JP2016525228A - 光シート顕微鏡検査用の装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、光シート顕微鏡検査用の装置に関する。この装置には、媒質中（２）に存在する試料（３）を受け入れるための１つの試料容器（１）が含まれ、試料容器（１）は１つのカバーを有しており、試料容器（１）の位置合わせは、１つの平坦な基準面に関して行われている。この装置には、試料（３）に光シートを照射するための、１つの照射用対物レンズ（６）を有する１つの照射光学系が含まれ、照射用対物レンズ（６）の光軸（７）と光シートとが、基準面の法線とゼロ以外のある照射角βをなして交わる同じ１つの平面内に位置するようになっている。この装置にはさらに、基準面の法線とゼロ以外の検出角δをなして交わる光軸（９）を持つ１つの検出用対物レンズ（８）を有する１つの検出光学系が含まれる。そのような装置において、カバーのところに（容器底部（１１）のところ、または容器キャップ（１８）のところのいずれかに）、試料（３）を受け入れるための、照射光および検出光に対する透過性を示す、１つの内部界面（１２）と１つの外部界面（１３）とを有する少なくとも１つの膨出部が構成されている。膨出部の形状、その観察時の位置、ならびに照射用対物レンズ（６）および検出用対物レンズ（８）の光軸（７，９）の姿勢については、少なくとも照射用対物レンズ（６）および検出用対物レンズ（８）の光軸（７，９）が界面を通り抜ける領域においては、光軸（７，９）が界面（１２，１３）の法線とある最小角度をなして交わるようにすることによって、相互チューニングがはかられている。

Description

本発明は、光シート顕微鏡検査用の装置に関する。

このような装置には、媒質中に存在する試料を受け入れるための１つの試料容器が含まれるが、この試料容器の位置合わせが、平坦な、大抵の場合は水平な１つの基準面に関して行われている。ほかにもこの装置には、試料に光シートを照射するための１つの照射用対物レンズを有する１つの照射光学系が含まれるが、この照射用対物レンズの光軸と光シートとが、基準面の法線とゼロ以外の照射角βをなして交わる同じ１つの平面内に位置するようになっている。最後にこの光シート顕微鏡検査用の装置には、ほかにも、基準面の法線とゼロ以外の検出角δをなして交わる光軸を持つ１つの検出用対物レンズを有する１つの検出光学系が含まれている。その際に照射用対物レンズおよび検出用対物レンズは、例えば、特許文献１に説明されているような、いわゆる二重対物レンズとして形成されたものであってもかまわない。この場合、両方の対物レンズは１つの共通モジュラーユニットにまとめられて、それぞれの光学系（すなわち、それぞれの対物レンズとその付属ビームパス、およびその中に配置される光学素子）は、幾つかの素子を共有することになる。

そのような装置は、特に生物試料を調査する際に導入されるが、その装置では、検出光軸とゼロ以外の角度で交差する平面を持つ光シートを使用して試料の照射が行われる。その際にこの光シートは、一般には、検出用対物レンズの光軸と等しいのが通例である検出方向と直角に交わるようになっている。ＳＰＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：選択的平面照明顕微鏡検査法）とも呼ばれるこの技術により、厚肉の試料であっても、比較的短時間のうちに３次元撮影画像を作成することができる。光学断層像を断層面に対して垂直な向きへの相対運動と組み合わせることによって、試料を拡大して立体画像で再構築することが可能となる。

このＳＰＩＭ技術は、好ましくは蛍光顕微鏡検査法において導入されるが、ＬＳＦＭ（Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：光シート蛍光顕微鏡法）とも呼ばれている。共焦点レーザ走査顕微鏡法や２光子顕微鏡法など、それ以外の定着している方法に対し、ＬＳＦＭ技術は幾つかの長所を有している。つまり、検出をワイドレンジで行うことができるために、試料のより大きな領域を捕捉することができる。確かに分解能は、共焦点レーザ走査顕微鏡法の場合よりも若干低下するとはいえ、侵入深さがそれよりも大きくなるために、ＬＳＦＭ技術を用いてより厚みのある試料を分析することができる。それ以外にも、この方法の場合は試料の露光が最小限となるが、それにより、何よりも特に試料の褪色の怖れが低減されることになる、というのも、試料は、薄い光シートだけによって、検出方向に対してゼロ以外の角度で照射されるからである。

