、但不限于,病毒衣壳蛋白或其部分,即,蛋白的细胞质结构域或其它结构域。
本文中使用的术语“病毒”或“病毒的”表示微小传染性病原体,其除了某些例外以外,通过光学显微术不可观察到,缺少独立代谢,且仅能够在活宿主细胞内复制。一些例外包括、但不限于本文描述的无细胞翻译系统。这些单个颗粒(即,例如,病毒粒子)通常包含核酸和蛋白壳或外壳;一些病毒粒子也具有含脂质的膜。术语病毒包括所有类型的病毒,包括动物、植物、噬菌体和其它病毒。
本文中使用的术语“病毒衣壳”或“衣壳”表示包围病毒核酸的蛋白外壳。病毒衣壳具有内表面和外表面。病毒衣壳的内表面是通常暴露于病毒核酸的表面。病毒衣壳的外表面是通常暴露于环境的表面。短语“病毒衣壳装配”表示,以足以产生病毒衣壳的方式排列病毒衣壳蛋白的过程。
本文中使用的术语“衣壳相互作用蛋白”表示,在病毒衣壳装配过程中或装配以后与病毒衣壳相互作用的蛋白。衣壳相互作用蛋白可以是病毒内源的,可以是外源地添加的,或者与无细胞提取物一起存在。衣壳相互作用蛋白可以包括、但不限于:衣壳分子伴侣和具有有利于衣壳形成的催化作用的蛋白。
本文中使用的术语“组分”表示,将天然存在的或非天然的氨基酸掺入增长的多肽链中所需的无细胞系统的组分。例如,组分可以包括、但不限于:缓冲剂、氨基酸、核酸转录物、ATP、GTP、磷酸肌酸、标记的氨基酸、肉豆蔻酰辅酶A锂盐、RNA酶抑制剂、肌酸激酶和tRNA。在本文中更详细地描述了组分。
短语“可检测的部分”或“缀合物”表示,可直接地或间接地监测到其存在、缺失或水平的任意原子、分子或其部分。多种可检测的部分是本领域技术人员众所周知的,且可以是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电、光或化学方式可检测的任意材料。这样的可检测的标记可以包括、但不限于:磁珠、荧光染料、放射性标记、酶和比色测量标记诸如胶体金或染色的玻璃或塑料珠子。
术语“氨基酸”表示天然存在的和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些。在本文中可以通过它们的通常已知的三字母符号或者通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示氨基酸。同样,可以通过它们通常接受的单字母代码表示核苷酸。对编码的序列中的单个或小百分比的氨基酸的氨基酸置换、缺失或添加是保守修饰的变体,其中所述改变会导致化学上类似的氨基酸对氨基酸的置换。提供在功能上类似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。这样的保守修饰的变体加入到并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。下面的八组每组含有相互为保守置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见,例如,Creighton,Proteins(1984))。
术语“核酸”表示,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它们的聚合物(单链或双链形式)和它们的补体。除非另有说明,特定核酸序列也含蓄地包括其保守修饰的变体(例如,简并密码子置换)和互补序列,以及明确地指出的序列。具体地,简并密码子置换可以通过产生这样的序列来实现:在所述序列中,一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等人,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。特定核苷酸序列也含蓄地包括“剪接变体”,如名称提示的,后者为基因的选择性剪接的产物。转录以后,可以剪接最初的核酸转录物,使得不同的(交替)核酸剪接产物编码不同的多肽。剪接变体的产生机制会变化,但是包括外显子的交替剪接。该定义也包括通过连读转录从相同核酸衍生出的交替多肽。在该定义中包括剪接反应的任意产物,包括剪接产物的重组形式。
本文中使用的短语“体外转录反应”表示,使用在很大程度上纯化的组分,例如,纯化的DNA模板和纯化的DNA依赖性的RNA聚合酶,在无细胞环境中进行的转录反应。
