KR100728585B1 - 셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 유포자 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)에 셀레늄 화합물을 첨가하여 발효시킴으로써 얻을 수 있는 셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법은, 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조에 있어서,

(1)유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 배지에 접종하여 진탕 배양하는 단계,

(2)배양액의 pH가 5.0∼6.0이 되면 배양을 중지하고 이를 전배양 배지로 사용하는 단계,

(3)상기의 전배양 배지에 셀레늄 용액을 첨가하고, 셀레늄 용액이 첨가된 전배양 배지를 포자 생성용 본배양 배지에 접종하고 진탕 배양하는 단계를 포함한다.

Description

셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법{lactic ferments with selenium and manufacturing method thereof}

도 1은 셀레늄이 함유된 유포자 유산균을 제조한 후 이들의 생균수, 포자 생성률을 나타낸 그래프이다.

도 2는 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)의 성장 곡선을 나타낸 그래프이다.

도 3은 셀레노메티오닌의 질량스펙트럼이다.

도 4는 셀레노시스테인의 질량스펙트럼이다.

도 5는 건조 균체의 유지시간을 5.22분으로 유지하고 측정된 질량스펙트럼이다.

도 6은 건조 균체의 유지시간을 6.02분으로 유지하고 측정된 질량스펙트럼이다.

본 발명은 셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 유포자 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)에 셀레늄 화합물을 첨가하여 발효시킴으로써 얻을 수 있는 셀레늄을 함유한 유산균 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

유포자 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)는 락토바실러스(Lactobacillus)와 바실러스(bacillus)의 중간형 특성을 가진 균종으로 호모 발효(homo fermentation)에 의해 L(+)-락틱산(L(+)-lactic acid)을 생성하는 고온성 균으로 발효와 호흡의 2가지 형태로 에너지를 얻을 수 있는 균종이다. 요즘 락토바실러스 스포로게네스는 바실러스 코아귤란스로도 나타내고 있다.

락토바실러스 스포로게네스는 혐기적 조건에서 발효성 당(fermentative saccharoid)이 풍부한 배지를 이용하여 발효에 의한 물질대사를 하며, 당의 발효에 의한 유산 생성능이 90％ 이상이고, 호기적 조건에서 효모 추출물(yeast extract), 펩톤(peptone)과 같은 단백질 분해물을 이용하여 호흡에 의한 물질대사를 하며 포자를 90％ 이상 형성하는 내성이 우수한 유포자성 유산균이다(Kim Y. M., Han Y. H., Paek N. S., Studies on the Ginseng Tea using Spore-Forming Lactic Acid Bacteria, Kor J. Food SCI. Technol. v.34, p661-665, 2002).

셀레늄(Selenium)은 화학적으로 황(sulfur)과 화학적 성질이 매우 비슷한 준금속으로 황화합물에 비하여 친핵성이 큰 원소이다.

초기에 셀레늄은 독성물질로 알려졌으나 슈와츠(schwart)와 폴츠(foltz)에 의하여 비타민 E(vitamin E)를 결핍시킨 쥐에서 관찰되는 간경변이 극미량의 셀레 늄의 투여로 예방될 수 있음이 알려지면서 점차 영양소로서의 기능이 알려지기 시작하였다.

그 후 세포질에서 항산화 역할을 하는 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase, GSH-Px)의 구성성분이라는 것이 밝혀지면서 세포내의 셀레노프로테인(selenoprotein) 내에 구조적으로 포함되어 작용할 것으로 알려지면서 셀레늄은 필수 미량 광물질로 인식되어 점차 관심을 받게 되었다.

자연계에서 셀레늄은 무기 형태와 유기 형태로 존재하며, 무기 형태로는 셀레나이트(selenite), 셀레네이트(selenate), 원소 셀레늄(elemental selenium)으로 존재하고, 유기 형태로는 셀레노메티오닌(selenomethionine), 셀레노시스테인(selenocysteine) 등으로 존재한다.

셀레늄의 항산화력은 vitamin E의 1970배에 달하며, vitamin E와 셀레늄을 병용하면 항산화력의 상승효과가 있는 것으로 알려져 있고, 또한 유기 셀레늄(organic selenium)의 주 공급원 중 하나인 셀레나이즈드 효모(selenized yeast)에는 셀로노펩티드(selenopeptid), 셀레노리피드(selenolipid), 셀레나이드(selenides) 등의 암 예방제(cancer preventing agent)로 연구되고 있는 셀레늄 화합물(selenium compound)들이 존재한다.

셀레늄의 작용효과는 간세포암의 발생과정에서 셀레노메티오닌 작용에 의한 암세포 증식억제, 적당량의 셀레늄 섭취시 개체성장 및 수명 연장 효과, 근육 및 신경 분화 촉진, 바이러스 증식억제, 면역작용 강화 등 다양한 생리적 조절작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.

셀레늄은 체내에서 셀레노시스테인과 셀레노메티오닌의 셀레노-아미노산의 유도체 형태로 존재한다.

