ITMI990050A1 - Composizione adatta quale integratore alimentare e per il trattamentoterapeutico di distirbi intestinali e di alterazioni della flora - Google Patents
Composizione adatta quale integratore alimentare e per il trattamentoterapeutico di distirbi intestinali e di alterazioni della floraInfo
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industrià-le
I processi metabolici che si svolgono nell'intestino sono di varia natura, ma essi si possono ricondurre essenzialmente a due gruppi: i processi metabolici che riguardano gli interscambi idroelettrolitici lume/liquidi tissutali/sangue, nonché l'assorbimento di frazioni terminali dei vari metabolismi primari (glucidi, protidi, lipidi) oppure il riassorbimento di sostanze afferenti la circolazione entero-epatica (esempio, sali biliari metabolizzati), con significato di processi di detossicazione; la produzione di fattori tossici e sistemi deputati alla loro eliminazione; in questo contesto acquistano particolare rilievo, in relazione alla loro potenziale tossicità, la produzione di radicali ammonici (altamente dannosi per le strutture cerebrali) come processo terminale del matabolismo azotato e la produzione di sostanze potenzialmente cancerogene, ecc.
La flora batterica intestinale riveste un ruolo di enorme importanza nei numerosi processi biochimici che avvengono nell'intestino, dato che le molteplici attività bio-enzimatiche di tale flora operano importanti modificazioni metaboliche dei substrati su cui vengono a contatto.
Potrà essere utile ricordare, in proposito, come la flora batterica sia in grado di effettuare la degradazione di taluni substrati alimentari che non sono aggredibili o digeribili dagli enzimi digestivi dell'organismo.
La responsabilità di molti degli eventi tossici per l'organismo e dei fenomeni basilari dell’invecchiamento viene oggi attribuita alla formazione di radicali liberi, formazione che ha carattere ubiquitario nei vari tessuti dell'organismo; tuttavia, sembra accertato che la formazione di radicali liberi nelle strutture del colon sia particolarmente elevata, anche per l'intervento biologico della flora batterica intestinale.
Un equilibrio fra produzione di radicali liberi e meccanismi biologici anti-ossidanti rappresenta una condizione indispensabile per il mantenimento di uno stato di benessere; ad un aumento della produzione di radicali liberi dovrebbe corrispondere un aumento dei processi di detossicazione, mentre, con il passare dell'età, avviene invece una diminuzione dell'efficienza di tali processi.
Numerose ricerche sono state dedicate allo sviluppo di prodotti probiotici in grado di regolare l'attività del distretto gastro-intestinale in tutti i casi in cui si verifichino alterazioni della flora batterica residente.
Tuttavia, alcune perplessità sono emerse sui vari principi biologici e sui preparati che li contengono in merito alla loro gastro-resistenza e stsbilità, elementi che condizionano evidentemente lo sviluppo culturale del principio attivo nel distretto intestinale e la produzione delle sue attività biologiche. In effetti, varie evidenze sperimentali hanno dimostrato un abbattimento delle cariche microbiche già prima della scadenza dei prodotti e una perdita di alcuni log per periodi limitati di permanenza (anche poche ore) in ambiente a pH acido, sottolineando come la durata del periodo di commercializzazione e l'acidità della'barriera gastrica rappresentino un ostacolo per un adeguato insediamento microbico a livello intestinale.
I microorganismi latto-produttori (produttori di acido lattico (L+)) sono quelli di più comune impiego (basti pensare ai fermenti lattici) in quanto in possesso di riconosciute attività probiotiche e di documentata tollerabilità trattandosi spesso di flora "ortobiotica", cioè già normalmente presente nel nostro organismo. Ciò considerato, secondo gli scopi della presente invenzione si ritiene utile introdurre tali microorganismi nell'uomo in quantità maggiori a titolo integrativo per meglio predisporre l'organismo a specifiche evenienze di natura fisiologica (prestazioni fisiche o intellettuali, cicli fisiologici, etc.) od anche patologiche (concetto di prevenzione di malattie).
