JP2016531162A - フェノフィブラート及びその類似体を用いた神経変性疾患の治療 - Google Patents

Abstract

フェノフィブラート又はその類似体を投与することによって神経変性を治療又は予防する方法が本明細書において提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照

本出願は、参照されることによりその全体が本明細書に組み入れられる２０１３年９月１８日出願の米国特許仮出願第６１／８７９５５３号の利益を主張する。

背景

神経変性疾患は孤発性又は家族性であり得、加齢に伴い発生数が増加する。したがって、人口の平均寿命が増えるにつれ、神経変性疾患の発生は増加する。米国人の４人に１人が生涯で神経変性状態を発症すると予想されている。しかしながら、一般的に、前記状態を引き起こす発症機序はよく理解されておらず、神経変性疾患を予防又は治療に利用できる有効な治療選択肢はほとんどない。

概要

本明細書では、神経細胞又は神経細胞の集団における増殖因子活性化受容体ガンマ活性化補助因子−１アルファ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ）（ＰＧＣ−１α）の発現を誘導する方法が提供される。この方法は、神経細胞（例えば、ニューロン又はグリア細胞）又は神経細胞の集団を有効量のフェノフィブラート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）又はその類似体と接触させるステップを含む。フェノフィブラート又はその類似体は、酸化ストレスの１若しくは複数の効果を減少させ、及び／又は１若しくは複数の抗炎症効果を提供する。加えて、フェノフィブラート又はその類似体は、リン酸化ＡＭＰＫのレベルを増加させ、ミトコンドリアの数を増加させ、及び／又は細胞生存度を増加させる。

本明細書ではまた、有効量のフェノフィブラート又はその類似体を対象に投与することによって対象の神経変性疾患を治療又は予防する方法が提供される。この方法は、中枢神経系の神経変性疾患である（例えば、疾患の初期である）対象又は中枢神経系の神経変性疾患のリスクのある対象を選択するステップを任意選択で含む。有効量のフェノフィブラート又はその類似体は、神経細胞におけるＰＧＣ−１αの発現を誘導する。この方法は、対象がコントロール対象（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｕｂｊｅｃｔ）と比較して減少したＰＧＣ−１α発現レベルを有すると判定するステップを任意選択で含む。このような判定ステップは、フェノフィブラート又はその類似体を投与する前、後、又は前後両方に行うことができる。

本明細書ではまた、神経保護を促進する薬剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、細胞を１又は複数のスクリーニングされる薬剤と接触させるステップと、細胞におけるＰＧＣ−１αのレベル又は活性を検出するステップと、を含む。ＰＧＣ−１αのレベル又は活性の増加は、薬剤が神経保護を促進することを示す。