또한 셀레늄의 체내에서 생화학적 작용은 셀레늄 의존 효소의 구성성분으로서 체내 대사과정에서 DNA나 세포막을 만들고 있는 지방질 분자를 파괴하는 작용을 하는 활성산소인 과산화수소(H₂O₂) 또는 알킬 하이드로퍼옥사이드(alkyl hydroperoxide)를 가수분해하여 제거함으로써 산화 방지 효과를 나타내는 항산화 기능을 가지고 있다.

상기에서 언급한 바와 같이 셀레늄은 유익한 역할을 함에도 불고하고, 무기 셀레늄은 강한 독성을 나타내기 때문에 의약품이나 화장품에의 응용은 매우 제한적이므로 세포독성이 없고, 항산화기능을 가진 유기 셀레늄의 개발이 중요하다.

셀레늄의 주요 공급원으로는 곡류, 육류, 어패류 등이며, 곡류 및 식물성 식품의 셀레늄 함량은 그 식물이 자란 토양에서 공급되며, 인위적인 공급원은 가축사료에 셀레늄 화합물을 첨가하고 이 가축사료를 젖소에 급여하여 셀레늄이 함유된 우유를 생산하거나, 셀레나이즈드 효모를 제조하는 방법 등이 있다.

미국 식품의약안정청(FDA)에서는 동물사료에 소디움 셀레나이트(sodium selenite)와 소디움 셀레네이트(sodium selenate)를 셀레늄의 공급원으로 사용하는 것을 권장하고 있다.

현재까지 셀레늄에 대한 연구는 효모(yeast)에 대해 매우 활발히 연구가 진행되어 셀레늄의 주요한 공급원, 특히 유기 셀레늄을 공급원으로서 셀레나이즈드 효모로 여겨지고 있으나, 효모 이외의 것을 이용하여 셀레늄에 대한 연구는 매우 부진한 실정이다.

본 발명은 셀레늄에 대한 연구를 진행하기 위해 효모가 아닌 유산균을 이용한 셀레늄, 특히 유포자 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)를 이용하여 셀레늄을 함유한 유산균에 대한 내용을 진행하고자 한다.

본 발명에서는 유포자 유산균의 배양시 셀레늄을 첨가하여 셀레늄이 함유된 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유포자 유산균의 배양한 배양물에 셀레늄을 첨가하는 단계를 포함하는 셀레늄이 함유된 유산균의 제조방법 제공을 목적으로 한다.

본 발명에 의해 제조한 셀레늄이 함유된 유산균은 음료와 같은 식품의 재료로 이용할 수 있다.

상기에서 언급한 목적을 달성하기 위해 사용하는 유산균은 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 유산균은 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스는 (주)메디오젠(대한민국)에서 제공하는 락토바실러스 스포로게네스 균체원말 1백금이를 채취하여 미리 멸균시켜 놓은 시험 튜브(test tube)에 넣어둔 BCP plate count agar(Eiken chemical, Japan) 10∼30ml(w/v)에 희석하여 잘 혼합한다. 그리고, 다시 순차적으로 락토바실러스 스포로게네스 균체원말 1백금이씩을 희석한 후 페트리 디쉬(petri dish)에 주가하여 응고시킨 후 38∼42℃에서 40∼55시간 동안 배양한 후 생성된 집락을 영양 아가(nutrient agar, Difco, USA) 사면배지에 배양하고 분리하였다.

상기에서 분리한 균주는 4주마다 계대 배양하여 4℃에서 냉장 보관하며 사용할 수 있다. 또한 계대배양된 균주는 멸균된 20％ 글리세롤에 배양액을 현탁하여 -70℃의 냉동고에 보관하며 사용할 수 있다.

본 발명은 셀레늄을 함유하는 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 포함한다.

락토바실러스 스포로게네스에 함유된 셀레늄은 1∼30ppm 농도의 셀레늄 용액을 락토바실러스 스포로게네스의 배양물에 첨가하고 배양시켜 셀레늄이 함유된 유산균을 얻을 수 있다.

본 발명은 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법을 포함한다.

본 발명의 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법은 락토바실러스 스포로게네스를 배양한 후 이 배양물에 셀레늄 또는 셀레늄 화합물을 첨가하는 단계를 포함하도록 하여 셀레늄을 함유하는 유산균을 얻을 수 있다.

본 발명의 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법의 일예로서,

(1)유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 배지에 접종하여 진탕 배양하는 단계,

(2)배양액의 pH가 5.0∼6.0이 되면 배양을 중지하고 이를 전배양 배지로 사용하는 단계,

(3)상기의 전배양 배지에 셀레늄 용액을 첨가하고, 셀레늄 용액이 첨가된 전배양 배지를 포자 생성용 본 배양배지에 접종하고 진탕 배양하는 단계를 포함한다.

이하 본 발명을 각각의 단계에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다.

상기의 제(1)단계는 락토바실러스 스포로게네스 균주 1백금이를 증류수 1리터에 대하여 펩톤(peptone) 0.1∼1.0g, 효모 추출물(yeast extract) 0.1∼1.0g, 글루코스(glucose) 0.1∼1.0g, KH₂PO₄ 0.01∼0.1g, K₂HPO₄ 0.01∼0.1g, MgSO₄·7H₂O 0.01∼0.1g, NaCl 0.001∼0.01g, MnSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, FeSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, CuSO₄·5H₂O 0.0001∼0.001g, CoSO₄·7H₂O 0.0001∼0.001g, ZnSO₄·7H₂O 0.0001∼0.001g가 함유된 액상배지 50ml∼100ml에 접종하여 36∼45℃, 100∼200rpm, 8∼10시간 동안 진탕 배양할 수 있다.