L'utilizzazione di principi biologici lattoproduttori e la realizzazione di preparati commerciali contenenti tali principi richiedono alcune verifiche basilari atte a garantire la crescita ottimale del microrganismo e la produzione delle attività biologiche nell'ospite umano.
I requisiti basilari da accertare preliminarmente sono la stabilità del prodotto biologico in condizioni idonee di conservazione (possibilmente a temperatura ambiente), una resistenza all'acidità dell'ambiente gastrico e la capacità di avviare un regolare processo di crescita nell'intestino con tutte le attività caratteristiche.
A tale riguardo la presente invenzione propone una composizione adatta sia quale integratore alimentare sia per il trattamento terapeutico di disturbi intestinali e di alterazioni della flora batterica caratterizzata dal fatto di contenere quale principio attivo una combinazione di Bacillus coagulane e di lisina.
In una prima forma di attuazione della presente invenzione, detta combinazione è realizzata associando detti due componenti come tali.
In una alternativa forma di esecuzione dell'invenzione, la combinazione del principio attivo è realizzata sottoponendo previamente il Bacillus coagulans ad una coltura in presenza di lisina in fase germinativa, e quindi riportandolo allo stato di spora.
In quest'ultima forma di esecuzione dell'invenzione, il Bacillus coagulans così sottoposto a coltura dà luogo a una forma modificata del batterio di partenza, forma modificata mai precedentemente descritta in letteratura. Secondo tale forma di esecuzione dell'invenzione, il principio attivo è dunque costituito da un nuovo ceppo batterico di Bacillus coagulans in cui la lisina è stata incorporata nella fase di crescita. Una coltura di tale nuovo microorganismo è stata perciò depositata presso il centro di raccolta di colture abilitato DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in data 27 Luglio 1998. Il numero di deposito della coltura così depositata è DSM 12316 (bacterial strain LAB LYS98). In una ulteriore forma di esecuzione dell'invenzione, il principio attivo è dato dalla combinazione di detto ceppo DSM 12316 ed ancora lisina come tale.
Secondo la presente invenzione, il ceppo batterico di tipo lattobacillare sporigeno Bacillus coagulans (altrimenti definito in letteratura anche Lactobacillus sporogenesi presenta requisiti adatti in quanto la sua forma sporogena assicura sia una stabilità nell'ambiente esterno (anche a temperature dell'ordine di 40°C per vari mesi e dell'ordine di 60° - 90°C per 30 minuti), sia il superamento dell'acidità gastrica dopo somministrazione del prodotto, ed una elevata biodisponibilità nei tratti successivi del-1'intestino.
Si tratta di un bacillo aerobio e microaerofilo Grampositivo, con dimensioni comprese fra 0,6-1 μπιe 2,5-5 pm, mobile per mezzo di flagelli, con morfologia tipicamente lattobacillare (bacilli singoli o, più raramente, disposti in corte _catene, la lunghezza delle quali varia a seconda delle condizioni culturali) e, per questo motivo, incluso nel genere LactoBacillus della 5<a >Edizione del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology; la sua collocazione tassonomica è stata tuttavia modificata nella 7<a >Edizione del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, per semplicità di classificazione, dal momento che risulta in grado di produrre spore che appaiono all'osservazione microscopica come corpi ellissoidali subterminali/terminali rifrangenti, con dimensioni comprese tra 0,9 - 1,2 μιη e 1,0 - 1,7 μπι. Non tutti gli autori sono comunque d'accordo con questo tipo di classificazione dal momento che non sembra che ci siano similitudini documentate tra i due microrganismi.
