JP2017006086A

JP2017006086A - 薬剤誘導性プロモーター及びこれを用いた遺伝子発現誘導方法

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Publication number: JP2017006086A
Application number: JP2015128038A
Authority: JP
Inventors: 祥子都築; Sachiko Tsuzuki; 西村　哲; Satoru Nishimura; 哲西村
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2017-01-12
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: JP6274161B2; US20170107528A1; CN106282181A; AU2016204251B2; US10968457B2; AU2016204251A1; BR102016013818A8

Abstract

【課題】サトウキビ及びその近縁属の植物において使用可能な薬剤誘導性プロモーターの提供。【解決手段】特定の塩基配列を、３’末端側から５’末端側にこの順で有するポリヌクレオチドを含み、プロベナゾール、アシベンゾラルSメチル、チアジニル及びイソチアニルからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物である植物防御活性剤の存在下において下流の遺伝子発現を亢進する薬剤誘導性プロモーターと、当該薬剤誘導性プロモーターの下流に連結されたコーディング領域とを含む発現ベクターを植物細胞に導入し、植物防御活性剤を当該植物細胞に接触させ、薬剤誘導性プロモーターの転写活性を活性化する、遺伝子発現誘導方法。【選択図】図２−３

Description

本発明は、所定の薬剤の存在下に転写活性を活性化できる薬剤誘導性プロモーター、当該薬剤誘導性プロモーターを有する発現ベクター及び当該薬剤誘導性プロモーターを用いた遺伝子発現誘導方法に関する。

生物の遺伝子情報は、機能性遺伝子のＤＮＡの情報がｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡの情報を翻訳して機能性タンパク質を合成する、セントラルドグマと呼ばれる一連のプロセスを経て情報伝達がなされ、生物機能を発現する。植物体においても、一般的に両親の半数体の会合によって形成された遺伝子情報の集合体であるゲノムＤＮＡが、それを含む細胞及び当該細胞に由来する植物体の運命を規定している。

その中で、細胞が有するゲノムＤＮＡの機能性遺伝子情報が正確に情報伝達され生物機能を発現するためには、適当な遺伝子が適当な条件下（例えば時期や部位、環境条件、薬剤への暴露）に適当な強度で発現されなければならず、特定の遺伝子の発現が厳密に制御されていることが必要とされる。

機能性遺伝子の発現は、当該遺伝子の５’上流域に存在する遺伝子発現制御ＤＮＡによりその発現時期、部位および強度が制御されている。

実用作物であるサトウキビについては、ゲノムＤＮＡ解読が実施されていないことから、各種機能性遺伝子の遺伝子発現制御ＤＮＡを取得することは容易ではない。そのため従来的に、サトウキビに遺伝子導入する際には、その導入遺伝子の発現制御を、他の植物に由来する遺伝子発現制御ＤＮＡを用いて行なっていた（非特許文献１，２）。

しかしながら、サトウキビにおいて他の植物に由来する遺伝子発現制御ＤＮＡを用いて機能性遺伝子を発現させた場合、その発現時期、部位及び強度などが厳密に制御されない場合が観察され、当該分野においてはサトウキビに由来する遺伝子発現制御ＤＮＡ、特に組織特異的な遺伝子発現制御ＤＮＡの取得が切望されていた。

例えば、特許文献１には、サトウキビにおける光合成組織、特に成葉に特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡと、当該遺伝子発現制御ＤＮＡを利用した遺伝子発現制御技術が開示されている。また、特許文献２には、サトウキビにおける成葉特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡの制御下に花成誘導遺伝子を発現させることで、サトウキビに花成（出穂）を促す技術が開示されている。さらに特許文献３には、サトウキビにおける成葉に特異的な遺伝子発現を促進する活性を有する遺伝子発現制御ＤＮＡが開示されている。