純然たる静的光シートを使用する代わりに、光ビームにより試料を急速に走査することによって、準静的光シートを発生することもできる。光ビームが、観察対象である試料に対して非常に高速で相対運動されて、またその際には、時間的に連続して何重にも列をなすように順番に並べられることによって、光シート状の照明を生じることになる。試料は最終的にはカメラのセンサに投影されるわけだが、この場合は、このカメラの積分時間が、その積分時間内に走査が完了するように選定されることになる。検出光学系においては、２次元アレイを持つカメラの代わりに、ラインセンサーを、再走査（リスキャン）と組み合わせて使用するようにしてもよい。ほかにも、検出は、共焦点方式で行われてもかまわない。

ＳＰＩＭ技術については、これまでの間に文献で数多く取り上げられている（例えば、特許文献２およびこれに基づいた特許文献３、ならびに、レビュー論文である非特許文献１を参照）。

光シート顕微鏡検査の主な適用例の１つは、サイズが数１００μｍから数ｍｍまでの、中くらいの大きさの生体のイメージングにある。通例これらの生体は、アガロース・ゲル中に埋め込まれるが、このアガロース・ゲルもまた、１つのガラス毛管内に入っている。このガラス毛管は、上側または下側から、水で充満された１つの試料チャンバーの中に入れられて、試料の一部が毛管から押し出される。アガロース中の試料は、光シートにより照射され、蛍光は、この光シートに対して垂直な、またそれ故に光シート光学系に対しても垂直な１つの検出用対物レンズにより、カメラに結像される。

この方式の光シート顕微鏡検査には、３つの大きな短所がある。第１に、調査対象である試料がかなり大きくなるが、これらは、発生生物学に由来するものである。ほかにも、試料プレパラートと、試料チャンバーの寸法上の理由から、光シートがかなり分厚くなり、それにより達成可能な軸方向の分解能に制約を生じている。それに加え、試料プレパラートの調製には手間暇がかかる上に、個々の細胞を対象とする蛍光顕微鏡検査法において広く一般に導入されるような、標準型試料プレパラートや標準型試料ホルダーとの互換性もない。

これらの制約を、少なくとも一部については避けて通ることができるようにするために、最近数年のうちに、照射用対物レンズと検出用対物レンズとが互いに直交し合うとともに、いずれも上側から４５°の角度で試料の方に向けられている、ＳＰＩＭ構造が開発された。基準面として、例えば試料ホルダーが固定されている試料テーブル、または別の水平面を援用した場合、照射角βおよび検出角δはいずれも４５°となる。そのような構成は、例えば（特許文献４）および（特許文献５）に説明されている。

そのような構成においては、試料が、例えば１つのペトリ皿の底面の上にある。このペトリ皿は水で充満されており、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズは、液浸媒体の機能も受け持つようになっているこの液体中に浸漬される。このアプローチ法により、より薄い光シートを発生することができるために、軸方向の分解能が向上されるという長所がもたらされる。分解能が向上されるために、より小さな試料についても調査が可能となる。また試料プレパラートの調製も、大幅に簡素化された。しかし、試料プレパラートも、また試料ホルダーも、既述の標準仕様になおも適合したものではない点が、依然として大きな短所となっている。このため、対物レンズを両方とも、シャーレの周縁部にぶつけることなく、シャーレの内部に浸漬できるようにするためには、ペトリ皿をかなり大きなものとしなければならない。この方法を用いる場合、生物学の数多くの分野においても、また蛍光顕微鏡検査による個々の細胞の分析でも、標準となっている、マイクロタイター・プレート（マルチウェル・プレートとも呼ばれる）を使用することは不可能である、というのも、このプレートの非常に小さい凹所の中に、対物レンズを浸漬させることはできないからである。それ以外にもこの方法には、異なる試料による汚染を回避するためには、試料を入れ替える際に対物レンズを清掃する必要があるために、極短時間で行われる数多くの試料の分析（ハイ・スループット・スクリーニング）を問題なく実現するわけにはいかない、という短所がある。