本発明の１又は複数の実施形態の詳細を、添付図面及び以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１（Ｆｉｇｕｒｅ １Ａ〜１Ｃ）は、フェノフィブラートがＰＧＣ−１αのアップレギュレーションを誘導し、神経保護を提供することを示している。図１Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ａ）は、ＭＮ９Ｄ細胞をフェノフィブラートで４時間処理し、ＰＧＣ−１αの遺伝子発現を調べるために全ＲＮＡを抽出したときの結果を示す。ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡ発現の有意な倍増が、１０又は２０μＭフェノフィブラートで処理したＭＮ９Ｄ細胞で検出された（^＊、ｐ＜０．０５ 処理対未処理コントロール）。図１Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ｂ）は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ９６ウェルアッセイによって検出された、フェノフィブラートで処理したＭＮ９Ｄ細胞におけるミトコンドリア量の増加を示す。図１Ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ｃ）は、フェノフィブラートで４時間前処理し、６−ＯＨＤＡストレスを１２時間与えたＭＮ９Ｄ細胞の細胞生存度データを示している。細胞生存度は、ＭＴＳアッセイによって検出した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ 処理対未処理コントロール）。 図１（Ｆｉｇｕｒｅ １Ａ〜１Ｃ）は、フェノフィブラートがＰＧＣ−１αのアップレギュレーションを誘導し、神経保護を提供することを示している。図１Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ａ）は、ＭＮ９Ｄ細胞をフェノフィブラートで４時間処理し、ＰＧＣ−１αの遺伝子発現を調べるために全ＲＮＡを抽出したときの結果を示す。ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡ発現の有意な倍増が、１０又は２０μＭフェノフィブラートで処理したＭＮ９Ｄ細胞で検出された（^＊、ｐ＜０．０５ 処理対未処理コントロール）。図１Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ｂ）は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ９６ウェルアッセイによって検出された、フェノフィブラートで処理したＭＮ９Ｄ細胞におけるミトコンドリア量の増加を示す。図１Ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ １Ｃ）は、フェノフィブラートで４時間前処理し、６−ＯＨＤＡストレスを１２時間与えたＭＮ９Ｄ細胞の細胞生存度データを示している。細胞生存度は、ＭＴＳアッセイによって検出した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ 処理対未処理コントロール）。 図２（Ｆｉｇｕｒｅ ２Ａ及び２Ｂ）は、フェノフィブラートがＰＧＣ−１αのアップレギュレーションを誘導し、ＢＶ２細胞に抗炎症をもたらすことを示している。図２Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ２Ａ）は、フェノフィブラートで４時間前処理し、さらに４時間リポ多糖類（ＬＰＳ）を施したＢＶ２細胞におけるＰＧＣ−１αの発現レベルを示している。ＰＧＣ−１αの発現は、ＲＴ−ＰＣＲで決定した。（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ ＬＰＳ及びフェノフィブラート処理対ＬＰＳ処理（フェノフィブラート未処理））。図２Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ２Ｂ）は、ＢＶ２細胞におけるＩＬ−１βの発現を示している。（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ ＬＰＳ及びフェノフィブラート処理対ＬＰＳ処理（フェノフィブラート未処理））。 図３（Ｆｉｇｕｒｅ ３Ａ及び３Ｂ）は、ＰＧＣ−１αがフェノフィブラートの抗炎症効果を媒介していることを示している。ＢＶ２細胞を、ＰＧＣ−１αを標的とする２０ｎＭのｓｉＲＮＡと共に４時間インキュベーションし、続いて２０μＭのフェノフィブラートと共にさらに１８時間インキュベーションした。その後細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間処理した。図３Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ３Ａ）は、ＰＧＣ−１αの発現レベルを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ用に抽出された全ＲＮＡを示している。図３Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ３Ｂ）も同様に、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現レベルを示している。（＃＃ｐ＜０．００１対コントロール；＄＄ｐ＜０．００１対ＬＰＳ；^＊＊ｐ＜０．００１対ＬＰＳ＋Ｆｅｎｏ。Ｓｃｒ：スクランブル；ｓｏｌ：ｓｉＲＮＡ希釈液用のＲＮＡｉＭＡＸ溶液）。 図４（Ｆｉｇｕｒｅ ４Ａ及び４Ｂ）は、フェノフィブラートを媒介するＰＧＣ−１αのアップレギュレーション及び抗炎症効果に、ＰＰＡＲαが必要でないことを示している。ＢＶ２細胞は、様々な濃度（０．２５、０．５、１及び２μＭ）のＰＰＡＲαアンタゴニストＧＷ６４７１と共に０．５時間インキュベートし、続いて２０μＭのフェノフィブラートと共にさらに１８時間インキュベートした。その後細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間処理した。図４Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ４Ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲ用に抽出された全ＲＮＡから検出されるＰＧＣ−１αのｍＲＮＡ発現を示している。図４Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ４Ｂ）は、ＩＬ−１β（Ｂ）のｍＲＮＡ発現を示している。（^＊＊ｐ＜０．００１対コントロール；＃＃ｐ＜０．００１対ＬＰＳ）。 図５（Ｆｉｇｕｒｅ ５）は、フェノフィブラートがＰＧＣ−１αＷＴ（ＰＧＣ−１α＋／＋）及びＰＧＣ−１αノックダウン（ＰＧＣ−１α＋／−）マウス由来の初代ミクログリアにおけるＬＰＳ誘導性炎症を阻害することを示している。図５Ａ、Ｂ及びＣは、５、１０及び２０μＭのフェノフィブラートで一晩処理し、続いてＬＰＳで１時間処理した、ＰＧＣ−１αＷＴ（ＰＧＣ−１α＋／＋）マウス由来の初代ミクログリアの遺伝子発現データを示している。図５Ｄ、Ｅ及びＦは、５、１０及び２０μＭのフェノフィブラートで一晩処理し、続いてＬＰＳで１時間処理した、ＰＧＣ−１αノックダウン（ＰＧＣ−１α＋／−）マウスの遺伝子発現データを示している。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１β（図５Ａ及びＤ）、ＴＮＦα（図５Ｂ及びＥ）、及びＰＧＣ−１α（図５Ｃ及びＦ）の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した。^＊＊＊，ｐ＜０．０１，ＬＰＳ対ＤＭＳＯ；＃＃，ｐ＜０．０５，＃＃＃，ｐ＜０．０１，ＬＰＳ＋ｆｅｎｏ対ＬＰＳ，ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルス事後解析。 図５（Ｆｉｇｕｒｅ ５）は、フェノフィブラートがＰＧＣ−１αＷＴ（ＰＧＣ−１α＋／＋）及びＰＧＣ−１αノックダウン（ＰＧＣ−１α＋／−）マウス由来の初代ミクログリアにおけるＬＰＳ誘導性炎症を阻害することを示している。図５Ａ、Ｂ及びＣは、５、１０及び２０μＭのフェノフィブラートで一晩処理し、続いてＬＰＳで１時間処理した、ＰＧＣ−１αＷＴ（ＰＧＣ−１α＋／＋）マウス由来の初代ミクログリアの遺伝子発現データを示している。図５Ｄ、Ｅ及びＦは、５、１０及び２０μＭのフェノフィブラートで一晩処理し、続いてＬＰＳで１時間処理した、ＰＧＣ−１αノックダウン（ＰＧＣ−１α＋／−）マウスの遺伝子発現データを示している。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１β（図５Ａ及びＤ）、ＴＮＦα（図５Ｂ及びＥ）、及びＰＧＣ−１α（図５Ｃ及びＦ）の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した。^＊＊＊，ｐ＜０．０１，ＬＰＳ対ＤＭＳＯ；＃＃，ｐ＜０．０５，＃＃＃，ｐ＜０．０１，ＬＰＳ＋ｆｅｎｏ対ＬＰＳ，ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルス事後解析。 図６（Ｆｉｇｕｒｅ ６）は、フェノフィブラートがＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のリン酸化を高め、ＡＭＰＫを阻害すると、フェノフィブラートを媒介する抗炎症効果が弱まることを示している。図６Ａは、様々な用量のフェノフィブラートで１時間処理したＢＶ２細胞のウェスタンブロットにおけるリン酸化ＡＭＰＫのレベルを示す。図６Ｂは、ＡＭＰＫ阻害剤化合物Ｃで０．５時間処理し、続いてフェノフィブラートでさらに１時間処理したＢＶ２細胞培養物の溶解物のウェスタンブロットにおけるリン酸化ＡＭＰＫのレベルを示す。細胞溶解物はウェスタンブロッティング分析のために回収した。図６Ｃは、化合物Ｃで０．５時間処理し、続いてフェノフィブラートで一晩処理したＢＶ２細胞培養物のＩＬ−１βのレベルを示している。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１βの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した。^＊＊，ｐ＜０．０１，フェノフィブラート及びＬＰＳと比較，ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−コイルス事後解析。

詳細な説明

本明細書では、神経細胞又は神経細胞の集団におけるＰＧＣ−１αの発現を誘導する方法、神経変性疾患である対象又は神経変性疾患を発症するリスクのある対象を治療する方法、及び神経保護作用がある薬剤をスクリーニングする方法が提供される。

本発明より以前は、ＰＧＣ−１α活性のアップレギュレートは、一般的に、ＰＧＣ−１αを過剰発現する遺伝子送達によるものであった。しかしながら、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が媒介するＰＧＣ−１αの過剰発現は、ドーパミン作動性マーカーの選択的減少及び線条体のドーパミン量の減少を誘導した。重要なことに、ＡＡＶが媒介するＰＧＣ−１αの高発現は、ドーパミン作動性ニューロンの明らかな変性を導く。したがって、生理学的なレベルを超えるＰＧＣ−１αは、有害作用を引き起こす。ＰＧＣ−１αを誘導する薬理学的調節はＰＧＣ−１α発現又は活性を誘導し、さらに厳密に調整できる。このようなＰＧＣ−１αの薬理学的調節は、病理学的に調整されないＰＧＣ−１αの増加を抑え又は正常化するように調整できる。本発明の方法は、ＰＧＣ−１αの発現を薬理学的に調節することによって、ＰＧＣ−１αの活性の生理学的レベルを維持する手段を提供し、それによって、薬物用量及び治療でＰＧＣ−１αのレベルを安全に制御する。

神経細胞又は神経細胞の集団におけるＰＧＣ−１αの発現を誘導する方法は、細胞又は細胞の集団をフェノフィブラート又はその類似体と接触させるステップを含む。前記接触させるステップはインビボ又はインビトロのいずれかで行うことができる。任意選択で、ＰＧＣ−１αの誘導は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲ−α）又はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲ−γ）又は両方に非依存的である。

