KR102036613B1 - 탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 세포주 라이브러리 - Google Patents

탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 세포주 라이브러리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 복수개의 세포주로 구성된 라이브러리 및 이를 응용한 키트에 관한 것으로, 이를 이용하여 특정 단백질과 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 간편하고 신속하게 발굴할 수 있다.

Description

탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 세포주 라이브러리{Deubiquitinating enzyme gene knock-out cell line library}
본 발명은 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주 라이브러리 및 이를 이용한 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 방법에 관한 것이다.
유비퀴틴(ubiquitin, Ub)은 76개의 매우 잘 보존된 아미노산으로 구성되어 있으며 모든 진핵 세포에 존재한다. 유비퀴틴에 의한 기질 단백질의 변형은 세포 내 다양한 과정을 조절하는데 매우 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 단백질 대사뿐 아니라 염색체 구조 조절, DNA 수선, 신호전달, 항원 제시, 바이러스 독성, 스트레스 반응 그리고 단백질의 이동 등에 관여한다.
유비퀴틴화에 의한 기질 단백질 변형은 단백질의 인산화/탈인산화에 의한 변형에서와 같이 가역적으로도 일어날 수 있다. 즉, 기질 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 것이 가능한데 이를 탈유비퀴틴화(deubiquitination)라 하며, 이 반응을 활성시키는 효소 군을 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB)라 한다.
탈유비퀴틴화 과정에 대한 연구는 유비퀴틴의 결합 과정에 대한 연구에 비해 아직은 초기 단계이지만, 유비퀴틴 결합과정의 역으로 작용하기 때문에 탈유비퀴틴화 과정 또한 세포 내 다양한 생리작용의 조절에 기여할 것으로 예상되며, 특히, 탈유비퀴틴화 효소는 유비퀴틴의 비활성 전구체를 활성화하는 역할도 한다. 최근 탈유비퀴틴화 관련 연구들로 인해 탈유비퀴틴화 과정의 중요성이 밝혀지고 있다.
사람에는 약 100개의 DUB가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 자세히는, 탈유비퀴틴화 효소는 크게 UCH (Ub C-terminalhydrolase), USP (Ub-specific processing protease), Otubain (OTU-domain Ub-aldehyde-binding protein), MJD (Machado-Joseph disease) 그리고 JAMM (Jab1/Pad1/MPN domain metallo-enzyme) family의 5개 그룹으로 나눌 수 있는데 이 중 USP 가 가장 큰 그룹을 형성한다.
USP의 경우는 주로 350 아미노산으로 구성된 활성-도메인을 가지고 있으며 단백질 분해 효소(Cysteine protease)들이다. 이들 USP 활성 도메인의 아미노산 보전 정도는 전반적으로 그리 높지 않은 편이지만, 활성 시스테인(Cysteine)과 히스티딘(Histidine) 잔기를 둘러싼 부위, 즉 시스테인 박스(Cysteine box) ＆ 히스티딘 박스(Histidine box) 는 잘 보존되어있다. USP의 경우 이런 활성-도메인 외에 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 도메인들을 다수 포함하고 있는데, 아마도 기질 인식, 세포 내 위치조절 및 단백질-단백질 상호작용 등에 관여하는 것으로 여겨진다.
탈유비퀴틴화 효소가 세포의 성장과 분화, 유전자의 전사(transcription) 조절과 같은 세포의 기초대사부터, 암, 각종 뇌질환 등 여러 질환에도 연관되어 있다는 것은 이미 알려져 있으나, 이들의 기능과 조절기전에 대한 연구는 그 효용성에 비해 충분치 않은 실정이다.
주된 이유는 특정 단백질에 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 탐색, 동정할 수 있는 효과적인 연구 시스템이 없기 때문이다.
이에 본 발명자들은 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 세포주 라이브러리를 구성함으로써, 상기 세포주 라이브러리를 이용하여 특정 단백질의 안정성이 어떤 탈유비퀴틴화 효소에 의해서 조절되는지 신속하고 정확하게 탐색할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명의 목적은 특정 단백질의 안정성을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 신속하고 정확하게 스크리닝할 수 있는 시스템을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 세포주를 하나 이상 포함하는 세포주 라이브러리(cell line library)를 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포주 라이브러리에 속한 각각의 세포주는 1개의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃될 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포주 라이브러리에 속한 각각의 세포주는 서로 다른 종류의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃될 수 있다.
바람직하게는, 상기 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 넉아웃은 유전자가위 기술을 이용하여 유도될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 세포주 라이브러리에 속하는 하나 이상의 세포주에서 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; (b) 발현수준에 따라 특정 단백질의 발현을 조절하는 탈유비퀴틴 효소를 선정하는 단계를 포함하는, 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계는 웨스턴 블롯팅(western blotting) 기법으로 수행될 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 세포주 라이브러리는 키트 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주에서 유래한 세포용해물(lysate) 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 유전자 넉아웃용 sgRNA(single-guide RNA ) 서열을 제공한다.
본 발명은 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 복수개의 세포주로 구성된 라이브러리 및 이를 응용한 키트에 관한 것으로, 이를 이용하여 특정 단백질과 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 간편하고 신속하게 발굴할 수 있다.
또한, 특정단백질과 탈유비퀴틴화 효소 사이의 상관관계를 손쉽게 연구할 수 있도록 함으로써, 암, 퇴행성 신경질환 등 난치성 질환의 신약 개발에도 도움이 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 세포주 라이브러리 키트를 도시한 것이다.
도 2는 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 넉아웃시키는 sgRNA를 제작하여 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 넉아웃시킨 뒤 T7 endonuclease 1 assay를 시행한 실험데이타이다.
도 3은 선별한 sgRNA와 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술을 이용하여 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 넉아웃시킨 뒤 T7 Endonuclease 1 assay를 통해, 해당 USP 유전자의 Indel efficiency(유전자 KO 여부)를 확인한 실험데이타이다.
도 4는 본 발명에 따른 세포주 라이브러리 제작 과정에 대한 모식도이다.
도 5는 sgRNA를 이용하여 USP28 유전자가 넉아웃된 인간 전분화능 줄기세포주를 확립한 T7E1 실험데이타이다.
도 6(a)는 본 발명에 따른 세포주 라이브러리에서 웨스턴블롯팅을 통해 p53 단백질의 발현량을 측정한 실험데이타이다.
도 6(b)는 USP39 단백질 양과 p53 단백질 양의 상관관계를 분자생물학적 기법을 통해 검증한 실험데이타이다.
도 7(a)는 본 발명에 따른 세포주 라이브러리에서 웨스턴블롯팅을 통해 REST 단백질의 발현량을 측정한 실험데이타이다.