欧州特許第０８６６９９３号明細書 独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書 国際公開第２００４／０５３５５８号 国際公開第２０１２／１１０４８８号 国際公開第２０１２／１２２０２７号

ジェー ヒューイスキン他（Ｊ．Ｈｕｉｓｋｅｎ ｅｔ．ａｌ），「発生生物学における選択的平面照明顕微鏡法技術（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，２００９年発行，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌 Ｖｏｌ．１３６，ｐ．１９６３

本発明の課題は、マイクロタイター・プレート、すなわち、多数の試料を受け入れることができる試料ホルダーを簡単に使用できるようにすることによって、試料のハイ・スループット分析が簡単に行われるように、冒頭に記した種類の光シート顕微鏡検査用の装置をさらに進化させることにある。

この課題は、冒頭に記したような光シート顕微鏡検査用の装置に関しては、試料を受け入れるための、少なくとも部分的に照射光および検出光に対する透過性を示す、少なくとも１つの膨出部がカバーに形成されていること、またこの膨出部が、１つの内部界面と１つの外部界面とを有することによって、解決される。そうすることによって、対物レンズを十二分に容易に試料に接近させられるようになり、特に、試料が容器底部に置かれている場合よりも横方向の寸法を小さくして作ることができる凹所を持つマイクロタイター・プレートを（回転式のマイクロタイター・プレートも）、特に分析のために直立型の顕微鏡構成が使用される場合には、使用できるようになる。

その場合は、ビームパスが界面を斜めに横切って延びており、それに伴い光が斜めに入射して試料容器から斜めに出射するときに伴うような収差を回避または最小限化するために、膨出部の形状、その観察時の位置、および照射用対物レンズおよび検出用対物レンズの光軸の姿勢の相互チューニングをはかることが肝要である。このチューニングは、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズの光軸が、内部界面および外部界面の法線と、少なくともこれらの光軸が界面を通り抜ける領域内では、最小角度を、具体的には、ゼロ、または、そこから数度、最大で約５°異なる角度をなすようにするやり方で、行われるようになっている。光軸と界面が互いに直交し合う場合は、発生するのが球面収差だけとなるが、これについては、カバーガラスに対して適合化されている周知の顕微鏡対物レンズの場合と同様に、補正することができる。

膨出部の形状については、上述の条件が守られる限り、基本的に任意に委ねられている。この膨出部は、例えば半樽形または半球形をとるとよいが、その場合は、可能な限り最善の構成におけるチューニングが施された装置内においては、両方の対物レンズの光軸が、半樽形の表面上における接線の法線と合致することになる。

非常に好ましい一構成形態においては、少なくとも１つの膨出部が、カバーおよび試料容器から突出している、平行な界面を持つ２つの板状素子からなるが、これらの板状素子は、膨出部とは別の試料容器の部分から最も離れている膨出部の箇所（膨出部が沈降部として構成される場合は、この沈降部の最深箇所、膨出部が隆起部として構成される場合は、この隆起部の最高箇所）のところで、最低でも１つの地点において接触しており、この地点のところで、沈降部もしくは隆起部、または試料容器もしくは容器キャップを下向きまたは上向きに閉止している。そこでは、第１の板状素子の界面の法線が、照射用対物レンズの光軸が通り抜ける領域内では、これらの法線とこの光軸とが、この板状素子のそれぞれの界面の地点を問わずに、照射用対物レンズの光軸に対して平行になるという意味で、この光軸と合致するようになっている。同様に、第２の板状素子の界面の法線は、検出用対物レンズの光軸と合致している、すなわち、この第２の板状素子のそれぞれの界面の地点を問わずに、この光軸に対して平行になっている。それにより、両方の対物レンズを基準とした膨出部の位置に関するチューニングにおける、より高い柔軟性を許容している。もっとも、内部界面と外部界面とが互いに対して平行な姿勢をとることを暗に意味することになるこの板状の形状は、絶対に必要だというわけではなく、特に、両方の板状素子が接触している領域においては、１つの小さな湾曲部をこの領域の内側に備えることによって、例えば沈降部である場合は、一方では、その最深地点のところでその強度が補強され、他方では、２枚の平坦な板がある角度をなすように突き合わされている場合に、すなわち、沈降部が少なくとも部分的にＶ型の断面形状を持つ場合にそうなるような、汚染物質の執拗な付着も阻止されるようにするとよい。