また、遺伝子発現制御ＤＮＡとしては、所定の化合物の存在下に転写活性を活性化するものが知られている。この特徴を有する遺伝子発現制御ＤＮＡを薬剤誘導性プロモーターと呼称するが、イネ及びトウモロコシにおける薬剤誘導性プロモーターが報告されている（特許文献４）。

ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．１９９２Ｆｅｂ；１８（４）：６７５−８９Ｐｌａｎｔａ１９９８２０６：２０−２７

特許第５４７２０８９号特開２０１４−００３９１７号公報特許第５６５５９４７号ＷＯ２０１４／１３６７９３Ａ１

しかしながら、サトウキビ及びその近縁属の植物において使用可能な薬剤誘導性プロモーターは知られていなかった。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、少なくともサトウキビに利用できる新規な薬剤誘導性プロモーター及びこれを用いた遺伝子発現誘導方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、サトウキビにおいて、所定の化合物の存在下で高発現している遺伝子を同定することに成功し、当該遺伝子の５’上流領域から単離したポリヌクレオチドが薬剤誘導性プロモーターとして機能することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。

（１）配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第１の塩基配列、配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第２の塩基配列、配列番号３に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第３の塩基配列、配列番号４に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第４の塩基配列、配列番号５に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第５の塩基配列を、３’末端側から５’末端側にこの順で有するポリヌクレオチドを含む、薬剤誘導性プロモーター。
（２）配列番号６又は７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有することを特徴とする（１）記載の薬剤誘導性プロモーター。
（３）植物防御活性剤の存在下において下流の遺伝子発現を亢進することを特徴とする（１）記載の薬剤誘導性プロモーター。
（４）上記植物防御活性剤は、プロベナゾール、アシベンゾラルSメチル、チアジニル及びイソチアニルからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物であることを特徴とする（３）記載の薬剤誘導性プロモーター。

（５）上記（１）〜（４）いずれかに記載の薬剤誘導性プロモーターと、当該薬剤誘導性プロモーターの下流に連結されたコーディング領域とを含む発現ベクター。
（６）上記（５）記載の発現ベクターを植物細胞に導入し、植物防御活性剤を当該植物細胞に接触させ、薬剤誘導性プロモーターの転写活性を活性化する、遺伝子発現誘導方法。
（７）上記植物細胞は、単子葉植物由来であることを特徴とする（６）記載の遺伝子発現誘導方法。
（８）上記単子葉植物は、イネ科植物であることを特徴とする（７）記載の遺伝子発現誘導方法。
（９）上記イネ科植物は、イネ科サトウキビ属植物であることを特徴とする（８）記載の遺伝子発現誘導方法。

（１０）上記（５）記載の発現ベクターで形質転換された形質転換植物体。
（１１）単子葉植物由来であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物体。
（１２）上記単子葉植物は、イネ科植物であることを特徴とする（１１）記載の形質転換植物体。
（１３）上記イネ科植物は、イネ科サトウキビ属植物であることを特徴とする（１２）記載の形質転換植物体。

本発明によれば、所定の化合物の存在下において特異的に遺伝子発現を促進する活性を有する新規な薬剤誘導性プロモーター、当該薬剤誘導性プロモーターを備える発現ベクター、当該発現ベクターを導入した形質転換植物体、及び当該薬剤誘導性プロモーターを用いた遺伝子発現誘導方法を提供することができる。

実施例で同定した２種類の薬剤誘導性プロモーターをHarrPlot（株式会社ゼネティックス社製）を用いて解析した結果を示す特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い他の領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い他の領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い更に他の領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い更に他の領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターにおける同一性の高い更に他の領域をアライメント解析により比較した特性図である。実施例で同定した２種の薬剤誘導性プロモーターを有する発現ベクターの構成を示す概略構成図である。図５に示した発現ベクターを作成する工程を示す概略構成図である。実施例で作製した組換え体について、プロベナゾール存在下・非存在下で遺伝子発現量を比較した結果を示す特性図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る薬剤誘導性プロモーター（以下、単に、薬剤誘導性プロモーターと称す）は、所定の化合物の存在下において転写活性が活性化するという特徴を有している。

