KR101883929B1 - Ｐｕ.１ 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이를 이용한 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, PU.1 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA, 이를 포함하는 가이드 RNA 벡터, 상기 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터를 이용한 PU.1 넉아웃(knockout) 생쥐 미세아교세포주의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주와 이를 이용한 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법, 및 상기 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 가이드 RNA를 이용하여 제조한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주는 PU.1 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 미세아교세포에서의 PU.1 유전자의 기능 연구를 기반으로 하여 신경퇴행성 질환 치료제 탐색에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA를 이용하여 제조한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주는 PU.1 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 미세아교세포에서의 PU.1 유전자의 기능 연구를 기반으로 하여 신경퇴행성 질환 치료제 탐색에도 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이를 이용한 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, PU.1 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA, 이를 포함하는 가이드 RNA 벡터, 상기 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터를 이용한 PU.1 넉아웃(knockout) 생쥐 미세아교세포주의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주와 이를 이용한 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법, 및 상기 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환으로, 발병이나 진행 기전에 관한 구체적인 이해가 부족하여 근본적인 치료법이 없는 상황이다.
중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 미세아교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendroc ytes)의 세 종류로 구성되어 있다.
이들 중에서 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(central nervous system, CNS)에 상재하는 조직-상주 대식세포(tissue-resident macrophage)로, CNS에서 조직 손상에 대해 초기 대응에 관여하는 중요한 역할을 한다. 하지만 비정상적으로 과다 활성화된 미세아교세포는 NO(nitric oxide) 또는 슈퍼옥사이드(superoxide), 전염증성 인자(pro-inflammatory factors)인 IL-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α), MCP-1(monocyte chemoattractant protein) 등과 같은 케모카인(chemokines)과 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)를 포함하는 세포독성 및 염증 유도 인자들의 발현과 생성을 촉진하여 만성염증성질환 발달에 기여하게 된다(Sawada M. et.al, Brain Res., 1989, 491: 394-397; Kriz J., Crit Rev Neurobiol ., 2006, 18: 145-157; Hailer NP., Prog Neurobiol ., 2008, 84: 211-233; Monji A. et.al, Psychiatry Clin Neurosci., 2009, 63: 257-265). 특히 미세아교세포는 LPS(lipopolysaccharide), 베타-아밀로이드(β-amyloid), 트롬빈(thrombin), IFN-γ(interferon-γ) 등에 의해 활성화 되고, 비정상적으로 활성화된 미세아교세포에 의한 염증 매개물의 분비는 면역계의 항상성을 교란시켜서 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinsonism disease, PD) 등과 같은 중추신경계 자가면역질환 관련 퇴행성 질환을 유발 및 진전시킨다(McGeer PL. et.al, Neurology., 1988, 38: 1285-1291; Dheen ST. et.al, Curr Med Chem ., 2007, 14: 1189-1197). 따라서 미세아교세포의 과다 활성화에 따른 선천 면역계 조절 장애를 이해하고 비정상적으로 활성화된 미세아교세포로부터 분비되는 염증매개물을 조절하는 것은 만성 염증성 질환의 진행을 늦추거나 손상에 대한 치료에 접근 방법이 될 수 있다.
또한, 미세아교세포(microglia)는 중추 신경계에서 발견된 다른 신경아교세포(glial cells)와 달리 단핵 식세포(mononuclear phagocytic cells) 계통(lineage)에 속하며, CNS 내에서 세포 매개 면역(cell-mediated immunity)을 담당한다(Thameem Dheen, S. et.al, Current medicinal chemistry, 2007, 14(11): 1189-1197; Kreutzberg, G.W. et.al., Trends in neurosciences, 1996, 19(8): 312-318). 미세아교세포는 활성화 상태에 따라 신경염증(neuroinflammation)을 악화시키거나 완화시키는 것으로 알려져 있다. 미세아교세포는 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 전염증성(pro-inflammatory) 자극에 노출되면 활성화되어 신경세포 상해적 타입(M1)이 되나, IL-4 및 IL-13과 같은 항염증성(anti-inflammatory) 자극에 노출되면 활성화되어 신경세포 보호적 타입(M2)이 된다. M1 타입의 미세아교세포는 항균 활성과 더불어 세포 독성을 나타내지만 M2 타입의 미세아교세포는 조직 복구(tissue repair) 및 항염증 활성을 촉진시킨다(Boche, D. et.al, Neuropathology and applied neurobiology, 2013, 39(1): 3-18). 미세아교세포 활성화의 기본적인 기전을 이해하는 것은 신경퇴행성 질환(neurodegnerative disease)의 병리학적 이해에 있어 중요하다.
신경염증(neuroinflammation)은 신경계 내에서 발생하는 염증성 질환이며, 면역 반응에 따라 신경퇴행성 장애의 주요 원인으로 지적되기도 한다.
최근 많은 연구를 통해 신경염증 및 그 근본적인 기전에 있어 미세아교세포의 활성화 작용이 밝혀진 바 있다. 그러나 휴지 상태(resting state)의 미세아교세포에서는 면역 관련 유전자의 발현 조절에 대해 잘 연구 되어져 있지 않은 상태이다.
PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1)은 미세아교세포(microglia) 및 다른 대식세포(macrophage)를 포함한 골수성 세포(myeloid cell)에서 흔히 발견되는 계통 결정 인자(linage-determing factor)로, PU.1은 세포 분화(cell differentiation) 과정에서 골수성 세포 계통의 신원을 결정하고 골수성 세포 특이적 유전자 발현 양상을 조절하는 것으로 알려져 있다(Scott, E.W., et al., Science, 1994, 265(5178): 1573-1577). 그러나, 특히 미세아교세포에서 PU.1에 의해 지배받는 유전자 조절 네트워크 조직은 잘 알려져 있지 않다. 따라서 PU.1 전사 인자(transcription factor)와 관련성이 있는 휴지 상태의 미세아교세포에서의 면역 관련 유전자의 전사 조절 연구가 필요한 실정이다.
한편, 유전자가위(engineered nuclease)란 유전체에서 특정 염기 서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 시스템을 말한다. 현재까지 개발된 유전자가위로는 1세대 징크핑거 뉴클레이즈(ZFNs, Zinc Finger Nucleases), 2세대 탈렌(TALENs, Transcription Activator-Like Effector Nucleases), 3세대 크리스퍼(CRISPR-Cas9)가 있다.
가장 최근 기술인 크리스퍼 유전자가위는 교정하려는 DNA를 찾아내는 가이드 RNA와 DNA를 잘라내는 Cas9 단백질로 구성된다. 크리스퍼(CRISPR-Cas9) 기술을 이용하면 유전자를 잘라내고 새로 바꾸는 데 최장 수년씩 걸리던 것이 며칠로 줄어들며, 동시에 여러 군데의 유전자를 손볼 수도 있다. 이로 인해 유전자가위는 에이즈, 혈우병 등 유전 질환을 치료하고, 유전자 변형 식물(GMO)을 대신하는 농작물 품질 개량 기술로 주목받고 있다(Jennifer A. Doudna et al., Science, 2014, 346(6213): 1077-1086).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 미세아교세포에서의 PU.1 유전자의 기능을 규명하고 이를 기반으로 신경퇴행성 질환 치료제 탐색을 위한 스크리닝 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PU.1 유전자를 인식할 수 있는 새로운 가이드 RNA 서열을 제작하였으며, 이를 이용하여 PU.1 유전자의 기능을 용이하게 규명하고 신경퇴행성 질환 치료제 탐색을 위한 신규한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Sawada M. et.al, Brain Res., 1989, 491: 394-397
Kriz J., Crit Rev Neurobiol., 2006, 18: 145-157
Hailer NP., Prog Neurobiol., 2008, 84: 211-233
Monji A. et.al, Psychiatry Clin Neurosci., 2009, 63: 257-265
McGeer PL. et.al, Neurology., 1988, 38: 1285-1291
Dheen ST. et.al, Curr Med Chem., 2007, 14: 1189-1197
Thameem Dheen, S. et.al, Current medicinal chemistry, 2007, 14(11): 1189-1197
Kreutzberg, G.W. et.al., Trends in neurosciences, 1996, 19(8): 312-318
Boche, D. et.al, Neuropathology and applied neurobiology, 2013, 39(1): 3-18
Scott, E.W., et al., Science, 1994, 265(5178): 1573-1577
Jennifer A. Doudna et al., Science, 2014, 346(6213): 1077-1086
본 발명의 목적은 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주(수탁번호: KCLRFBP00375)를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 이용하여 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA, 이를 포함하는 가이드 RNA 벡터, 상기 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터를 이용한 PU.1 넉아웃(knockout) 생쥐 미세아교세포주의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주와 이를 이용한 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법, 및 상기 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주(수탁번호: KCLRFBP00375)를 제공한다.
상기 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주 제조 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
1) 서열번호 1 내지 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제작한 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터를 제작하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 제작한 가이드 RNA 벡터 및 Cas9 단백질 발현 벡터를 생쥐 미세아교세포(mouse microglia)에 형질주입시켜 생쥐 미세아교세포에서 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 유전자의 표적 서열에 DNA 결실(deletion)을 유발하는 단계.
본 발명에서 용어, "넉아웃(knock-out, KO)"이란 유전자가 작동하지 않게 하는 것을 의미하며, "PU.1 유전자 넉아웃"이란 PU.1 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주"란 PU.1 유전자의 발현이 억제되거나 현저히 감소한 생쥐 미세아교세포주를 의미한다.
본 발명에서 용어, "가이드 RNA(guide RNA, gRNA)"란 RNA 유전자가위(RNA-guided engineered nuclease, RGEN)의 DNA 특이성을 결정하는 작은 RNA 분자로, 가이드 RNA는 세포내에서 유전자가위 단백질(Cas9)과 결합하여 RNA 유전자가위를 형성한다.
