JP2016536366A - ラクトバチルス・プランタルム(lactobacillus plantarum)を含む組成物 - Google Patents

ラクトバチルス・プランタルム(lactobacillus plantarum)を含む組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、個体のコレステロールの吸収の改変、または心疾患、糖尿病もしくは肥満の処置に使用するための乳酸桿菌株およびその株を含有する組成物に関する。

Description

本発明は、コレステロールレベルの管理に有用な、プロバイオティクス組成物に関する。
プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を付与する細菌である。典型的に、腸内に天然に存在する細菌集団を補給するために、プロバイオティクス細菌株の培養物が個体によって消費され、または個体に投与される。数例を挙げると、がん、下痢症および過敏性腸症候群の発生の低減を含むいくつかの健康上の利益が、プロバイオティクスに関連するとされている。プロバイオティクスは、いくつかの生理的状態を管理する一助になる潜在可能性があり、摂取された脂質などのある特定の物質の吸収を低減するように作用する。また予備研究では、プロバイオティクスが、コレステロールの血清レベルおよび血圧の低下に有用であり、糖尿病をモジュレートし、体重を低減する一助になり得ることが示されている。
本発明の一目的は、腸内のコレステロール吸収を既に低減している可能性があるプロバイオティクス組成物を提供することである。またプロバイオティクス組成物が、心疾患、糖尿病または肥満などの他の生理的状態を処置するために使用できることは、やはり有益となるはずである。
本発明の一態様では、コレステロールの吸収の改変に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを含む組成物が提供される。
本発明の第2の態様では、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを含む組成物が提供される。
本発明のさらなる一態様では、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満を処置するための薬品の製造における、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを含む組成物の使用が提供される。
本願の文脈における用語「変異株」は、開示されている株から直接導出されているが、1つまたは複数の遺伝子変異の導入によって(遺伝子操作または選択によって)、表現型的に異なっている任意の株を意味することを企図する。
本発明の組成物は、主に、ヒト個体におけるコレステロールの吸収の改変またはある特定の関連疾患の処置を目的としている。しかし、該組成物は、動物を処置するために等しく使用することができる。
両方の態様に共通して、該組成物は、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121株またはその変異株をさらに含むことができる。
さらに該組成物は、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121またはそれらの変異株から選択される2つまたはそれを超える株を含むことができる。
1つまたは複数の株は、オリゴ糖などのプレバイオティクス組成物と混合することができる。しかし、選択された正確なプレバイオティクスは、該組成物中の1つまたは複数の株によって決定され、好ましくは1つまたは複数の株の増殖に特異的である。
プロバイオティクス組成物は、好ましくは、小腸内のコレステロールの吸収プロファイルの変化を誘発するために、組成物中に有効量で存在する。好ましくは、培養物は、個体に10cfu/g〜1012cfu/gの範囲の量で投与される。より好ましくは、プロバイオティクス細菌株は、10cfu/g〜10cfu/gの範囲の量で存在する。ただし、個体の状態に応じて異なる投与量が投与され得ることを理解されよう。
株は、被包されていてもよい。多くの被包技術が、当業者には明らかであり、用いられる被包技術は、消化通過中にプロバイオティクス培養物に必要な安定性に合わせて調整される。被包は、プロバイオティクスに合わせて具体的に調整されたプレバイオティクスを含むことができる。
プロバイオティクス組成物は、コレステロール吸収を低下するのに最も適した時間に放出されるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含むことができる。典型的に、培養物は、小腸の腸管腸細胞に到達するまでに、相対的に無傷で生存していなければならない。
組成物は、いくつかの食料品型式、例えば飲むことのできる液体、スプレッド、および/または固体もしくは液体食料品と混合できる粉末であってもよい。該組成物は、栄養補助食品として提供することもできる。
組成物は、1つまたは複数の活性成分、例えばビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せと組み合わせることができる。
ビタミンには、脂溶性ビタミン、例えばビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、およびビタミン、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン、例えばビタミンC(アスコルビン酸)、ビタミンB(チアミンまたはB1、リボフラビン(riboflavoin)またはB25ナイアシンまたはB3、ピリドキシンまたはB6、葉酸またはB9、シアノコバラミン(cyanocobalimin)またはB12、パントテン酸、ビオチン)、およびそれらの組合せが含まれ得る。
ミネラルには、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
抗酸化剤には、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンEリン酸塩、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルリン酸塩、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド(fiavonoid)、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