상기 (1)단계 후 배양액의 pH가 5.0∼6.0이 되면 배양을 중지하고 이를 전배양 배지로 사용할 수 있다.

(1)단계 후 배양액을 pH를 5.0∼6.0으로 조절하는 것은 후술하는 (3)단계의 본배양 배지와 pH를 일치시키기 위해서이다.

상기 (3)단계에서 셀레늄 용액은 소디움 셀레나이트(sodium selenite), 소디움 셀레네이트(sodium selenate) 중에서 선택된 어느 하나의 셀레늄 또는 셀레늄 화합물을 정제수에 용해하여 농도가 1∼30ppm 되도록 하고 이를 전 배양배지에 첨가할 수 있다.

상기 (3)단계에서 포자 생성용 본 배양배지는 증류수 1리터에 대하여 콩 효소 가수분해물(soybean enzymatic hydrolysate, SEH) 1.5∼2.5g, 콩 펩티드(soy peptide) 1.0∼2.0g, KH₂PO₄ 0.01∼0.1g, K₂HPO₄ 0.01∼0.1g, MnSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, CaCl₂ 0.001∼0.01g, 소포제(antifoaming agent) 0.1∼1.0g가 함유된 액상배지를 사용할 수 있다.

상기 (3)단계에서 셀레늄 용액이 첨가된 전 배양배지 5∼10ml를 포자 생성용 본 배양배지 50∼100ml에 접종하고 38∼43℃, 100∼200rpm, 20∼30시간 동안 진탕 배양하여 셀레늄을 함유하는 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 얻을 수 있다.

본 발명에서 셀레늄이 함유된 유산균을 얻기 위해 셀레늄의 첨가량, 배양조건과 같은 다양한 조건에 의해 실시한바, 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스에 셀레늄을 첨가하여 배양함으로써 셀레늄이 함유된 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 얻을 수 있다.

한편, 상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 셀레늄이 함유된 유산균은 셀레 늄을 함유하는 식품의 재료로 이용할 수 있다. 이러한 식품의 일예로서 건강보조식품, 음료, 드링크제, 비타민제 중에서 선택된 어느 하나의 재료로 이용할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 락토바실러스 스포로게네스 분리

유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스는 (주)메디오젠(대한민국)에서 제공하는 락토바실러스 스포로게네스 균체원말 1백금이를 채취하여 미리 멸균시켜 놓은 시험 튜브(test tube)에 넣어둔 BCP plate count agar(Eiken chemical, Japan) 20ml(w/v)에 희석하여 잘 혼합하였다.

그리고, 다시 순차적으로 락토바실러스 스포로게네스 균체원말 1백금이를 희석한 후 페트리 디쉬(petri dish)에 주가하여 응고시킨 후 40℃에서 48시간 동안 배양한 다음 생성된 집락을 영양 아가(nutrient agar, Difco, USA) 사면배지에 배양하고 분리하였다.

분리된 균주는 4주마다 계대 배양하여 4℃에서 냉장 보관하며 사용할 수 있다.

또한 계대배양된 균주는 멸균된 20％ 글리세롤(shinyo chemical, JAPAN)에 배양액을 현탁하여 -70℃의 냉동고(Operon-128c, KOREA)에 보관하며 사용할 수 있 다.

상기에서 락토바실러스 스포로게네스 균체원말로부터 분리한 락토바실러스 스포로게네스 균주의 형태학적 특성은 현미경 영상분석기로 관찰하였고, 생리적 특성은 카탈라제(catalase)를 조사하였으며 그램(gram) 염색의 유무, 당 이용성 시험을 하였다.

카탈라제 시험은 MRS 배지 10ml에 락토바실러스 스포로게네스 1백금이 접종하여 40℃에서 24시간 진탕 배양한 전 배양액을 MRS 배지 200ml에 5% 접종하고 40℃에서 24시간 진탕 배양한 후 유리 슬라이드에 한 방울을 도말하고 피펫으로 3% 과산화수소수 한 방울을 떨어뜨린 다음 즉시 거품이 생기는지 관찰하여 거품이 발생하면 양성, 거품이 발생하지 않으면 음성으로 판정하였다.

시험결과 카탈라제는 양성으로 나타났고, 그램 염색에서 역시 양성반응을 보였다.