본 발명에서 용어, "RNA 유전자가위(RNA-guided engineered nuclease, RGEN)"란 유전자 가위 단백질(Cas9)과 가이드 RNA(guide RNA)로 구성되어 있는 제3세대 유전자가위로, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소로 인간 및 동식물 유전자 교정에 사용된다.
즉, 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)란 CRISPR-Cas9 시스템에서 타겟 유전자를 특이적으로 인식하는 RNA(ribonucleic acid)를 의미하며, 본 발명에서 용어, "CRISPR-Cas9"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다. 이때 타겟 유전자의 조건은 23 bp 길이이고 두 개의 구아닌 염기(GG)로 끝나기만 하면 된다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3 bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기(GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다.
상기 가이드 RNA는 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 유전자의 특정 서열 표적으로 하며, 상기 PU.1 유전자는 인간 및 동물의 공지된 서열이라면 어느 것이나 포함될 수 있고, 예를 들어 생쥐 PU.1 유전자(NCBI GenBank Accession number: NC_000068.7)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 생쥐 PU.1 유전자는 서열번호 4로 표시하였다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 생쥐(Mus musculus)의 2번 염색체의 91096837-91096859번째 염기에 상보적으로 결합하며, PU.1 유전자의 1번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.
상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 생쥐(Mus musculus)의 2번 염색체의 91099519-91099541번째 염기에 상보적으로 결합하며, PU.1 유전자의 2번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 생쥐(Mus musculus)의 2번 염색체의 91113423-91113445번째 염기에 상보적으로 결합하며, PU.1 유전자의 3번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.
상기 단계 1)의 가이드 RNA 제작은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 생쥐 미세아교세포에서 추출한 DNA를 시료로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 포함할 수 있다:
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트.
상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.
상기 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.
상기 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.
상기 단계 2)의 가이드 RNA 벡터는 상기 단계 1)에서 제작한 서열번호 1 내지 3으로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 포함할 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 PU.1(spleen focus forming virus(SFFV) proviral integration oncogene, Spi1; Sfpi1) 유전자를 인식할 수 있다.
상기 가이드 RNA 벡터를 이용하여 세포를 형질주입하면 세포 내에 가이드 RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 가이드 RNA 단편은 PU.1 유전자를 인식할 수 있다.
상기 가이드 RNA 벡터는 Tracer RNA를 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 가이드 RNA 벡터를 이용하여 세포를 형질주입하면 세포 내에 가이드 RNA 단편 및 Tracr RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 Tracr RNA 단편은 gRNA와 복합체를 형성하여 Cas9이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
상기 단계 3)의 형질주입은 단계 2)에서 제작한 가이드 RNA 벡터 중 1종 이상을 이용할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 중 1종 내지 3종을 이용하여 형질주입할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 PU.1 gRNA-2를 생쥐 미세아교세포에 형질주입시켜 하나의 표적 서열을 인식하였다.
상기 단계 3)에서 사용한 Cas9 단백질 발현 벡터란 Cas9 단백질을 세포 내에서 발현할 수 있는 운반체라면 그 종류를 제한하지 않으나, 예를 들어 시중에서 판매하는 공지의 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 Cas9 단백질 발현 벡터는 Cas9 단백질에 GFP(green fluoresence protein)이 연결되어 함께 발현되는 pCas9-GFP 벡터를 구입하여 이용하였으나, 상기 벡터가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다. 상기 GFP는 리포터 단백질일 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질주입(transduction)"이란 동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법을 의미하며, 이는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 칼슘 인산염 형질주입법(calcium phosphate transfection), 리포펙션법(lipofection), 전기천공(electroporation), 미량주사법(microinjection), 마이크로프로젝틸법(microprojectile)법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 진핵생물의 경우 DNA인산칼슘침전법 또는 리포펙션 등의 상품화된 시약과 DNA를 혼합하여 세포를 처리하는 방법이 대표적이며, 유전자 도입한 리포터 유전자의 발현을 측정하여 발현세포의 동정 등을 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "표적 서열"이란 가이드 RNA가 인식하는 유전자의 특정 염기서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, "DNA 결실(deletion)"이란 유전자 염기서열의 일부 또는 전부가 제거된 것을 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 가이드 RNA가 인식하는 표적 서열 부위가 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 제거된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 한 개의 가이드 RNA를 형질주입하여 제조한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의 PU.1 유전자 발현량을 확인한 결과, 가이드 RNA가 형질주입되지 않은 대조군(정상 미세아교세포주, BV-2)에 비해 PU.1 유전자 발현량이 현저히 감소함을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명의 일실시예에서, 정상 미세아교세포주(BV-2; wild type) 및 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)에 미세아교세포 활성화 유도물질로서 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 활성화 시키고, 이에 따른 면역 관련 유전자(immune-related gene)의 발현량을 확인한 결과, 대조군인 정상 미세아교세포주(BV-2)에 비해 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자의 발현 수준이 현저히 낮음을 확인하였다(도 6의 B).
상기 미세아교세포 활성화 유도물질은 LPS(lipopolysaccharide), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 트롬빈(thrombin), 또는 베타-아밀로이드(β-amyloid)일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 구체적으로
1) PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주(수탁번호: KCLRFBP00375)에 미세아교세포 활성화 유도물질을 처리하는 단계;
2) 상기 미세아교세포 활성화 유도물질이 처리된 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에서 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 정도를 측정하는 단계;
3) 정상 생쥐 미세아교세포주에 미세아교세포 활성화 유도물질을 처리하는 단계;
4) 상기 미세아교세포 활성화 유도물질이 처리된 정상 생쥐 미세아교세포주에 시험물질을 접촉시키고 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 정도를 측정하는 단계; 및
5) 상기 정상 생쥐 미세아교세포주에서 측정된 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 정도를 상기 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에서 측정된 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 정도와 비교하여 동등하거나 저발현하는 여부를 판단하는 단계;를 포함하는, 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 PU.1 유전자를 결실(deletion)시켜 제작한 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 야생형(WT) 생쥐 미세아교세포주 BV-2에 미세아교세포 활성화 유도물질로서 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 활성화 시키고, 세포 형태(morphology), 세포 증식력(cell proliferation), 세포 이동능(cell migration) 등과 같은 기본적인 생리학적 활성(physiological activity)을 확인해 본 결과, 두 세포 간에 유의적인 차이가 없음을 확인하였다(도 4).
이를 통해, PU.1 유전자가 넉아웃 되었음에도 본 발명의 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)는 정상 미세아교세포주 BV-2와 기본적인 생리학적 활성은 차이가 것으로 확인되었다. 하지만 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 정상 미세아교세포주 BV-2를 활성화 시켰을 때, CCL2와 CCL9과 같은 특정 사이토카인 유전자의 발현이 감소하며, 미세아교세포의 활성화에 따라 분비되는 사이토카인 등이 변화됨을 확인하였다. 따라서, 상기 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)를 이용하여 비정상적으로 활성화된 미세아교세포에 의한 염증 매개물의 분비에 있어 PU.1 유전자의 기능을 규명할 수 있으며, 염증 매개물 분비에 따른 면역계의 항상성 교란에 의해 유발되는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 질환과 같은 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝에 적용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 정상 미세아교세포주(BV-2; wild type) 및 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)에 미세아교세포 활성화 유도물질로서 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 활성화 시키고, 이에 따른 면역-염증 관련 유전자의 발현량을 확인한 결과, 대조군인 정상 미세아교세포주(BV-2)에 비해 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자의 발현 수준이 현저히 낮음을 확인하였다(도 6의 B).
이를 통해, LPS와 같은 미세아교세포 활성화 유도물질 매개에 의한 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14와 같은 면역-염증 반응 유전자 발현은 PU.1 유전자에 의존적으로 조절됨을 알 수 있었다.
본 발명에서 용어, "CCL2(chemokine (C-C motif) ligand 2)"는 단핵세포에서 분비되는 염증전구물질로서 생물학적 특성을 반영하여 monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)과 macrophage inflammatory protein-1α(MIP-1α)로 불리어지기도 하고, 조직손상에 따른 염증 상황이나 신경손상에 따른 신경병증 상황에서 그 생성이나 분비가 증가하는 것으로 알려져 있는 케모카인(chemokine)이다. "CCL9(chemokine (C-C motif) ligand 9)"는 CC 케모카인 계통(family)에 속하는 작은 사이토카인으로 macrophage inflammatory peptide gamma(MIP-1γ)로 불리어지기도 하고, 조직손상에 따른 염증 상황에서 그 생성이나 분비가 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, "C5AR1(complement component 5a receptor 1)"은 화학주성(chemotatic) 및 염증성 펩티드인 염증 매개물질로 작용하는, 아나플라톡신(anaphylatoxin) C5a에 대한 수용체로 CD88(Cluster of Differentiation 88)로 불리어지기도 하고, 염증 상황에서 그 생성이나 분비가 증가한다. "CD40(Cluster of differentiation 40)"은 APC(antigen presenting cell)에서 발견되는 보조 자극 단백질로, CD40과 이의 리간드(ligand)인 CD40L의 반응은 염증과정에 중요한 역할을 하며, 염증성 사이토카인 분비와 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. "HCAR2(hydrocarboxylic acid receptor 2)"는 Niacin receptor 1(NIACR1) 또는 G-protein-coupled receptor 109A(GPR109A)로 불리어지기도 하고, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 파킨슨 병(parkinson's disease)과 같은 신경면역질환(neuroimmune disorder) 치료를 위한 잠재적인 치료 표적으로 알려져 있다. "PARP14(Poly(ADP-Ribose) Polymerase Family Member 14)"는 염증(inflammation), 유전자 발현 조절, DNA 손상 수리(DNA damage repair) 등 광범위한 생물학적 과정(biological process)에 관여하는 Poly(ADP-Ribose) Polymerase(PARP) 서브패밀리(subfamily)로, 알러지 염증(allergic inflammation) 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 염증 면역(inflammatory immunity) 반응 동안 다양한 사이토카인의 반응을 조절하는 것으로도 알려져 있다.