植物性化学物質には、カロテノイド(cartotenoid)、葉緑素、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン(anthocyamn)、シアニジン(cyaniding)、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン(epigailocatechingallate)、テアフラビン、テラルビシン(thearubigin)、プロアントシアニジン(proanthocyanin)、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラバノンスヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ダイズイソフラボン、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
組成物は、医薬品または薬品の代わりに(またはそれに加えて)、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品として使用することができる。さらに組成物は、既存の食料品、例えばヨーグルト、食品スプレッドに組み込むことができ、または食料品と容易にブレンドすることができ、もしくは液体飲料に製造することができる粉末として組み込むことができる。
本発明のさらに第3の態様によれば、有効量のラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを有する組成物を投与することによって、高コレステロール血清レベルを有する個体を処置する方法が提供される。
該方法は、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121株またはその変異株を追加で投与するステップをさらに含むことができる。
この方法は、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)およびラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121またはそれらの変異株から選択される2つまたはそれを超える株を投与するステップを含むことができる。
本発明の第1および第2の態様に関して列挙されている組成物のいくつかの特徴は、本発明の方法で投与される組成物と交換可能であることも、当業者は理解されよう。
本発明の詳細な説明
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。
96ウェルプレートで、MRSA中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。 96ウェルプレートで、MRSAだけ(対照)、MRSA+0.5%GDCA、MRSA+0.5%TDCA、MRSA+0.5%Oxgal、およびMRSA+2%Oxgal中、嫌気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。 96ウェルプレートで、MRSAだけ(対照)、MRSA+0.5%GDCA、MRSA+0.5%TDCA、MRSA+0.5%Oxgal、およびMRSA+2%Oxgal中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。 ハイスループットスクリーニングに付した多様な乳酸桿菌株を示す円グラフである。 コレステロール低下能のさらなる分析のために識別された24種類の株の結果を示す棒グラフである。 光学密度に対してコレステロール同化を正規化した後の、図5に示されている24種類の株の結果を示す棒グラフである。 フリーズドライ実験中のいくつかの株の粉末計数を示す棒グラフである。 フリーズドライ実験中のいくつかの株のフリーズドライでの生存率を示す棒グラフである。 フリーズドライ状態にされたいくつかの株の胃内でのインビトロ生存率を示す棒グラフである。 株B4321、B2828およびB2830に関する200μMのGDCにおける胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す棒グラフである。 株B4321、B2828およびB2830に関する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性(Oxgal)を示す棒グラフである。
乳酸桿菌の718の株の初期ハイスループットスクリーニング(HTS)試験を実施して、異なるタイプの胆汁酸塩に対する耐性を評価した。次に、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を確立するために、さらなる実験を実施して、286の耐性株における胆汁の沈殿を調査した。
試験した株は、乳酸桿菌アシドフィルス(acidophilus)、乳酸桿菌ヘルベティカス(helveticus)、乳酸桿菌アリメンタリス(alimentarius)、乳酸桿菌ブレビス(brevis)、乳酸桿菌ブチネリ(buchneri)、乳酸桿菌カゼイ(casei)(亜種:ラムノサス(rhamnosus)、カゼイ(casei)、トレランス(tolerans)、シュードプランタルム(pseudoplantarum)、パラカゼイ(paracasei)、アラクトスス(alactotsus)およびラムノサス(rhamnosus)を含む)、乳酸桿菌クリスパタス(crispatus)、乳酸桿菌クルバトゥス(curvatus)(亜種:クルバトゥス(curvatus)を含む)、乳酸桿菌デルブリュッキ(delbrueckii)(亜種:ブルガリクス(bulgaricus)およびラクチス(lactis)を含む)、乳酸桿菌ファーメンタム(fermentum)、乳酸桿菌パニス(panis)、乳酸桿菌パラカゼイ(paracasei)(亜種:パラカゼイ(paracasei)を含む)、乳酸桿菌ペントスス(pentosus)、乳酸桿菌プランタルム(planatarum)、乳酸桿菌プランタルム(plantarum)、乳酸桿菌ラムノサス(rhamnosus)、乳酸桿菌サケイ(sakei)、乳酸桿菌サリバリウス(salivarius)(亜種:サリバリウス(salivarius)を含む)であった。