本文中使用的术语“调控”或“调节”是指,与靶标直接地或间接地相互作用,从而改变靶标的活性,包括、例如,抑制靶标的活性,或限制或降低靶标的活性。因此,短语“调控细胞功能”是指,改变途径的功能,其可以包括、但不限于抑制蛋白合成或抑制蛋白装配成分子结构诸如病毒衣壳。
本文中使用的术语“试验化合物”或“化合物”或“药物候选物”或“调节剂”或语法等效词描述了要试验其直接地或间接地调控肿瘤细胞增殖的能力的天然存在的或合成的任意分子,例如,蛋白、寡肽(例如,长度为约5至约25个氨基酸,优选地长度为约10-20或12-18个氨基酸,优选地长度为12、15或18个氨基酸)、小有机分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。所述试验化合物可以是试验化合物文库的形式,诸如组合的或随机化的文库,其提供了足够范围的多样性。试验化合物任选地连接至融合配偶体,例如,靶向化合物、救护化合物、二聚化化合物、稳定化化合物、可寻址的化合物和其它功能部分。常规地,如下产生具有有用性质的新化学实体:鉴别具有一些合乎需要的性质或活性(例如,抑制活性)的试验化合物(被称作“先导化合物”),产生所述先导化合物的变体,和评价那些变体化合物的性质和活性。经常采用高通量筛选(HTS)方法进行这样的分析。化合物可以是例如核酸和多肽序列的抑制剂、活化剂或调节剂,且用于表示使用核酸和多肽序列的体外和体内测定鉴别出的活化分子、抑制分子或调控分子。抑制剂是这样的化合物:例如,其结合例如源自本文描述的无细胞系统的核酸或多肽(例如,拮抗剂),部分地或完全地阻断所述核酸或多肽的活性,减少、阻止、延迟所述核酸或多肽的活化,灭活、脱敏或下调所述核酸或多肽的活性或表达。活化剂是这样的化合物:其增加、开启、活化、促进、增强例如源自本文描述的无细胞系统的核酸或多肽(例如,激动剂)的活化,敏化、激动或上调所述核酸或多肽。例如,抑制剂、活化剂或调节剂也包括源自无细胞系统的蛋白的遗传修饰形式,例如,具有改变的活性的形式,以及天然存在的和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环状肽、核酸、反义分子、核酶或小化学分子。
短语“小有机分子”表示天然存在的或合成的有机分子,其具有约50至约2500道尔顿、优选地小于约2000道尔顿、优选地约100至约1000道尔顿、更优选地约200至约500道尔顿的分子量。
本文中使用的术语“生物药物”或“生物药物化合物”表示这样的任意化合物,诸如蛋白、肽、多肽、抗体等:其可以在遗传控制下在生物系统中内源地表达,且其会赋予朝向药物或治疗用途的生物活性。可以组成性地或可诱导地表达生物药物或生物药物化合物。所述生物系统可以是体内生物系统和/或体外生物系统。
无细胞系统
无细胞麦胚提取物会提供对于翻译而言关键性的细胞溶质因子,并支持多种mRNA体外翻译成蛋白。所述翻译机制是足够保守的,以致于无细胞系统可以高效率地翻译原核和真核mRNA。可以为每种要翻译的RNA序列确定最佳麦胚提取物浓度。
在一个示例性实施方案中,本发明提供了用于表达目标蛋白(包括病毒蛋白)的无细胞系统(组合物),其包含5%麦胚提取物。在不同的实施方案中,本发明提供了用于病毒衣壳装配的无细胞系统,其包含5%麦胚提取物。但是,本领域技术人员会认识到,小于约5%(诸如约4%、约3%、约2%或约1%)的麦胚提取物量可以用于表达病毒蛋白。本发明的组合物也可以包括更高量的麦胚提取物,诸如约6%、约7%、约8%、约9%、约10%等,使得麦胚提取物的总浓度小于所述组合物的约20%体积/体积。
用于生产在本发明中使用的麦胚提取物的方法没有特别限制,只要所述麦胚提取物在供给模板核酸、氨基酸和能源等时能够合成无细胞蛋白即可。在一种示例性的方法中,如下得到提取物并用作麦胚提取物:将小麦种子中的麦胚与胚乳分离,随后从所述麦胚提取和纯化。本领域技术人员会认识到,可以从小麦种子制备麦胚提取物(参见,例如,Erikson和Blobel,Methods Enz96:38-50(1983);PNAS97:559-564(2000))。本领域技术人员也认识到,可以商业上购买麦胚(例如Promega、American Biosciences等)。
使用麦胚提取物的无细胞翻译系统可以利用除了麦胚提取物以外的多种组分进行有效翻译。本文描述了可用于使用麦胚提取物有效地翻译病毒蛋白的基础组分。但是,本领域技术人员会认识到,其它组分可能可用于翻译和/或衣壳装配,这取决于生产的蛋白和/或衣壳的期望性质、期望的生产条件和其它变量。本发明的无细胞系统的适当组分的选择,是在本领域技术人员的能力范围内。麦胚提取物用于衣壳装配的用途也是本领域已知的,且更详细地描述在,例如,Lingappa和Thielen,Methods Mol Biol.485:185-95(2009)和美国专利号7,638,269。