상기 단계 1) 또는 단계 3)에서 처리한 미세아교세포 활성화 유도물질은 LPS(lipopolysaccharide), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 트롬빈(thrombin), 또는 베타-아밀로이드(β-amyloid)일 수 있다.
상기 단계 2) 또는 단계 4) 에서 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 정도는, 이에 제한되는 것은 아니나, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 측정될 수 있다.
상기 단계 4)의 "시험물질"이란 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 후보 물질로, 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료의 효능이 있을 것이라 예상되는 생명체에 적용 가능한 물질을 의미한다. 본 발명의 시험물질은 이에 제한되지는 않으나, 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있다.
상기 "염증성 신경퇴행성 질환"은 신경계 내에서 발생하는 염증성 질환인 신경염증(neuroinflammation) 및 신경세포의 퇴행성 변화에 의해 나타나는 여러가지 증상을 유발하는 질환으로서, 이에 제한되지는 않으나, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinsonism disease, PD), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 미세아교세포 활성화 유도물질로서 LPS를 처리하여 활성화 시킨 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)에서 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14와 같은 면역-염증 반응에 관여하는 유전자의 발현 정도를 확인해 본 결과, PU.1 유전자가 넉아웃 됨에 따라 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14와 같은 면역-염증 반응에 관여하는 유전자의 발현 수준이 억제됨을 확인하였다.
이에, PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있는 미세아교세포를 확보하고, 미세아교세포를 활성화 시켜 면역-염증 반응에 관여하는 유전자들의 발현 조절과 PU.1의 관계를 규명하고, 이들 조절을 제어함으로써 궁극적으로 염증성 신경퇴행성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 유추할 수 있다.
따라서, 상기 단계 5)에서 미세아교세포 활성화 유도물질인 LPS(lipopolysaccharide) 매개에 의해 활성화된 정상 생쥐 미세아교세포주의 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 수준이, 상기 단계 4)의 시험물질에 의해 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에서 측정된 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 또는 PARP14 유전자 발현 수준 대비 동등하거나 더 낮게 발현하는 경우, 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질로 판단된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 정상 생쥐 미세아교세포주에 미세아교세포 활성화 유도물질을 처리하는 단계; 2) 상기 미세아교세포 활성화 유도물질이 처리된 정상 생쥐 미세아교세포주에 시험물질을 접촉시키고 PU.1 유전자 발현 정도를 측정하는 단계; 및 3) 상기 측정된 PU.1 유전자 발현 정도를 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질이 PU.1 유전자의 발현을 억제하는 여부를 확인하는 단계;를 포함하는, 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)에서 처리한 미세아교세포 활성화 유도물질은 LPS(lipopolysaccharide), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 트롬빈(thrombin), 또는 베타-아밀로이드(β-amyloid)일 수 있다.
상기 단계 2)의 "시험물질"이란 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 후보 물질로, 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료의 효능이 있을 것이라 예상되는 생명체에 적용 가능한 물질을 의미한다. 본 발명의 시험물질은 이에 제한되지는 않으나, 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있다.
상기 "염증성 신경퇴행성 질환"은 신경계 내에서 발생하는 염증성 질환인 신경염증(neuroinflammation) 및 신경세포의 퇴행성 변화에 의해 나타나는 여러가지 증상을 유발하는 질환으로서, 이에 제한되지는 않으나, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinsonism disease, PD), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)일 수 있다.
상기 단계 2)에서 PU.1 유전자 발현 정도는, 이에 제한되는 것은 아니나, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 측정될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, PU.1 유전자가 넉아웃 됨에 따라 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14와 같은 면역-염증 반응에 관여하는 유전자의 발현 수준이 억제됨을 확인하였다.
이에, 미세아교세포가 발현하고 있는 PU.1 유전자를 결실(deletion)시키거나, PU.1 유전자 발현을 저해(inhibition) 함으로써, 상기 면역-염증 반응에 관여하는 유전자들의 발현 수준을 억제 시킬 수 있으며, 이들 억제되는 조절 기전을 이해함으로써, 궁극적으로 미세아교세포 활성화에 따른 염증성 신경퇴행성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 유추할 수 있다.
따라서, 상기 단계 3)에서 LPS 매개에 의해 활성화된 정상 생쥐 미세아교세포주의 PU.1 유전자 발현 수준이, 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 시험물질에 의해 감소한 경우, 염증성 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 물질로 판단된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주(수탁번호: KCLRFBP00375)를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적상 상기 스크리닝용 조성물은 세포주의 배양에 필요한 배지, 사용방법을 설명한 설명서가 포함될 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA를 이용하여 제조한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주는 PU.1 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 미세아교세포에서의 PU.1 유전자의 기능 연구를 기반으로 하여 신경퇴행성 질환 치료제 탐색에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)의 타겟 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의 결실(deletion) 부위를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 PU.1 유전자 발현량을 비교한 qRT-PCR 결과(A) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting) 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 세포 형태(morphology)를 관찰한 현미경 사진(A)과, 세포 증식력(B) 및 세포 이동능(C)을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(A)와, LPS 처리 시간에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(B)이다. 여기에서, 그래프 상에 포함된 수치는 통계분석한 결과로 P값(p-value)을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 IPA® 소프트웨어를 이용한 PU.1 유전자 넉아웃 관련 유전자 네트워크 분석 결과(A) 및 농도별 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14 및 LRRC25의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(B)이다. 여기에서, 그래프 상에 포함된 수치는 통계분석한 결과로 P값(p-value)을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 CCL2(A)와, IL-6(B)의 분비량을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의 결실(deletion) 부위를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 PU.1 유전자 발현량을 비교한 qRT-PCR 결과(A) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting) 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 세포 형태(morphology)를 관찰한 현미경 사진(A)과, 세포 증식력(B) 및 세포 이동능(C)을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(A)와, LPS 처리 시간에 따른 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(B)이다. 여기에서, 그래프 상에 포함된 수치는 통계분석한 결과로 P값(p-value)을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 IPA® 소프트웨어를 이용한 PU.1 유전자 넉아웃 관련 유전자 네트워크 분석 결과(A) 및 농도별 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14 및 LRRC25의 발현량을 비교하여 나타낸 그래프(B)이다. 여기에서, 그래프 상에 포함된 수치는 통계분석한 결과로 P값(p-value)을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 LPS 자극에 의한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)와 대조군(WT BV-2)의 CCL2(A)와, IL-6(B)의 분비량을 비교하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
제작
Mali 등의 논문(Science., 2013; 339(6121):823-826)에서 디자인한 방법을 변형하여 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9) 시스템을 이용하여 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주를 제작하였다. 구체적인 제작 방법은 다음과 같다.
실시예
1-1: 생쥐 미세아교세포
BV
-2의 배양
생쥐 미세아교세포(mouse microglia) BV-2 세포주는 고농도의 글루코스가 함유된 DMEM(high glucose Dulbecco's Modifiend Eagle's Medium, DMEM-hg; 11995-065, Life technologies)에 10% FBS(fetal bovine serum; 16000-044, Life technologies) 및 1% 페니실린(100 U/㎖)-스트렙토마이신(100 ㎎/㎖)(Penicillin-Streptomycin; 15140-122, Life technologies)을 첨가한 배지를 이용하여 배양하였다. 이때, BV-2 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였으며, 배지는 2~3일마다 교체하였다.
실시예
1-2: PU.1 유전자를
타겟으로
하는 가이드 RNA 및
gRNA
벡터의 제작
PU.1 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 발현하는 gRNA 벡터에 클로닝하기 위하여 각 타겟 부분에 상보적인 서열을 선택하여 100bp oligos를 제노텍에서 주문 제작하였다. PU.1 유전자는 NCBI GenBank Accession number NC_000068.7로 등록되어 있다. PU.1 유전자 서열은 서열번호 4로 표시하였다.
3개의 PU.1 가이드 RNA(gRNA) 단편(PU.l gRNA-1, -2, -3)을 준비하기 위하여, PU.1 코딩 영역에서 3쌍의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였고, 이를 통해 3개의 사이트를 증폭하였다. 이때 PCR은 PCR 증폭 조건으로 98℃에서 2분간 가열한 다음, 98℃에서 10초, 53℃에서 20초, 72℃에서 30초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 4회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 5분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다. 증폭된 각각의 가이드 RNA 정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 가이드 RNA 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다. 가이드 RNA의 타겟 부분은 도 1에 나타내었다.