株を、MRS中37℃で終夜増殖させた。これらの培養物の中からグリセロール原液を生成し、−80℃で保存した。マイクロタイタープレートに接種し、すべての株を、マスタプレートに四連で入れた。
これらの実験で使用した胆汁酸塩は、Sigma(登録商標)から購入し、以下の通りであった。グリコデオキシコール酸ナトリウム(GDCA)(Sigma製品番号G3258、CAS:16409−34−0)、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物(TDCA)(Sigma製品番号T0875、CAS:207737−97−1)およびウシ胆汁(Oxgal)(Sigma製品番号B3883、CAS:8008−63−7)。実験で使用した胆汁酸塩の濃度は、以下の通りであった。0.5%GDCA、0.5%TDCA、0.5%oxgal、および2.0%oxgal。グリコデオキシコール酸を使用するインビトロデータは、ヒトのインビボ環境をより厳密に模倣するので、生成物の有効性の可能性を反映する可能性がより高いと思われる。
培養物を、96ウェルプレートで、MRSA中37℃で終夜増殖させた。次に、96ウェルプレート中MRSA寒天150μlを含有し、添加した胆汁酸塩を含むウェルに、培養物5μlをスポッティングし、好気/嫌気条件下で48時間インキュベートした。株の適切な増殖を確実にするために、pH条件をモニタした。
結果は、ある特定の株が、嫌気条件下および好気条件下の両方で、MRSAプレート上で実際に増殖したことを示した。以下の表1は、初期HTSから得られた陽性結果のすべてを示しており、特定の株は、嫌気条件下で、様々な胆汁酸塩上で増殖することができる(OD600の測定によって評価した)。
図1は、多くの株が、MRSA中、好気条件下で十分に増殖したことを示している。図3に示されている通り、GDCAは、好気条件下であらゆる場合において株の増殖を阻害するが、図2に示されている通り、嫌気条件下では、いくつかの株がGDCA中で実際に増殖する。2.0%Oxgalは、好気条件および嫌気条件の両方においていくつかの株の増殖を阻害することが見出された。
以下の表2は、増殖の結果の簡単な概要を示す。
合計41の株は、3種類すべての胆汁酸塩が0.5%で存在する状態で増殖することが見出された。
次に、耐性株における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を、5μlを「PCRチューブプレート」(薄肉微量遠心管中寒天150μl)にスポッティングすることによって評価した。これらのチューブプレートを、96ウェルプレートと同じ条件下で増殖させた(MRS+0.5%TDCA、MRS+0.5%GDCA、MRS+0.5%oxgal、MRS+2.0%oxgal、胆汁なしのMRS(対照))。
プレートを、37℃で嫌気的にインキュベートし、胆汁の沈殿(胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関する)を、以下の採点系を使用して、24時間および48時間後に評価した。BSH活性については、+または−として増殖を記録する。次に、0.5%oxgalを含有するMRSプレート上へのその後の画線培養のために、陽性を選択した。
72時間後、数個の陽性を識別した。陽性培養物だけが、GDCAおよびTDCAにおける沈殿を示した。
図4は、初期ハイスループットスクリーニングアッセイに使用した株の範囲を示す。
初期(earler)BSH活性に基づいて株数を24まで絞った後、0.4%を補充したMRS培地におけるコレステロール同化のさらなるスクリーニングを実施した。
以下の表3は、選択された株およびそれらのコレステロール低下の平均(%)の結果を示す。
図5は、表の結果を棒グラフで示しており、最初の8つの株の間には、株の残りと比較して大きな差異があることを示している。
以下の表4および図6は、光学密度に対して正規化されたコレステロール同化を示している。
次に、コレステロール低下(%)(以下の表5)および腸内の株の潜在的な増殖有効性の文脈においてODに正規化したコレステロール低下(以下の表6)に基づいて、株の結果を比較して評価を行った。
株2828(ECGC13110403)、2830(ECGC13110402)、2691(ECGC13110401)およびATCC43121は、先の表5および6の両方の分析において、高コレステロールの低下および良好なBSH活性を示している。実施したインビトロ試験は、これらの株が、互いに組み合わせられようと、または個々であろうと、個体のコレステロール吸収の改変、または心疾患、糖尿病もしくは肥満の処置に使用するのに適し得ることを強力に示唆している。これらの株を、増殖に特異的なプレバイオティクスと併用すると、増殖を促進し、支持することができる。
次に、いくつかの株が、フリーズドライに上手く対処する方法、および選択された3種類の株の特定の胆汁酸塩に対するその後のBSH活性を調査するための実験を実施した。
第1のステップは、いくつかの株を発酵させることであった。株は、選択されたすべての担体および抗凍結剤を酸性にすることが見出された。配合物は、生成中に冷間加工されるべきであると評価された。担体の選択およびそれらの最終濃度は、以下の通りであった。82%MD+14%ソルビトール(MD=マルトデキストリン)(残りの培地、および細菌)および82%MD+14%スクロース。すべての株は、酵母エキスおよび大豆ペプトンのミックスを用いて、選択された窒素供給源上で十分に増殖した。動物成分は、この検証については提案されなかったが、大豆ペプトンは、不溶性沈殿物を生じる場合があり、これは将来的に下流処理を妨害するおそれがあると評価された。生成に使用される培地は、100%YEに基づくものと評価され、他の窒素供給源を含まないことが理想的であった。以下の表7は、選択された3種類の株(B4321、B2828およびB2830)に関する、培地中の発酵の結果および生存率の概要を示す。以下のデータでは、B4321は、過去に言及したB2691と同じ株に関する。