薬剤誘導性プロモーターは、配列番号１〜５に示す塩基配列によって規定することができる。配列番号１〜５に示す塩基配列は、所定の化合物の存在下において転写活性が活性化することが見いだされた新規の複数のポリヌクレオチドに共通する塩基配列である。すなわち、これら複数のポリヌクレオチドは、配列番号１〜５に示す５種類の塩基配列を３’末端側から５’末端側にこの順で含んでいる。したがって、これら配列番号１〜５に示す５種類の塩基配列は、薬剤誘導性プロモーターにおける薬剤誘導性に関与する領域を規定している。

また、配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の機能を有する蓋然性が高い。配列番号２〜５に示す塩基配列も同様に、それぞれ９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号２〜５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の機能を有する蓋然性が高い。

したがって、薬剤誘導性プロモーターは、配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第１の塩基配列、配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第２の塩基配列、配列番号３に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第３の塩基配列、配列番号４に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第４の塩基配列、配列番号５に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第５の塩基配列を、３’末端側から５’末端側にこの順で有するポリヌクレオチドを有すると定義することができる。

特に、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第１〜第５の塩基配列は、配列番号１〜５に示す塩基配列に対して、それぞれ９５％以上の同一性を有する塩基配列であることが好ましく、それぞれ９８％以上の同一性を有する塩基配列であることがより好ましく、それぞれ９９％以上の同一性を有する塩基配列であることが最も好ましい。

また、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第１の塩基配列と第２の塩基配列との間は、第１の塩基配列と第２の塩基配列との間は、特に限定されないが、例えば１〜２０塩基、好ましくは１〜１５塩基、より好ましくは１〜１１塩基の長さとする。また、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第１の塩基配列と第２の塩基配列とは隣接していても良い。

さらに、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第２の塩基配列と第３の塩基配列との間は、特に限定されないが、例えば１０〜６０塩基、好ましくは１５〜５５塩基、より好ましくは２０〜５０塩基、最も好ましくは３０〜４５塩基の長さとする。

さらにまた、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第３の塩基配列と第４の塩基配列との間は、特に限定されないが、例えば５０〜１１００塩基、好ましくは８０〜１０００塩基、より好ましくは１００〜９００塩基、最も好ましくは、１１０〜８６０塩基の長さとする。

さらにまた、薬剤誘導性プロモーターにおいて、第４の塩基配列と第５の塩基配列との間は、特に限定されないが、例えば１〜２５０塩基、好ましくは５〜２２５塩基、より好ましくは５〜２１０塩基、最も好ましくは１０〜２００塩基の長さとする。

ところで、より具体的に、配列番号１〜５に示す塩基配列を３’末端側から５’末端側にこの順で有する薬剤誘導性プロモーターとしては、配列番号６又は７に示すポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６及び７のいずれかに示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号６及び７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の機能を有する蓋然性が高い。すなわち、薬剤誘導性プロモーターとしては、配列番号６及び７のいずれかに示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。また、薬剤誘導性プロモーターとしては、配列番号６及び７のいずれかに示す塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましく、配列番号６及び７のいずれかに示す塩基配列に対して９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであることがより好ましく、配列番号６及び７のいずれかに示す塩基配列に対して９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが最も好ましい。なお、塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌａｔｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて上記同一性を判断することができる。

さらに、薬剤誘導性プロモーターとしては、配列番号６又は７に示す塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するものであってもよい。例えば、配列番号６又は７に示す塩基配列において、１〜１００個の塩基、好ましくは１〜５０個の塩基、より好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドであっても、所定の化合物の存在下に転写活性が活性化される薬剤誘導性プロモーターに含まれる。