照射角βと検出角δの合計は９０°であることが好ましいが、それによりビームパス内への検出器の配置が容易となる。角度がそれ以外である場合は、画像平面、すなわち検出器が位置する平面と、物体平面、すなわち光シートにより照射される平面と、検出用対物レンズの物体側の主平面とが、同一直線上で交差するように、留意する必要がある。

少なくとも１つの膨出部は、溝形に構成されたものであってもよいが、この場合は試料容器の内部に、例えば容器底部に、複数の溝が前後に並べて配置されてもよい。非常に好ましい一構成形態においては、この膨出部が角錐形に形成されているが、このため、板状素子は両方とも三角形の形状を有しており、これにさらにもう２枚の板状素子が補足されている。それにより、膨出部の中に位置する試料を異なる４つの側面から分析することが可能となるが、これは、試料が１つの側面のところに堆積する場合に有利であるかもしれない。さらに、その上に、容器底部の表面、または容器キャップの内部には、角錐形の膨出部が網目状に配置されてもよいが、その結果、試料容器は、そのような角錐形の膨出部を多数有するマイクロタイター・プレートとして形成され得ることにもなる。溝形に形成される場合も、個々の溝がいずれも、ブレースのような仕切り素子により単独区画に分割されるのであれば、マイクロタイター・プレートを形づくるために、これを使用することができる。

１つのそのような沈降部を有する試料容器は、ガラスから製造することができるが、しかし安価な変形例においては、プラスチックから、例えばこの沈降部が溝形である場合は深絞り成形法により、製造されることが好ましい。

膨出部の内部界面の表面で細胞を成長させるために、この界面の少なくとも一部に機能性を持たせると、すなわち、この界面の少なくとも一部を特殊な構造体により被覆して、これに細胞の表面組織が結合してそこに繋ぎ止められるようにしてやると、好適である。少なくとも１つの膨出部を、すなわち、例えば１つの溝または角錐形の沈降部を、ゲルまたはアルギン酸塩により充満して、それにより３次元マトリックスをシミュレートできるようにすることによって、本願の光シート顕微鏡検査装置を使用してハイ・スループット分析が行われることになる個々の細胞のための成長条件を、自然の成長環境に対してさらに良好に適合化することが可能になる。

既に示唆したように、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズが、反転型の構成で、試料容器の下側に配置されている好ましい一構成形態においては、カバーが容器底部として、膨出部がこの容器底部の沈降部として構成されている。そうすることによって、対物レンズを十二分に容易に試料に接近させられるようになり、特に多数の凹所を持つマイクロタイター・プレートも使用できるようになるが、その場合はこれらの凹所のそれぞれに、１つの試料用の沈降部が１つずつ構成されていることになる。１つの沈降部、または、多数の細胞試料を調査するために複数の沈降部を使用することにより、（基準面の平面内の）横方向への広がりを減らすことができるために、試料容器内部の凹所の個数を増大することが可能となる。

光シート顕微鏡を直立型構成とするためには（すなわち、上からの観察を行うためには）、カバーとして、容器底部の代わりに、容器キャップについても、容器底部について説明したのと同様の方法で適合化を行った上で、直立型の光シート顕微鏡検査用装置を使用して、細胞分析が実施されるようにするとよい。したがって、本発明のこの構成形態においては、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズが、試料容器の上側に配置されていることになる。この場合は容器キャップの内部に、１つの沈降部の代わりに、少なくとも１つの隆起部が構成されている。この隆起部の形状、その観察時の位置、ならびに照射用対物レンズおよび検出用対物レンズの光軸の姿勢については、この場合も同様に、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズの光軸が、少なくとも界面をこれらの光軸が通り抜ける領域においては、界面の法線とある最小角度をなして交わるようにすることによって、相互チューニングがはかられている。隆起部は、沈降部と同様に、例えば溝形、角錐形、または半樽形、または半球形であってもよい。