フェノフィブラート又はその類似体は、例えば、エキソビボ、インビトロ、及びインビボを含む数多くの手段で、神経細胞又は細胞の集団に投与することができる。インビボ投与は中枢神経系神経細胞又は末梢神経系神経細胞に直接行うことができる。したがって、インビボにおける接触は、対象が中枢神経系におけるＰＧＣ−１αのレベルが減少している又はそのリスクがある場合に有用であり得る。インビトロにおける接触は、例えば、移植のための細胞を処理するときに望まれ得る。神経細胞は、同じ又は異なる対象の神経系から外植することができ、幹細胞由来であってもよく、細胞株由来であってもよい。神経細胞は、脱分化し次いで神経細胞系譜に分化される非神経細胞由来であってもよい。このような細胞は人工多能性幹細胞であってもよい。フェノフィブラート又はその類似体は血液脳関門を通過するので、中枢神経系の神経細胞は、フェノフィブラート又はその類似体を対象に全身投与することによって、フェノフィブラート又はその類似体と接触することができる。しかしながら、フェノフィブラート又はその類似体は、例えば、局所注射、ポンプ、又は徐放性移植によって、髄腔内に投与することができる。

本明細書で使用される神経細胞は、ニューロン（ドーパミン作動性ニューロンを含む。）及びグリア細胞（アストロサイト、乏突起膠細胞、シュワン細胞、及びミクログリア）の両方を含む。任意選択で、神経細胞又は神経細胞の集団は中枢神経系細胞を含む。

理論によって限定される意味ではなく、ＰＧＣ−１αの誘導は、炎症の減少、ミトコンドリア生合成、ＡＭＰＫのリン酸化、細胞生存度の増加、及び酸化ストレスの減少と関連がある。炎症、ミトコンドリア機能障害及び酸化ストレスは、対象が神経変性疾患を発症する見込みが増えることが考えられ（例えば、環境での有害化合物への感受性が増加することによる。）、そのような疾患の進行を早めることがある。したがって、前記接触させるステップは、インビボ又はインビトロでの神経細胞の神経保護を促進することができる。

本明細書ではまた、神経変性障害である対象又は神経変性障害を発症するリスクのある対象を治療する方法が提供される。本明細書で提供される、神経変性疾患を治療又は予防する方法は、フェノフィブラート又はその類似体を対象に投与するステップを含む。任意選択で、前記方法は、中枢神経系の神経変性疾患である対象又は中枢神経系の神経変性疾患のリスクのある対象を選択するステップを含む。本発明の方法の利点の１つは、本方法は、疾患の初期段階にある対象の治療にも有用であることである。初期段階は、微細運動能力又は筋緊張での、初発症候である震え又はわずかな変化によって示され得る。パーキンソン病のさらなる症候は、例を挙げると、臭覚機能障害、睡眠障害、情緒変化、自律神経障害、異常な脳画像、血液及びＣＳＦマーカー、及び／又はＰＤ関連遺伝子変異（すなわち、ＬＲＲＫ２及びＳＮＣＡ）が挙げられる。神経変性疾患のリスクのある対象は、家族歴がある対象、遺伝子変異若しくはマーカーがある対象、又は原因物質に職業若しくは環境上さらされている対象を含む。したがって、例えば、ある毒性化合物又は反復的な激しい振動にさらされている対象は、神経変性疾患のリスクがあり得る。

神経変性疾患は、一般的に潜行性発症及び細胞死の進行及び機能損失を特徴とする。例を挙げると、このような疾患は、限定されないが、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、家族性認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、レビー小体型認知症、軽度認識障害、ピック病、レビー小体病、多系統委縮症、進行性核上性麻痺、筋萎縮性側索硬化症、及び網膜神経変性を含む。パーキンソンプラス症候群は、多系統委縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）からなる群より選択される。

フェノフィブラートはフィブラート化合物であり、内因性脂質異常症、高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症の治療に以前から使用されている。フェノフィブラートの調製は米国特許第４０５８５５２号明細書に開示されている。フェノフィブリン酸はフェノフィブラートの活性代謝物である。フェノフィブラートは水に溶解せず、消化（ＧＩ）管における吸収には限界がある。この問題を克服するために、代替製剤及び代替方法が用いられている。参照されることによりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第４８０００７９号明細書及び第４８９５７２６号明細書（微粉末化フェノフィブラート）；米国特許第６２７７４０５号明細書（錠剤又はカプセル内の顆粒形態の微粉末化フェノフィブラート）；米国特許第６０７４６７０号明細書（固体状の即時放出性微粉末化フェノフィブラート）；米国特許第５８８０１４８号明細書（フェノフィブラートとビタミンＥの組み合わせ）；米国特許第５８２７５３６号明細書（フェノフィブラートの可溶化剤としてのジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ））；及び米国特許第５５４５６２８号明細書（フェノフィブラートと１又は複数のポリグリコール化グリセリドとの組み合わせ）を参照されたい。多数の他の誘導体、類似体及び製剤が当業者に知られている。例えば、参照されることによりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第４０５８５５２号明細書に記載されている、ｐ−カルボニルフェノキシイソ酪酸の種々のエステルが使用できる。フェノフィブラート類似体は、米国特許第４８０００７９号明細書に定義されている類似体を含む。例を挙げると、ゲムフィブロジルは本明細書に開示されている方法に使用することができる。

フェノフィブラートは、適当な溶媒又は可溶化剤に任意選択で溶解させる。フェノフィブラートは多くの種々の可溶化剤に溶解することが知られており、例えば、陰イオン界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び非イオン界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、錯化剤（Ｎ−メチルピロリドン）である。フェノフィブラート又はフェノフィブラート誘導体の経口投与用にバイオアベイラビリティが改善されている液体及び半固体製剤が、参照されることによりその全体が本明細書に組み入れられる国際公開第２００４／００２４５８号に記載されている。

１日につき３００〜４００ｍｇの割合のフェノフィブラートでの長期治療が使用されているが、高濃度及び低濃度の使用は、対象の状態又は望ましいＰＧＣ−１αのレベルを考慮して妥当とすることができる。通常の成人のフェノフィブラート用量は１日につき３つのゼラチンカプセルであり、各カプセルは１００ｍｇのフェノフィブラートを含む。当業者は、有効量のフェノフィブラート又はその類似体を選択することによって、用量又は投与計画を選択することができる。このような有効量は、神経細胞のＰＧＣ−１αの発現を誘導する量、抗炎症性を有する量、酸化ストレスの１又は複数の効果を減少させる量を含む。加えて、有効量のフェノフィブラート又はその類似体は、リン酸化ＡＭＰＫのレベルを増加させ、ミトコンドリアの数を増加させ、細胞生存度を増加させる。