도 7(b)는 USP19 단백질 양과 REST 단백질 양의 상관관계를 검증한 실험데이타이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 세포주를 하나 이상 포함하는 세포주 라이브러리(cell line library)에 관한 것이다.
본 발명자들은 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 복수개의 세포주를 포함하는 라이브러리를 발명함으로써, 특정 단백질과 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 간편하고 신속하게 발굴할 수 있도록 하였다.
탈유비퀴틴화 효소는 특정 단백질에 결합된 유비퀴틴 분자를 제거시켜 단백질 분해를 조절하는 효소이다. 탈유비퀴틴화 효소는 세포의 성장과 분화, 유전자의 전자 조절과 같은 세포의 다양한 기초대사에 관여하며, 암, 뇌질환 등 여러 질환에도 연관이 되어 있다.
탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB)는 UCH (Ub C-terminalhydrolase), USP (Ub-specific processing protease), Otubain (OTU-domain Ub-aldehyde-binding protein), MJD (Machado-Joseph disease), JAMM (Jab1/Pad1/MPN domain metallo-enzyme) family의 5개 그룹으로 나눌 수 있다.
자세히는, USP(Ub-specific processing protease) 그룹에 속하는 USP1, USP2, USP3, USP4, USP5, USP6, USP7, USP8, USP9X, USP9Y, USP10, USP11, USP12, USP13, USP14, USP15, USP16, USP17, USP17L2, USP17L3, USP17L4, USP17L5, USP17L7, USP17L8, USP18, USP19, USP20, USP21, USP22, USP23, USP24, USP25, USP26, USP27X, USP28, USP29, USP30, USP31, USP32, USP33, USP34, USP35, USP36, USP37, USP38, USP39, USP40, USP41, USP42, USP43, USP44, USP45, USP46 가 있으며, Otubain(OTU-domain Ub-aldehyde-binding protein) 그룹에 속하는 OTUB1, OTUB2가 있고, MJD (Machado-Joseph disease) 그룹에 속하는 ATXN3, ATXN3L 및 UCH (Ub C-terminalhydrolase) 그룹에 속하는 BAP1, UCHL1, UCHL3, UCHL5 등이 있다.
본 발명자들은 현재까지 보고된 탈유비퀴틴화 효소들 중에서 가장 중요도와 활용도가 높은 탈유비퀴틴화 효소를 선별하여 실험에 이용하였다. 본 발명의 일 실시예에서는, USP (Ub-specific processing protease) 그룹에 속하는 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃 된 세포주 라이브러리를 제작하였으나, 이에 제한되지 않는다.
탈유비퀴틴화 효소는 상기 나열한 탈유비퀴틴화 효소 이외에도 연구자들의 연구를 통해 지속적으로 발굴되고 있으며, 앞으로 새롭게 발굴되는 탈유비퀴틴화 효소 또한 본 발명에 적용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에서, 용어 '유전자 넉아웃(knock out)' 이란 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다. 본 발명은 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 넉아웃시킴으로써, 세포 내 다양한 생명현상들을 조절하는 특정 단백질과 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 확인할 수 있도록 한 것이다.
본 발명에 있어서, 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 넉아웃은 '유전자 가위 기술'을 이용하여 유도될 수 있다.
'유전자 가위 기술'은 유전체에서 원하는 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 기술을 의미한다. 인간 및 동식물 세포의 유전체를 교정하는 데 사용되는 유전자 교정(genome editing) 기술로 유전체에서 특정 염기 서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 시스템을 말한다.
현재까지 개발된 유전자가위로는 1세대 징크핑거 뉴클레이즈(ZFNs · Zinc Finger Nucleases), 2세대 탈렌(TALENs · Transcription Activator-Like Effector Nucleases), 3세대 크리스퍼(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated, CRISPR/Cas9)가 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술을 이용하여 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 넉아웃을 유도하였다.
가장 최근 기술인 크리스퍼 유전자가위는 인간이나 동식물의 세포에서 특정 유전자가 있는 DNA를 잘라내는 효소로 박테리아의 면역시스템에서 유래하였다. 크리스퍼 유전자 가위는, 교정하려는 DNA를 찾아내는 가이드 RNA와 DNA를 잘라내는 Cas9 단백질로 구성된다. 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 기술을 이용하면 유전자를 잘라내고 새로 바꾸는 데 최장 수년씩 걸리던 것이 며칠로 줄어들며, 동시에 여러 군데의 유전자를 손볼 수도 있다. 또한, DNA 특정 서열만을 타게팅하여 작동하기 때문에 정확도가 높으며 가이드 RNA 커스터마이징을 자유자재로 할 수 있어 디자인 유연성이 뛰어나다. 더욱이, 하나의 가이드 RNA와 하나의 단백질로 심플하게 구성되어 있어 활용성이 좋으며 대량생산에 용이한 장점이 있다.
본 발명자들은 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자에 특이적으로 결합하여 넉아웃을 유발하는 sgRNA(small guide RNA)를 탈유비퀴틴화 효소 유전자 별 2개씩 제작, 총 100 여개 이상의 sgRNA 서열을 제작한 뒤, 이를 이용하여 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주를 구성하였다.
상기 sgRNA는 특정 DNA에 특이적인 RNA로서, 탈유비퀴틴화 효소 유전자에 특이적으로 결합하여 넉아웃을 유발할 수 있으며, 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자가위 기술에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 탈유비퀴틴화 효소 유전자 별 2개의 sgRNA를 제작한 뒤, 넉아웃 효율이 좋은 sgRNA를 선별하여 이를 CRISPR/Cas9 유전자가위 기술에 이용하였다.
목표 유전자의 단백질 발현을 억제시키기 위한 수단으로, 상기 유전자 가위 기술 이외에도, siRNA가 이용되기도 하나, 세포 내 지속시간이 수일에 불과하여 표적을 억제하는 시간과 효과가 일시적이기 때문에, 이를 이용하여 본 발명과 같은 넉아웃 세포주 라이브러리를 키트 형태로 제작하는 것은 불가능하다.
CRISPR/Cas9을 비롯한 유전자 가위 기술은 유전체 상에서 해당 유전자 서열을 완전히 넉아웃(knock-out)시키기 때문에 siRNA 기술에 비하여 목표유전자의 발현을 원천적으로 차단할 수 있을 뿐만 아니라, 각각의 탈유비퀴틴화 효소들이 knock-out된 세포주들의 유전체 서열분석을 통하여, 해당 유전자 서열의 어느 부분이 어떻게 knock-out 되었는지 명확히 할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 유전자 가위 기술로서, 3세대 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술을 이용하였으나 이에 제한되지 않는다. 다른 종류의 유전자 가위 기술도 적용가능하며, 앞으로 개발될 새로운 유전자 가위 기술도 적용 가능함은 물론이다.