在一个示例性实施方案中,本发明的组合物另外包括缓冲液。无细胞翻译系统通常需要适当的补充缓冲液。麦胚翻译系统的钾和镁浓度可以对翻译效率具有显著影响,并使用补充缓冲液来调节总翻译反应物的离子浓度至最适浓度,所述最适浓度可以针对每种待翻译的mRNA来确定。缓冲液可以包括用于有效蛋白表达的其它组分,包括、但不限于:乙酸钾、胺(例如,精胺)和硫化合物(例如,二硫苏糖醇)。
本发明的组合物也任选地包括编码蛋白或其部分的核酸。在一个示例性实施方案中,所述翻译混合物含有编码一种或多种病毒蛋白的转录物核酸或其片段。在该实施方案中,所述无细胞翻译系统包含2个关联的反应:体外转录和无细胞翻译。可以如下得到RNA:通过本领域已知的任意方法,包括、但不限于:分离mRNA,或通过从DNA制备体外RNA转录物,所述DNA被克隆进含有RNA聚合酶启动子的载体中。还可以在用于翻译反应的相同反应容器中产生RNA分子。在一个示例性实施方案中,通过将例如SP6聚合酶与病毒蛋白编码区或cDNA一起加入反应混合物中,在原位产生RNA。
在一个示例性实施方案中,使用含有目标病毒或被目标病毒感染的个体的体液或得自个体的受感染细胞的样品作为编码病毒蛋白的病毒核酸的来源。然后可以将其工程改造在适当启动子(例如SP6聚合酶的启动子)的后面,通过PCR进行扩增,并纯化用于转录连接的翻译。所述体液可以是任意体液,包括、但不限于,血液、血清、血浆、淋巴液、尿、痰、脑脊液等。
存在于麦胚提取物中的内源mRNA可以与外源RNA竞争核糖体和翻译所需的因子。因此,任选地有利的是,通过用核酸酶处理制备的提取物,降低内源RNA的浓度。这样的核酸酶是本领域众所周知的,且可以包括、但不限于得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的微球菌核酸酶。
使用本领域已知的方法来维持足以维持蛋白合成的能量水平。在一个示例性实施方案中,在反应过程中加入额外核苷酸能源。在不同的实施方案中,通过加入能源诸如磷酸肌酸/肌酸磷酸激酶来维持能量。在一个示例性实施方案中,存在于本领域已知的标准翻译混合物中的ATP和GTP浓度足以支持蛋白合成和衣壳形成。
在一个示例性实施方案中,所述病毒具有肉豆蔻酰化的中间体(intermediary)。对于这样的病毒,可以向所述系统中加入足够的肉豆蔻酰基辅酶A(MCoA),其含有或不含可接受的盐,以实现衣壳装配。需要的浓度可以随特定实验条件而变化,且因此可以经验地确定。
在不同的实施方案中,本发明的无细胞翻译系统包含单独的或组合的其它组分,包括、但不限于,RNA酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、微粒体膜和tRNA。
病毒蛋白表达和衣壳装配
本发明也提供了使用本发明的组合物表达蛋白的方法。在一个示例性实施方案中,使用所述无细胞系统来模仿衣壳生源说和装配。在所述无细胞系统中,在含有衣壳蛋白翻译和随后衣壳装配所需的可溶性因子的麦胚提取物存在下翻译病毒衣壳转录物(Lingappa等人.J.Cell Biol136:567-581(1997))。存在于麦胚提取物中的细胞溶质蛋白和膜蛋白可以参与衣壳装配和/或病毒复制。嵌膜蛋白可以包括跨膜蛋白。在使用需要膜蛋白进行衣壳装配的病毒的那些实施方案中,可以将适当的膜加入无细胞翻译混合物中。进一步可能用其它外源性蛋白(诸如分子伴侣蛋白,其可以例如促进衣壳中间体的装配)补充无细胞翻译混合物。所述无细胞系统中的衣壳装配在最低限度上仅需要参与衣壳装配的特定病毒蛋白的表达。表达后,多肽继续装配成由宿主因子催化的衣壳。
温育足以产生衣壳的时间以后,可以分析无细胞反应的产物以确定沉降值、浮力密度和电子显微术外观。这些一起形成衣壳形成的完整性的灵敏测量集合。
可以以本领域已知的任意方式检测合成的病毒蛋白。在一个示例性实施方案中,使用用标记的氨基酸放射性地标记的衣壳多肽。在一个使用该方案的实施方案中,将35S甲硫氨酸加入翻译混合物中。在体外表达以后,速度沉降梯度可以产生等分进负载缓冲液中的级分,并在标准SDS-PAGE凝胶上电泳。可以将凝胶暴露于产生放射自显影照片的胶片,其显示速度沉降梯度的不同级分的35S标记的病毒蛋白的量。可替换地,如本领域已知的,可以使用磷光成像仪(phosphoimager)使放射性地标记的病毒蛋白显影。