任意選択で、フェノフィブラート又はその類似体は毎日投与される。

フェノフィブラート又はその類似体を用いる治療方法は、対象に第２の治療剤を投与するステップをさらに含むことができる。第２の治療剤は、例えば、レバドパ、ドーパミンアゴニスト、抗コリン剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、アマンタジン、リバスチグミン、ＮＭＤＡアンタゴニスト、コリンエステラーゼ阻害剤、リルゾール、抗精神病薬、抗うつ剤及びテトラベナジンからなる群より選択される。

神経変性疾患である対象又は神経変性疾患を発症するリスクのある対象を治療する方法はまた、任意選択で、フェノフィブラート又はその類似体を投与する前、間及び／又は後に多くの様々な試験を含む。例えば、対象がコントロールレベルと比較して減少したＰＧＣ−１α発現又は活性レベルを有するかどうかを判定するために、対象を試験することができる。ＰＧＣ−１αのレベルの減少は、フェノフィブラート又はその類似体を患者に投与すべきであること、用量の増加又は投与回数の増加が必要であること、又はフェノフィブラート又はその類似体が十分な治療でなく、フェノフィブラート又はその類似体と組み合わせて、補助剤又は治療剤を投与すべきであることを示すことができる。

前記方法は、任意選択で、神経変性疾患である対象又は神経変性疾患を発症するリスクのある対象を選択するステップを含む。当業者であれば、神経変性疾患である対象又は神経変性疾患を発症するリスクのある対象を診断する方法を知っている。例えば、次の試験のうちの１又は複数を使用することができる：遺伝子検査（例えば、ＴＤＰ−４３遺伝子における変異の同定）又は家族の分析（例えば家族歴）、中枢神経系イメージング（例えば、磁気共鳴映像法及びポジトロン放出断層撮影）、臨床試験若しくは行動試験（例えば、筋力低下、震え、筋緊張、運動技能、又は記憶の評価）、又は臨床検査。

ＰＧＣ−１αの誘導及び活性を測定する方法は当技術分野で知られており、以下の例で提供されている。例えば、Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ａ ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｏｂｏｔｉｚｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｓｓａｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ＰＧＣ−１α ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ：７：ｅ４６７５３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６７５３．３を参照されたい。ＰＧＣ−１αのレベルは、例えば、ＰＧＣ−１αに対する抗体又は他の検出手段を使用して直接評価することができる。ＰＧＣ−１αの活性は、例を挙げると、ミトコンドリア機能（例えば酸化的代謝）の調節の評価をすることによって検出することができ、ミトコンドリア遺伝子（例えばＬＤＨ−２、ＡＴＰ５ｊ等）の活性又は発現を検出することによって評価することができる。

全体を通じて使用される「有効量」という用語は、望まれる生理的応答を起こすために必要又は十分な量として定義される。例を挙げると、フェノフィブラート又はその類似体の全身用量（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｏｓａｇｅ）は、毎日１〜１０００ｍｇが可能であり、例えば毎日３００〜４００ｍｇ（例えば、１〜５用量で投与される。）が挙げられる。当業者は下記に示す通り、阻害剤の特定の特徴、治療を受ける対象、投与形態、治療又は予防される疾患のタイプ及び重症度等を基に、用量を調整するであろう。さらに、治療期間は、数日間、数週間、数ヶ月間、数年間、又は対象の寿命期間であってもよい。例えば、神経変性疾患である対象又は神経変性疾患を発症するリスクのある対象への投与は、効果が持続し、副作用が管理できる限り、数週間、数ヶ月間、又は数年間に少なくとも毎日（例えば、１日につき１回、２回、３回）行ってもよい。

フェノフィブラート又はその類似体を投与するための有効量及びスケジュールは、経験に基づいて決定することができ、このような決定は当分野の技術範囲内である。投与の用量範囲は、疾患又は障害の１又は複数の症状に影響を与える望ましい効果（例えば、減少させる効果又は遅延させる効果）が生じるために十分多い範囲である。用量は、相当有害な副作用（例えば望まない交差反応や細胞死等）を引き起こす程の多量にするべきではない。一般的に用量は、神経変性疾患のタイプ、対象の種、年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事、投与の形態及び時間、排泄速度、複合薬、並びに特定の病状の重症度によって変化し、当業者であれば決定することができる。用量は、禁忌のときに、個々の医者によって調整することができる。用量は変化させることができ、毎日１又は複数の用量投与で投与することができる。

本開示はまた、パッケージ及び／又は１若しくは複数の医薬組成物の成分が充填された１又は複数の容器を含む医薬包装又はキットを提供する。任意選択で、医薬包装又はキットは上述の第２の治療剤（例えばＬ−ドーパ）を含む。組成物の使用のための使用説明書も含むことができる。

本明細書ではまた、薬学的に許容される担体に有効量のフェノフィブラート又はその類似体を含む医薬組成物が提供される。担体という用語は、化合物、組成物、物質、又は構造物を意味し、それは、化合物又は組成物と組み合わせるとき、その意図される使用又は目的のために、調製、保管、投与、送達、有効性、選択性、又は化合物若しくは組成物の他の任意の特徴も補助し、又は促進する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小にし、及び対象における任意の有害な副作用を最小にするために選択することができる。このような薬学的に許容される担体は、無菌である生体適合性の医薬担体（生理食塩水、緩衝生理食塩水、人工大脳髄液、デキストロース、及び水が挙げられるが、これらに制限されない。）を含む。

投与の意図された態様によると、医薬組成物は、固体、半固体、液体の剤形の形態であることができ、例えば、錠剤、坐薬、ピル、カプセル、粉末、液体、エアゾール、又は懸濁液であり、正確な用量の単独投与に適した単位剤形が好ましい。組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療上有効な量である本明細書に記載の化合物又はその誘導体を含み、さらに、他の薬剤、医薬剤、担体、又は希釈剤を含むことができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない材料であって、許容されない生物学的効果を引き起こさない又はそれが含まれる医薬組成物の他の成分と有害な相互作用をしない、選択された化合物と共に個体に投与することができる材料であることを意味する。

本明細書で使用される担体という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、又は医薬製剤に用いられ、当技術分野で知られている他の材料を含む。組成物に使用する担体の選択は、その組成物の意図する投与経路に依存するであろう。これらの材料を含む薬学的に許容される担体及び製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｐａ．，２００５に記載されている。生理学的に許容される担体の例は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及び他の有機酸の緩衝液）；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン）；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）；塩形成性対イオン（例えばナトリウム）；及び／又は非イオン性界面活性化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；ブリッジウォーター，ニュージャージー）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ（ＢＡＳＦ；フローラ パーク，ＮＪ））を含む。