본 발명에 따른 세포주 라이브러리에 속한 각각의 세포주는 1개의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃될 수 있다.
또한, 상기 세포주 라이브러리에 속한 각각의 세포주는 서로 다른 종류의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃될 수 있다.
본 발명에서 '세포주 라이브러리(cell line library)'란 복수 개의 세포주의 집합을 의미한다.
본 발명자들은 현재까지 기능이 알려지고 기능의 중요성이 높다고 보고된 탈유비퀴틴화 효소 약 50 여개를 선별한 뒤, 세포주 별로 탈유비퀴틴화 효소 유전자를 넉아웃시킨 뒤 이들의 집합체인 세포주 라이브러리를 제작하였다.
본 발명에 따른 세포주 라이브러리에 속하는 각각의 세포주는 탈유비퀴틴화 효소 유전자 1개가 넉아웃되어 있으며, 바람직하게는, 서로 다른 종류의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃될 수 있다.
본 발명에 따른 세포주 라이브러리에 포함된 세포주의 개수는 약 1 내지 100개일 수 있다. 현재까지 알려진 탈유비퀴틴화 효소는 약 100여 종류이지만, 앞으로, 탈유비퀴틴화 효소 종류가 더 밝혀진다면, 세포주 라이브러리에 포함된 세포주의 개수는 100개 이상으로 더욱 늘어날 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 약 50 여개의 세포주로 라이브러리를 구성하였으나, 연구자의 실험 목적에 따라 라이브러리에 속하는 세포주의 개수는 조절할 수 있다. 또한, 실험자는 원하는 탈유비퀴틴화 효소를 선별하여 세포주 라이브러리를 구성할 수도 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 HEK293T(Human Embryonic Kidney 293 cell)일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 세포주는 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 배아 종양 세포주인 NCCIT(human embryonic carcinoma cell line)일 수 있다.
세포주로서 줄기세포를 이용하는 경우, 본 발명을 통해 줄기세포의 특성을 유지하는데 관련된 주요 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화효소를 탐색할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 HEK293T, NCCIT 세포주를 이용하였으나, 본 발명의 라이브러리를 구성하는 세포주의 종류는 이에 제한되지 않으며, 사용자가 실험목적에 따라 다양한 세포주를 이용하여 세포주라이브러리를 제작할 수 있다. 예를 들어, H9, H1, CHA3 또는 CHA4 세포일 수 있으며, 마우스 줄기세포도 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 세포주 라이브러리는 동일한 종류의 세포주 복수개로 구성되며, 각 세포주는 탈유비퀴틴화 효소 유전자 1개가 넉아웃되어 있으며, 각 세포주는 서로 다른 종류의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포주 라이브러리에 속하는 하나 이상의 세포주에서 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; (b) 발현수준에 따라 특정 단백질의 발현을 조절하는 탈유비퀴틴 효소를 선정하는 단계를 포함하는, 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주 라이브러리에서, 연구자가 목적으로 하는 특정 단백질의 발현이 유지되는지 아니면 분해되어 감소하는지를 측정함으로써, 특정 단백질의 안정성을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 발굴할 수 있다.
이는, 매우 간편한 공정을 통해, 연구자가 목적으로 하는 특정 단백질과 탈유비퀴틴화 효소와의 상관관계를 신속하고 정확하게 탐색할 수 있어, 특정 단백질과 연관된 탈유비퀴틴화 효소를 발굴하여 그 기능을 분석하고 활용하는 의생명과학 전 분야에 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계는 웨스턴블롯팅(western blotting) 기법으로 수행될 수 있다.
"단백질 발현 수준 측정"이란 탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 라이브러리에 속하는 각 세포주에서 탈유비퀴틴 효소 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포주 라이브러리는 키트 형태로 제조될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포주 라이브러리를 키트 형태로 제작한 것을 도식화 한 것이다.
상기 키트는 탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 라이브러리를 구성하는 모든 세포주, 또는 세포주에서 파생된 단백질, RNA 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 라이브러리는 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주에서 유래한 세포용해물(lysate)로 구성될 수 있다.
본 발명은 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주에서 유래한 세포용해물(lysate)을 포함하는 특정 단백질 조절 탈유비퀴틴화 효소 탐색용 키트로도 활용될 수 있다.
키트 형태로 제조시, 운반, 보관, 이동이 용이하여, 사용자에게 용이하게 제공될 수 있고, 세포용해물(lysate)을 포함하도록 구성되는 경우, 웨스턴 블롯팅과 같은 간편한 방법을 통해 사용자가 원하는 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 매우 용이하게 발굴할 수 있다.
다시말해, 사용자는 상기 라이브러리에서 연구하고자 하는 단백질의 발현양상을 간편한 공정으로 파악함으로써, 해당 단백질의 조절에 관여하는 새로운 탈유비퀴틴화 효소를 용이하게 발굴해 낼 수 있다.
또한, 연구자는 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 세포주에서 유래한 세포용해물(lysate)을 이용하여 연구자가 원하는 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 간편한 공정으로 발굴할 수 있다.
최근 탈유비퀴틴화 효소의 중요성이 인식되면서 관련 연구규모는 커지고 있으나, 개별 연구 집단에서 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 발굴하는 것이 실험적으로 어렵고 정확도도 떨어져, 비용은 많이 발생되고 효율은 낮아 연구자들이 많은 어려움을 겪고 있다.
본 발명에 따른 세포주 라이브러리를 이용하면 별도의 복잡한 처리과정 없이 웨스턴 블롯팅(Western blotting)과 같은 기법을 통해 특정 단백질의 발현 정도를 확인함으로써 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소를 발굴할 수 있기 때문에, 다른 실험기법들에 비하여 소모되는 기간이 2~5일 정도로 짧고 비용이 매우 저렴하면서도 정확하다는 장점이 있다. 즉, 본 발명은 특정 단백질 관련 탈유비퀴틴화 효소를 탐색, 동정할 수 있는 효과적인 연구 시스템이라 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 탈유비퀴틴화 효소 유전자 넉아웃 세포주 라이브러리( DUBs KO Library) 제작
(1) sgRNA sequence 선별
본 발명자들은 USP 그룹에 속하는 각각의 탈유비퀴틴화 효소 유전자에 대응하는 sgRNA를 2개씩 디자인하고(in silico), 그 중 가장 높은 넉아웃(knock-out) 효율을 보이는 sgRNA sequence를 T7 Endonuclease1 assay를 통하여 선별하였다(도 2).