在不同的实施方案中,使用抗体(例如,商购可得的抗体)来检测成功的蛋白表达或衣壳装配。可替换地,如本领域众所周知的,可以针对目标蛋白特异性地产生抗体。
在本发明的无细胞系统中的病毒蛋白表达和衣壳装配可用于来自任意科的病毒,包括、但不限于,黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、布尼安病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、细小RNA病毒科(Picornaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)。
非病毒蛋白
本发明也提供了使用本发明的组合物表达非病毒蛋白的方法。在一个示例性实施方案中,使用所述无细胞系统来模仿装配成多蛋白复合物的途径,病毒衣壳充当所述多蛋白复合物的类似模型。图14解释了5%麦胚提取物用于将不同中枢神经系统相关蛋白(包括DISC1基因)分解成合成阶段和装配阶段的用途。因为在病毒衣壳装配中涉及的宿主蛋白由于其它目的而必须存在于宿主中,所以作为那些内源装配途径的底物的非病毒蛋白应当同样有效地可用于本发明的药物筛选。因而,本发明不仅适用于中枢神经系统疾病,而且适用于在其它障碍中涉及的蛋白,包括、但不限于代谢疾病、肿瘤学疾病和免疫学疾病。本发明可以进一步用于模仿形成多蛋白复合物的细菌或寄生物蛋白,所述多蛋白复合物当分裂时会改善细菌或寄生物疾病。本发明的适用性要求,新合成的目标蛋白具有使用所述提取物中的其它蛋白的能力,以辅助或促进它们装配成不同的多蛋白复合物。
调节剂的测定
在某些实施方案中,通过在本发明的无细胞系统(例如,含有约5%麦胚提取物)中确定化合物对蛋白的表达、折叠和装配的影响,可以评估蛋白(包括病毒蛋白)的调控。在其它实施方案中,通过使用本发明的无细胞系统(例如,含有约5%麦胚提取物)确定化合物对衣壳装配的影响,可以评估病毒衣壳装配的调控。在某些实施方案中,通过在本发明的无细胞系统(例如,使用5%麦胚提取物)中确定化合物对蛋白表达的影响,可以评估衣壳相互作用蛋白(包括、但不限于衣壳装配分子伴侣蛋白)的调控。调控可以进一步包括、但不限于感染、复制、受体结合、细胞进入、颗粒形成等的调控。
使用本发明的无细胞系统的一个优点是,减慢衣壳形成的过程,从而允许衣壳装配的调节剂靶向衣壳装配过程。使用本发明的无细胞系统(诸如具有约5%麦胚提取物的那些)的一个优点是,增加的检测化合物的灵敏度,所述化合物否则在更高的麦胚浓度不可检测到。
使用多种体外、体内和离体测定,可以进行病毒蛋白和/或病毒衣壳装配的调控的测量。本文描述的测定可以使用全长病毒蛋白、变体、突变体或其片段。影响活性(例如,酶活性、细胞表面标志物表达、病毒复制和增殖)的合适的物理、化学或表型变化可以用于评估试验化合物对表达的蛋白的影响。所述测定还可以利用一种或多种药物,所述药物被设计成阻断或改变蛋白活性、衣壳装配或分子伴侣与病毒蛋白的结合。所述测定还可以鉴别病毒衣壳装配中间体的调节剂。此外,还可以将基因组核酸衣壳化进衣壳中,所述衣壳可以用于设计干扰衣壳化的药物和设计测定系统,所述测定系统检查抑制衣壳化的药物的作用机理。
所述结合测定可以是固态或可溶性的。所述蛋白或病毒衣壳可以共价地或非共价地结合固体支持物。经常,本发明的体外测定是非竞争性的或竞争性的底物或配体结合或亲和测定。其它体外测定包括:测量蛋白的光谱(例如,荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如,形状)、色谱或溶解度性质的变化。
可以进行高通量结合测定,其中使病毒蛋白与潜在调节剂接触,并温育合适量的时间。所述潜在调节剂可以结合固体支持物和添加的蛋白。可替换地,所述蛋白结合固体支持物。可以使用多种调节剂,包括、但不限于,小有机分子,或生物药物或生物实体,诸如蛋白,例如,抗体或肽,糖,核酸,例如,反义寡核苷酸或核酶或siRNA,或脂质。可以使用多种测定来鉴别病毒蛋白-调节剂结合,包括标记的蛋白-蛋白结合测定、电泳泳动率变动、免疫测定、酶测定等。在某些情况下,通过使用竞争性结合测定来确定候选调节剂的结合,其中在有潜在调节剂存在下测量对已知配体或底物的结合的干扰。首先结合调节剂、已知配体或底物;然后加入竞争剂。洗涤蛋白以后,确定对潜在调节剂或已知配体或底物的结合的干扰。经常标记潜在调节剂或已知配体或底物。