本明細書に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグを含む、非経口注射に適した組成物は、生理学的に許容される無菌水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液へと再構成するための無菌の粉末を含むことができる。適した水性及び非水性の担体、希釈剤、溶剤又は媒体の例は、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、これらの適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液の場合は要求される粒径を維持することによって、及び界面活性化剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び調剤のような補助剤も含むことができる。微生物の活動の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等）により促進することができる。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム等）も含むことができる。注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン等）の使用によってもたらされ得る。

本明細書に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグの経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒を含む。このような固体剤形では、本明細書に記載の化合物又はその誘導体は、少なくとも１つの慣用の不活性賦形剤（又は担体）と共に混合されている。不活性賦形剤（又は担体）は、例えば、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム、又は（ａ）充填剤又は増量剤（例えば、スターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸）、（ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシア）、（ｃ）保湿剤（例えばグリセロール）（ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ポテトスターチ又はタピオカスターチ、アルギン酸、特定のケイ酸錯塩、及び炭酸ナトリウム）、（ｅ）溶液遅延剤（例えばパラフィン）、（ｆ）吸収促進剤（例えば第４級アンモニウム化合物）、（ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、（ｈ）吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト）、及び（ｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、或いはそれらの混合物である。カプセル、錠剤、及びピルの場合、剤形は緩衝剤を含むこともできる。

類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤及び高分子量のポリエチレングリコール等を用いてソフト及びハード充填ゼラチンカプセル内の充填剤として使用することもできる。

錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒のような固体剤形は、コーティング及びシェル化、例えば、腸溶コーティング及び当技術分野で知られている他のコーティングによって調製可能である。それらは乳白剤を含むことができ、活性化合物を放出する又は腸管の特定の部分において遅延形態で化合物を放出する組成物となることもできる。使用可能な包埋組成物は高分子物質及びワックスである。活性化合物は、上述の１又は複数の賦形剤を適宜含むマイクロ封入形態のものとすることもできる。

本明細書に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグの経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤のような、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含むことができ、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、又はこれらの物質の混合物等である。

不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、及び香料のような補助剤も含むことができる。

懸濁液には、活性化合物に加えて補助剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、又はそれらの物質の混合物等を含むことができる。

本明細書に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグを含む、直腸投与用の組成物は、任意選択で坐薬であり、それは、化合物を、ココアバター、ポリエチレングリコール、又は坐薬ワックスのような適当な非刺激賦形剤又は担体と混合することによって調製することができる。常温では固体であるが、体内温度で液体になることによって直腸又は膣腔内で溶解し、活性成分を放出する。

本明細書ではまた、細胞を、スクリーニングされる薬剤と接触させるステップと、細胞のＰＧＣ−１αレベル又は活性を検出するステップと、を含み、ＰＧＣ−１αレベル又は活性の増加は神経保護を促進する薬剤であることを示す、神経保護を促進する薬剤をスクリーニングする方法が提供される。細胞は、任意選択で、ニューロン、グリア細胞、又は単核血球である。

全体を通して使用されている「コントロール」とは、神経変性疾患ではない対象の値又は神経変性疾患ではない対象集団の典型的な既知のコントロール値を意味する。上述のいくつかの場合、コントロール値は、神経変性疾患を発症する前又はそれによって治療を開始する前の同じ対象から得ることができる。

全体を通して、「治療する」及び「治療」とは、神経変性疾患の１又は複数の影響又は症状を減少させる又は遅延させる方法を意味する。対象は疾患であると診断することができる。治療は、単なる症状よりむしろ潜在する病状を減少させる方法も意味することができる。対象への投与の効果は、制限されることなく、神経変性疾患若しくは障害の１若しくは複数の症状の減少、神経の疾患若しくは傷の重症度の減少、神経の疾患若しくは傷の完全な除去、又は１若しくは複数の症状の発症若しくは悪化の遅延を含む。例えば、開示されている方法は、治療前の対象と比較するとき、若しくはコントロール対象又はコントロール値と比較するとき、対象の疾患の１又は複数の症状が約１０％減少している場合、治療であると考えられる。つまり、その減少は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はその間の任意の量の減少であり得る。

本明細書において使用されている、「予防する」又は「予防」とは、神経変性疾患又は１若しくは複数のその症状の発症、発生、重症化、又は再発を不可能にする、遅延させる、防ぐ、未然に防ぐ、未然に妨げる、止める、又は妨げる方法を意味する。例えば、開示されている方法は、フェノフィブラート又はその類似体を投与しなかった、神経変性の疑いがあるコントロール対象と比較して、神経変性の疑いがある対象で、神経変性又は神経変性の１若しくは複数の症状（例えば、震え、虚弱、記憶喪失、硬直、痙攣、萎縮）の発症、発生、重症化、又は再発の減少又は遅延がある場合、予防であると考えられる。開示されている方法は、治療を受ける前の対象の進行と比較して、フェノフィブラート又はその類似体を受けた後に、神経変性の疑いがある対象で、神経変性又は神経変性の１若しくは複数の症状の発症、発生、重症化、又は再発の減少又は遅延がある場合、予防であるとも考えられる。したがって、神経変性の発症、発生、重症化、又は再発の減少又は遅延は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はその間の任意の量の減少であり得る。

全体を通して使用されている「対象」とは、個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）を意味する。対象は霊長類のような哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。非ヒト霊長類も対象である。対象という用語は、ネコ、イヌ等のような飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）及び実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモット等）を含む。したがって、獣医学的使用及び医学製剤は本明細書に企図されている。

開示された方法及び組成物に使用される、それらと共に使用される、それらの調製に使用される、又はそれらの生産物である、材料、組成物、及び成分が開示されている。これらの材料及び他の材料は、本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等は開示されていること、これらの化合物の各々の様々な個別的及び集合的組み合わせ及び順列の具体的な参照は明示的に開示されていないこともある一方、各々は、具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び論じられ、本方法に含まれる多数の分子にされ得る多数の改変が論じられている場合、方法の各々の、かつすべての組み合わせ及び順列並びに可能な改変は、そうでないことが具体的に示されていない限り、具体的に企図されている。このように、これらの任意のサブユニット又は組み合わせも、具体的に企図され、開示されている。この概念は、開示された組成物を使用する方法のステップを含むが、制限されることなく、この開示のすべての側面に当てはまる。したがって、行うことができる様々の付加的なステップがある場合、これらの付加的なステップの各々は開示された方法の任意の具体的な方法のステップ又は方法のステップの組み合わせと共に行うことができること、及びこのような組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々が具体的に企図され、開示されたものと考えられるべきであることが理解される。