図7は、いくつかの株の粉末計数を示し、図8は、同じ株のフリーズドライでの生存率を示す。
図9は、胃内の株の生存率を示す。株B4321(B2691)は、明らかに試験条件下でより良好に生存している。約109CFU/mLの定常細胞を、ペプシンおよびリパーゼを含むNa/K/HCl溶液中、pH2.45で60分間インキュベートした。
図10および11は、選択された株に対する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示している。B2828およびB2830は、3時間でほぼ100%の基質に変換された。したがって、これらの株を区別することは不可能であると思われた。
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる方法を例示する。
生物学的材料の寄託
生物学的材料の寄託は、英国National Collection of Type Cultures(NCTC)の英国特許出願の目的で行われた。NCTCは、ブダペスト条約の下で認知されている国際寄託当局(IDA)である。
英国のNCTCに寄託された株のそれぞれには、接頭辞ECGCを有する番号が割り当てられている。ECGCは、European Culture General Collectionを表す。
B2691(ECGC13110401)は、元々、NCTCに寄託されたとき、L.ロイテリ(reteri)として表現型的に分類されていたことに留意されたい。その後、B2691は、遺伝子分析に基づいてL.プランタルム(plantarum)であることが見出され、この株は、本願ではB2691と呼ばれており、後の実験ではB4321と改名された。

Claims (19)

  1. コレステロールの吸収の改変に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを含む、組成物。
  2. 高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを含む、組成物。
  3. ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121株またはその変異株をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
  4. ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121またはそれらの変異株から選択される2つまたはそれを超える株を含む、請求項1または2に記載の組成物。
  5. 前記1つまたは複数の株が、10cfu/g〜1012cfu/gの範囲の量で存在する、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
  6. 被包されている、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記1つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合される、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
  8. 前記プレバイオティクスが、前記1つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含む、請求項6に記載の組成物。
  9. 食料品の形態である、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
  10. 栄養補助食品の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 有効量のラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも1つを有する組成物を投与することによって、高コレステロール血清レベルを有する個体を処置する、方法。
  12. ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121株またはその変異株を追加で投与するステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
  13. ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2828(ECGC13110403)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2830(ECGC13110402)、およびラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)2691(ECGC13110401)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)ATCC43121またはそれらの変異株から選択される2つまたはそれを超える株を投与するステップを含む、請求項10から11のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記1つまたは複数の株が、10cfu/g〜1012cfu/gの範囲の量で投与される、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記組成物が被包されている、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
  16. 前記1つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合される、請求項10から14のいずれかに記載の方法。
  17. 前記プレバイオティクスが、前記1つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含む、請求項15に記載の方法。
  18. 食料品の形態である、請求項10から16のいずれかに記載の方法。
  19. 栄養補助食品の形態である、請求項10から16のいずれか一項に記載の方法。
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