在可溶性的或固态的高通量测定中,可能在一天中筛选多达数千种不同的调节剂或配体。具体地,可以使用微孔滴定板的每个孔运行针对选择的潜在调节剂的单独测定,或者,如果要观察浓度或温育时间效应的话,每5-10个孔可以试验单一调节剂。因而,单个标准微孔滴定板可以测定约350(例如,384)种调节剂。如果使用1536孔板,那么单个平板可以容易地测定约100至约1500种不同的化合物。每天可能测定许多平板;使用集成的系统,多达约6,000、20,000、50,000或超过100,000种不同化合物的测定筛选是可能的。
可以使用高通量筛选方法,其包括:提供组合的小有机分子或肽文库,所述文库含有大量潜在治疗性化合物(潜在调节剂或配体化合物)。然后在一个或多个测定中筛选这样的“组合化学文库”或“配体文库”,以鉴别表现出期望的特有活性的那些文库成员(特定化学物种或亚类)。如此鉴别的化合物可以充当常规“先导化合物”,或者其本身可以用作潜在的或实际的治疗剂。
组合化学文库是通过组合许多化学“结构单元”诸如试剂,通过化学合成或生物合成产生的不同化学化合物的集合。例如,通过以给定化合物长度(即,多肽化合物中的氨基酸的数目)的每种可能方式组合一组化学结构单元(氨基酸),形成线性组合化学文库诸如多肽文库。通过这样的化学结构单元的组合混合,可以合成无数的化学化合物。
组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员众所周知的。这样的组合化学文库包括、但不限于肽文库(参见,例如,美国专利5,010,175,Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和Houghton等人,Nature354:84-88(1991))。还可以使用产生化学多样性文库的其它化学试剂。这样的化学试剂包括、但不限于:类肽(例如,PCT公开号WO91/19735)、编码的肽(例如,PCT公开号WO93/20242)、随机的生物寡聚体(例如,PCT公开号WO92/00091)、苯并二氮杂环庚三烯(例如,美国专利号5,288,514)、diversomer诸如乙内酰脲、苯并二氮杂环庚三烯和二肽(Hobbs等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:6909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等人,J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽肽拟似物(Hirschmann等人,J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成(Chen等人,I Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、寡氨基甲酸酯(Cho等人,Science261:1303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell等人,J Org.Chem.59:658(1994))、核酸文库(参见Ausubel,Berger和Sambrook,出处同上)、肽核酸文库(参见,例如,美国专利5,539,083)、抗体文库(参见,例如,Vaughn等人,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见,例如,Liang等人,Science,274:1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)、小有机分子文库(参见,例如,苯并二氮杂环庚三烯,Baum C&EN,1月18日,第33页(1993);类异戊二烯,美国专利5,569,588;噻唑烷酮和间噻嗪酮,美国专利5,549,974;吡咯烷,美国专利5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物,美国专利5,506,337;苯并二氮杂环庚三烯,美国专利5,288,514,等)。
哺乳动物提取物