당 이용성 시험은 락토바실러스 스포로게네스 균주 1백금이를 MRS 배지 10ml에 접종하여 30℃, 24시간 동안 전 배양하고, MRS 배지 200ml에 전 배양액 10ml(5%)를 접종하여 30℃, 24시간 동안 본 배양하였다. 본 배양액을 미리 멸균해 놓은 원심분리관에 무균적으로 넣은 다음 원심분리 하였다(Hitachir21, JAPAN, 10000g, 10min, 4℃). 원심분리 후 침전된 균체를 생리식염수 200ml에 1회 세척한 후 다시 원심분리(Hitachir21, JAPAN, 10000g, 10min, 4℃)하여 세척된 균체를 생리식염수 200ml에 재현탁시켰다. 이 생리식염수 균 현탁액을 접종균으로 사용하였 다. 당을 제외한 BCP 배지를 시험관에 10ml씩 주입하고 살균한 후 글루코스(glucose), 락토오스(lactose), 자일로스(xylose), 달토오스(daltose), 덱스트린(dextrin), 트레할로스(trehalose), 프럭토스(fructose), 아라비노오스(arabinose), 만니톨(manitol), 이눌린(inulin), 라피노오스(raffinose)의 당 종류별로 첨가한 BCP 배지 10ml에 상기의 생리식염수 균 현탁액을 0.5m씩 각각 접종하여 40℃에서 48시간 동안 정치 배양하여 배지색이 보라색에서 노란색으로 변하면 양성으로, 변하지 않으면 음성으로 판정하는 당 발효성 유무 시험을 하였다. 상기에서 당은 0.2㎍ 규격의 시린지 필터(syringe filter, Advantec, 0.2㎍.Nitrate)를 이용하여 각각의 당을 종류별로 제균한 후 0.1%(0.01ml)씩 BCP 배지에 첨가하였다.

당 이용성 시험에서는 글루코스(glucose), 락토오스(lactose), 자일로스(xylose), 달토오스(daltose), 덱스트린(dextrin), 트레할로스(trehalose), 프럭토스(fructose)에 대한 이용 능력이 있는 것으로 확인되었고, 아라비노오스(arabinose), 만니톨(manitol), 이눌린(inulin), 라피노오스(raffinose)에 대해서는 이용 능력이 없는 것으로 확인되었다.

아래의 표 1에 분리 동정한 락토바실러스 스포로게네스의 형태학적 특성을 나타내었고, 생리적 특성 결과를 표 2에 정리하여 나타내었다.

<표 1> 락토바실러스 스포로게네스의 형태학적 특성

항목
Vegetative Cell	R o d	width : 0.5∼1㎛
		Length : 3∼5㎛
Spore	Ellipsodial
	Terminal
Sporangium	Swallen

<표 2> 락토바실러스 스포로게네스의 생리적 특성

항목		결과	항목	결과
Gram reaction		+	Hydrolysis of starch	+
Motility		+	Citrate utilization	+
Anaerobic groth		+	Citrate liquefaction	+
Gas Productuin from glucose		-	Acid production from glucose	+
Voges-proskauer reaction		+	Acid production from Lactose	+
Methyl red reaction		+	Acid production from Arabinose	-
Catalase		+	Acid production from Xylose	+
Litmus milk	Litmus reaction	+	Acid production from Mannitol	-
	Curd formation	+	Acid production from Daltose	+
	proteolysis	-	Acid production from Dextrin	+
growth at pH 5.7		+	Acid production from Trehalose	+
growth at 60℃		+	Acid production from Fructose	+
growth at 32℃		+	Acid production from Inulin	-
growth at 7% NaCl		+	Acid production from Raffinose	-
growth at 0.02% Azide		+

<실시예 2> 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조

하기의 (1)단계 내지 (3)단계에 의하여 셀레늄을 함유하는 유산균을 제조하였다.

(1)실시예 1에서 분리된 락토바실러스 스포로게네스 균주 1백금이를 증류수 1리터에 대하여 펩톤(peptone) 0.5g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5g, 글루코스(glucose) 0.2g, KH₂PO₄ 0.05g, K₂HPO₄ 0.05g, MgSO₄·7H₂O 0.03g, NaCl 0.001g, MnSO₄·7H₂O 0.001g, FeSO₄·7H₂O 0.001g, CuSO₄·5H₂O 0.0001g, CoSO₄·7H₂O 0.0001g, ZnSO₄·7H₂O 0.0001g 함유된 액상배지 50ml에 접종하여 40℃, 150rpm, 9시간 동안 진탕 배양하였다.

(2)상기 (1)단계 후 배양액의 pH가 5.6이 되면 배양을 중지하고 이를 전배양 배지로 사용하였다.

(3)상기의 전배양 배지에 셀레늄 용액을 첨가하고, 셀레늄 용액이 첨가된 전배양 배지를 pH가 5.6인 포자 생성용 본배양 배지에 접종하고 진탕 배양하는 단계를 포함하여 셀레늄을 함유하는 유산균을 제조하였다.

상기 (3)단계에서 셀레늄 용액은 소디움 셀레나이트(sodium selenite)를 정제수에 용해하여 소디움 셀레나이트의 농도가 1ppm이 되도록 하고 이를 전 배양배지에 첨가하였다.

상기 (3)단계에서 포자 생성용 본배양 배지는 증류수 1리터에 대하여 콩 효소 가수분해물(soybean enzymatic hydrolysate, SEH) 1.5g, 콩 펩티드(soy peptide) 1.0g, KH₂PO₄ 0.0025g, K₂HPO₄ 0.025g, MnSO₄·7H₂O 0.001g, CaCl₂ 0.001g, 소포제(antifoaming agent)(LS300, 다우코닝사 제품) 0.4g가 함유된 액상배지를 사용하였다.