DUBs KO Library 제작에 사용된 USP family targeting sgRNA sequence
Gene sgRNA Direction Sequence (5' to 3') 서열번호
USP1 sgRNA1 FP GCATAGAGATGGACAGTATG 1
USP1 sgRNA1 RP CATACTGTCCATCTCTATGC
USP1 sgRNA2 FP CATCCGAAAGAGGAAATGAA 2
USP1 sgRNA2 RP TTCATTTCCTCTTTCGGATG
USP2 sgRNA1 FP TCCCTCCTGGACTATGACCG 3
USP2 sgRNA1 RP CGGTCATAGTCCAGGAGGGA
USP2 sgRNA2 FP TTAGGCAGTGGCCTCAGCGG 4
USP2 sgRNA2 RP CCGCTGAGGCCACTGCCTAA
USP3 sgRNA1 FP CTTTTCTGATTTCTTATGGT 5
USP3 sgRNA1 RP ACCATAAGAAATCAGAAAAG
USP3 sgRNA2 FP AGTTCAGCACACAGTATGTA 6
USP3 sgRNA2 RP TACATACTGTGTGCTGAACT
USP4 sgRNA1 FP GCTGAGTTGCCATTTCAGCA 7
USP4 sgRNA1 RP TGCTGAAATGGCAACTCAGC
USP4 sgRNA2 FP GGTATCTTATTGACAGCCGG 8
USP4 sgRNA2 RP CCGGCTGTCAATAAGATACC
USP5 sgRNA1 FP GGAGAAGTTTGAATTAGACG 9
USP5 sgRNA1 RP CGTCTAATTCAAACTTCTCC
USP5 sgRNA2 FP CACCCCGGAAGAAGCCCACG 10
USP5 sgRNA2 RP CGTGGGCTTCTTCCGGGGTG
USP6 sgRNA1 FP CTATTCGGAGTATAACCCGG 11
USP6 sgRNA1 RP CCGGGTTATACTCCGAATAG
USP6 sgRNA2 FP ATAGTTTGCAGGCACAGGAG 12
USP6 sgRNA2 RP CTCCTGTGCCTGCAAACTAT
USP7 sgRNA1 FP GAGTGATGGACACAACACCG 13
USP7 sgRNA1 RP CGGTGTTGTGTCCATCACTC
USP7 sgRNA2 FP ATCCTCCATGTCCTCCTCCG 14
USP7 sgRNA2 RP CGGAGGAGGACATGGAGGAT
USP8 sgRNA1 FP GGAACTATACACAATGATGA 15
USP8 sgRNA1 RP TCATCATTGTGTATAGTTCC
USP8 sgRNA2 FP ACAGGCAGGAGGAAGCACAG 16
USP8 sgRNA2 RP CTGTGCTTCCTCCTGCCTGT
USP9X sgRNA1 FP CCAGATCCTCGATCACCAAA 17
USP9X sgRNA1 RP TTTGGTGATCGAGGATCTGG
USP9X sgRNA2 FP ACGACTCGTGGCTCTCCGGT 18
USP9X sgRNA2 RP ACCGGAGAGCCACGAGTCGT
USP10 sgRNA1 FP GCTGTGGATAAACTACCTGA 19
USP10 sgRNA1 RP TCAGGTAGTTTATCCACAGC
USP10 sgRNA2 FP GCTTCCAAAATAACCCCTGA 20
USP10 sgRNA2 RP TCAGGGGTTATTTTGGAAGC
USP11 sgRNA1 FP GCGTTGGCTGTAGAAGAGAA 21
USP11 sgRNA1 RP TTCTCTTCTACAGCCAACGC
USP11 sgRNA2 FP GCACTGGTATAAGCAGTGGG 22
USP11 sgRNA2 RP CCCACTGCTTATACCAGTGC
USP12 sgRNA1 FP TTGCGTATAAGAGTCAACCT 23
USP12 sgRNA1 RP AGGTTGACTCTTATACGCAA
USP12 sgRNA2 FP GATCTGCTAAGCATGTAAGA 24
USP12 sgRNA2 RP TCTTACATGCTTAGCAGATC
USP13 sgRNA1 FP AAGGTAAGAGGGGCGTCTGG 25
USP13 sgRNA1 RP CCAGACGCCCCTCTTACCTT
USP13 sgRNA2 FP GTGGAGCGTTACCAAAAAGG 26
USP13 sgRNA2 RP CCTTTTTGGTAACGCTCCAC
USP14 sgRNA1 FP TGGTAACACTTGTTACATGA 27
USP14 sgRNA1 RP TCATGTAACAAGTGTTACCA
USP14 sgRNA2 FP CCATGTGGATTGACAAACCT 28
USP14 sgRNA2 RP AGGTTTGTCAATCCACATGG
USP15 sgRNA1 FP GGTGTCCCCTTTCCGGAGCG 29
USP15 sgRNA1 RP CGCTCCGGAAAGGGGACACC
USP15 sgRNA2 FP CGGCGGATCTGGACACCCAG 30
USP15 sgRNA2 RP CTGGGTGTCCAGATCCGCCG
USP16 sgRNA1 FP ATTAGAAAAGGATTGGAACA 31
USP16 sgRNA1 RP TGTTCCAATCCTTTTCTAAT
USP16 sgRNA2 FP AGGCTTTAGTGAATGTGGAA 32
USP16 sgRNA2 RP TTCCACATTCACTAAAGCCT
USP17 sgRNA1 FP CAAACGTGTCATCGTCACAA 33
USP17 sgRNA1 RP TTGTGACGATGACACGTTTG
USP17 sgRNA2 FP TATGCAAGCTCACATCACAC 34
USP17 sgRNA2 RP GTGTGATGTGAGCTTGCATA
USP18 sgRNA1 FP GGAGTGATCACGAATGAGCA 35
USP18 sgRNA1 RP TGCTCATTCGTGATCACTCC
USP18 sgRNA2 FP GCAGCCCAGAGAGCGTCCCA 36
USP18 sgRNA2 RP TGGGACGCTCTCTGGGCTGC
USP19 sgRNA1 FP GCAAACCAGGAGAGCAAGGA 37
USP19 sgRNA1 RP TCCTTGCTCTCCTGGTTTGC
USP19 sgRNA2 FP TGTTCTTTCCTTCATCGTCA 38
USP19 sgRNA2 RP TGACGATGAAGGAAAGAACA
USP20 sgRNA1 FP TCACCTTGACTCCATAGGAG 39
USP20 sgRNA1 RP CTCCTATGGAGTCAAGGTGA
USP20 sgRNA2 FP AGGAGGTATTCCTGGAGCAG 40
USP20 sgRNA2 RP CTGCTCCAGGAATACCTCCT
USP21 sgRNA1 FP GGCCAGGTCTGCCTGATGAA 41
USP21 sgRNA1 RP TTCATCAGGCAGACCTGGCC
USP21 sgRNA2 FP AATAAACTGGAGCTGGGACG 42