그 다음, 각각의 가이드 RNA를 삽입한 gRNA 벡터를 제작하였다. gRNA 클로닝 벡터(#41824, Addgene)는 AflⅡ(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 이용하여 선형화(linearized) 하였으며, 제조사의 지시에 따라 Gibson assembly® Master Mix(E2611, BioLabs)를 이용해 각각의 gRNA를 Gibson Assembly 방법으로 결찰(ligation) 시켰다. 상기와 같이 제조된 gRNA 벡터를 NEB 5-alpha 컴피턴트 세포(competent cell; New England Biolabs)에 형질전환시켰다. 그 후, gRNA 벡터를 분리하고 염기서열을 분석한 결과, 클로닝(cloning) 되었음을 확인하였다.
| 서열번호 | gRNA 명칭 | 서열 | PU.1 타겟 부위 | PU.1 타겟 엑손 | 방향 | PU.1 타겟 서열 |
| 1 | PU.1 gRNA-1 | CCUGCGUCUGACCCACGACCGUC | chr2: 91096837-91096859 |
1 | - | GACGGTCGTGGGTCAGACGCAGG |
| 2 | PU.1 gRNA-2 | CCAUAGCGGUGAGUACCUGGUCC | chr2: 91099519-91099541 |
2 | _ | GGACCAGGTACTCACCGCTATGG |
| 3 | PU.1 gRNA-3 | CCCACACCGGCCUCAGUCACCAG | chr2: 91113423-91113445 |
3 | _ | CTGGTGACTGAGGCCGGTGTGGG |
| 서열번호 | 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') |
| 5 | PU.1 gRNA- target 1-F |
정방향 | TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACGGTCGTGGGTCAGACGC |
| 6 | PU.1 gRNA- target 1-R |
역방향 | GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGCGTCTGACCCACGACCGTC |
| 7 | PU.1 gRNA- target 2-F |
정방향 | TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGACCAGGTACTCACCGCTA |
| 8 | PU.1 gRNA- target 2-R |
역방향 | GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTAGCGGTGAGTACCTGGTCC |
| 9 | PU.1 gRNA- target 3-F |
정방향 | TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCCTGGTGACTGAGGCCGGTGT |
| 10 | PU.1 gRNA- target 3-R |
역방향 | GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACACACCGGCCTCAGTCACCAG |
실시예
1-3:
CRISPR
-
Cas9을
이용한 PU.1
넉아웃
세포주(PU.1 KO
BV
-
2)의
제작
상기 실시예 1-2에서 제작한 gRNA 벡터와 pCas9-GFP 플라스미드(#44719, Addgene)를 생쥐 미세아교세포 BV-2 세포(mouse microglia BV-2 cell)에 트랜스펙션(transfection) 시키는 방법으로 PU.1 유전자의 타겟 부분을 결실(deletion)시켜 PU.1 넉아웃 세포주를 제작하였다.
구체적으로, gRNA 벡터 및 pCas9_GFP 플라스미드(# 44719, Addgene)를 95 : 5 비율로 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine® 3000(L3000-001, Life technologies)을 사용하여, 상기 실시예 1-1에서 배양한 생쥐 미세아교세포 BV-2 세포에 트랜스펙션(transfection) 시켰다. PU.1 gRNA-1, PU.1 gRNA-2, PU.1 gRNA-3를 각각 트랜스펙션(transfection) 시킨 PU.1 넉아웃 세포주를 제작하였다. 이 중 PU.1 gRNA-2를 트랜스펙션 시킨 PU.1 넉아웃 세포주는 한국세포연구재단에 기탁하였다(수탁번호: KCLRFBP00375).
트랜스펙션(transfection)된 BV-2 세포는 pCas9_GFP 플라스미드로부터 발현된 GFP(green fluorescent protein)의 형광(fluorescence)에 대하여 BD FACSAria™ Ⅲ Cell Sorter(648282, BD Bioscience)를 사용하여 유세포 분석법(flow cytometry)으로 분리(sorting)하였다. 이후, 모든 웰(well)에 하나의 고유 세포가 포함되도록 웰(well) 당 1개 이하의 세포 비율로 상기 분리한 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 시딩(seeding)하였다. 시딩 후 2주 동안 배양하고, 각 웰의 세포를 24웰 플레이트(24-well plate)로 옮겨 genomic DNA(gDNA) 분리를 위해 배양하였다. 배양 후, Wizard® Genomic DNA Purification Kit(A1125, Promega)를 사용하여 genomic DNA(gDNA)를 분리하였으며, 상기 gDNA는 하기 표 3의 PU.1 유전자의 타겟 부분 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 이때, 상기 특이적 프라이머 세트는 가이드 RNA의 타겟 부분이 각각 다르므로, PU.1 유전자에서 타겟 부분을 각각 포함하는 프라이머 세트 3쌍을 제작하여 사용하였다. PCR 증폭 조건은 95℃에서 10분간 가열한 다음, 95℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 30회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 10분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다.
PCR로 PU.1 유전자 타겟 부위를 증폭시킨 후 PU.1 유전자의 결실(deletion)이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위해 시퀀싱(sequecning)하여 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열을 NCBI의 PU.1 genomic DNA 염기서열(NCBI Accession no. NC_000068.7)과 비교하여 결실(deletion)된 부분을 결정하였다(도 2).
| 서열번호 | 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') |
| 11 | PU.1 gRNA-target 1-confirmation-F | 정방향 | GGCCAGAGACTTCCTGTAGC |
| 12 | PU.1 gRNA-target 1-confirmation-R | 역방향 | GCCAGGGCATGCTCTAAGG |
| 13 | PU.1 gRNA-target 2-confirmation-F | 정방향 | TGCTGACCTCTGACCTCTCT |
| 14 | PU.1 gRNA-target 2-confirmation-R | 역방향 | CCCCAAGGACCAGACAAGAT |
| 15 | PU.1 gRNA-target 3-confirmation-F | 정방향 | CTGCCCAGCCTGAATGGTTA |
| 16 | PU.1 gRNA-target 3-confirmation-R | 역방향 | AGAGAAGATGGCCGAGGACT |
실시예
2: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
유전자 발현 양상 분석
상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 생쥐 미세아교세포주에서 PU.1 유전자가 실제로 넉아웃 되었는지 검증하기 위하여, PU.1 mRNA 발현 정도 및 PU.1 유전자 발현 정도를 qRT-PCR과 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하여 확인하였다.
실시예
2-1: 실시간
역전사
중합효소연쇄반응
(real-time RT-
PCR
)
생쥐 미세아교세포에서 추출한 total RNA는 제조사의 지시에 따라 oligo dT 프라이머와 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(6110A, Takara)를 사용하여 total RNA 샘플을 cDNA로 역전사(reverse transcription) 시켰다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)은 상기 cDNA를 주형(template)으로 하여 SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ(RR820, Takara)와 7500 Real-time PCR System(4351104, Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응은 하기 표 4의 PU.1 특이적 프라이머(최종 농도 4 pmol)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 가열한 다음, 95℃에서 60초, 60℃에서 60초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 40회(cycle) 반복하였다. 대조군으로는 내재성 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. PU.1 mRNA 발현값은 Applied Biosystems(Carlsbad, CA)사로부터 제공받은 프로그램(7500 software v2.3)을 이용하여 비교 임계 역치 ΔΔCT(comparative critical threshold ΔΔCT) 방법에 의해 대조군으로 사용한 GAPDH 유전자 발현값과 대비하여 표준화하여 분석하였다.
상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포의 total RNA를 분리한 후 cDNA를 만들어 real-time RT-PCR을 수행해 본 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포에 비해 PU.1 KO BV-2 세포에서 PU.1 유전자의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인하였다(도 3의 A).
| 서열번호 | 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') |
| 17 | PU.1(Spi1)-F | 정방향 | ATGTTACAGGCGTGCAAAATGG |
| 18 | PU.1(Spi1)-R | 역방향 | TGATCGCTATGGCTTTCTCCA |
| 19 | GAPDH-F | 정방향 | TGCGACTTCAACAGCAACTC |
| 20 | GAPDH-R | 역방향 | CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG |
실시예
2-2:
웨스턴
블롯팅
(western blotting)
야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포 및 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포(3×106 개의 세포수)를 각각 PBS로 1회 세척하고 세포 스크레퍼(scraper)를 사용하여 1 ㎖의 PBS에 재현탁(resuspension) 시켰다. 상기 각각의 세포를 13,300 rpm에서 3분간 4℃에서 원심 분리하여 수집하고, 아이스(ice) 상에서 30분간, 1× 프로테아제 억제제 칵테일(1× protease inhibitor cocktail, PI; 04693132001, Roche) 및 1× 포스파타제 억제제(1× phosphatase inhibitor; P3200-001, GenDEPOT)가 포함된 RIPA 버퍼(R2002, Biosesang)로 용해시켰다. 이후, 전세포 용해물(whole cell lysate)을 13,300 rpm에서 10분간 4℃에서 원심 분리하고 단백질을 포함하는 상층액(supernatant)을 수집하였다. 단백질 농도는 Pierce® BCA Protein Assay kit(23225, Thermo Scientific)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 웨스턴 블롯(Western-blot)은 PU.1(sc-352, Santa Cruz) 항체를 사용하여 수행하였다. 이때 대조군으로는 β-Actin(LF-PA0207, AB 프론티어)을 사용하였다.
상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포의 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행해 본 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포에 비해 PU.1 KO BV-2 세포에서 PU.1 유전자의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인하였다(도 3의 B).
상기 결과를 통해, 본 발명의 PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 PU.1 유전자를 결실(deletion)시킴에 따라 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)를 용이하게 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
3: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
특성 평가
상기 실시예 1에서 PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포가 실제로 PU.1 유전자가 결실되어 있음을 상기 실시예 2에서 검증하였으며, PU.1 유전자가 넉아웃 되어있는 BV-2 세포의 기본적인 생리학적 활성(physiological activity)을 분석하여 상기 세포의 전반적 특성을 평가하였다.
실시예
3-1: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
형태(morphology) 분석
먼저, 미세아교세포의 활성을 유도하기 위해 염증성 자극인자(inflammatory stimuli)인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하고 4시간 후 세포의 형태(morphology)를 분석하였다.
그 결과, 하기 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포와 야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포 간에 뚜렷한 차이가 나타나지 않음을 확인하였다. 구체적으로, PU.1 KO BV-2 세포 및 WT의 BV-2 세포 모두 휴지 상태(resting state)에서 아메바 형태(amoeboid form)를 나타내었고, LPS 자극 4시간 후, 양극성(bipolar) 또는 삼극성(tripolar) 형태로 변화함을 확인하였다.
실시예
3-2: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
세포 증식력 분석
상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포의 증식 정도를 평가하기 위해, WST-1 assay를 수행하였다.