상기 (3)단계에서 셀레늄 용액이 첨가된 전 배양배지 5ml를 포자 생성용 본 배양배지 50ml에 접종하고 40℃, 150rpm, 24시간 동안 진탕 배양하여 셀레늄을 함유하는 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 얻었다.

상기 (3)단계에서 사용한 소디움 셀레나이트는 소디움 셀레나이트 1g을 멸균수 100ml에 용해하고 0.2㎍의 시린지 필터(syringe filter, Advantec, 0.2㎍, Nitrate)를 이용하여 제균한 셀레늄 용액을 사용하였다.

<실시예 2∼6>

하기의 표 3과 같이 소디움 셀레나이트(sodium selenite)를 정제수에 용해하여 소디움 셀레나이트의 농도가 3∼1000ppm인 셀레나이트 용액을 첨가하여 각각의 실시예로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 셀레늄을 함유하는 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 얻었다.

<표 3> 각각의 실시예에 따른 셀레나이트 용액의 농도

실시예	셀레나이트 용액 농도
실시예 2	3ppm
실시예 3	5ppm
실시예 4	7ppm
실시예 5	10ppm
실시예 6	30ppm

<비교예 1∼9>

하기의 표 4와 같이 소디움 셀레나이트를 첨가하지 않은 용액을 사용하거나 또는 소디움 셀레나이트(sodium selenite)를 정제수에 용해하여 소디움 셀레나이트의 농도가 50∼1000ppm인 셀레나이트 용액을 첨가하여 각각의 비교예로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 셀레늄을 함유하는 유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스를 얻었다.

<표 4> 각각의 비교예에 따른 셀레나이트 용액의 농도

비교예	셀레나이트 용액 농도
비교예 1	0ppm
비교예 2	50ppm
비교예 3	70ppm
비교예 4	100ppm
비교예 6	300ppm
비교예 7	500ppm
비교예 8	700ppm
비교예 9	1000ppm

<시험예 1> 셀레늄이 함유된 유포자 유산균의 생균수, 포자 생성률

상기 실시예 및 비교예에 의해 셀레늄이 함유된 유포자 유산균을 제조한 후 이들의 생균수, 포자 생성률을 측정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

생균수는 평판배양법으로 40℃에서 48±1시간 동안 인큐베이터(DR-112, 대륜과학, KOREA)에서 배양하여 측정하였다.

포자 생성률은 혈구계수기(0.0025mm² ×0.1mm, Marienfeld, GERMANY)를 이용하여 현미경 영상분석기로 측정하여 총 균수에 대한 포자수의 비율로 나타내었다.

도 1에서 생균수는 막대그래프로 나타내었고, 포자 생성률(●)은 꺽은선 그래프로 나타내었다.

또한 가로축인 셀레늄 농도에서 C0은 셀레늄 함량이 0ppm(비교예 1), C1은 셀레늄 함량이 1ppm(실시예 1), C2는 셀레늄 함량이 3ppm(실시예 2), C3은 셀레늄 함량이 5ppm(실시예 3), C4는 셀레늄 함량이 7ppm(실시예 4), C5는 셀레늄 함량이 10ppm(실시예 5), C6은 셀레늄 함량이 30ppm(실시예 6), C7은 셀레늄 함량이 50ppm(비교예 2), C8은 셀레늄 함량이 70ppm(비교예 3), C9는 셀레늄 함량이 100ppm(비교예 4), C10은 셀레늄 함량이 300ppm(비교예 5), C11은 셀레늄 함량이 500ppm(비교예 6), C12는 셀레늄 함량이 700ppm(비교예 7), C13은 셀레늄 함량이 1000ppm(비교예 8)을 나타낸다.

도 1에서처럼 생균수의 경우 셀레늄을 1ppm에서 10ppm까지 첨가한 실시예는 셀레늄을 첨가하지 않은 비교예보다 증가하는 경향을 보였으며, 셀레늄을 30ppm 초 과하여 첨가한 비교예는 셀레늄을 30ppm 첨가한 이후부터 생균수가 급격히 감소하고, 셀레늄의 농도가 50ppm 이상인 비교예에서는 생균수가 10％ 미만인 것으로 나타났다.

포자 생성률의 경우 셀레늄을 첨가하지 않은 비교예에서 92％로 가장 높게 나타났으나, 셀레늄의 농도가 10ppm의 실시예는 87％ 이상으로 비교적 높은 포자 생성률을 유지하였으며, 셀레늄의 농도가 30ppm인 실시예에서는 74％ 이하로 감소되었으나 아직까지 높은 포자 생성률을 유지하였다. 그러나 셀레늄의 농도가 100ppm 이상인 포자를 생성하지 않았다.

<시험예 2> 최적의 셀레늄 농도

각각의 실시예, 비교예에서 셀레늄이 함유된 유포자 유산균을 제조시 진탕 배양한 배양액을 4회 세척하여 세포외부에 잔존하는 무기 셀레늄의 잔류량을 메틸렌 블루 감소 테스트(Methylene Blue Reduction Test, MBRT)를 이용하여 분석한 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.