Seguendo questo criterio, anche altri bacilli sporigeni produttori di acido lattico aerobi o facoltativi, catalasi positivi, sono assegnati al genere Bacillus nell'8<a >Edizione del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ad ogni modo, ad eccezione del riferimento tassonomico, il nome Lactobacillus sporogenes viene largamente utilizzato per tale batterio. Dal punto di vista biologico, il Bacillus coagulans cresce ad una temperatura di 35 - 50°C ad un pH preferibilmente compreso tra 5,5 - 6,5.
Il terreno di coltura elettivo risulta essere il "GYE agar medium", dove il batterio si sviluppa formando colonie di forma irregolare, a margine lobato e con profilo umbonato; nella stessa formulazione in brodo, la crescita si evidenzia come una pellicola superficiale (zona a contatto con l'ossigeno), unitamente ad una lieve torbidità diffusa, mentre nelle brodocolture poste in agitazione la crescita appare con la sola torbidità diffusa.
Tra le proprietà e le caratteristiche rilevanti dal puto di vista dell'utilizzazione nell'uomo di questo principio biologico, sono da sottolineare la capacità di moltiplicarsi, di aderire a livello cellulare e di produrre acido lattico (L+) in quantità rilevante, e batteriocine (o sostanze analoghe) contro varie specie batteriche anche non correlate dal punto di vista tassonomico tra le quali anche germi enteropatogeni. Bacillus coagulans o LactoBacillus sporogenes, in fase vegetativa, si mostra insensibile/resistente a numerosi chemio-antibiotici, come Penicilline, Cefalosporine, Lincomicina, Sulfametiazolo, Trimethoprimsulfametossazolo, etc.
Secondo l'invenzione, si è voluto verificare quali terreni culturali risultassero più idonei a garantire una crescita ottimale delle cellule del Bacillus coagulans quando passate alla fase vegetativa, avendo peraltro riguardo alla scelta di principi che risultassero compatibili con l'alimentazione umana.
Sono state perciò condotte delle prove microbiologiche addizionando al terreno di cultura specifico per il lattobacillo alcuni aminoacidi (tra cui, in particolare, acido aspartico, lisina, prolina); da queste esperienze, è secondo l'invenzione sorprendentemente risultato che l'addizione al terreno di lisina in determinate concentrazioni (dell'ordine di 0,1 - 1 mg/mi) ha esaltato la crescita delle cellule lattobacillari e la formazione di acido lattico (L+), fenomeno che non avviene, o avviene in misura decisamente modesta, con altri nutriliti aminoacidici. La valutazione della crescita di Bacillus coagulans è stata effettuata impiegando un terreno agar/brodo Sabouraud addizionato dello 0,5% di estratto di lievito. A questo punto, si è cercato di determinare quali tra diversi componenti aminoacidici presenti nel lievito (acido .aspartico, prolina, lisina, triptofano), ed in quale concentrazione, fossero in grado di favorire uno sviluppo più rigoglioso del microrganismo; a tale proposito l'incremento della crescita è stato valutato al biofotometro mediante la lettura in Densità Ottica (A63O). Dopo una serie di valutazioni preliminari, sono stati scelti i due aminoacidi (lisina e prolina) che avevano mostrato i migliori risultati e sono stati confrontati secondo la metodica di seguito riportata.
Esempio A
In apposite cuvette per biofotometro, preventivamente sterilizzate, sono state allestite brodocolture che contemplavano l’aggiunta al terreno di base (10 mi di brodo Sabouraud) di:
a) lisina (0,025 mg/ml), b) prolina (0,01 mg/ml), c) lievito (5 mg/ml).
Una cuvetta con solo brodo Sabouraud veniva inoltre impiegata come controllo. Ognuna delle quattrro brodocolture è stata successivamente inoculata con 100 μl di una diluizione di una brodocoltura over night (per l'intera notte) di Bacillus coagulans, effettuata a partire dalla polvere liofilizzata (concentrazione finale di circa 10<4 >ufc/ml).
La crescita delle colture è stata valutata in Densità Ottica utilizzando il biofotometro, strumento in grado di determinare il grado di sviluppo sulla base della incremento di torbidità.