マイクロタイター・プレートでは、試料は通常、重力に従って深部へと沈降する、または最深地点に沈着するために、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズが試料容器の上側に配置されている場合は、観察を問題なく行うことは不可能である。この理由から、容器キャップの内部に隆起部が構成されている場合は、さらにそれに追加して、試料容器の内部に、試料容器の、その深さに関して上側の領域内の、両対物レンズの作動距離の範囲内に、試料を位置決めするための手段が配置されている。これに準じて、この位置決め用の手段は、容器キャップの内部の同様に両対物レンズの作動距離の範囲内に配置されてもかまわない。開口数が大きい典型的な対物レンズについては、この作動距離が一般には数１００μｍから数ｍｍまでの範囲内に位置している。

沈降部は、隆起部のように、内部界面が機能性を示してもよい板状素子から組み合わされたものであってもよい。試料容器の構成形態のさらにもう１つの可能性として、回転式のマイクロタイター・プレートを使用することもできるが、そこでは、キャップ内の隆起部が、当初は下方を指し示すことになる。試料は、実装位置においては１つの沈降部に相当するこの隆起部の中に入れられて、そこで、試料の位置決め用の手段を使用して、例えば１つのプランジャーにより、この少なくとも１つの隆起部の内部の位置を固定されるようになっている。引き続いて底部が上方から回転式マイクロタイター・プレートの上にセットされて、これを封止する。このマイクロタイター・プレートを使用するのが直立型の光シート顕微鏡である場合、マイクロタイター・プレートは、その後、続く分析のために回転される。これを使用するのが反転型の光シート顕微鏡である場合、回転は不要である。

容器キャップの上４分の１または少なくとも１つの隆起部の中に試料を位置決めするこの手段は、栄養溶液浸透性を示す１つの半透膜、多数の穴を有する１つのプラットフォーム、または１つのウェブからなると好適である。肝要であるのは、いずれのケースにおいても、試料が栄養溶液と接触する点、しかしながら、その際には、試料が重力のために栄養溶液中に沈降してはならない点である。この膜、プラットフォーム、またはウェブは、ゲルから作製されたものであってもかまわない。

それぞれの対物レンズと試料間の光がいずれも、３種類の媒体を通過する、または２つの界面を通り抜けるという事実に基づくと、これらの対物レンズが界面に関して鉛直に配向される場合にも、球面収差が発生することになる。これについては、容器底部内の１つの沈降部の形態をとるか、または容器キャップ内の１つの隆起部の形態をとる膨出部用の材料が既知であり、かつ、少なくとも平行な界面を有する板状素子に関して、厚さが既知である場合は、顕微鏡対物レンズを対象として広く一般にも実現されている方法で、補正することができる。それらは部分的には既定の材料からなる規定のカバーガラス厚さに関して補正される。照射用対物レンズよりも開口数が大きいのが通例である検出用対物レンズについては、そのような補正が実施されると非常に好ましい。

好ましい１構成形態においては、照射光学系および検出光学系のうちの少なくとも一方に、上述の収差だけではなく、照射光および検出対象である光のうちの少なくとも一方が、９０°以外の角度で界面を通り抜けることにより発生する収差も低減するための補正手段が含まれている。

したがって、照射用対物レンズの内部および検出用対物レンズの内部のうちの少なくとも一方に、特殊な補正レンズが配置されると好ましいが、これらの補正レンズは、−対物レンズが界面の法線とゼロ以外の角度をなして交わる場合は、円柱レンズ、傾斜レンズ、または、光軸上には配置されないレンズからなっていてもかまわないし、ほかにも、非球面または自由形状面を備えた補正素子もまた、補正のために使用することができる。あるいはその代わりに、またはそれに補足して、照明用ビームパス内に、照射光および検出光のうちの少なくとも一方の位相面を操作するためのアダプティブ光学素子の形態をとる補正手段が配置されてもよい。その場合は、変形可能なミラー、３次元光変調器、または位相板が使用されることが好ましい。