상기에서 MBRT는 바이알(vial)에 0.1ml의 락토바실러스 스포로게네스 배양 현탁액을 넣고 0.2M의 인산완충액(pH 5.5)을 이용하여 제조한 20％의 1-티오글리세롤 용액(1-thioglycerol solution)을 5ml 가해준 다음 10초간 쉐이킹(shaking)시켜주고 2％의 메틸렌 블루 용액 10㎕를 3분후에 가하였다. 그리고 다시 10초간 쉐이킹(shaking)시켰다. 메틸렌 블루 용액을 가하는 시간을 시작으로 메틸렌 블루의 색이 완벽하게 탈색되는 시간을 기록하고 이 시간을 MBRT로 설정하였다. 나고다위타 나(Nagodawithana) 등은 MBRT 시간이 15분에서 20분 이상으로 측정되면 세포외부에 남아있는 무기 셀레늄이 섭취 가능한 정도로 충분히 낮다고 판정하였다.

<표 5> 각각의 실시예 및 비교예의 MBRT 시간

셀레늄 첨가량(ppm)	MTRT 시간(분)	결정*
0	33.5	b
1	29.5	b
3	28.8	b
5	24.8	b
7	22.5	b
10	21.5	b
30	15.5	b
50	13.3	c
70	11	c
100	8	c
300	4.5	c
500	2.5	c
700	1.5	c
1000	1	c

* a : MBRT 시간이 90분 이상으로 셀레늄이 없는 상태(without any selenium)

b : MBRT 시간이 15∼20분 이상으로 충분히 낮은 세포외 무기 셀레늄 함량(sufficiently low extracellular inorganic selenium content)

c : MBRT 시간이 0.5∼7분으로 상당히 높은 세포외 무기 셀레늄 함량(substantial high extracellular inorganic selenium content)

상기 표 5에서처럼 셀레늄을 30ppm 첨가한 배양액의 경우 세척 후 MBRT 시간이 20분으로 나타나 유산균 세포외부에 충분히 낮은 농도의 무기 셀레늄이 남은 것으로 나타났으며, 셀레늄을 50ppm 이상을 첨가한 배양액의 경우 유산균 세포외부에 매우 높은 농도의 무기 셀레늄이 남은 것으로 판단된다. 따라서 배지 내에 10ppm의 셀레늄을 첨가하여 배양할 경우 비교적 높은 포자 생성률을 유지하며 생균수 수치 도 높일 수 있어, 본 발명에서 셀레늄을 함유한 유산균의 제조를 위한 최적 셀레늄 농도는 10ppm 임을 확인하였다.

<시험예 3>

락토바실러스 스포로게네스의 배양액에 셀레늄을 첨가시기를 확인하기 위해 포자형성용 배지에 전배양 배지를 5％를 접종하고 28시간 동안 2시간 간격으로 배양액을 채취하여 620nm에서 O.D값을 측정하여 락토바실러스 스포로게네스의 성장 곡선을 작성하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서처럼 유도기는 배양 후 4시간까지였으며, 4시간 이후부터 대수증식기에 접어들어 균수가 기하급수적으로 증식하였고, 24시간 이후 사멸기에 들어가는 것으로 나타냈다.

<시험예 4> 유기 셀레늄의 함량 분석

건조균체의 유기 셀레늄 함량은 ICP/MS(ICPM-8500, Shimazu, JAPAN)를 이용한 전체 셀레늄 함량에서 MBRT를 이용한 무기 셀레늄 함량을 빼준 값으로 결정하였다.

표 6에 실시예 1 내지 실시예 6의 각각의 셀레늄 첨가 농도에 따라 제조한 유산균의 유기 셀레늄 함량을 나타내었다. 유기 셀레늄의 함량은 셀레늄의 첨가농도가 높아질수록 증가하여 셀레늄 10ppm 첨가농도에서는 333.4ppm, 셀레늄 30ppm 첨가농도에서는 991.3ppm을 나타내었다.

표 7에서는 첨가시기에 따른 유기 셀레늄의 함량 변화를 나타내었다. 10ppm 첨가농도에서 첨가시기를 달리하여 제조한 유산균의 경우 0시간 첨가군에서 343ppm으로 측정된 유기 셀레늄 함량이 4시간 첨가군에서 370ppm이었으며, 8시간 첨가군에서 445.5ppm으로 측정되었다. 12시간 이후에는 다시 감소하여 403ppm인 것으로 나타났다. 30ppm에서도 10ppm과 비슷한 경향으로 증가한 후 다시 감소하는 방향으로 나타났다.

상기에서 유산균에 함유된 유기 셀레늄 함량 측정시 유산균은 하기와 같이 건조 유산균을 제조하여 나타내었다.

셀레늄을 첨가하여 배양이 끝난 유산균 배양액을 미리 멸균해 놓은 원심분리관에 무균적으로 넣은 다음 1000g에서 30분간 원심분리(HITACHICR21, JAPAN)하고, 상등액은 회수하여 버린 다음, 침전된 균체에 멸균 생리식염수 50ml을 가하여 현탁시킨 후 1000g에서 30분간 원심분리 하였다. 이 과정을 4회 반복 시행하여 세포외부에 남아있는 무기 셀레늄을 최대한 제거하고, 60℃의 건조오븐에 12시간 동안 건조하여 수분을 제거한 후 분쇄하여 -20℃ 냉동고에서 보관하며 시험예 5의 셀레늄 함량 및 정성에 대한 분석재료로 사용하였다.