Le cuvette così allestite sono state posizionate nel vano dello strumento in presenza di un agitatore magnetico in grado di mantenere la coltura in sospensione uniforme, condizione che permette una corretta lettura della torbidità del mezzo colturale.
Il grafico di figura 1 dei disegni allegati alla presente descrizione riassume i risultati di tale prova. Tale grafico riporta in ordinata la densità ottica, i cui valori risultano proporzionali al numero degli individui batterici prodotti, mentre in ascissa è riportato il tempo. Le quattro curve riportate nel grafico identificano il comportamento rispettivamente della lisina (usata ad una concentrazione 0.025 mg/ml), del lievito (5 mg/ml), della prolina (0.01 mg/ml) confrontato con il solo terreno Sabouraud preso come standard di riferimento.
Dal confronto delle curve di crescita ottenute dopo incubazione over night a 37°C è emerso che tra le diverse sostanze in esame il nutriente più efficace è la lisina (alla concentrazione di 0.025 mg/ml).
Infatti, tale aminoacido è in grado di favorire un evidente incremento della curva di crescita, riducendo i tempi della fase di latenza ed aumentando il numero delle cellule presenti ai vari tempi considerati.
Anche la produzione di acido lattico (L+), effettuata su una brodocoltura di 24 ore addizionata di lisina, è risultata più elevata (raggiungendo anche una concentrazione di 486 mg/1) rispetto ai controlli in bianco o dopo addizione con altri aminoacidi.
Esempio B
Un esperimento è stato condotto facendo crescere il B.coagulans in terreni contenenti lisina in tre stadi successivi :
Stadio I: crescita della forma vegetativa in terreno liquido (brodo Sabouraud lisina 0.25 mg/ml, ossia ad una concentrazione 10 volte superiore a quella che aveva mostrato la migliore resa nella prova dell'esempio A.
Stadio II: subcoltura a 37°C "over night" in terreno solido (agar Sabouraud) addizionato dell'aminoacido lisina alla medesima concentrazione per consentirne un'ulteriore incorporazione.
Stadio III: ulteriore incubazione delle piastre a temperatura ambiente per un tempo sufficiente a provocare un evidente cambiamento nella morfologia delle colonie che da umbonate e mucose diventano piatte e secche in seguito alla graduale sporificazione del microrganismo .
Il microrganismo così ottenuto presenta caratteristiche nuove rispetto al batterio di partenza. Si tratta di una nuova forma in cui la lisina è stata incorporata dal Bacillus coagulans nella sua fase di crescita. Questa nuova preparazione biologica è stata depositata presso la DSMZ con la sigla DSM 12316 (LAB LYS98) .
La verifica dell'incremento della crescita della nuova forma DSM 12316 rispetto al B.coagulans di partenza è stata condotta valutando lo sviluppo dei due ceppi in esame al biofotometro secondo la metodica descritta in precedenza.
Il grafico della figura 2 dei disegni allegati mostra il confronto delle curve di crescita rilevate dopo incubazione "over night" a 37°C.
Ancora in ordinata è riportata la densità ottica mentre in ascisse è riportato il tempo in ore. Le due curve si riferiscono rispettivamente, secondo la didascalia della figura 2, alla crescita di Bacillus coagulans e DSM 12316 in brodo Sabouraud addizionato di lisina (0.025 mg/ml).
Come si vede dalla figura 2, la curva di crescita del nuovo ceppo batterico secondo la presente invenzione, a partire da 8-12 ore diventa marcatamente più vantaggiosa in termini di densità ottica, e quindi di crescita batterica, rispetto alla semplice combinazione di Bacillus coagulans e lisina come tali.
In linea generale, le composizioni farmaceutiche o nutrizionali a cui la presente invenzione si riferisce possono preferibilmente essere del tipo seguente: -a) preparazioni di Bacillus coagulans addizionato di lisina, in formulazioni rivestite per una cessione ritardata dell'amminoacido nel tratto intestinale -b) preparazioni di Bacillus coagulans precoltivato in terreni arricchiti di lisina, in particolare della coltura DSM 12316 sopra specificata.