구체적으로, 야생형(WT) BV-2 세포 및 PU.1 KO BV-2 세포의 수는 Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(MK400, Takara)을 사용하여 측정하였다. WT BV-2 세포 및 PU.1 KO BV-2 세포(1 × 103 세포/웰(well))를 각각 96-웰 플레이트에서 20시간 동안 배양하고, 상이한 농도의 LPS(무첨가, 10 ng/㎖, 10 ㎍/㎖)를 4시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하였다. 이후, 1일, 2일, 3일에 걸쳐 배양한 뒤 각각의 배양일에 WST-1(10 ㎕/웰)을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 이후 450 nm 파장에서 흡광도(absorbance)를 측정하였으며, 세포 성장률(cell growth rate)은 1일(24시간) 동안 증식된 세포의 결과에 대한 흡광도의 상대적인 비율로서 나타내었다. 각 조건에 대해 12개 웰의 평균 흡광도를 사용하여 세포 증식 정도를 분석하였다.
그 결과, 하기 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포는 야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포와 비교하여 세포 성장률에 있어 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 구체적으로, LPS를 처리하지 않은 경우, PU.1 KO BV-2 세포 및 WT의 BV-2 세포 모두 세포 성장률에 있어 유의한 차이가 없었으며, 이를 통해 PU.1 KO BV-2 세포는 적어도 자극없이 안정한 세포주를 유지할 수 있음을 알 수 있었다(도 4의 B의 상). 또한, 10 ng/㎖ 또는 10 ㎍/㎖의 LPS를 처리한 경우에도, PU.1 KO BV-2 세포 및 WT의 BV-2 세포 모두 세포 성장률에 있어 유의한 차이가 없었으며, 이를 통해 PU.1 유전자의 부재가 세포 증식에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 4의 B의 중 및 하).
실시예
3-3: PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)의
세포 이동능 분석
상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포의 세포 이동능(cell migration) 분석을 위해, cell migration assay를 수행하였다.
구체적으로, 세포 이동 정도는 QCM™ 24-well Fluorimetric Chemotaxis Cell Migration Assay(ECM509, Merck Millipore)를 사용하여 분석하였다. 야생형(WT) BV-2 세포 및 PU.1 KO BV-2 세포(5 × 104개의 세포수)를 각각 24-웰 플레이트의 인서트(insert) 부위에 시딩(seeding)하였다. 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 세포를 안정화시킨 후, LPS로 4시간 동안 자극을 주었다. 이때 대조군은 LPS를 처리하지 않았다. LPS로 4시간 자극 후, 24-웰 플레이트의 인서트 부위를 새로운 배지가 채워져 있는 웰로 옮기고, FBS(fetal bovine serum)가 포함되지 않은 새로운 배지로 채워 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후, 인서트 부위를 미리 데워둔(pre-warmed) 세포 분리 버퍼(cell detachment buffer)가 포함되어 있는 새로운 웰로 옮기고, 37℃에서 30분 동안 분리하였다. 이후, 실온(room temperature)에서 15분 동안 CyQUANT GR Dye가 첨가되어 있는 용해 버퍼(lysis buffer)로 용해시켰다. 형광(fluorescence) 검출을 위해 세포 용해물(cell lysate)을 96-웰 플레이트로 옮겼으며, 형광은 480/520 필터 세트 및 65의 게인(gain) 설정으로 Synergy H1 Multi-Mode Reader(BioTek)를 사용하여 검출하였다. 세포 이동 정도를 측정하고, 이는 LPS로 자극하지 않은 야생형(WT) BV-2 세포에 대한 상대적인 백분율로서 나타내었다.
그 결과, 하기 도 4의 C에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포는 야생형(wild type, WT)의 생쥐 미세아교세포인 BV-2 세포와 비교하여 세포 이동능에 있어 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 구체적으로, 이전 연구(J Neuroinflammation, 2013. 10(75.10): p. 1186)에서 보고된 바와 마찬가지로 PU.1 KO BV-2 세포 및 WT의 BV-2 세포 모두 LPS 자극 후 세포 침윤(cell invasion)이 감소하였다. 또한, PU.1 KO BV-2 세포는 LPS로 자극을 주거나, 자극을 주지 않은 두 경우 모두 WT의 BV-2 세포와 비교하여 세포 침윤에 있어서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 이를 통해 PU.1 유전자가 세포 침윤 활성을 음성 조절(negative regulation)함을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 PU.1 유전자를 결실(deletion)시켜 제작한 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)는 세포 형태(morphology), 세포 증식력(cell proliferation), 세포 이동능(cell migration) 등과 같은 기본적인 생리학적 활성(physiological activity)에 있어 야생형(WT) 생쥐 미세아교세포주 BV-2와 유의한 차이가 없음을 알 수 있었다.
실시예
4: PU.1 유전자의 기능 규명
상기 실시예 1에서 PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 제작한 PU.1 유전자 넉아웃 BV-2 세포가 실제로 PU.1 유전자가 결실되어 있음을 상기 실시예 2에서 검증하였으며, 상기 실시예 3에서 PU.1 유전자가 넉아웃 되어있는 BV-2 세포의 기본적인 생리학적 활성(physiological activity)이 PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있지 않은 야생형(WT) BV-2 세포와 유의적 차이가 없음을 확인하였다.
이에, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포를 이용하여 PU.1 유전자의 기능을 규명하고자, PU.1 KO BV-2 세포에 염증성 자극인자(inflammatory stimuli)인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 PU.1 KO BV-2 세포를 활성화 시키고, 이에 따른 전염증성(pre-inflammatory) 사이토카인(cytokine)의 발현량 및 면역 관련 유전자(immune-related gene)의 발현량을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하여 확인하였다. 또한, ELISA assay(enzyme linked immuosorbent assay)를 수행하여 염증성 케모카인(chemokine) 및 전염증성(pre-inflammatory) 사이토카인(cytokine)의 분비량을 측정하였다.
실시예
4-1:
LPS
자극에 의한 PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1
KO BV-2)의 전염증성(pre-inflammatory) 사이토카인의 발현 변화 분석
면역 반응(immune response)에서 신경세포 상해적 타입인 M1 미세아교세포(microglia)의 주요 역할은 국소 염증(local inflammation)을 유도하기 위한 전염증성(pre-inflammatory) 사이토카인의 분비와 관련된다. 구체적으로 활성화된 M1 미세아교세포는 IL-6, IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현에 영향을 미친다.
이에, 사이토카인 생산에 있어 PU.1 유전자의 조절 역할을 규명하고자, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포를 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하여 확인하였다.
먼저, 10 ng/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도의 LPS를 각각 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포와 PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있지 않은 야생형(WT) BV-2 세포에 4시간 동안 처리하여 각 세포를 활성화 시켰다. 상기 활성화된 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포의 total RNA를 분리한 후 cDNA를 만들어 real-time RT-PCR을 수행하였다. real-time RT-PCR은 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 수행하였으며, 하기 표 5의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 대조군으로는 LPS 무처리군을 사용하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') |
| 21 | IL-6-F | 정방향 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC |
| 22 | IL-6-R | 역방향 | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC |
| 23 | IL-1β-F | 정방향 | GCAACTGTTCCTGAACTCAACT |
| 24 | IL-1β-R | 역방향 | ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT |
| 25 | TNF-α-F | 정방향 | CAGGCGGTGCCTATGTCTC |
| 26 | TNF-α-R | 역방향 | CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG |
다양한 농도의 LPS로 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포를 4시간 동안 자극하고, IL-6, IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현 정도를 real-time RT-PCR을 수행하여 분석해 본 결과, 하기 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, LPS 자극 없이는 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α의 발현 수준은 야생형(WT) BV-2 세포와 비교하여 PU.1 KO BV-2 세포에서 현저하게 변화되지는 않았다. 그러나, 고농도(10 ㎍/㎖)의 LPS로 자극을 준 경우에는, 야생형(WT) BV-2 세포에 비해 PU.1 KO BV-2 세포에서 IL-1β의 발현 수준이 감소되었으며, 이에 반해, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준은 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 한편, 상기 실시예 2-1에서 수행한 real-time RT-PCR 결과와 마찬가지로, PU.1 KO BV-2 세포에서 PU.1 유전자의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인하였다.
또한, 10 ng/㎖ 농도의 LPS를 각각 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포와 PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있지 않은 야생형(WT) BV-2 세포에 0시간, 2시간, 4시간, 12시간 및 24시간 동안 처리하여 각 세포를 활성화 시켰다. 상기 활성화된 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포의 total RNA를 분리한 후 cDNA를 만들어 real-time RT-PCR을 수행하였다. real-time RT-PCR은 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 수행하였으며, 하기 표 5의 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 대조군으로는 LPS 무처리군을 사용하였다.
10 ng/㎖ 농도의 LPS로 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포를 0시간, 2시간, 4시간, 12시간 및 24시간 동안 자극하고, IL-6, IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현 정도를 real-time RT-PCR을 수행하여 분석해 본 결과, 하기 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, 저농도(10 ng/㎖)의 LPS로 자극을 준 경우에는, 4시간 동안의 자극 조건하에서 야생형(WT) BV-2 세포에 비해 PU.1 KO BV-2 세포에서 IL-6의 발현 수준이 현저하게 감소한 것을 제외하고는 LPS 자극 시간에 따른 염증성 사이토카인 발현 수준이 두드러지게 증가하거나 감소되는 것이 관찰되지 않았다.
상기 결과를 통해, IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 전사는 PU.1 유전자에 크게 의존적이지 않으며, 즉, PU.1 유전자는 전염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생산에 있어 필수적인 유전자가 아니며, IL-6 및 TNF-α는 상이한 메카니즘에 의해 조절될 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예
4-2:
LPS
자극에 의한 PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1
KO
BV
-
2)의
면역 관련 유전자(immune-related gene)의 발현 변화 분석
상기 실시예 4-1에서 사이토카인 생산에 있어 PU.1 유전자의 조절 역할을 규명하고자, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포를 이용하여 in vitro 실험을 수행해 본 결과, PU.1 유전자가 사이토카인 발현에 있어 모순된 발현 양상을 나타냄을 확인하였다. 이에, PU.1 유전자와 관련된 유전자를 체계적으로 분석하기 위해 먼저 IPA® 소프트웨어를 이용하여 PU.1 유전자 넉아웃 관련 유전자 네트워크 분석을 수행하였다. 이때, IPA® 소프트웨어는 QIAGEN사의 Igenuity® pathway analysis(IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity) 소프트웨어를 사용하였으며, 이를 통해 시스템적으로 PU.1 유전자의 기능을 우선 분석하였다.