本明細書で引用されている刊行物及びそのためにそれらが引用されている資料は、参照されることによりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。多くの実施形態について記載した。それにもかかわらず、様々な改変を加えうることが理解されよう。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲に包含される。

実施例１：
ＦＤＡによって承認され、血液のコレステロールレベルを減少させる薬物であるフェノフィブラートを、ＰＧＣ−１αの遺伝子発現を誘導できる分子として使用した。ドーパミン作動性ニューロン細胞株ＭＮ９Ｄで、フェノフィブラートは用量依存的にＰＧＣ−１αを増加させ（図１Ａ，左上のパネル）、ミトコンドリア量のわずかな増加を促進した（図１Ｂ）。さらに、フェノフィブラートは、ＭＮ９Ｄ細胞を６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）誘導性酸化ストレス媒介細胞死から確実に保護した（図１Ｃ）。同様に、フェノフィブラートはミクログリア細胞株ＢＶ２でも、用量依存的にＰＧＣ−１αの遺伝子発現を誘導し（図２Ａ）、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１βアップレギュレーションを顕著に阻害した（図２Ｂ）。さらに、ＰＧＣ−１αのｓｉＲＮＡノックダウンを用いると、ＰＧＣ−１αの遺伝子発現（図３Ａ）及びＩＬ−１βの遺伝子発現（図３Ｂ）の減少が示されているように、ＢＶ２細胞におけるフェノフィブラート媒介抗炎症効果にはＰＧＣ−１αが必要であることが示された。ＰＰＡＲαのアンタゴニストであるＧＷ６４７１は、ＢＶ２細胞におけるフェノフィブラートを媒介するＰＧＣ−１αのアップレギュレーション及び抗炎症効果を抑制することができず（図４）、このことはＢＶ２細胞におけるフェノフィブラートの効果がＰＰＡＲα非依存的であることを示唆している。

試薬：
フェノフィブラートは、Ｓｉｇｍａから購入した（Ｃａｔ＃Ｆ６０２０）。ＰＰＡＲαアンタゴニストは、Ｓｉｇｍａから購入した（Ｃａｔ＃Ｇ５０４５）。ＩＬ−１β（Ｍｍ００４３４２２８−ｍ１）及びＰＧＣ−１αＲＴ−ＰＣＲアッセイは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。細胞培養試薬もＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。

細胞培養：
マウス中脳細胞株であるＭＮ９Ｄは、フェノフィブラートの神経保護効果を評価するために使用した。ＭＮ９Ｄ細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。ＢＶ−２細胞（マウスミクログリア）は、１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）が添加されたＤＭＥＭで維持された。抗生物質はフェノフィブラート評価研究において除いた。

実施例２：
フェノフィブラートは血液脳関門を通過し、パーキンソン病（ＰＤ）に影響を与える中脳ドーパミン作動性ニューロンにおいて神経保護効果を発揮する。フェノフィブラート媒介ＰＧＣ−１αアップレギュレーションは、ＰＤのようなＰＧＣ−１α欠失及びミトコンドリア機能障害と関連する神経変性疾患に対して安全及び有効な介入であると断定される。

ＰＧＣ−１αアップレギュレーションを媒介するフェノフィブラートの神経保護効果は、ＰＤであるＭＰＴＰ毒性マウスモデルで評価される。ＭＰＴＰは、ＰＤモデルで広く用いられる強い神経毒性剤である。ＭＰＴＰは、ミトコンドリア複合体Ｉを阻害し、ＲＯＳを誘導し、細胞死を引き起こす。急性、亜急性及び慢性の、主に３タイプのＭＰＴＰ中毒プロトコールがある。有力な証拠によって、１４日慢性ＭＰＴＰｉ．ｐ．注入プロトコールが、初期ＰＤの病理学的な特徴をさらに正確に再現することが示唆されている。したがって、慢性ＭＰＴＰ毒性モデルでの、小分子ＰＧＣ−１α活性化剤の前臨床評価は、ＰＤの早期介入に対するミトコンドリアストラテジー（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ）の開発に重要である。トランスジェニックマウスが使用され、それらは野生型又はＰＧＣ−１α遺伝子に対してヘミ接合（ＰＧＣ−１α＋／−）であり、Ｎｒｆ１ａ，ｂ／Ｎｒｆ２媒介転写応答（抗酸化応答エレメント駆動ヒト胎盤型アルカリフォスファターゼ発現；ＡＲＥｈＰＬＡＰ）を伝達する導入遺伝子をも保有する（３３）。Ｎｒｆ１／Ｎｒｆ２転写はＰＧＣ−１αの下流にあり、ＩＩ型抗酸化応答を媒介する。正常にＰＧＣ−１αを発現するトランスジェニックＡＲＥｈＰＬＡＰマウス（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンド）、又はＰＧＣ−１α発現が欠損しているユニーク化合物トランスジェニックマウス（ＡＲＥｈＰＬＡＰ：：ＰＧＣ−１α＋／−；Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンド）はＭＰＴＰ毒性モデリングに使用される。ＡＲＥｈＰＬＡＰマウスは、ｈＰＬＡＰの測定によって脳の領域に影響を与える酸化ストレスの容易なモニタリングを可能にする。ＡＲＥｈＰＬＡＰ：：ＰＧＣ−１α＋／−マウスを使用すると、内因性ＰＧＣ−１αの遺伝的相補性が半分の状況の、ＰＧＣ−１α発現の生理学レベルのフェノフィブラート回復研究が可能になる。予防及び保護はＰＤである慢性ＭＰＴＰ中毒マウスモデルで評価される。予防介入を試験するために、トランスジェニックＡＲＥｈＰＬＡＰ又はＡＲＥｈＰＬＡＰ：：ＰＧＣ−１α＋／−マウス（すべてＣ５７ＢＬ／６）に、様々な用量（０、１、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ）の経口フェノフィブラート又は管理された胃管栄養法のいずれかで２８日間治療をする。フェノフィブラート治療を始めてから１０日後、マウスに、１４日間浸透性ミニポンプ（１４−ｄａｙ ｏｓｍｏｔｉｃ ｍｉｎｉ−ｐｕｍｐ）をｉ．ｐ．に埋め込む（生理食塩水コントロール：ｎ＝１６；ＭＰＴＰ，４６ｍｇ／ｋｇ／日：ｎ＝１６）。ＭＰＴＰ注入開始の１日前及び１８日後の運動協調性は加速ローターロッドトレッドミルで試験し、ＭＰＴＰ注入開始の１日前及び１８日後の水平及び垂直運動を検出するために、ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｄｉｇｉｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍによってマウスの運動をモニターする。１日後に動物を屠殺し、脳を組織病理学的評価のために摘出した。脳のサブセット（ｎ＝８／群）を固定し、免疫化学分析用に切片に切る。ドーパミン（ＤＡ）ニューロン数及び末梢を決定するために、ＳＮ及びＳＴＲ領域を含む脳の切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）で染色し、続いてＳＮでのＤＡニューロンの立体的計数（ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）、並びにコンピューターを使ったイメージ解析システム及び立体解析ソフトウェアを使用してＳＴＲのＴＨ密度の測定を行う。ＴＵＮＥＬ染色を行い、アポトーシスニューロン細胞死を決定する。グリア活性化プロファイルを特徴付けるために、ＳＮのミクログリア（Ｉｂａ１ ＩＨＣ）及びアストロサイト（ＧＦＡＰ ＩＨＣ）の免疫染色を利用する。酸化ストレス応答は、ｈＰＬＡＰ ＩＨＣによって決定する。（ＩＩ）。脳の他のサブセット（ｎ＝８／群）は、ＤＡ（及び代謝産物）量（ＳＴＲ及びＳＮのＨＰＬＣ測定）；ＰＧＣ−１α発現（ウェスタンブロット）；アポトーシスタンパク質レベル（開裂カスパーゼ−３、ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−２及びＢａｘのウェスタンブロット）；ストレス応答／生存遺伝子（ＰＫＣ、ＬＲＧ−１２、ｇａｄｄ４５−β、ＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、及びＶＩＰ）；酸化及び抗酸化遺伝子（ＳＯＤ、Ｃａｔ、ＮＱＯ１、ＧＳＴ、Ｎｒｆ２）；及び炎症誘発性又は抗炎症遺伝子（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α，ＮＯＳ−ＩＩ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＲ２、アルギナーゼ、Ｍｍｒ、及びＩＬ１０）発現（ＴａｑＭａｎ＠ｐＲＴ−ＰＣＲアレイ；３８４ウェルＭｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｄｓ）の生化学及び神経化学アッセイ用に、ＳＴＲ及びＳＮを顕微解剖する。ｈＰＬＡＰは、ウェスタン及びｑＲＴＰＣＲで定量する。ウェスタンブロッティングからの免疫反応性シグナルは、Ｇｅｌ−Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）で定量する。