USP21 sgRNA2 RP CGTCCCAGCTCCAGTTTATT
USP22 sgRNA1 FP GGAGGCGGCTCTGTACCAGA 43
USP22 sgRNA1 RP TCTGGTACAGAGCCGCCTCC
USP22 sgRNA2 FP CCAGTCCTCTGGAAGAGAGA 44
USP22 sgRNA2 RP TCTCTCTTCCAGAGGACTGG
USP24 sgRNA1 FP TGAGAATGGAAACTGCTCAG 45
USP24 sgRNA1 RP CTGAGCAGTTTCCATTCTCA
USP24 sgRNA2 FP TACAAGCGAGAAGAATCACT 46
USP24 sgRNA2 RP AGTGATTCTTCTCGCTTGTA
USP25 sgRNA1 FP ATCAACTGAGAGAAATTACG 47
USP25 sgRNA1 RP CGTAATTTCTCTCAGTTGAT
USP25 sgRNA2 FP GAGTTTGGCCGAATCAAACA 48
USP25 sgRNA2 RP TGTTTGATTCGGCCAAACTC
USP26 sgRNA1 FP GGACAGAGTTCATCAAAACG 49
USP26 sgRNA1 RP CGTTTTGATGAACTCTGTCC
USP26 sgRNA2 FP CCACCTGTGAGACCTGGTAA 50
USP26 sgRNA2 RP TTACCAGGTCTCACAGGTGG
USP27 sgRNA1 FP GCAGTATACCTGTATTACGG 51
USP27 sgRNA1 RP CCGTAATACAGGTATACTGC
USP27 sgRNA2 FP GAAGCAGCCAAAGAAGACAC 52
USP27 sgRNA2 RP GTGTCTTCTTTGGCTGCTTC
USP28 sgRNA1 FP GAGAGAAATCACAGGCATTC 53
USP28 sgRNA1 RP GAATGCCTGTGATTTCTCTC
USP28 sgRNA2 FP CTTTCTCCATGAAGCTCTGA 54
USP28 sgRNA2 RP TCAGAGCTTCATGGAGAAAG
USP29 sgRNA1 FP AGATCTTGCTATGTTGCCCA 55
USP29 sgRNA1 RP TGGGCAACATAGCAAGATCT
USP29 sgRNA2 FP TGAGGCGGGTGGATTACTGG 56
USP29 sgRNA2 RP CCAGTAATCCACCCGCCTCA
USP30 sgRNA1 FP GCGCTTCCTGCGGACCGGGG 57
USP30 sgRNA1 RP CCCCGGTCCGCAGGAAGCGC
USP30 sgRNA2 FP GAAGCGCTGGATGGCCCTGT 58
USP30 sgRNA2 RP ACAGGGCCATCCAGCGCTTC
USP31 sgRNA1 FP AAGAATGCACTGCAGTACCG 59
USP31 sgRNA1 RP CGGTACTGCAGTGCATTCTT
USP31 sgRNA2 FP ATGCCCAGGAGTTTCTGCTG 60
USP31 sgRNA2 RP CAGCAGAAACTCCTGGGCAT
USP32 sgRNA1 FP AATGGAAAGAATGCTCCACG 61
USP32 sgRNA1 RP CGTGGAGCATTCTTTCCATT
USP32 sgRNA2 FP GTAAAGTCCCAGATACACTC 62
USP32 sgRNA2 RP GAGTGTATCTGGGACTTTAC
USP33 sgRNA1 FP GATTTGATACAAAAATCCCT 63
USP33 sgRNA1 RP AGGGATTTTTGTATCAAATC
USP33 sgRNA2 FP AGATGTTCATATGTTGGCTG 64
USP33 sgRNA2 RP CAGCCAACATATGAACATCT
USP34 sgRNA1 FP ACAGAGTGCAGCTCGTAACA 65
USP34 sgRNA1 RP TGTTACGAGCTGCACTCTGT
USP34 sgRNA2 FP AAGCATAATGTTGTATCCAA 66
USP34 sgRNA2 RP TTGGATACAACATTATGCTT
USP35 sgRNA1 FP GGTCTGCAGCTGCTGCCCGA 67
USP35 sgRNA1 RP TCGGGCAGCAGCTGCAGACC
USP35 sgRNA2 FP GCGCCTCTACGTGGGCGGCG 68
USP35 sgRNA2 RP CGCCGCCCACGTAGAGGCGC
USP36 sgRNA1 FP GTTGCTCAACCCCAAAACAG 69
USP36 sgRNA1 RP CTGTTTTGGGGTTGAGCAAC
USP36 sgRNA2 FP CGGCTGATGATGGAGAACTG 70
USP36 sgRNA2 RP CAGTTCTCCATCATCAGCCG
USP37 sgRNA1 FP AATGTGGTGCTTCGACCCAG 71
USP37 sgRNA1 RP CTGGGTCGAAGCACCACATT
USP37 sgRNA2 FP GTAAGGATGCAGAGGAAATG 72
USP37 sgRNA2 RP CATTTCCTCTGCATCCTTAC
USP38 sgRNA1 FP GCTGATTATGAGCTGTCCGT 73
USP38 sgRNA1 RP ACGGACAGCTCATAATCAGC
USP38 sgRNA2 FP GCAGGTAGAGGTGTTACGGA 74
USP38 sgRNA2 RP TCCGTAACACCTCTACCTGC
USP39 sgRNA1 FP AAGCGAGAGTCTGAGTCGCG 75
USP39 sgRNA1 RP CGCGACTCAGACTCTCGCTT
USP39 sgRNA2 FP GCAGCTCCGGTCGCGTCAAG 76
USP39 sgRNA2 RP CTTGACGCGACCGGAGCTGC
USP40 sgRNA1 FP AGAGAATTCACCAATTTAAG 77
USP40 sgRNA1 RP CTTAAATTGGTGAATTCTCT
USP40 sgRNA2 FP AGCGGAATCAGAAATCAGGG 78
USP40 sgRNA2 RP CCCTGATTTCTGATTCCGCT
USP41 sgRNA1 FP CAGCCACAACTGGACCTGCG 79
USP41 sgRNA1 RP CGCAGGTCCAGTTGTGGCTG
USP41 sgRNA2 FP CCACTCTGTGTTGACTTCCA 80
USP41 sgRNA2 RP TGGAAGTCAACACAGAGTGG
USP42 sgRNA1 FP GAATCAGCCTGGCAGCTCCG 81
USP42 sgRNA1 RP CGGAGCTGCCAGGCTGATTC
USP42 sgRNA2 FP TCAGCCTATCAGAATCAGCC 82
USP42 sgRNA2 RP GGCTGATTCTGATAGGCTGA
USP43 sgRNA1 FP AAGTACGGCTCTCAGTTCCA 83
USP43 sgRNA1 RP TGGAACTGAGAGCCGTACTT
USP43 sgRNA2 FP GTTGCTGGATCGTGTACATG 84