그 결과, 하기 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, 면역 기능과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2와 같은 대부분의 유전자가 PU.1 유전자 넉아웃에 의해 하향-조절(down-reuglation)됨을 확인하였다.
이에, 면역반응 유전자(immune responsive gene) 발현에 있어 PU.1 유전자의 기능을 실질적으로 in vitro 상에서 규명하고자, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포에 염증성 자극인자(inflammatory stimuli)인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하고 이에 따른 면역 관련 유전자(immune-related gene), 구체적으로 상기 유전자 네트워크 분석을 통해 확인한 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14와 같은 면역 반응과 관련된 유전자의 발현량을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하여 확인하였다. 이때, LRRC25는 IPA® 유전자 네트워크 분석을 통해 PU.1 유전자와 유의한 관련성을 나타내지 않은 유전자로 대조군으로서 사용하였다.
먼저, 10 ng/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도의 LPS를 각각 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포와 PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있지 않은 야생형(WT) BV-2 세포에 4시간 동안 처리하여 각 세포를 활성화 시켰다. 상기 활성화된 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포의 total RNA를 분리한 후 cDNA를 만들어 real-time RT-PCR을 수행하였다. real-time RT-PCR은 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 수행하였으며, 하기 표 6의 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14 및 LRRC25 특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 대조군으로는 LPS 무처리군을 사용하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') |
| 27 | CCL2-F | 정방향 | TAAAACCTGGATCGGAACCAAA |
| 28 | CCL2-R | 역방향 | GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT |
| 29 | CCL9-F | 정방향 | CCCTCTCCTTCCTCATTCTTACA |
| 30 | CCL9-R | 역방향 | AGTCTTGAAAGCCCATGTGAAA |
| 31 | C5AR1-F | 정방향 | ATGGACCCCATAGATAACAGCA |
| 32 | C5AR1-R | 역방향 | GAGTAGATGATAAGGGCTGCAAC |
| 33 | CD40-F | 정방향 | TGTCATCTGTGAAAAGGTGGTC |
| 34 | CD40-R | 역방향 | ACTGGAGCAGCGGTGTTATG |
| 35 | HCAR2-F | 정방향 | CTGGAGGTTCGGAGGCATC |
| 36 | HCAR2-R | 역방향 | TCGCCATTTTTGGTCATCATGT |
| 37 | PARP14-F | 정방향 | AAGCAGATTGAAGTTGAGGACAA |
| 38 | PARP14-R | 역방향 | CTTTGCCGGGGTTTCTGAAGT |
| 39 | LRRC25-F | 정방향 | GAACTAGGTTGCTGTGGTTATGT |
| 40 | LRRC25-R | 역방향 | GTCTGAGTCCAGTCTACCCTG |
다양한 농도의 LPS로 PU.1 KO BV-2 세포와 야생형(WT) BV-2 세포를 4시간 동안 자극하고, CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14, LRRC25와 같은 면역반응 관련 유전자의 발현 정도를 real-time RT-PCR을 수행하여 분석해 본 결과, 하기 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극을 준 경우에는, 야생형(WT) BV-2 세포에 비해 LRRC25를 제외하고 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14의 발현 수준이 LPS 매개에 의해 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 그러나, LPS 자극 없이는 C5AR1을 제외하고 PU.1 유전자 넉아웃에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 상기 C5AR1은 LPS 자극과 무관하게 PU.1 유전자 넉아웃에 의해 발현 수준이 강하게 감소됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, LPS에 의한 면역 반응과 관련된 유전자의 유도(induction)는 PU.1 유전자 의존적이며, 즉, LPS-매개에 의한 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2, PARP14와 같은 면역 반응 유전자의 mRNA 전사는 PU.1 유전자에 의존적으로 조절됨을 알 수 있었다.
실시예
4-3:
LPS
자극에 의한 PU.1 유전자
넉아웃
생쥐
미세아교세포주(PU.1
KO
BV
-
2)의
염증성
케모카인
(
chemokine
) 및
전염증성
(pre-inflammatory) 사이토카인의 분비량 변화 분석
상기 실시예 4-1에서 PU.1 유전자가 전염증성 사이토카인 IL-6 생산을 조절하지 않음을 확인하였으며, 상기 실시예 4-2에서는 PU.1 유전자 의존적으로 염증성 케모카인 CCL2의 발현이 조절되며, LPS에 의해 활성화되었을 때도 CCL2의 발현이 조절됨을 확인하였다.
이에, 상기 결과를 재검증하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포에 염증성 자극인자(inflammatory stimuli)인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 PU.1 KO BV-2 세포를 활성화 시키고, 상기 LPS 자극에 의해 실질적으로 PU.1 KO BV-2 세포에서 분비되는 CCL2 및 IL-6의 분비량을 측정하고자 ELISA assay(enzyme linked immuosorbent assay)를 수행하였다.
구체적으로, 야생형(WT) BV-2 세포와 상기 실시예 1에서 제작한 PU.1 KO BV-2 세포에 10 ng/㎖ 농도의 LPS를 각각 처리하고 37℃에서 8시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 LPS 무처리군을 사용하였다.
배양 후, 원심분리하여 세포가 제거된 배양액을 회수하고, EzWayTM pink-one cytokine ELISA kit(CCL2, K0331219P; IL-6, K0331230P; Komabiotech)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 배양액 내 분비되어 있는 CCL2 및 IL-6 분비량을 측정하였다.
CCL2의 분비량을 측정해 본 결과, 하기 도 7의 A에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 경우에는 야생형(WT) BV-2 세포에 비해 PU.1 KO BV-2 세포에서 CCL2 분비량이 현저하게 낮음(약 80% 정도 낮은 수준)을 확인하였으나, PU.1 KO BV-2 세포에 LPS를 처리한 경우에는 CCL2 분비량이 LPS를 처리하지 않은 경우에 비해 현저하게 증가하여 야생형(WT) BV-2에 비해 약 15% 정도 낮은 수준으로 분비됨을 확인하였다. 이는, 상기 실시예 4-2의 결과와 일치되게 CCL2 분비가 PU.1 유전자 의존적으로 LPS 매개에 의해 조절됨을 알 수 있었다.
또한, IL-6의 분비량을 측정해 본 결과, 하기 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 경우 야생형(WT) BV-2 세포와 PU.1 KO BV-2 세포에서 IL-6 분비량에 유의한 차이가 없음을 확인하였으며, PU.1 KO BV-2 세포에 LPS를 처리한 경우 IL-6 분비량이 LPS를 처리하지 않은 경우에 비해 다소 증가함을 확인하였다. PU.1 KO BV-2 세포에 LPS를 처리한 경우에 IL-6 분비량이 LPS를 처리하지 않은 경우에 비해 증가하기는 하였으나, 야생형(WT) BV-2에 비해 약 70% 정도 낮은 수준으로 분비됨을 확인하였다. 이는, 상기 실시예 4-1 결과와 일치되게 IL-6 분비가 PU.1 유전자에 크게 의존적이지 않음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 염증성 자극인자(inflammatory stimuli)인 LPS(lipopolysaccharide) 자극에 의해 활성화된 미세아교세포(microglia)에서 PU.1 유전자가 전염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생산에 있어 필수적인 유전자가 아니며, LPS에 의한 면역-염증 반응과 관련된 유전자의 유도(induction)는 PU.1 유전자 의존적임을 알 수 있었다.