保護介入のために、動物に１４日のＭＰＴＰ注入（生理食塩水コントロール：ｎ＝１６；ＭＰＴＰ、４６ｍｇ／ｋｇ／日：ｎ＝１６）を行い、その後２８日間経口薬物の投与治療（０、１、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ）を開始する。治療の機能転帰は、ＭＰＴＰ注入を開始する１日前及び４１日後の、ローターロッド動作及び運動活性を比較することによって評価する。１日後動物を屠殺し、上述の通り、ＰＧＣ−１α、第ＩＩ相解毒遺伝子、ミトコンドリア機能及び炎症誘発性／抗炎症遺伝子のプロファイリング、ＰＧＣ−１α及びｈＰＬＡＰタンパク質発現、並びにＳＮチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性ニューロン及びＳＴＲのＴＨ密度の計数（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を含む死後神経病理学的分析のために脳を摘出する。

ローターロッド動作：
運動協調性は、加速Ｒｏｔａ−Ｒｏｄトレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）で試験する。マウスは３０秒間、５ｒｐｍの一定速度で試験し、その後速度は１秒当たり０．１回転加速させることができる。各マウスがロッドから落ちる時間を自動的に記録する。

運動活性：
マウスの運動は、水平運動及び垂直運動を検出するために、ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｄｉｇｉｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）でモニターした。コンピューターによって収集されたデータは、多くの水平運動、多くの垂直運動及び全移動距離を含む。

免疫組織化学：
中脳全体の連続凍結切片（３０μｍ）の吻端から尾方端までを切断し、ＴＨ、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１抗体で免疫染色し、続いて対応する２次抗体で免疫染色し、標準ＡＢＣ法を行う。無作為に細胞を数えるため、Ｓｔｅｒｅｏ−Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＶＴ）を用いた解剖技術を利用して、ＳＮのＴＨ陽性ニューロンの数を推定する。

ＴａｑＭａｎ微小流体ｑＲＴ−ＰＣＲ：
ＲＮＡは、夾雑ゲノムＤＮＡを分解するために、ＲＱ１ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理し、続いてフェノール：クロロホルム抽出及びエタノール／ＬｉＣｌ沈殿を行う。ＲＮＡの整合性は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ技術（ＬＣＣＣ；ジョージタウン大学メディカルセンター）を用いて決定する。１マイクログラムの全ＲＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔの１００μｌ反応液で逆転写する。ｃＤＮＡの質は、β−アクチンのＰＣＲによって確認する。各サンプルの１０μｌのアリコートｃＤＮＡを、９０μｌのＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘに加え、標的遺伝子（ＰＫＣ、ＬＲＧ−１２、ｇａｄｄ４５−β、ＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びＶＩＰ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＮＯＳ−ＩＩ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＣＣＲ２、アルギナーゼ、Ｍｍｒ、及びＨｅｓ１）及び１つの内因性コントロール（１８ｓＲＮＡ）のプローブ及びプライマーがプレロードされている、Ｔａｑｍａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｄにロードする。リアルタイムＰＣＲ反応をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実行する。その結果は、相対定量ΔΔＣＴ法で解析し、サンプルを処理コントロール（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）で標準化する。

生化学アッセイ：
（１）ＳＴＲ ＤＡレベルの決定は、ＨＰＬＣ測定により行う。（２）細胞死検出キットは、ＴＵＮＥＬアッセイのために使用する。（３）ＲＥＴ及びＡＫＴのリン酸化、アポトーシスタンパク質のレベル（ＳＮ組織の開裂カスパーゼ−３、ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−２及びＢａｘ）は、ウェスタンブロットで決定する。（４）ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、及びＶＩＰは、ＥＬＩＳＡで決定する。