USP43 sgRNA2 RP CATGTACACGATCCAGCAAC
USP44 sgRNA1 FP TATCACTGCACAACTCGTAG 85
USP44 sgRNA1 RP CTACGAGTTGTGCAGTGATA
USP44 sgRNA2 FP ACTGCACAACTCGTAGTGGG 86
USP44 sgRNA2 RP CCCACTACGAGTTGTGCAGT
USP45 sgRNA1 FP AGAAAGCCAAAAGAAGTAAA 87
USP45 sgRNA1 RP TTTACTTCTTTTGGCTTTCT
USP45 sgRNA2 FP AAGAAAGAAGATTCTATGAT 88
USP45 sgRNA2 RP ATCATAGAATCTTCTTTCTT
USP46 sgRNA1 FP AAACTTGCTGACGTGCCTG 89
USP46 sgRNA1 RP CAGGCACGTCAGCAAGTTT
USP46 sgRNA2 FP TCTGCTCTGGAAAAAGACAT 90
USP46 sgRNA2 RP ATGTCTTTTTCCAGAGCAGA
USP47 sgRNA1 FP GTGATTATGTCAGCCAAAGC 91
USP47 sgRNA1 RP GCTTTGGCTGACATAATCAC
USP47 sgRNA2 FP ATAGGTCCGCTTCCAAGAGA 92
USP47 sgRNA2 RP TCTCTTGGAAGCGGACCTAT
USP48 sgRNA1 FP TCGATGATCCCAACTGTGAG 93
USP48 sgRNA1 RP CTCACAGTTGGGATCATCGA
USP48 sgRNA2 FP TTTGTGGGCCTGACTAACCT 94
USP48 sgRNA2 RP AGGTTAGTCAGGCCCACAAA
USP49 sgRNA1 FP GCTAAGAAGCTCCCTCCTGG 95
USP49 sgRNA1 RP CCAGGAGGGAGCTTCTTAGC
USP49 sgRNA2 FP GCTCAATGATAACCCAGAGG 96
USP49 sgRNA2 RP CCTCTGGGTTATCATTGAGC
USP50 sgRNA1 FP TGATACCCTTCCAGTTAAGG 97
USP50 sgRNA1 RP CCTTAACTGGAAGGGTATCA
USP50 sgRNA2 FP CCTATCTGATGACAGACATG 98
USP50 sgRNA2 RP CATGTCTGTCATCAGATAGG
CYLD sgRNA1 FP AAGCTCCTTAAAGTACCGAA 99
CYLD sgRNA1 RP TTCGGTACTTTAAGGAGCTT
CYLD sgRNA2 FP AAAGGCCTCCAAATAGACGT 100
CYLD sgRNA2 RP ACGTCTATTTGGAGGCCTTT
(2-1) 크리스퍼 ( CRISPR / Cas9 ) 유전자 가위 기술을 이용한 DUB knock-out HEK293T 세포주 라이브러리 제작
선별된 각각의 sgRNA와 CRISPR/Cas9 3세대 유전자가위 기술을 이용하여, 각각의 탈유비퀴틴화효소(DUBs) 유전자가 넉아웃(knockout) 된 HEK293T 세포주를 확립하고 이를 기반으로 라이브러리를 구성하였다.
자세히 설명하면, 도 4에 도식화한 것과 같이, 상기 선별된 100 여개의 sgRNA sequence에 상보적으로 결합하는 reverse sequence를 디자인한 뒤, DNA 합성을 통해 oligo-DNA를 제작하였다. 각 sgRNA의 forward sequence와 reverse sequence를 annealing 한 후, RNA 발현 벡터(expressing vector)에 클로닝(cloning) 하였다.
클로닝된 특정 USP gene targeting sgRNA 벡터와 Cas9-PuroR 플라스미드를 HEK293T 세포주(ATCC에서 구입, CRL-3216TM)에 트랜스펙션(Transfection) 시킨 후, 3일간 퓨로마이신 함유 배지(puromycin containing media)로 셀렉션(selection) 하였다.
Single cell colony selection을 위하여, 트랜스펙션(Transfection)된 세포를 96well plate에 한 well당 1개의 세포가 들어가도록 seeding하였다. 약 10일 후, 적당한 크기를 가진 single cell colony를 harvest하여 genomic DNA를 얻고, 일부는 계속 배양(culture)하였다.
T7 Endonuclease 1 assay를 통해, 해당 USP 유전자의 Indel efficiency(유전자 KO 여부)를 확인하였다(도 3). Indel이 확인된 세포주는 DNA sequencing을 통해 유전자상 정확한 KO(넉아웃) 상태를 확인하였다. 목표로 한 USP 유전자의 넉아웃이 확인된 세포주를 DUBs KO Library에 포함시켰다.
상기 과정을 반복하여, 탈유비퀴틴화효소(DUBs) 유전자가 넉아웃(knockout) 된 HEK293T 세포주 50개로 구성된 세포주 라이브러리를 완성하였다.
(2-2) CRISPR / Cas9 유전자가위기술을 이용한 DUB knock-out NCCIT 세포주 제작
상기 과정과 동일한 방법으로, 탈유비퀴틴화효소 유전자가 넉아웃된 인간 배아 종양 세포주인 NCCIT(human embryonic carcinoma cell line) 세포주를 제작하였다(ATCC에서 구입, CRL-2073TM).
도 5를 참고하면, USP28에 대하여 선별된 각각의 sgRNA 1과 2와 CRISPR/Cas9 3세대 유전자가위를 이용하여, 각각의 USP28이 넉아웃 된 NCCITT 세포주 3개를 확립하였다(레인 1, 3, 4).
이 과정을 반복하여, 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 인간 전분화능 줄기세포주인 NCCIT 세포주 및 세포주 라이브러리를 완성하였다.
실시예 2: 세포주 라이브러리를 이용하여 특정 단백질의 조절에 연관된 탈유비퀴틴 효소 스크리닝
(1) 발암유전자인 p53의 발현과 관련된 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝
각각의 탈유비퀴틴화 효소가 넉아웃된 HEK293T 세포주 라이브러리에서, 웨스턴블롯팅(Western blotting) 기법으로 p53 단백질의 발현 수준을 측정하였다. p53 단백질의 발현량에 따라, 3그룹으로 분류한 뒤, 그 중 가장 발현수준이 낮은 그룹을 p53 단백질의 발현을 조절하는 후보군으로 선정하였다(도 6(a)).
p53 단백질의 조절에 유효하게 작용할 것으로 예상되는 몇 개의 후보들을 대상으로 p53 단백질양과의 상관관계를 분자생물학적 기법을 통해 검증한 결과, USP39 단백질의 양과 p53 단백질양이 가장 큰 상관관계를 보이는 것을 확인하였다(도 6(b)).