-c) preparazioni comprendenti detti a) e b) insieme, -d) preparazioni di cui ai punti a), b) e c) integrate con altri componenti tra cui carbone attivato, micronutrienti di vario tipo, principi antiossidanti naturali, quali oleoeuropeina o fenilpropanoidi della Ajuga Reptans, eventualmente con opportuni rivestimenti atti a controllare la loro cessione nel tratto gastro-intestinale .
Gli altri componenti secondo d) comprendono tutte le vitamine, con particolare riferimento alle vitamine con specifica azione antiossidante (vitamine A, C, E,) ed alle vitamine del gruppo B, i vari sali minerali od oligoelementi i cui livelli di assunzione sono raccomandati in base a studi specifici (anche in questo caso prevedendo, in particolare, quelli legati ai meccanismi di detossicaziòne dell'accumulo di radicali liberi, come rame, zinco, manganese, selenio, magnesio, etc.), le varie frazioni nucleiche e principi enzimatici di origine naturale presenti come tali o in forma mista in alimenti estrattivi.
La gamma dei principi nutrizionali previsti non deve essere considerata in alcun modo limitativa, potendo essa comprendere sia composti/prodotti di tipo ortomolecolare (cioè giàfacenti parte dell'organismo umano, come è il caso della maggior parte di queli sopraelencati), che prodotti non ortomolecolari, di origine naturale, vegetale od animale, ma aventi sempre carattere di alimento nutraceutico, cioè non specifica connotazione scientifica in relazione a particolare tappe metaboliche.
Gli stessi micronutrienti acalorici (nutraceutici) considerati, e verosimilmente anche altri, entrano di norma in processi biochimici sistemici ed assolvono a funzioni biochimiche fisiologiche che possono determinare una assenza di stato di malattia e/o persistenza di benessere (quindi, di fatto, non manifestare alcun effetto visibile e, come tali, non essere percepiti dal soggetto nel loro significato biologico).
Secondo l'invenzione, le composizioni possono essere preparate per la cessione dei principi attivi in tratti distali dell'intestino per evitarne un assorbimento precoce.
Gli "alimenti/veicolo" possono comprendere ogni tipo di prodotto alimentare idoneo a non essere degradato nelle zone prossimali dell'intestino, ma a giungere al colon in forma almeno parzialmente immodificata, inglobando, in preparazioni tecnologicamente idonee, i principi micronutrizionali citati e cedendoli prevalentemente nel colon per una loro migliore utilizzazione.
Un elenco indicativo, ma non esclusivo, di macromolecole indigeribili, o scarsamente digeribili, dai succhi gastro-enterici, ma potenzialmente degradabili dalle attività enzimatiche della flora batterica intestinale, ed ammesse dalla legislazione sugli alimenti, è il seguente: cellulosa microcristallina, metilcellulosa, idrossipropilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, metiletilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gomma xantano, gomma lacca, grassi vegetali idrogenati, pectina.
Dal punto di vista della tecnologia alimentare, si possono propsettare differenti soluzioni.
Un esempio può essere un nucleo di varia forma contenente la sostanza nutrizionale da veicolare, ottenuto in genere con una tecnologia usuale per la fabbricazione delle compresse, rivestito di uno strato protettivo, costituito da coadiuvanti ammessi nella legislazione alimentare, che impedisce il contatto del nucleo con il tratto gastro-duodenale.