本发明解释的概念同样适用于能够支持蛋白合成和蛋白装配的非麦胚提取物。因而,通过与本发明类比,最低浓度的能够从头合成蛋白的哺乳动物蛋白提取物可能是多蛋白装配的最有效系统。本领域技术人员能够使用这里关于麦胚提取物提供的信息,并将它应用于从哺乳动物细胞开发提取物。
试剂盒
在一个示例性实施方案中,本发明提供了用于蛋白的无细胞表达的试剂盒。在不同的实施方案中,所述试剂盒可用于装配病毒衣壳。本发明的示例性试剂盒包括无细胞混合物,所述无细胞混合物包含不超过约5%麦胚提取物和蛋白的表达所必需的每种组分。在所述试剂盒中包括的麦胚提取物和组分可以是如本文中所述的麦胚提取物和组分。本发明另外提供了用于确定化合物是否调控蛋白表达的试剂盒。在某些实施方案中,可以包括其它组分以调节病毒蛋白的表达或用于适合目的的衣壳的装配。试剂盒通常包括关于优化蛋白表达和/或衣壳装配的说明书。试剂盒可以任选地包括实践本发明的测定对蛋白活性和/或衣壳装配的影响的高通量方法的说明书、一个或多个容器或隔室(例如,以容纳探针、标记等)、活性的对照调节剂和/或用于混合试剂盒组分的机器人配件等。
下述实施例意图解释本发明的示例性实施方案,且不限制本发明的范围。
实施例1
在有化合物(或DMSO)对照(已经在细胞培养物中评估了其对传染性病毒的效力)存在下,在具有5%、10%或20%麦胚提取物组合物的无细胞蛋白合成系统中检查了病毒衣壳装配。
结果
首先通过印迹2μL翻译提取物(一式三份),在5%、10%或20%麦胚提取物的组合物中定量蛋白合成,并在用丙型肝炎病毒核心多肽使用基于碱性磷酸酶缀合的第二抗体的比色法定量带强度以后,绘制为任意密度单位。在麦胚提取物的每个百分比,蛋白合成是大致相同的(图1)。另外,蛋白合成是均匀的(不论麦胚提取物来源或制备条件)(图9-13),且对形成大多蛋白复合物的生物学上有关的和医学上重要的蛋白的子集是选择性的(图15)。
然后,使用在不同麦胚提取物浓度的无细胞蛋白合成系统,针对对各种病毒衣壳蛋白的效能,关联在细胞培养物中证实对丙型肝炎病毒、流感病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和人免疫缺陷病毒有效的化合物。
丙型肝炎病毒(HCV)
针对经证实对丙型肝炎病毒有效的化合物,确定了最佳麦胚提取物浓度。化合物在细胞培养物中对传染性病毒的效能范围从弱(138-85;EC50>50μM)至强(138-136;EC50=100nM)(图2A和6)。药物敏感性显示出在5%麦胚提取物时与传染性病毒药物敏感性的最大关联,在10%或20%时几乎没有明显关联(图2B)。
流感病毒(FLUV)
针对经证实对流感病毒有效的化合物,确定了最佳麦胚提取物浓度。化合物在细胞培养物中对传染性病毒的效能范围从弱(138-65;EC501-20μM)至强(150-120;EC50<0.16-4nM)(图3A和图8)。药物敏感性显示出在5%麦胚提取物时与传染性病毒药物敏感性的最大关联。所述关联在10%麦胚提取物时丧失,并且在20%在一定程度上再现,但是没有与传染性病毒细胞培养物测定的效能完全关联(图3B)。
委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)
针对经证实对委内瑞拉马脑炎病毒有效的化合物,确定了最佳麦胚提取物浓度。化合物在细胞培养物中对传染性病毒的效能范围从弱(158-80;EC50>20μM)至强(150-133;EC50<0.4μM)(图4A)。药物敏感性显示出在5%麦胚提取物时与传染性病毒药物敏感性的最大关联,且在10%麦胚提取物时大幅下降,在20%麦胚提取物时大部分丧失(图4B)。
人免疫缺陷病毒(HIV)
针对经证实对人免疫缺陷病毒有效的化合物,确定了最佳麦胚提取物浓度。化合物在细胞培养物中对传染性病毒的效能显示在图7中。药物敏感性显示出在5%麦胚提取物时与传染性病毒药物敏感性的最大关联,且在更高的麦胚提取物浓度大幅下降或丧失(图5)。
方法
将克隆的编码目标蛋白的cDNA工程改造在SP6噬菌体启动子和哺乳动物5’不翻译编码区后面,并制备PCR产物,进行凝胶纯化、苯酚/氯仿萃取、乙醇沉淀,并溶解于无菌水中,调节至1mg/mL。将产物用于制备转录物。
建立含有指定终浓度的下述组分的转录反应物:45mM Tris pH7.9,6mM MgAc,2mM精脒,10mM二硫苏糖醇,和各自480μM的ATP、GTP、UTP、CTP,500单位/mL SP6聚合酶,25单位/mL Rnasin,和20μg/mL PCR产物,在40℃温育2.5小时,等分,并在液氮中冷冻,在-80℃储存。