例えば、薬剤誘導性プロモーターは、配列番号２又は３に示す塩基配列において５’末端及び／又は３’末端より、連続する１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個又は１０００個の塩基が欠失されたポリヌクレオチドであってもよい。塩基の欠失は当業者に公知の一般的な手法（例えば、ＰＣＲ法、制限酵素処理など）によって行うことができる。

なお、配列番号６又は７に示す塩基配列において１〜複数個の塩基を欠失、置換、付加もしくは挿入した塩基配列を設計する場合、プロモーターとしての機能を喪失しないよう当業者に公知のプロモーター解析ツール（例えば、ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎａｌｙｓｉｓＳｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ／）；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ，Ｄ．Ｓ．（１９９５）．ＰｒｅｄｉｃｔｉｎｇＰｏｌＩＩＰｒｏｍｏｔｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅｓＵｓｉｎｇＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：９２３−３２）を使用して、プロモーター機能に関与する領域を検索することができる。

さらにまた、薬剤誘導性プロモーターは、配列番号６又は７に示す塩基配列の全部もしくは一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。当該ポリヌクレオチドであっても、所定の化合物の存在下に転写活性が活性化される薬剤誘導性プロモーターに含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１〜０．２×ＳＳＣ及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５〜６５℃にて洗浄を行う条件をいう。

上述のように、配列番号６及び７とは異なる所定の塩基配列からなり、薬剤誘導性プロモーターとして機能するポリヌクレオチドは、例えば、イネ科植物サトウキビ属に属する植物で同定することができる。サトウキビ属に属する植物としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｉｎｅｎｓｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｂａｒｂｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｒｏｂｕｓｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｅｄｕｌｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｐｐ．ｈｙｂｒｉｄｓｃｖ．ＮｉＦ８など（特にこれらに限定されない）、およびその近縁属種、例えば、ソルガム、エリアンサス等が含まれる。好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｐｐ．ｈｙｂｒｉｄｓｃｖ．ＮｉＦ８である。

配列番号６及び７とは異なる所定の塩基配列からなるポリヌクレオチドが薬剤誘導性プロモーターか否かは、当業者に公知であるレポーターアッセイ等によって確認することができる。レポーターアッセイは、種々のレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等）を遺伝子発現誘導機能を検討する塩基配列の制御下（下流域）に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入又は一過的に導入した後、当該レポーター遺伝子の発現レベルを上記化合物の存在下及び非存在下で測定することにより確認することができる。当該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子（以下、ＬＵＣ）、β−グルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子、及びグリーンフルオレッセントプロテイン（以下、ＧＦＰ）遺伝子等を挙げることができる。

レポーター遺伝子の発現レベルは、当該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、当該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。各レポーター遺伝子の発現レベルは以下の手法で測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、当該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出する。ＬＵＣ遺伝子である場合には、当該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出する。ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出する。例えば、レポーター遺伝子がＧＵＳの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、（ｉ）ヒストケミカルなＧＵＳ染色による方法（ＥＭＢＯＪ．６，３９０１−３９０７（１９８７））により、及び／又は（ｉｉ）蛍光基質を用いるＣａｓｔｌｅ＆Ｍｏｒｒｉｓの方法（ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，Ｂ５，１−１６（１９９４）；Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ＆Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従ってＧＵＳ活性を測定し、さらにＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４（１９７６））に従ってタンパク質量を測定して、ＧＵＳ活性をタンパク量当たりに換算する（ｎｍｏｌｅ４−ＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎとして算出する）ことにより、それぞれ確認することができる。

また、上記以外の遺伝子をレポーターとして使用する場合には、当該遺伝子の転写レベルをノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ技術などを用いて測定することによって、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法、ウェスタンブロッティング法などを用いて測定することによって行うことができる。