Per tale strato possono essere impoiegate sostanze insolubili, o poco solubili; l'effetto viene ottenuto mediante erosione meccanica e lo spessore dello strato è il fattore che determina la cessione nel colon o comunque nel tratto distale dell'intestino (sostanze gelificanti, gelatina, grassi alimentari idrogenati). E' stato anche osservato che l'uso di macromolecole a base di fibre indigeribili prevalentemente di origine naturale vegetale, normalmente utili per favorire la formazione di una massa fecale voluminosa e soffice, cioè fisiologica, ha sorprendentemente incrementato l'azione "nutraceutica" di tutta una serie di composti che rientrano nella sfera dei micronutrienti acalorici essenziali quando tali nutraceutici erano tecnologicamente inglobati in tali complessi macromolecolari.
ESEMPI DI FORMULAZIONE
Allo scopo di meglio comprendere le caratteristiche delle composizioni dell'invenzione, si riportano di seguito alcuni esempi di pratica attuazione.
Tali esempi hanno scopo solo illustrativo e non limitativo.
In particolare, come forme per la somministrazione, si possono citare:
1) capsule di gelatina dura contenenti Bacillus coagulans (oppure il nuovo ceppo LAB LYS98 sopra definito) in quantità di 10-1000 milioni di CFU per capsula e lisina mg 10 sino a mg 100 in forma di microgranuli rivestiti per cessione controllata ritardata 2) Bustine con polvere o granulato
3) Flaconi con polvere o granulato e misurino dosatore
4) Flaconcini bevibili
ESEMPIO 1. CAPSULE DI GELATINA DURA
ESEMPIO 2. POLVERE IN FLACONE CON MISURINO DOSATORE
ESEMPIO 3. FLACONCINO CON TAPPO DOSATOPRE
ESEMPIO 4. GRANULATO IN BUSTINA
ESEMPIO 5. CAPSULE SINGOLE 0 ABBINATE
Composizione capsula con carbone:
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizione adatta sia quale integratore alimentare sia per il trattamento terapeutico di disturbi intestinali e di alterazioni della flora batterica, caratterizzata dal fatto di comprendere quale principio attivo una combinazione di Bacillus coagulane e di lisina.
- 2. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detta combinazione del principio attivo è realizzata sottoponendo previamente il Bacillus coagulane ad una coltura in presenza di lisina in fase germinativa, e quindi riportandolo allo stato di spora.
- 3. Composizione secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che detto principio attivo così ottenuto è costituito da una coltura batterica di Bacillus coagulans che incorpora lisina, coltura depositata presso il centro di raccolta DSMZ con il numero di deposito DSM12316.
- 4. Composizione secondo la rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto di comprendere quale principio attivo una combinazione di detto Bacillus coagulans DSM 12316 e lisina come tale.
- 5. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di essere formulata per uso orale con eccipienti per una cessione ritardata del principio attivo nel tratto intestinale.
- 6. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di comprendere uno o più ulteriori ingredienti scelti tra vitamine, oligoelementi, sali minerali, antiossidanti di origine vegetale quali oleoeuropeina e fenilpropanoidi, carbone attivato.
- 7. Bacillus coagulans incorporante lisina con le caratteristiche identificate nella coltura depositata presso il DSMZ con il numero di deposito DSM 12316.
- 8. Metodo per la preparazione di una coltura di Bacillus coagulans incorporante lisina, caratterizzato dal fatto di comprendere i seguenti stadi: I) crescita della forma vegetativa in terreno liquido brodo Sabouraud lisina 0.25 mg/ml. II) subcoltura a 37°C "over night" in terreno solido (agar Sabouraud) addizionato di lisina alla medesima concentrazione per consentirne un'ulteriore incorporazione. Ili) ulteriore incubazione delle piastre a temperatura ambiente per un tempo sufficiente a provocare un evidente cambiamento nella morfologia delle colonie che da umbonate e mucose diventano piatte e secche in seguito alla graduale sporificazione del microrganismo.
- 9. Uso di una combinazione di Bacillus coagulans e lisina nella preparazione di composizioni per uso di integrazione alimentare o di terapia per disturbi intestinali.
- 10. Composizioni, metodo ed uso come sopra descritto, in particolare negli esempi riportati.
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