在20μL体积中以384孔板形式进行翻译反应,其中1/5的体积包含转录反应物。反应物的余量包括在最终翻译反应物中的指定浓度的下述组分:各自1mM的ATP和GTP,4mM磷酸肌酸,40μM的用于蛋白合成的20种氨基酸中的每一种,4μg/mL Rnasin,50μg/mL肌酸激酶,具有在图11-13中指出的A260/280吸光度值的麦胚提取物,占翻译体积的大约5%或更小。
讨论
已知造成人疾病的病毒科显示在表1中,且顺从已经装配假定衣壳的的方案和包含为研究的每个病毒科鉴别的特有装配中间体的途径。对于这些科中的13个科,已经针对在无细胞筛选中有活性的化合物寻找了在细胞培养物中抗传染性病毒的确证,并在每个情况下鉴别出多个有活性的药效团。每个病毒科已经在本发明的无细胞衣壳装配系统中装配出衣壳。
结果表明,以前的提示在无细胞衣壳装配系统中应当使用20%或更高的麦胚提取物的观点是没有根据的。这是因为,在5%(而不是10%或20%)的麦胚提取物浓度,观察到在细胞培养物中对病毒的化合物效能在无细胞系统中的衣壳装配之间的最大关联。所以,以前使用标准麦胚提取物发现病毒调节剂的尝试可能忽略了有前途的抗病毒候选物。
表1.已知造成人疾病的病毒科
应当理解,本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的,并且提示本领域技术人员可以以此为依据做出各种变型或改变,且它们应当被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引述的所有出版物、专利和专利申请特此通过引用整体并入用于所有目的。
Claims (31)
1.一种用于表达目标蛋白的无细胞系统,其中所述无细胞系统包含2%到不超过5%麦胚提取物,且进一步包含所述目标蛋白的表达所需的组分,而且其中所述系统用于检测作为所述目标蛋白之调节剂的化合物,对于否则在更高的麦胚浓度下不可检测到的化合物具有增加的检测灵敏度,其中所述目标蛋白是病毒蛋白。
2.根据权利要求1所述的无细胞系统,其中所述病毒蛋白是病毒衣壳蛋白。
3.根据权利要求1所述的无细胞系统,其中所述目标蛋白是衣壳相互作用蛋白。
4.根据权利要求1所述的无细胞系统,其中所述病毒蛋白由病毒表达,所述病毒是选自以下组的病毒科的成员:黄病毒科、披膜病毒科、布尼安病毒科、沙粒病毒科、纤丝病毒科、痘病毒科、正粘病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、嗜肝病毒科、博尔纳病毒科、细小RNA病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、乳头状瘤病毒科、腺病毒科、星状病毒科、多瘤病毒科、环病毒科、细小DNA病毒科和嵌杯病毒科。
5.根据权利要求1所述的无细胞系统,其中所述组分包含选自以下的成员:缓冲液、氨基酸、核酸转录物和它们的组合,其中所述核酸转录物编码病毒蛋白。
6.根据权利要求5所述的无细胞系统,其中所述组分进一步包含选自以下的成员:可检测的部分、ATP、GTP、磷酸肌酸、标记的氨基酸、肉豆蔻酰辅酶A锂盐、RNA酶抑制剂、肌酸激酶、tRNA和它们的组合。
7.根据权利要求6所述的无细胞系统,其中所述标记的氨基酸是[35S]甲硫氨酸。
8.根据权利要求5所述的无细胞系统,其中所述核酸转录物在体外转录反应中进行装配。
9.根据权利要求5所述的无细胞系统,其中所述核酸转录物编码病毒衣壳蛋白。
10.根据权利要求5所述的无细胞系统,其中所述核酸转录物编码病毒衣壳相互作用蛋白。
11.根据权利要求5所述的无细胞系统,其中所述缓冲液包含选自以下的成员:乙酸钾、精胺、二硫苏糖醇和它们的组合。
12.一种用于装配病毒衣壳的无细胞系统,其中所述无细胞系统包含2%到不超过5%麦胚提取物和表达至少一种构成所述病毒衣壳的病毒蛋白所需的组分,而且其中所述系统用于检测作为病毒衣壳装配之调节剂的化合物,对于否则在更高的麦胚浓度下不可检测到的化合物具有增加的检测灵敏度。