収差を低減するためのさらにもう１つの方途は、カバー、もしくは、容器キャップ内の隆起部または容器底部内の沈降部のために、特段の適合化が行われた材料を使用することにある。

非常に好ましい一実施形態においては、容器底部内のまたは容器キャップ内の沈降部または隆起部のための材料として、試料が入っている媒質の屈折指数との差が５％未満である屈折指数を有するような物質が使用されるようになっている。試料が入っている媒質として、例えば、波長λ_ｄ＝５７８．５６ｎｍ時の屈折率がｎ_ｄ＝１．３３である水を使用する場合、カバー用の材料として適しているのは、例えばＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン、ｎ_ｄ＝１．３５）、ＣＹＴＯＰ（商標）（ｎ_ｄ＝１．３４）、またはＰＦＥＰ（ペルフルオロ（エチレン−プロピレン）、ｎ_ｄ＝１．３４）である。ほかにも、ペルフルオロ（ジオキソラン）共重合体を使用することができるが、その屈折指数も同様に、通例は１．３３から１．３６の間に位置している。またＴｅｆｌｏｎ（商標）ＡＦも、非常に良く適した材料であるが、これは一般に屈折指数ｎ_ｄ＝１．３２を有している。この材料はアモルファス・ポリマーであるが、この場合は、ポリマーが冷間状態にあるときには試料が入っている媒質の屈折指数を有するように、ガラス転位温度を調整することができる。当然ながら、ガラス転位温度の調整が可能である、それ以外のアモルファス・ポリマーも使用することができる。

屈折指数が正確には一致しない場合は、依然として、その程度は低くなるとはいえ、収差が発生することになる。したがって、これらの収差をさらに軽減するためには、膨出部を可能な限り薄肉に構成すべきであり、その厚さは数百μｍ以下でなければならない。反転型の装置の場合がそうであるように、カバーを同時に試料容器の底部として利用する場合は、当然ながら、試料が入っている媒質から加えられる圧力に対する十分な安定性について、留意する必要がある。これは、カバーが、直立姿勢での観察用の試料容器のキャップである場合は不要となるが、この場合は、材料を、それよりもさらに大幅に薄肉に、厚さ１００μｍ未満に成形することができる。

特に直立型の光シート顕微鏡検査においては容易に実現することができるさらにもう１つのステップにおいては、液浸対物レンズを再び使用できるようになっている。液浸媒体として、試料の受け入れに使用したのと同じ媒質、すなわち例えば水を使用し、あわせて水の屈折指数を使用して、さらに、容器キャップまたは容器底部内の隆起部／沈降部のために、水とほぼ同一の屈折指数を有する材料を使用する場合は、界面が散乱または屈折によってあらわになることはなく、この場合は対物レンズのそれ以上の補正は不要となる。

容器キャップ内および容器底部内の隆起部または沈降部用の材料としては、１つの第１成分および１つの第２成分からなるナノ構造化混合材料も使用可能であるが、試料を受け入れるための媒質の屈折指数よりも、第１成分の屈折指数は小さく、第２成分の屈折指数は大きくなっている。第１成分の材料からなる構造の平均サイズが、照射のために使用される検出対象である光の光波長よりも小さい場合は、この混合材料に関して生じる有効屈折指数についても同様に、試料が埋め込まれる媒質の屈折指数に対して、領域のサイズと領域数とに従属して、この媒質の屈折指数の前後５％の範囲内に位置するように適合化することができる。使用することができるのは、例えばナノ多孔質シリカであるが、この場合は第１成分が空気、第２成分がシリカとなる。そのようなナノ構造化材料については、例えば２００７年に発行されたＮａｔｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｖｏｌ．１，ｐ．１７６〜１７９に、反射防止膜の製造との関係で、ジェー−キュー シー他（Ｊ．−Ｑ．Ｘｉ ｅｔ．ａｌ）による「広帯域フレネル反射除去のための低屈折率光学薄膜材料（Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ ｂｒｏａｄｂａｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｓｎｅｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）」と題する記事に説明されている。