결론적으로, 탈유비퀴틴화 효소 USP39이 발암유전자인 p53의 발현과 상관관계가 있음이 확인되었다.
(2) REST(repressor element 1-silencing transcription factor) 유전자의 발현에 연관된 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝
상기와 동일한 방법으로, 각각의 탈유비퀴틴화 효소가 넉아웃된 HEK293T 세포주 라이브러리에서, 웨스턴블롯팅(Western blotting) 기법으로 REST(repressor element 1-silencing transcription factor) 단백질의 발현 수준을 측정하였다. REST 단백질의 발현량에 따라, 3그룹으로 분류한 뒤, 그 중 가장 발현수준이 낮은 그룹인 USP3, USP7, USP19를 REST의 발현을 조절하는 후보군으로 선정하였다(도 7(a)).
선정된 후보들을 대상으로 REST 단백질양과의 상관관계를 검증한 결과, USP19 단백질의 양과 REST 단백질양이 가장 큰 상관관계를 보이는 것을 확인하였다(도 7(b)). 즉, 선정된 후보군 중 하나인 USP19 단백질의 knock-out, 과발현, mutation에 따라 REST 단백질의 발현량 또한 변화하였다.
결론적으로, 탈유비퀴틴화 효소 중 USP19가 REST(repressor element 1-silencing transcription factor) 유전자의 발현과 상관관계가 있음이 확인되었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Deubiquitinating enzyme gene knock-out cell line library <130> WPN16204 <160> 100 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP1 targeting sgRNA1 <400> 1 gcatagagat ggacagtatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP1 targeting sgRNA2 <400> 2 catccgaaag aggaaatgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP2 targeting sgRNA1 <400> 3 tccctcctgg actatgaccg 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP2 targeting sgRNA2 <400> 4 ttaggcagtg gcctcagcgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP3 targeting sgRNA1 <400> 5 cttttctgat ttcttatggt 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP3 targeting sgRNA2 <400> 6 agttcagcac acagtatgta 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP4 targeting sgRNA1 <400> 7 gctgagttgc catttcagca 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP4 targeting sgRNA2 <400> 8 ggtatcttat tgacagccgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP5 targeting sgRNA1 <400> 9 ggagaagttt gaattagacg 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP5 targeting sgRNA2 <400> 10 caccccggaa gaagcccacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP6 targeting sgRNA1 <400> 11 ctattcggag tataacccgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP6 targeting sgRNA2 <400> 12 atagtttgca ggcacaggag 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP7 targeting sgRNA1 <400> 13 gagtgatgga cacaacaccg 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP7 targeting sgRNA2 <400> 14 atcctccatg tcctcctccg 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP8 targeting sgRNA1 <400> 15 ggaactatac acaatgatga 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP8 targeting sgRNA2 <400> 16 acaggcagga ggaagcacag 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP9X targeting sgRNA1 <400> 17 ccagatcctc gatcaccaaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP9X targeting sgRNA2 <400> 18 acgactcgtg gctctccggt 20 <210> 19 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP10 targeting sgRNA1 <400> 19 gctgtggata aactacctga 20 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP10 targeting sgRNA2 <400> 20 gcttccaaaa taacccctga 20 <210> 21 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP11 targeting sgRNA1 <400> 21 gcgttggctg tagaagagaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP11 targeting sgRNA2 <400> 22 gcactggtat aagcagtggg 20 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP12 targeting sgRNA1 <400> 23 ttgcgtataa gagtcaacct 20 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP12 targeting sgRNA2 <400> 24 gatctgctaa gcatgtaaga 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP13 targeting sgRNA1 <400> 25 aaggtaagag gggcgtctgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP13 targeting sgRNA2 <400> 26 gtggagcgtt accaaaaagg 20 <210> 27 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP14 targeting sgRNA1 <400> 27 tggtaacact tgttacatga 20 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP14 targeting sgRNA2 <400> 28 ccatgtggat tgacaaacct 20 <210> 29 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP15 targeting sgRNA1 <400> 29 ggtgtcccct ttccggagcg 20 <210> 30 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP15 targeting sgRNA2 <400> 30 cggcggatct ggacacccag 20 <210> 31 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP16 targeting sgRNA1 <400> 31 attagaaaag gattggaaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP16 targeting sgRNA2 <400> 32 aggctttagt gaatgtggaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP17 targeting sgRNA1 <400> 33 caaacgtgtc atcgtcacaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP17 targeting sgRNA2 <400> 34 tatgcaagct cacatcacac 20 <210> 35 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP18 targeting sgRNA1 <400> 35 ggagtgatca cgaatgagca 20 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP18 targeting sgRNA2 <400> 36 gcagcccaga gagcgtccca 20 <210> 37 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP19 targeting sgRNA1 <400> 37 gcaaaccagg agagcaagga 20 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP19 targeting sgRNA2 <400> 38 tgttctttcc ttcatcgtca 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP20 targeting sgRNA1 <400> 39 tcaccttgac tccataggag 20 <210> 40 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP20 targeting sgRNA2 <400> 40 aggaggtatt cctggagcag 20 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP21 targeting sgRNA1 <400> 41 ggccaggtct gcctgatgaa 20 <210> 42 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP21 targeting sgRNA2 <400> 42 aataaactgg agctgggacg 20 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP22 targeting sgRNA1 <400> 43 ggaggcggct ctgtaccaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP22 targeting sgRNA2 <400> 44 ccagtcctct ggaagagaga 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP24 targeting sgRNA1 <400> 45 tgagaatgga aactgctcag 20 <210> 46 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP24 targeting sgRNA2 <400> 46 tacaagcgag aagaatcact 20 <210> 47 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP25 targeting sgRNA1 <400> 47 atcaactgag agaaattacg 20 <210> 48 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP25 targeting sgRNA2 <400> 48 gagtttggcc gaatcaaaca 20 <210> 49 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP26 targeting sgRNA1 <400> 49 ggacagagtt catcaaaacg 20 <210> 50 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP26 targeting sgRNA2 <400> 50 ccacctgtga gacctggtaa 20 <210> 51 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP27 targeting sgRNA1 <400> 51 gcagtatacc tgtattacgg 20 <210> 52 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP27 targeting sgRNA2 <400> 52 gaagcagcca aagaagacac 20 <210> 53 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP28 targeting sgRNA1 <400> 53 gagagaaatc acaggcattc 20 <210> 54 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP28 targeting sgRNA2 <400> 54 ctttctccat gaagctctga 20 <210> 55 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP29 targeting sgRNA1 <400> 55 agatcttgct