上述のように規定された薬剤誘導性プロモーターは、所定の化合物の存在下で転写活性が活性化される。所定の化合物としては、特に限定されないが、植物防御活性を有する化合物（植物防御活性剤）を挙げることができる。植物防御活性剤としては、特に限定されないが、プロベナゾール、アシベンゾラルSメチル、チアジニル及びイソチアニルを挙げることができる。特に、植物防御活性剤としては、プロベナゾール（オリゼメート）とすることが好ましい。

本明細書において「所定の化合物の存在下で転写活性が活性化」とは、上記化合物が存在する条件下における下流遺伝子の発現量が、上記化合物が存在しない条件下における下流遺伝子の発現量と比較して顕著に高いこと、または統計的に有意に高いこと（例えば、およそ２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上）を意味する。

ところで、薬剤誘導性プロモーターは、その塩基配列が確定されると、化学合成によって、又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって作製することができる。さらに、配列番号６又は７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して部位特定変異誘発等によって、配列番号６又は７に示す塩基配列とは異なる塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成することもできる。なお、配列番号６又は７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。

次に、上述した薬剤誘導性プロモーターを有する発現ベクターについて説明する。
本発明に係る発現ベクターは、上述した薬剤誘導性プロモーターと、当該薬剤誘導性プロモーターの下流に連結されたコーディング領域とを含んでいる。コーディング領域とは、開始コドンから終始コドンまでのアミノ酸配列をコードする領域を意味する。なお、本発明に係る発現ベクターは、薬剤誘導性プロモーターが所定の遺伝子と機能しうるかたちで連結された構成を有すると言い換えることもできる。ここで、「機能しうるかたちで連結した」、「機能しうるかたちで連結された」とは、発現ベクターが導入された宿主細胞内において、薬剤誘導性プロモーターの制御の下でコーディング領域が転写されるように、当該薬剤誘導性プロモーターとコーディング領域とを連結することを意味する。ここで「連結」は直接連結されても良いし、適当な長さ及び配列のスペーサーを介して間接的に連結されても良い。本発明に用いるベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に機能性遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＢＩＩ系、ｐＰＺＰ系（ＨａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚＰ，ＳｖａｂＺ，ＭａｌｉｇａＰ．：Ｔｈｅｓｍａｌｌ，ｖｅｒｓａｔｉｌｅｐＰＺＰｆａｍｉｌｙｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．，２５：９８９−９４，１９９４）、ｐＣＡＭＢＩＡ系（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｍａｉｎ／ｒ＿ｅｔ＿ｃａｍｖｅｃ．ｈｔｍ）、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特にｐＢＩ系およびｐＢＩＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＩ２２１、ｐＩＧ１２１などが挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１０（３），６９７−７０４（１９９１））。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などの植物ウイルスベクターも用いることができる。

連結及び／又はベクターへの挿入を容易にするべく、上述した薬剤誘導性プロモーター及び/又はコーディング領域には、制限酵素認識配列を適宜、置換、挿入または付加することができる。ベクターへの挿入に際しては、まず、上述した薬剤誘導性プロモーター及びコーディング領域を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素認識部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができる。

コーディング領域としては、対象となる植物における内因性遺伝子、又は外来遺伝子であって、その遺伝子産物の発現が所望される任意の遺伝子をいう。かかる遺伝子としては、光合成関連遺伝子、転流関連遺伝子、有用物質（医薬、色素、芳香成分など）生産遺伝子、糖代謝関連遺伝子、耐病虫害性〔昆虫食害抵抗性、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など〕遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、光障害、紫外線）耐性関連遺伝子、植物生長制御（促進／抑制）遺伝子などが挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明に係る発現ベクターには、さらに、必要に応じて、遺伝子発現制御ＤＮＡ及び／又は機能性遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、エンハンサー、イントロン、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。

エンハンサーとしては、例えば、機能性遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。

ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ３５ＳＲＮＡ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。

選択マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、アセト乳酸合成酵素（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子などが挙げられる。選択マーカー遺伝子は、上述のように機能性遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選択マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、機能性遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。

このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（ｉｎｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるｉｎｐｌａｎｔａ法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。

遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。

本発明において形質転換に用いられる植物としては、特に限定されないが、例えば、イネ科、ナス科、アブラナ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、セリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科などに属する植物が挙げられるが、特にこれらの植物に限定されない。好ましくは、イネ科の植物、例えば、サトウキビ、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ、ネピアグラス、スイッチグラスなどの植物が挙げられる。なかでも、イネ科サトウキビ属に属する植物とすることが好ましい。

本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂（植物の芽の先端の生長点）、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。またｉｎｐｌａｎｔａ法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用し得る。

また、本発明において形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、実等）植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞のいずれをも意味するものである。

植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換植物体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。

まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。

カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。

本発明において「形質転換植物体」には、形質転換を施した再分化当代である「Ｔ１世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「Ｔ２世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「Ｔ２世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ３世代）などの後代植物をも含む。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、先ず、植付け後、約60日のサトウキビQ165系統にプロベナゾール（Meiji Seika ファルマ社製、オリゼメート粒剤8%）を20ｇ/土壌4Lとなるように薬剤処理した。処理前後に最上展開葉をサンプリングし、Rneasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotal RNAを抽出した。

次に、得られたtotal RNAをRNAseq発現解析(イルミナ社、HiSeqシーケンス、両末端解析)を実施し、リードデータを得た。アセンブラーVelvet（ver.1.2.08）を用いて、リードデータをコンティグ配列情報に復元した。また、復元したコンティグ配列情報を、各RNA配列と参照し、マッピングプログラムBowtie（ver.1.0.0）を用いて、マッピングデータを得た。このデータをRNAseq解析の元データとした。

元データの各EST配列について薬剤処理区、無処理区の数値を比較し、100倍以上発現量の上がるEST配列を探索した。その結果、プロベナゾールの投与により遺伝子発現を強度に誘導される遺伝子を選抜した。選抜した遺伝子について、EST配列をベースにBEX社開発のStraight Walk法を用いて、その5’上流域に存在する2種類の遺伝子発現制御DNAを取得した。これら遺伝子発現制御DNAは、プロベナゾールといった薬剤の存在下に転写活性を活性化する薬剤誘導性プロモーターである。これら2種類の薬剤誘導性プロモーターをそれぞれtp1及びtp2と命名し、その塩基配列をそれぞれ配列番号６及び７に示した。

本実施例では、これら2種類の薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2について、塩基配列の類似性をGenetyxに付属するHarrPlot（株式会社ゼネティックス社製）を用いて解析した。その結果を図１に示した。なお図１に示した解析結果において、縦軸はtp1の塩基配列であり、横軸はtp2の塩基配列である。これら塩基配列間において配列が一致した部位に点を表示することで、所定の長さで配列が一致すると線が表示される。図１に示すように、2種類の薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2においては、配列同一性が非常に高い５種類の領域を見いだした。これら５種類の領域について、tp1及びtp2の塩基配列から導き出せる、tp1及びtp2に共通する塩基配列を配列番号１〜５に示した。

配列番号１に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列における２０１７〜２１１０番目、配列番号７に示す塩基配列における１８１８〜１９１２番目に相当している。配列番号２に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列における１９６９〜２０１６番目、配列番号７に示す塩基配列における１７５９〜１８０６番目に相当している。配列番号３に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列における１７５３〜１９２５番目、配列番号７に示す塩基配列における１５５０〜１７２６番目に相当している。これら配列番号１〜３に示す塩基配列を含む、tp1及びtp2のアライメント解析結果を図２−１〜図２−３に示した。

また、配列番号４に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列における３９６〜８９４番目、配列番号７に示す塩基配列における９８１〜１４８２番目に相当している。配列番号４に示す塩基配列を含む、tp1及びtp2のアライメント解析結果を図３−１及び図３−２に示した。