<표 7> 셀레늄 첨가농도에 따른 유기 셀레늄 함량

셀레늄 첨가 (㎍/ml)	총 셀레늄 함량 (㎍/g)	무기 셀레늄 함량 (㎍/g)	유기 셀레늄 함량 (㎍/g)
1	72	0.10	71.9
3	112	1.98	110.0
5	249	3.00	246.0
7	315	3.31	312.7
10	347	3.58	333.4
30	1006	14.74	991.3

<표 8> 셀레늄 첨가 농도 및 첨가시간에 따른 유기 셀레늄 함량

세레늄 첨가 (㎍/ml)	셀레늄 첨가시간 (시간)	총 셀레늄 함량 (㎍/g)	무기 셀레늄 함량 (㎍/g)	유기 셀레늄 함량 (㎍/g)
10	0	347	3.59	343.4
	4	375	4.41	370.5
	8	450	4.44	445.5
	12	420	16.89	403.1
30	0	1006	12.28	993.7
	4	1241	24.89	1216.1
	8	1203	24.89	1178.1
	12	1076	25.51	1050.5

<시험예 5> 유기 셀레늄의 정성 분석

유기 셀레늄인 셀레노메티오닌, 셀레노이스테인의 표준물질을 하기에서 언급한 방법으로 제조하고, 이러한 표준물질 및 실시예 5,6에서 제조한 유산균을 건조균체로 처리한 것을 시료로 하여, 표준물질과 시료에 대해 GC/MS를 이용하여 표준물질과 시료에 대한 정성분석을 실시하였다.

한편, 실시예 5,6에서 제조한 유산균을 건조균체로 처리한 것은 시험예 4에서 언급한 방법으로 건조 균체를 얻었다.

(1)표준물질 제조

셀레노메티오닌(selenomethionine, Sigma, USA) 4mg에 0.1M HCl 3ml를 가하여 용해하고, 셀레노시스테인(selenocysteine, Sigma, USA) 0.6mg에 3차 증류수 3ml과 10％ NaBH₄(Samchun, KOREA) 1ml을 가한 후 90℃에서 10분간 용해하였다.

셀레노메티오닌 용액과 셀레노시스테인 용액에서 300㎕씩을 취한 후 각각에 에탄올(Samchun, KOREA) 150㎕, 피리딘(Yakuri, JAPAN) 50㎕, 에틸 클로로포르메이 트(Ethyl chloroformate(ECF), Sigma, USA) 50㎕를 가한 후 거품이 완전히 사라질 때까지 쉐이킹(shaking) 시켜주고, 1％ ECF를 함유한 클로포로름(Samchun, KOREA) 500㎕을 가하였다.

각 용액에서 클로로포름층을 100㎕를 취하고 혼합하여 표준물질로 사용하였다.

(2)건조 균체 제조

시험예 4의 셀레늄을 함유한 유산균 배양액으로부터 얻은 시료 0.3g을 3차 증류수 5ml와 0.1M HCl을 가하고 초음파 발생 욕조(JAC-4020, KOREA)에서 50℃/2h의 조건으로 처리하고, 4000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 0.45㎛의 막 필터(Whatman Cat. No. 7401-004, ENGLAND)를 이용하여 여과하고 여액에서 500㎕를 바이알(vial)에 취하였다. 에탄올 150㎕, 피리딘 50㎕, ECF 50㎕를 가한 후 거품이 완전히 사라질 때까지 쉐이킹하고, 1％ ECF를 함유한 클로포로름 500㎕을 가하였다. 층이 분리되면 클로로포름 층을 100㎕를 취하여 분석용 시료로 사용하였다.

(3)GC/MS 분석 조건

GC/Mass(GC/MS Hewlett-Packard HP 6890 gas chromatograph with an 5973 mass-selective detector)의 조건은 아래와 같다.

0. 칼럼(column) : Agilent HP-5MS

0. 주입포트(the injection port) : 250℃

0. 흐름율(Flow rate) : 0.6ml/min, Helium carrier gas

0. 내부 압력(inlet pressure) : 5.6psi

0. 주입 부피(injection volume) : 2㎕

0. 분열 배출 흐름(split vent flow) : 50ml/min(Splitless type injection)

0.오븐 온도(Oven Temperature) : 120℃(increases at 20℃, final temperature of 290℃, 5min)

0. 총 운전시간(Total run time) : 13.50min

표준물질로 이용한 셀레노메티오닌과 셀로노시스테인의 크로마토그래프(chromatograph)에서의 유지시간(retention time)은 각각 5.20분 및 6.02분으로 피크가 나타났다.