atgttgccca 20 <210> 56 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP29 targeting sgRNA2 <400> 56 tgaggcgggt ggattactgg 20 <210> 57 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP30 targeting sgRNA1 <400> 57 gcgcttcctg cggaccgggg 20 <210> 58 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP30 targeting sgRNA2 <400> 58 gaagcgctgg atggccctgt 20 <210> 59 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP31 targeting sgRNA1 <400> 59 aagaatgcac tgcagtaccg 20 <210> 60 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP31 targeting sgRNA2 <400> 60 atgcccagga gtttctgctg 20 <210> 61 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP32 targeting sgRNA1 <400> 61 aatggaaaga atgctccacg 20 <210> 62 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP32 targeting sgRNA2 <400> 62 gtaaagtccc agatacactc 20 <210> 63 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP33 targeting sgRNA1 <400> 63 gatttgatac aaaaatccct 20 <210> 64 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP33 targeting sgRNA2 <400> 64 agatgttcat atgttggctg 20 <210> 65 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP34 targeting sgRNA1 <400> 65 acagagtgca gctcgtaaca 20 <210> 66 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP34 targeting sgRNA2 <400> 66 aagcataatg ttgtatccaa 20 <210> 67 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP35 targeting sgRNA1 <400> 67 ggtctgcagc tgctgcccga 20 <210> 68 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP35 targeting sgRNA2 <400> 68 gcgcctctac gtgggcggcg 20 <210> 69 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP36 targeting sgRNA1 <400> 69 gttgctcaac cccaaaacag 20 <210> 70 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP36 targeting sgRNA2 <400> 70 cggctgatga tggagaactg 20 <210> 71 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP37 targeting sgRNA1 <400> 71 aatgtggtgc ttcgacccag 20 <210> 72 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP37 targeting sgRNA2 <400> 72 gtaaggatgc agaggaaatg 20 <210> 73 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP38 targeting sgRNA1 <400> 73 gctgattatg agctgtccgt 20 <210> 74 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP38 targeting sgRNA2 <400> 74 gcaggtagag gtgttacgga 20 <210> 75 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP39 targeting sgRNA1 <400> 75 aagcgagagt ctgagtcgcg 20 <210> 76 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP39 targeting sgRNA2 <400> 76 gcagctccgg tcgcgtcaag 20 <210> 77 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP40 targeting sgRNA1 <400> 77 agagaattca ccaatttaag 20 <210> 78 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP40 targeting sgRNA2 <400> 78 agcggaatca gaaatcaggg 20 <210> 79 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP41 targeting sgRNA1 <400> 79 cagccacaac tggacctgcg 20 <210> 80 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP41 targeting sgRNA2 <400> 80 ccactctgtg ttgacttcca 20 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP42 targeting sgRNA1 <400> 81 gaatcagcct ggcagctccg 20 <210> 82 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP42 targeting sgRNA2 <400> 82 tcagcctatc agaatcagcc 20 <210> 83 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP43 targeting sgRNA1 <400> 83 aagtacggct ctcagttcca 20 <210> 84 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP43 targeting sgRNA2 <400> 84 gttgctggat cgtgtacatg 20 <210> 85 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP44 targeting sgRNA1 <400> 85 tatcactgca caactcgtag 20 <210> 86 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP44 targeting sgRNA2 <400> 86 actgcacaac tcgtagtggg 20 <210> 87 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP45 targeting sgRNA1 <400> 87 agaaagccaa aagaagtaaa 20 <210> 88 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP45 targeting sgRNA2 <400> 88 aagaaagaag attctatgat 20 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP46 targeting sgRNA1 <400> 89 aaacttgctg acgtgcctg 19 <210> 90 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP46 targeting sgRNA2 <400> 90 tctgctctgg aaaaagacat 20 <210> 91 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP47 targeting sgRNA1 <400> 91 gtgattatgt cagccaaagc 20 <210> 92 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP47 targeting sgRNA2 <400> 92 ataggtccgc ttccaagaga 20 <210> 93 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP48 targeting sgRNA1 <400> 93 tcgatgatcc caactgtgag 20 <210> 94 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP48 targeting sgRNA2 <400> 94 tttgtgggcc tgactaacct 20 <210> 95 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP49 targeting sgRNA1 <400> 95 gctaagaagc tccctcctgg 20 <210> 96 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP49 targeting sgRNA2 <400> 96 gctcaatgat aacccagagg 20 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP50 targeting sgRNA1 <400> 97 tgataccctt ccagttaagg 20 <210> 98 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> USP50 targeting sgRNA2 <400> 98 cctatctgat gacagacatg 20 <210> 99 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLD targeting sgRNA1 <400> 99 aagctcctta aagtaccgaa 20 <210> 100 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYLD targeting sgRNA2 <400> 100 aaaggcctcc aaatagacgt 20

Claims (15)

  1. 서열번호 1 내지 100의 서열을 각각 포함하는 100개의 sgRNA(single-guide RNA)에 의하여 유전자가 각각 넉아웃(knock-out)된 USP(Ub-specific processing protease) 그룹 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB)를 포함하는 세포주 라이브러리(cell line library).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세포주 라이브러리에 속한 각각의 세포주는 1개의 탈유비퀴틴화 효소 유전자가 넉아웃된 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 탈유비퀴틴화 효소 유전자의 넉아웃은 유전자 가위 기술을 이용하여 유도되는 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 유전자 가위 기술은 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술인 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포주는 HEK293T인 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 세포주는 줄기세포주인 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 세포주 라이브러리는 키트 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는, 세포주 라이브러리.
  11. (a) 제1항의 세포주 라이브러리에 속하는 하나 이상의 세포주에서 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계;
    (b) 발현수준에 따라 특정 단백질의 발현을 조절하는 탈유비퀴틴 효소를 선정하는 단계를 포함하는,
    특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 특정 단백질의 발현수준을 측정하는 단계는 웨스턴블롯팅(western blotting) 기법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 특정 단백질을 조절하는 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 서열번호 1 내지 100의 서열을 각각 포함하는 100개의 sgRNA(single-guide RNA)에 의하여 유전자가 각각 넉아웃(knock-out)된 USP(Ub-specific processing protease) 그룹 탈유비퀴틴화 효소를 포함하는 세포주에서 유래한 세포용해물(lysate)을 포함하는, 특정 단백질 조절 탈유비퀴틴화 효소 스크리닝용 키트.
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KR101883929B1 (ko) * 2017-01-11 2018-08-01 한양대학교 에리카산학협력단 Ｐｕ.１ 넉아웃 생쥐 미세아교세포주 및 이의 용도

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