즉, 이와 같이 본 발명의 PU.1 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 및 이를 포함하는 gRNA 벡터를 이용하여 PU.1 유전자를 결실(deletion)시켜 제작한 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주(PU.1 KO BV-2)를 PU.1 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, PU.1 유전자가 넉아웃 되어 있는 경우, 미세아교세포 활성화에 따른 면역-염증 반응에 관여하는 유전자들의 발현이 억제됨을 확인함으로써, 궁긍적으로 상기 PU.1 넉아웃 생쥐 미세아교세포주를 신경퇴행성 질환 치료제 탐색에 유용하게 사용할 수 있음을 유추할 수 있었다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus
<120> PU.1 knockout murine microglia cell line and uses thereof
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<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PU.1 gRNA_1
<400> 1
ccugcgucug acccacgacc guc 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PU.1 gRNA_2
<400> 2
ccauagcggu gaguaccugg ucc 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PU.1 gRNA_3
<400> 3
cccacaccgg ccucagucac cag 23
<210> 4
<211> 33386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mus musculus PU.1 gene
<400> 4
ttattatagc catgaagtgc tctgctctct tctcttttcc ttgctgtacc ccggggttga 60
aggaacacag gcctctccag gccccaggat ccagccttac tggactacca tctcttccca 120
aaggcagggc atggggacca ggaacgagag gtgagtcggg caggcagggt aggatggggg 180
tgggggtggg cctggcctcc ccaaagcagg ccacctcagg gtgggcaaag tgttatctgg 240
acagagggta aagcaggtat agatctgaca gcaacaggct ttctggagag gcctaagact 300
atcgatcttg gcaaggctta gaaacagagc ctggttaggg tctgaaacct aggtatctcc 360
aagtggcaaa agccatatct gagacatggg ttctcactga cccctgacac caaagcctga 420
cttaagcata gccacaatag gcctggctca ggccagcttg ggtgctggac ttagaacctt 480
gaagacaaat ggcccgaggt ccgagggccc agaaaactct aggttcttct aggtcacgat 540
gggccaccac cctaacccct gcacatgaaa gccagggtct gtgtctgccc ctctgcgggc 600
ctggtggcaa gagcgtttct cccaggccct gtgtggtgcc tgtggtaatg gggctgttgg 660
cgttttgcaa tgggcagggg gtggggaggc agagcacaca tgcttcctgt ggtgactggg 720
cgcttcctgt tttctcaggc accggccttg ctgctgccga tgtggaaaca ggggcagctg 780
cagccagggc ggctccaggc tgggcactct gaccctgccc agaagggagt gagggggccc 840
accaccctta gacttacgat ctagacagtg ggtgggcagg aggactcctg cccatattga 900
gtcctagtct tggctcaccc aagggaaagg tcaggcatgt atgattctga acaagctggg 960
agcccaggag gtcaacacct aggggtgaca gctaggggtg acagctaggg gtgacagcta 1020
ggggtgacag ctaggggtga cagctagggc acatggttct gggcttggtt gtctctctaa 1080
aggccactgt cagcctctcc tagtccttgg tttctgtttt tgtgtagtgt tatggcagcc 1140
atgatgtaca atccctaact cacactggcc ttcacacaga gttggggaca gcactgaagt 1200
tgagcccccc acgcccctag aggtgaggct ggggacagac cttagcagaa ggggaaactg 1260
taagactgga ggaatgtaag gcaggtggga cctaccagca ccaagtaagt cctggtgttg 1320
gaggaacaga gggacagtag tgggtatgta gttgatgcag agggacactg cagaaggaca 1380
cttttatccc tgcagatggt gcaaaggtgt ttgagagccc caacatcctt cctgataaga 1440
ctaatggtca gatgcagggt tccccttctc ccagggacat ggaaacccat atgatgtatg 1500
acccagtagc cttgggagag acccattcct ggtcctagct gtcaacctgc ttgctgggct 1560
gagatggggt gttgccatta ggggaaggcc ttgaggtttg acatcgcctc ttcccgaagc 1620
tgtttgtttt gcttctgggc tggtgtttcg agaaccgaag ggaatgactt tgcttcgtga 1680
agcacttaca gagggcatct ggcccctgaa ggaggctgag gctcaagccc ctggatactg 1740
accaatttgt ggactgagtt agctagctgt cctgttggtc taggatgttt tgagatgtgt 1800
accccacagg aagcccccct ctaatcctaa gatttactaa ccacagtgga ggggcccagt 1860
tgaagcttca gaatcctctg agcctgagac tcgggctcag gggcctctac agttctgtgc 1920
cctggggctg cctgagtgct gagttggctg agttggcgac acagcagctg ccctggccat 1980
ggaggcccag ttataaataa gcgccatctg gccaggtcat caagttccgc agatcctccg 2040
gtccagctgc attacctcag tgcccacagg tcggactgcc caatgctggg ctcatcagaa 2100
cccacccact cagaccaaaa gctgagtgtg atcctcgaat ctcaggccta agcatctgca 2160
agcccctcag acccaaacct cactggacac aggtcacaga gggacagggc acatttcgcc 2220
tgcacacacg gagtcagagc gggcagctat ttacaaaccg aaaccgggag aagtgaagtg 2280
gctgtggcca aagtggctcc aggtccccag cccccactcc cactccatcc ccactggccc 2340
agccccctct ccccatggct tcctctttcc ttccccgcat agctccccaa cctcccaccg 2400
cctggtcagc tcaagagtcc ctgcaagcac ctcacggtga cctctaactc ccacagaatg 2460
ttcctggggg tcaccttctt ttcatcccag gaccccaaca atcagagctc ctggagctgt 2520
tccttcccac cagcctcagc tcaccctggg ctgcaggaac acattcccac agttctcggt 2580
tccctttcac gcctggaaaa gcttcaacct caatggccgc cacagtgctt ctggtctcca 2640
cccaagggcg gcttctctgc ccgctcttaa ccttcacaat ggacaagtaa gggccaagag 2700
atctagcagg cttgggtggt actggagtcc ccaggggccc tggcaagaag ccctggacat 2760
ctctctattc aaattggatt tcatccccgt gtcagatcag gcttgtgagg gtcgcaggcg 2820
tttgcacagt ccagacttga gttgagatag ctaggatcag cactgcctag gaactagtag 2880
taggttggtc cttcaaaata gacaaatgat tgacaacata aacccattac ttggaggccg 2940
agaatgtagc tcagtatgta gtgtgcttat ctagcacaaa gccctgagtt tggttcccag 3000
cactgtatga acagctgcgg tggcacacag tgcgagagga tcagaagccc aaggttgtcc 3060
tcctataagt accacattca aggctaccct ggactacatg agactttggt taaaaaacaa 3120
cggggaaaac ctctactgag gatagacagc ctccccacat tgatacagca gcttaaagct 3180
cacagtcatc tatttgtctt ggaaacaaaa caatctcctc atctgtcata aagtggaaac 3240
agaggccctg ggaggaagcc atgcatccaa gggcacactg ctcaaaagca tctcaatgac 3300
atggcctctc ctttgcctac cccgctccat tcctcagtct ccctcctggc aagagagacg 3360
tttcccagat atgacaagga cagagagaga gatgtcctga ggagaaagcg ggccttagag 3420
atgagcttgt caccttcccc ggctgtatac tactcatgct ggtacccccc ggtcttctct 3480
gctcacccca tcctcctttc ttgccatgtc ctggctgagg gaaggtgcta gtcttaactt 3540
gcttggtcca aagatagctg actgagccct acctgtcttc tctgattcct cacaaacatt 3600
tagttggtat accatgccag ccctttgtcg ggttcccagt gtctctacag ctgagactta 3660
tcttttgacc ccagaaacct ataatccaat gggcagatga acaacacaat cccaagagct 3720
tcaagagagg gctgtggggg aacagcggag cagtgaggat tgcttgggct ggggaaagga 3780
ggtactggag aggggctgct tgggatggcg tgtgcgtgac aggagagagt aaggacgatg 3840
ggctctccat gctgagccac aggccttggc ttcagtggtt cccatggtct gggtgccttt 3900
ccttgctttt gactttgctg aattccttac caacctaccg aggccctcag acacaccata 3960
gggtatgtgt cagacacacc gggcccggcc tggcagctcc tcacctgcct cctctttcca 4020
gagcctgaac agaaccagcg gccaggtctc ctggttcaca atacccttgc cagccccacc 4080
cgggcaggca tctgctccca ggctccagcc ccctttgtcc tctgctctga aaagcaccgt 4140
ttcccttttc tgggtgacca cacaccatgc acagggaatt tccattgtag cctgcggagt 4200
gtctgattca ctcaggcccc tcacaaagtt aactccttgc aggtccaaca cagtaggctg 4260
tctcccaccc aatcttgggt agctgtgtac tgaccttagg ccccatagaa aggaacttga 4320
gctcagaaac tccacttagc tcccctcatt catcccaaaa ccctgaccat gcaccctcag 4380
gcagtttccc agacatcgag ggattggagg ggaggcaaac atgccccttt ctacctgtgt 4440
ggcctgaaat gagcccatgg cttacctata aagcagaagc aattcctgtc tgtagtctta 4500
ctgaaaaggc aagtgtgctg ggcccacagt aagagctctt tattagtttt ctatcttttt 4560
aaagagccca ctactctgat cggggtctcc gctcaagacc aggtcctctg ggctggctct 4620
ctctttctga gagcagaggg ctcagagaca ttgcctttga gttggtgggg acctgaagag 4680
aaaagcatct cacagccctt cttttccaat cctctgactt cttttctcgg aagctcttaa 4740
gggactgagg actaagcaag atgctgagtt ctggagacgg gactgtcttc ttccccagat 4800
tgagatgcca ggcatgtgtg tctcacacag actctgtgcc tactacctca gttagccttg 4860
agaaatcccc acctccattc ccagaggtat cttctattat tgctcctatc tggggacaaa 4920
gagcctgagg tccctagaag tgggttcctg gctctcagtt gtgaagataa ttaggtatag 4980
ggagtcacac tgcaggtcac agaaagcact ggcagaagcc aatgaaagag gcacatacta 5040
agtagacttt tagtcttgga aacaaggcta ggaggtgatt cttgttgatg tctctctgta 5100
gagctgagcc taagttctgg agaggggaag gaactcagaa ggctacatgg ccaatccatg 5160
ggggttgggg gagaacccgt ggagctagag atgggatggt agagggggcg ccttagagga 5220
ggtaggcctg agtggggaag cagctcttgt ccttggtgag caagctggag gtgtggtgct 5280
gcccgtggcg agcagacgga agttgctgtg ggtggcggtg ggtttgaggt gcaggagact 5340
gagtgatgtg gccaggaggt gagagctccg catctgcagg cctggtcagc aggagacggg 5400
gttcagtaag attcagagga gtgtgggctg aactggagat ttgtatctct cagtcaccgg 5460
ccctggaaca catgggacca ggaaccggaa tagaacagga ggagaaactg aggcaaggct 5520
tgggaaagac agagcaaact gaaaaaaaaa aaaaaagggc acttagagga gtgtccagta 5580
gggtgtggaa gacagtgaga gcctgtgtga gcaaagcctg tgggagattg agaaagagca 5640
gagcttctgg gaatgttgag tcttctggtt ggcatggggg tagggctagc tggactccca 5700
gtgtaggagg ctccagcaca ggcctccaag gtatgggctc cagctctgga caggtaagag 5760
ctgaggaaga cttccaggta gggagagaca caagaagcca agaggtgaga cagctgaaga 5820
aggccaggcc ctagggcact cagagctgca ggcatctctg ccctctgccc ctaacccaca 5880
gccactgtgt gtgcccattg catgactctc acctctctga cctcagtctc tcacctgcaa 5940
aatagcactg ataagtcctg cctggtggaa ccacgaacag gtcagaggag ctgacattgg 6000
catacagtag aaacttaata aacgccagtt gcccacagta ctcaaaaaag cacttgcagg 6060
aggctttttc tcccgtcttt tctgatctgg cttggctgag taagtctaca agatataaag 6120