셀레노메티오인과 셀레노시스테인의 질량스펙트럼을 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다. 펠라에즈 등의 연구(Pelaez, M.V., Bayon, M.M., Alonso, J.I.G., Sanz Medel, A., 2000. A comparison of different derivatization approaches for the determination of selenomethionine by GC-ICP-MS. J. Anal. Atom. Spectrom. 15(9),1217-1222)에서와 마찬가지로 m/z=297의 주변에서 셀레노메티오닌의 유도체 피크그룹이 형성되었으며, N-에톡시카보닐 에틸 에스터 유도체(molecular ion)의 동위원소의 형태와 251과 224의 주변의 피크그룹이 보인다. 또한 셀레늄 동위원소의 징후와 CH₃CH₂OH그룹(251 그룹)과 COOCH₂CH₃그룹(224 그룹)에서 떨어져 나온 피크들이 나타났다. 202 질량 피크는 molecular ion으로부터 SeCH₃가 떨어져나간 것으로 추정된다. m/z=175는 CH₂CH₂SeCH₃가 떨어젼 나간 것으로, m/z=109는 CH₂SeCH₃인 것으로 추정되어 셀레늄 동위원소의 징후가 보인다. 128 피크는 molecular ion으로부터 COOCH₂CH₃와 SeCH₃ 그룹이 떨어져 나간 것으로 사료된다.

셀레노시스테인의 질량스펙트럼은 m/z=297의 주변에서 셀레노메티오닌의 유도체 피크 그룹이 형성되었으며, 셀레늄을 포함한 195 주변의 피크는 COOCH₂CH₃와 EtOH가 떨러져 나간 것으로 판단된다. m/z=180 주변의 피크는 m/z=196으로부터 CH₃ 그룹이 떨여져 나간 것으로 보인다. 이와 같은 표준용액의 질량스펙트럼을 바탕으로 셀레노메티오닌의 경우 m/z=297 피크 그룹을 선택이온으로 사용하여 분석하였으며, 셀레노시스테인의 경우 m/z=268 피크 그룹을 선택이온으로 사용하여 정성분석을 하였다.

시료는 셀레늄을 10ppm 농도로 배양 8시간 이후 셀레늄을 첨가한 건조균체를 전처리하여 사용하여 정성분석을 하고, 그 결과를 도 5, 도 6에 나타내었다.

도 5는 건조 균체의 유지시간을 5.22분으로 유지하고 측정된 질량스펙트럼으로 선택이온 m/z=297 그룹이 표준물질의 피크와 일치하고 있음을 알 수 있었다.

도 6은 건조 균체의 유지시간을 6.02분으로 유지하고 측정된 질량스펙트럼으로 m/z=268 그룹이 표준물질의 피크와 일치하고 있어 결과적으로 건조 균체 내에 셀레노메티오닌과 셀레노시스테인이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

상기의 시험예의 결과에서처럼 본 발명에 의해 셀레늄이 함유된 유산균 제조방법은 유산균에 유기 셀레늄을 함유하고 있음을 알 수 있다.

본 발명에 의해 유기 셀레늄을 유산균 형태로 용이하게 공급할 수 있어 종래 효모에 의한 셀레늄 공급 이외에 새로운 방법으로 셀레늄을 공급할 수 있음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조에 있어서,

   (1)유포자성 유산균인 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes)를 배지에 접종하여 진탕 배양하는 단계,

   (2)배양액의 pH가 5.0∼6.0이 되면 배양을 중지하고 이를 전배양 배지로 사용하는 단계,

   (3)상기의 전 배양배지에 셀레늄 또는 셀레늄 화합물을 첨가한 셀레늄 용액을 첨가하고, 셀레늄 용액이 첨가된 전배양 배지를 포자 생성용 본 배양배지에 접종하고 진탕 배양하는 단계를 포함하는 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 제(1)단계는 락토바실러스 스포로게네스 균주 1백금이를 증류수 1리터에 대하여 펩톤(peptone) 0.1∼1.0g, 효모 추출물(yeast extract) 0.1∼1.0g, 글루코스(glucose) 0.1∼1.0g, KH₂PO₄ 0.01∼0.1g, K₂HPO₄ 0.01∼0.1g, MgSO₄·7H₂O 0.01∼0.1g, NaCl 0.001∼0.01g, MnSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, FeSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, CuSO₄·5H₂O 0.0001∼0.001g, CoSO₄·7H₂O 0.0001∼0.001g, ZnSO₄·7H₂O 0.0001∼0.001g 함유된 액상배지에 50ml∼100ml에 접종하여 36∼45℃, 100∼200rpm, 8∼10시간 동안 진탕배양 함을 특징으로 하는 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법.
6. 제4항에 있어서, (3)단계의 셀레늄 용액은 소디움 셀레나이트(sodium selenite), 소디움 셀레네이트(sodium selenate) 중에서 선택된 어느 하나의 셀레늄 또는 셀레늄 화합물을 정제수에 용해하여 농도가 1∼30ppm 되도록 하고 이를 전배양 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법.
7. 제4항에 있어서, 포자 생성용 본 배양배지는 증류수 1리터에 대하여 콩 효소 가수분해물(soybean enzymatic hydrolysate, SEH) 1.5∼2.5g, 콩 펩티드(soy peptide) 1.0∼2.0g, KH₂PO₄ 0.01∼0.1g, K₂HPO₄ 0.01∼0.1g, MnSO₄·7H₂O 0.001∼0.01g, CaCl₂ 0.001∼0.01g, 소포제(antifoaming agent) 0.1∼1.0g 함유된 액상배지 임을 특징으로 하는 셀레늄을 함유하는 유산균의 제조방법.
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