13.根据权利要求12所述的无细胞系统,其中所述病毒衣壳得自选自以下组的病毒科:黄病毒科、披膜病毒科、布尼安病毒科、沙粒病毒科、纤丝病毒科、痘病毒科、正粘病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、嗜肝病毒科、博尔纳病毒科、细小RNA病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、乳头状瘤病毒科、腺病毒科、星状病毒科、多瘤病毒科、环病毒科、细小DNA病毒科、和嵌杯病毒科。
14.根据权利要求12所述的无细胞系统,其中所述组分包含缓冲液、氨基酸和编码所述病毒蛋白的核酸转录物。
15.根据权利要求14所述的无细胞系统,其中所述组分进一步包含可检测的部分、ATP、GTP、磷酸肌酸、标记的氨基酸、肉豆蔻酰辅酶A锂盐、RNA酶抑制剂、肌酸激酶和tRNA。
16.根据权利要求15所述的无细胞系统,其中所述标记的氨基酸是[35S]甲硫氨酸。
17.根据权利要求14所述的无细胞系统,其中所述核酸转录物在体外转录反应中进行装配。
18.根据权利要求14所述的无细胞系统,其中所述核酸转录物编码构成所述病毒衣壳的蛋白。
19.根据权利要求14所述的无细胞系统,其中所述缓冲液包含选自以下的成员:乙酸钾、精胺和二硫苏糖醇。
20.一种表达目标蛋白的方法,其中使用根据权利要求1-11任何一项所述的无细胞系统表达所述目标蛋白,且其中所述目标蛋白是病毒蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述病毒蛋白是病毒衣壳蛋白。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述目标蛋白是病毒衣壳相互作用蛋白。
23.使用根据权利要求12-19任何一项所述的无细胞系统装配病毒衣壳的方法。
24.一种试验化合物是否调控细胞功能的方法,所述方法包括:
(a)将所述化合物引入根据权利要求1-11任何一项所述的无细胞系统;和
(b)确定所述细胞功能是否受到调控。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述化合物选自小有机分子和生物药物。
26.一种试验化合物是否调控病毒衣壳装配的方法,所述方法包括:
(a)将所述化合物引入根据权利要求12-19任何一项所述的无细胞系统;和
(b)确定所述病毒衣壳装配是否受到调控。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述化合物选自小有机分子和生物药物。
28.一种用于蛋白的无细胞表达的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)无细胞混合物,所述无细胞混合物包含2%到不超过5%麦胚提取物;
(b)所述蛋白的表达所需的组分;和
(c)足以使用所述试剂盒的说明书,
而且其中所述试剂盒用于检测作为所述蛋白之调节剂的化合物,对于否则在更高的麦胚浓度下不可检测到的化合物具有增加的检测灵敏度,且其中所述蛋白是病毒蛋白。
29.一种用于装配病毒衣壳的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)无细胞混合物,所述无细胞混合物包含2%到不超过5%麦胚提取物;
(b)病毒衣壳装配需要的蛋白的表达所需的组分;和
(c)足以使用所述试剂盒的说明书,
其中所述试剂盒用于检测作为病毒衣壳装配需要的蛋白之调节剂的化合物,对于否则在更高的麦胚浓度下不可检测到的化合物具有增加的检测灵敏度。
30.一种用于确定化合物是否调控蛋白的表达的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)无细胞混合物,所述无细胞混合物包含2%到不超过5%麦胚提取物;
(b)所述蛋白的表达所需的组分;和
(c)足以确定所述化合物是否调控所述蛋白的表达的说明书,
其中所述试剂盒用于检测作为所述蛋白之调节剂的化合物,对于否则在更高的麦胚浓度下不可检测到的化合物具有增加的检测灵敏度,且其中所述蛋白是病毒蛋白。
31.一种用于确定化合物是否调控病毒衣壳装配的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)无细胞混合物,所述无细胞混合物包含2%到不超过5%麦胚提取物;
(b)病毒衣壳装配需要的蛋白的表达所需的组分;和
(c)足以确定所述化合物是否调控病毒衣壳装配的说明书。
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