実施例３：
フェノフィブラートは、用量依存的に、ミクログリア細胞株ＢＶ２におけるＰＧＣ−１α遺伝子発現を誘導し、ＬＰＳ媒介炎症誘発性サイトカインＩＬ−１βの産生を阻害する。さらに、ＰＧＣ−１αのｓｉＲＮＡノックダウンを用いると、ＢＶ２細胞におけるフェノフィブラート媒介抗炎症効果にはＰＧＣ−１αが必要であることが明らかになっている。ｓｉＲＮＡはＰＧＣ−１α遺伝子発現を部分的にのみノックダウンしていると考えると、ホモ接合及びヘテロ接合のＰＧＣ−１αノックアウトマウス（ＰＧＣ−１α−／−及びＰＧＣ−１α−／＋）由来の初代ＣＮＳ細胞の使用は、フェノフィブラート効果を媒介するＰＧＣ−１αの不可欠な役割のさらなる決定的証拠を提供する。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂ６．１２９−ＰｐａｒｇｃｌａｔｍｌＢｒｓｐ／Ｊ）（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）からのヘテロ接合ＰＧＣ−１αノックアウトマウス（ＰＧＣ−１α−／＋）を交配し（ＰＧＣ−１α−／＋×ＰＧＣ−１α−／＋）、ヘテロ接合及び野生型である出生後のマウスから初代ミクログリア細胞を単離し、培養した。細胞を様々な濃度のフェノフィブラートで一晩処理し、続いて０．１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１時間処理した。全ＲＮＡを単離し、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β及びＴＮＦαの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで決定した。これらの結果は、フェノフィブラートはＷＴ（ＰＧＣ−１α＋／＋）及びヘテロ接合（ＰＧＣ−１α＋／−）初代ミクログリアの両方で、同様の抗炎症保護効果を発揮していることを示した（図５Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥ）。

試薬：
培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む組織培養の材料は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。大腸菌ＬＰＳからのリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａから購入した（Ｃａｔ＃Ｌ６５２９）。抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。

細胞培養：
新生児マウス（１日齢；ＰＧＣ−１α＋／＋又はＰＧＣ−１α＋／−）の大脳皮質から髄膜を剥き、Ｈｅｐｅｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で細かく切った。細胞を、アール塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔ）、ｌ−グルタミン、０．０１％ピルビン酸塩、０．６％グルコース、４％ウシ胎仔血清、及び６％ウマ血清（完全培地）を含む最小必須培地（ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）中で分離し、遠心分離、再懸濁し、１つのＴ７５フラスコにつき１つの脳の密度で、１０ｍｌの完全培地を含むフラスコにプレートした。培養は、３７℃、５％ＣＯ_２下で行った。１日後、細胞残屑を除去するためにフラスコを静かに軽くたたき、培地を除去し、新しい完全培地に置換した。培養を上述のとおり約１２日間行い、フラスコを軽くたたき、ミクログリアを多く含む培地を回収することによってミクログリアを採取した。ミクログリアは、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）によりペレットにし、０．０１％ピルビン酸塩、０．６％グルコース、及び５％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭで再懸濁し、計数した。

ＢＶ−２細胞（マウスミクログリア）は、１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地で維持された。抗生物質は、フェノフィブラート評価研究のために除かれた。

実施例４：
ＡＭＰＫはエネルギーセンサーであり、ＰＧＣ−１αをリン酸化できる。ＡＭＰＫがＰＧＣ−１αをリン酸化し、そしてＰＧＣ−１αが自らの遺伝子発現を増やすために筋細胞エンハンサー因子（ＭＥＦ）結合部位に結合し、正のフィードバックを介して作用することはもっともらしい。したがって、ＡＭＰＫシグナル経路がＣＮＳ細胞でフェノフィブラート効果の媒介に関与しているかを判定するために、ＢＶ２細胞を様々な用量のフェノフィブラートで１時間処理し、その後ウェスタンブロッティング分析用に細胞溶解物を回収した。ＡＭＰＫリン酸化は用量依存的に、フェノフィブラート処理に応じて増加した（図２Ａ）。次に、ＢＶ２細胞をＡＭＰＫ阻害剤化合物Ｃで０．５時間処理し、続いてさらに１時間フェノフィブラート処理を行った。ＡＭＰＫリン酸化への化合物Ｃの濃度依存的な阻害効果が確認された（図２Ｂ）。ＢＶ２細胞におけるフェノフィブラート媒介抗炎症への化合物Ｃの阻害効果を試験した。ＢＶ２細胞培養液に化合物Ｃを加えて０．５時間後、一晩のフェノフィブラート処理を行った。化合物Ｃは用量依存的に、ＢＶ２細胞におけるフェノフィブラートの抗炎症効果を弱めた（図２Ｃ）。これらのデータは、ＣＮＳ細胞において、ＡＭＰＫ活性化が媒介フェノフィブラート効果に役割を果たしていることを示唆している。

本発明の多くの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な改変を加えうることが理解されよう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲に包含される。

Claims (25)

1. 神経細胞におけるＰＧＣ−１αの発現を誘導する方法であって、神経細胞又は神経細胞の集団を有効量のフェノフィブラート又はその類似体と接触させるステップを含む方法。
2. 前記接触させるステップがインビボである、請求項１に記載の方法。
3. 前記接触させるステップがインビトロである、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＰＧＣ−１αの誘導がＰＰＡＲα非依存的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記神経細胞又は神経細胞の集団が１又は複数のニューロンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記１又は複数のニューロンがドーパミン作動性ニューロンである、請求項５に記載の方法。
7. 前記神経細胞又は神経細胞の集団が１又は複数のグリア細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記有効量が酸化ストレスの１又は複数の効果を減少させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記有効量がリン酸化ＡＭＰＫのレベルを増加させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記有効量がミトコンドリアの数を増加させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記有効量が神経細胞の生存度を増加させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記有効量が抗炎症効果を提供する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
13. 対象における神経変性疾患を治療又は予防する方法であって、
    神経変性疾患である対象又は神経変性疾患のリスクのある対象を選択するステップと、
    前記対象に有効量のフェノフィブラート又はその類似体を投与するステップと、
    を含む方法。
14. 前記対象が初期の神経変性疾患を有する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記神経変性疾患が、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、家族性認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、レビー小体型認知症、軽度認識障害、網膜神経変性、及び筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記パーキンソンプラス症候群が、多系統委縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記フェノフィブラート又はその類似体が全身投与される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記フェノフィブラート又はその類似体が経口投与される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記有効量のフェノフィブラート又はその類似体が神経細胞におけるＰＧＣ−１αの発現を誘導する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記フェノフィブラート又はその類似体が毎日投与される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記対象に第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第２の治療剤が、レバドパ、ドーパミンアゴニスト、抗コリン剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、アマンタジン、リバスチグミン、ＮＭＤＡアンタゴニスト、コリンエステラーゼ阻害剤、リルゾール、抗精神病薬、抗うつ剤、及びテトラベナジンからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記対象がコントロール対象と比較して減少したＰＧＣ−１α発現レベルを有すると判定するステップをさらに含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 神経保護を促進する薬剤をスクリーニングする方法であって、
    細胞を、スクリーニングされる薬剤と接触させるステップと、
    前記細胞におけるＰＧＣ−１αレベル又は活性を検出するステップと、
    を含み、
    ＰＧＣ−１αレベル又は活性の増加は前記薬剤が神経保護を促進することを示す、
    方法。
25. 前記細胞がニューロン、グリア細胞、又は血単核細胞である、請求項２４に記載の方法。

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