さらに、配列番号５に示す塩基配列は、配列番号６に示す塩基配列における２６０〜３８２番目、配列番号７に示す塩基配列における６６１〜７８４番目に相当している。配列番号４に示す塩基配列を含む、tp1及びtp2のアライメント解析結果を図４−１〜図４−３に示した。

図１に示した解析結果、図２−１〜図４−３に示したアライメント解析結果に示すように、配列番号１〜５に示す塩基配列は、tp1及びtp2の間において互いに非常に類似した領域の塩基配列であり、本実施例で特定した薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2における薬剤応答性に深く関与する領域の塩基配列である。

〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で単離した２種の薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2について、プロベナゾール存在下・非存在下における転写促進活性を検討した。まず、本実施例では、図５に示したように、tp1を有する発現ベクター（図５中（A））と及びtp2を有する発現ベクター（図５中（B））を構築した。

これら発現ベクターを作製する際には、特開２０１４−００３９１７号公報に開示された遺伝子発現ベクターを使用した。この遺伝子発現ベクターは、特開２０１４−００３９１７号公報に開示されたecc0002遺伝子の発現制御領域とイネHd3aをコードするcDNAとを連結し、植物形質転換用ベクター（pIG121-Hm）に連結したものである。この遺伝子発現ベクターを本実施例ではecc0002-Hd3a-pIG121-Hmと称する。

詳細には図６に示すように、先ず、HindIII及びSacIを用いた制限酵素処理によりecc0002-Hd3a-pIG121-Hmからecc0002遺伝子の発現制御領域とイネHd3aをコードするcDNAを除き、pIG121-Hm SacI - Hind III large fragmentを得た。

一方、サトウキビQ165系統のゲノムを鋳型としたPCRにより薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2を取得した。薬剤誘導性プロモーターtp1を増幅するPCRには、フォワードプライマー：tgattacgccaagcttGATACACGATTGCTTGATCTG（配列番号８）及びリバースプライマー：gccacttccggccatGGGGAGCGATGCTACTAAAG（配列番号９）を使用した。薬剤誘導性プロモーターtp2を増幅するPCRには、フォワードプライマー：tgattacgccaagcttGATCAAAGTTGTTTTGCAACC（配列番号１０）及びリバースプライマー：gccacttccggccatGGGGAACGATGCTACTAAAG（配列番号１１）を使用した。

また、薬剤誘導性プロモーターtp1と連結するためのイネHd3aをコードするcDNAを増幅するPCRには、フォワードプライマー：GTAGCATCGCTCCCCatggccggaagtggcagggacag（配列番号１２）及びリバースプライマー：gttctgacgccacccgggcgcgtacactgtctgacg（配列番号１３）を使用した。薬剤誘導性プロモーターtp2と連結するためのイネHd3aをコードするcDNAを増幅するPCRには、フォワードプライマー：GTAGCATCGTTCCCCatggccggaagtggcagggac（配列番号１４）及びリバースプライマー：gttctgacgccacccgggcgcgtacactgtctgacg（配列番号１５）を使用した。

次に、PCRにより得られた薬剤誘導性プロモーターtp1及びイネHd3aをコードするcDNAを鋳型とするPCRにより、これら薬剤誘導性プロモーターtp1及びイネHd3aをコードするcDNAを連結した。同様に、PCRにより得られた薬剤誘導性プロモーターtp2及びイネHd3aをコードするcDNAを鋳型とするPCRにより、これら薬剤誘導性プロモーターtp2及びイネHd3aをコードするcDNAを連結した。

次に、得られたDNA断片をpIG121-Hm SacI - Hind III large fragmentにライゲーションすることで、図５（A）及び（B）に示した発現ベクターを構築した。

以上のように構築したtp1を有する発現ベクターと及びtp2を有する発現ベクターを用いて組換え体１〜８を作製した。なお、組換え体１〜７がtp1を有する発現ベクターを用いて作製されたものであり、組換え体８がtp2を有する発現ベクターを用いて作製されたものである。