ccacttcaga ggctcagttg cctgctacca gggaggttga taacggaggt gacttcagat 6180
cttgatgggt gagactgtac ccaccactgt gcccacaatc agagtcaagg tcaaactcca 6240
gcccccagcc ctgattgatg ccccctctgg gtctgctctt agggttcttc tgctgttccc 6300
acatctgatg atgtcgacac tgggtggccc cgatgcttgg agccctgtgc gttccttccc 6360
tcacctgcgt ccagggcttg ctcaaatcta ctgttctgtt ctgcgtgtct cctttcatat 6420
atcaaccttc cagcatgtgc acccctttcc ccagatgcct gcccctttta tctacagctc 6480
ctttgcttct aacaggcagt ggaagattct cgcttcttct ggtcacctgg catctagaga 6540
actcaagtaa atatttgttg actttctttt tctttttttc tttctttctt tttttttttt 6600
tttttttttt tttttttttt ttggtctttt ggttttttgg ttttttcgag acaggaactc 6660
actttgtaga ccaggctggc ctcgaactca gaaatccacc tgcttctgcc tcccgagtgc 6720
tggggttaaa ggcgtgcacc accacaccca gcttgttgac tatcttaatg ttctcaagag 6780
ccaacccagt gttgtggcca aaacttgtgg agctctgagg ggcctaagta acgcaggctg 6840
gggccccagg aacctctccc agtgtctcaa ccatgagagg aagttgcaag acggccattt 6900
cagtacacgg acaggctcag ctctttatgg tcagctttcc cagccctcga tgggaaggtc 6960
tgtgttttca cacgcattct gccacagctc ctggggttct gtgtggagga aagtgggaag 7020
gggagtcctc tcacttctca gtcctttggg ctgccgtgcc gtgctgtgcc agggaggttg 7080
agggtctgta gttggagggc ttctgctggt ttctggtggc tggcctagtc tgcgattgca 7140
ttaacaccct gcccaccccc atcagcaacc agcccagagg ggacaaaggg atatacagct 7200
accaggctgc tgatctccct gtcactctga aggccacctc ttgcagcacc atcatgtgta 7260
ctgctattag gacgataaat tggtacaatt cagttgtgca agataaggca atacttatct 7320
gtctatcatc tctctccgaa ttaaaaacgc actgcccttt gaccttgtaa ttcaaatgtt 7380
agacattttt gctagacaca tccctacatg tgtataaact aatgtatttt atcaacacag 7440
ccccggttag agcgcaaaag atggctgaac ataactgggc aaacctgtaa tacactgtgt 7500
cctccgggaa gcaggaacag aagacctgtc agttcaaggc cagaaaaaag aaagaacaaa 7560
gaaagaataa cccaagttga taaggacctg gttatagaaa ctgtgaccac gagacactat 7620
ccagcaaatg acaagaacca cagcaacacg catccccatg ggcctcaaga gcaacaccaa 7680
agaccctgca agtttcctct atccattttc tgttgtgaaa ataaattacg aagccagtct 7740
aggttacata gtgagatcca ggctaaccag actggcatgg tctcaactag taagtaagta 7800
agtaagtaag taaataaaat ttaaaaactg aaatgcactt ttagagatgt ttataaggaa 7860
gagcagacag gatggtgctg taactcagag ctcttggctg gtcctcgtga gacctttatt 7920
tcaattcaat ccccaggacc gcaaagaaac gggactggag gcacaggccg ggaatcccag 7980
cttctggaga gaatgagatg ggtgtgggtg ggtgtgtggg tggcaggaag ttccaggcct 8040
gctgggcaat ttagtgacat tttgtttcat atttaggaag ggcggaagat acagctcagt 8100
ggcagagctc ttgcctggct catgtgaggc cctgggttta acctctgtgc cagacagaaa 8160
gaaaaatcac agagatgaag ttagggtaca gttccttcta gaaggaaatg ggggcagggc 8220
acgtagggca agcttcatgt tcatgtcttc acctgggtga ttacataaca ggtgttaact 8280
ttacaattat ctttcactgc aaatacatat gatatgtgct ctattttatg aatggtgccc 8340
cattgtctgc agatacaaag ctggacttgg tgacacacat tcattgcctt gctactggtt 8400
ttattttgtt ttgttttcag aacctaggaa tcaaactcgg ggccttgtgc atgttaggga 8460
agaactctaa acactggggt acatcttcag ctgtagtcct tgttgcttat gagattgagg 8520
gtcacttgag cccaggaatt tgggtataac caacacaaga cactatctca ataaaataca 8580
ttcgtttgtt ttctatatat ttagtgtgtg tgcatcatgg cgtgggtgga ggcatgcacg 8640
agtgtggagg cgagaggagc tctcatatgt gagtcagttc cctcctccca ccagctgggt 8700
cccacggatc taagagtttc aaggttgtta gcctttacca ttaagctatt tcatttgccc 8760
gatttttttt ttaaacaaac tacatttttt ttctcttgta ttaccatgtt atattcctgg 8820
taaagtaatc ataagttgga aatgcttaaa attaaaaatg catttcctag ggctggccaa 8880
caggctcggc aagggagggc agcagctgct caactgagaa gcctgaattc agccctggaa 8940
aggcacatgg tagaagagaa caaactccac agagttgtct tctgacctcc acacgtgggc 9000
catggcacac atacctgccc catcagacac acagtgaaaa cacaatgtgt tttaacttta 9060
aaatgtatgt atgtcaggtc atggtggtgc gcctttaatc ccagcactca ggaggcagag 9120
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agagagactc tgctttaaag aaaagaaaga ggtggagtgt gaaagagaaa gatgcttgaa 23100
gtccttctgg cttctgcatg tgcacacact catctgaaca tccacatgta cacacacaca 23160
catacacacc aaaataaaat aaacaaaagg gttagacaag gtcaggagag gttttgaagg 23220
tatcaaatac acatagtata aaatttacca cctgtgatgg tttgtatatc cttggaccag 23280
ggagtggcac catctgaagg tgtggccttg ttggaatagg tgtgacctgg ttggaatggg 23340
tgtgtcactg tgggtgtggg tataagatcc tcaccctagt tgcctggaag tcagtcttcc 23400
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gatgctgtca tgctcccaac ttgatgataa tggactgaac ctctgaacct gtaagccagc 23520
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gtgcctggca cagggataga tgctgtgggg tgaataggat gctgatacag ccacattcaa 25380
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aggaaggaaa gacaatgaca gaacaaaaga gaaaagaaaa gaaaggggag agagagagag 27360
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL2_R
<400> 28
gcattagctt cagatttacg ggt 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL9_F
<400> 29
ccctctcctt cctcattctt aca 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL9_R
<400> 30
agtcttgaaa gcccatgtga aa 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C5AR1_F
<400> 31
atggacccca tagataacag ca 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C5AR1_R
<400> 32
gagtagatga taagggctgc aac 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD40_F
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tgtcatctgt gaaaaggtgg tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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actggagcag cggtgttatg 20
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<211> 19
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ctggaggttc ggaggcatc 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PARP14_F
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> LRRC25_F
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LRRC25_R
<400> 40
gtctgagtcc agtctaccct g 21
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 1) 수탁번호 KCLRFBP00375로 기탁된 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에 미세아교세포 활성화 유도물질을 처리하는 단계;
2) 상기 미세아교세포 활성화 유도물질이 처리된 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에서 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자 발현 정도를 측정하는 단계;
3) 정상 생쥐 미세아교세포주에 미세아교세포 활성화 유도물질을 처리하는 단계;
4) 상기 미세아교세포 활성화 유도물질이 처리된 정상 생쥐 미세아교세포주에 시험물질을 접촉시키고 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자 발현 정도를 측정하는 단계; 및
5) 상기 정상 생쥐 미세아교세포주에서 측정된 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자 발현 정도를 상기 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주에서 측정된 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자 발현 정도와 비교하여 동등하거나 저발현하는 여부를 판단하는 단계;를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 미세아교세포 활성화 유도물질은 LPS(lipopolysaccharide), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 트롬빈(thrombin), 또는 베타-아밀로이드(β-amyloid)인 것인 스크리닝 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 염증성 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinsonism disease, PD), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS, 근위축성축삭경화증) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 스크리닝 방법.
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- 삭제
- 삭제
- 미세아교세포 활성화 유도물질 매개에 의한 CCL2, CCL9, C5AR1, CD40, HCAR2 및 PARP14 유전자를 저발현하는, 수탁번호 KCLRFBP00375로 기탁된 PU.1 유전자 넉아웃(knock-out) 생쥐 미세아교세포주를 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝용 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020170004127A KR101883929B1 (ko) | 2017-01-11 | 2017-01-11 | Ｐｕ.１ 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170004127A KR101883929B1 (ko) | 2017-01-11 | 2017-01-11 | Ｐｕ.１ 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이의 용도 |
Publications (2)
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| KR101883929B1 true KR101883929B1 (ko) | 2018-08-01 |
Family
ID=63103347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170004127A KR101883929B1 (ko) | 2017-01-11 | 2017-01-11 | Ｐｕ.１ 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이의 용도 |
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Families Citing this family (2)
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3046551B1 (en) * | 2013-09-18 | 2020-08-05 | Georgetown University | Treating neurodegenerative disease with fenofibrate and analogs thereof |
-
2017
- 2017-01-11 KR KR1020170004127A patent/KR101883929B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PNAS, 2006, Vol. 103, No. 43, p. 16021-16026 (2006.10.24.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180083017A (ko) | 2018-07-20 |
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