具体的には、作製した発現ベクターをアグロバクテリウムEHA105にエレクトロポレーションにて導入し、ハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB寒天培地にて培養した。得られたシングルコロニーをハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB液体培地にて培養し、80%グリセロール溶液に懸濁した。得られた懸濁液をストックソリューションとした。

次に、ストックソリューションをハイグロマイシン（50mg/L）を含むLB液体培地にて一晩培養し、回収した菌体をN6液体培地に懸濁した。これに20mg/Lアセトシリンゴンを添加し、N6液体培地にて希釈して感染用菌液とした。

次に、感染用菌液に共存用培地に、サトウキビQ165系統のカルスを浸漬することでアグロバクテリウムEHA105の感染を行った。約10分間浸漬した後、感染用菌液をよく吸い取った後、カルスを共存用培地に置床し、25℃で暗黒下にて4日間培養した。その後、カルスをハイグロマイシン含有選抜培地に置床し、27℃で暗黒下にて培養し、薬剤耐性カルスを確認した。そして、黄色でやや堅めのカルスを4mm大にわけ、再分化培地に移植し、シュートが2〜3cm以上に成長した個体を発根培地に移植した。

以上のように作製した組換え体１〜８について、土壌4Lに20gずつオリゼメート粒剤（プロベナゾール8％、Meiji Seika ファルマ社製）を処理し、薬剤処理0日目（処理直前に取得）、7日目、14日目に葉のサンプリングを実施した。そして、アプライドバイオシステムズ社のABI7500リアルタイムPCR装置にて、SYBR Green法により、組換え体由来のRNA量を定量した。結果を図７に示す。なお、図７に示した比較例は、ecc0002-Hd3a-pIG121-Hmを用いた組換え体である。また、図７に示したコントロールは、野生型のサトウキビQ165系統である。

図７に示すように、プロベナゾール処理区において３倍以上の遺伝子発現誘導を確認できた。この結果から、実施例１で同定・単離した２種の薬剤誘導性プロモーターtp1及びtp2は、プロベナゾール存在下において転写活性を大幅に活性化する特徴を有することが明らかとなった。

Claims

配列番号１に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第１の塩基配列、配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第２の塩基配列、配列番号３に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第３の塩基配列、配列番号４に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第４の塩基配列、配列番号５に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する第５の塩基配列を、３’末端側から５’末端側にこの順で有するポリヌクレオチドを含む、薬剤誘導性プロモーター。
配列番号６又は７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１記載の薬剤誘導性プロモーター。
植物防御活性剤の存在下において下流の遺伝子発現を亢進することを特徴とする請求項１記載の薬剤誘導性プロモーター。
上記植物防御活性剤は、プロベナゾール、アシベンゾラルSメチル、チアジニル及びイソチアニルからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物であることを特徴とする請求項３記載の薬剤誘導性プロモーター。
請求項１乃至４いずれか一項記載の薬剤誘導性プロモーターと、当該薬剤誘導性プロモーターの下流に連結されたコーディング領域とを含む発現ベクター。
請求項５記載の発現ベクターを植物細胞に導入し、植物防御活性剤を当該植物細胞に接触させ、薬剤誘導性プロモーターの転写活性を活性化する、遺伝子発現誘導方法。
上記植物細胞は、単子葉植物由来であることを特徴とする請求項６記載の遺伝子発現誘導方法。
上記単子葉植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子発現誘導方法。
上記イネ科植物は、イネ科サトウキビ属植物であることを特徴とする請求項８記載の遺伝子発現誘導方法。
請求項５記載の発現ベクターで形質転換された形質転換植物体。
単子葉植物由来であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物体。
上記単子葉植物は、イネ科植物であることを特徴とする請求項１１記載の形質転換植物体。
上記イネ科植物は、イネ科サトウキビ属植物であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換植物体。