言うまでもなく、上記で指摘し、下記でさらに解説することになる特徴は、提示される組合せにおいてだけではなく、それ以外の組合せにおいても、または単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく導入することができる。

以下では本発明を、発明にとり重要な特徴も開示されている添付図面に基づいて、例を挙げてさらに詳しく解説するものとする。

光シート顕微鏡検査用の装置を示す図。 沈降部を有する試料容器の１例を示す図。 容器キャップまたは容器底部を例示した図。 ａ−ｃは、マイクロタイター・プレートの１つの凹所の上側領域内に試料を配置するための可能性の１例を示す図。 回転式マイクロタイター・プレートの使用法を示す図。

最初に図１には、光シート顕微鏡検査用の装置の基本構造が示されるが、この装置は、調査対象である試料への容易な接近を可能とするものであって、またそれ故に、個々の細胞のハイ・スループット分析における導入のための前提条件を充足するものとなっている。この装置は、ここでは反転型の光シート顕微鏡として構成されているが、直立型の光シート顕微鏡にも、問題なくこの装置を転用することができる。試料容器１の内部には、媒質２中に試料３が存在している。この試料容器１は、１つの平坦な基準面に関して位置合わせが行われているが、ここでは、試料テーブル４の水平表面がこの基準面を定義している。ほかにもこの装置には、１つの光源５と、試料３に光シートを照射するための１つの照射用対物レンズ６とを有する１つの照射光学系が含まれている。この光シートと照射系対物レンズ６の光軸７は、基準面の法線とゼロ以外の照射角βをなして交わる同じ１つの平面内に位置している。試料から出る光は、基準面の法線とゼロ以外の検出角δをなして交わる光軸９を持つ検出用対物レンズ８を有する１つの検出光学系により、１つの検出器１０に投影されるが、この検出器１０は、記録した強度を、引き続き演算処理することができる画像データに変換するようになっている。照射角βと検出角δは、ここでは等しくなっているが、しかしながら、これは絶対に必要だというわけではない。例えば両方の対物レンズの開口が異なる場合は、これらの角度もまた、３次元スペースの所要量に基づいて、異なる値に設定されてもかまわない。

照射用対物レンズ６および検出用対物レンズ８は、試料容器１の下側に配置されている。試料容器１は、照射光および検出光に対する透過性を示す、１つの内部界面１２と１つの外部界面１３とを持つ、１つの容器底部１１を有している。この容器底部１１のところには、照射光および検出光に対する透過性を示す少なくとも１つの沈降部１４が、この沈降部の中に試料３が沈着するように構成されている。これについては、試料容器１がこの沈降部１４の領域内で透過性を示せば十分であるが、しかしながら、通例は、ガラスなどの単一材料または深絞り成形されるプラスチックから、製造した方が簡単である。試料３がこの沈降部１４の内部に沈殿する結果、この光シート顕微鏡の光学装置である照射用対物レンズ６と検出用対物レンズ８にとっては、より容易に試料３に接近できることになる。したがって、平坦な底面を持つ容器よりも、そのような沈降部１４を多数備えた試料容器１の方が、個々の細胞のハイ・スループット分析にはより良く適することになる、というのも、沈降部の内部で試料が沈殿することによって、そのようなマルチウェル・プレートまたはマイクロタイター・プレートが利用することができる個々の凹所については、横方向への寸法を小型化して、構想設計を練ることができるからである。その場合は、マイクロタイター・プレートのそれほど頻繁な交換は不要となる。

沈降部１４の形状、その観察時の位置、ならびに照射用対物レンズ６または検出用対物レンズ８の光軸７および９の姿勢の相互チューニングが、照射用対物レンズ６および検出用対物レンズ８のこれらの光軸７、９を、内部界面１２および外部界面１３の法線と、少なくとも光軸７および９がこれらの界面１２および１３を通り抜ける領域においては、ある最小角度をなすように交わらせることによって、はかられている。そうすることによって、界面を通り光が斜めに入射したり、光が斜めに出射したりすることにより発生する収差を最小限化することができる。そこでは、この角度がゼロであることが好ましい。

図１に示される例においては、少なくとも１つの沈降部１４が、容器底部１１から突出している第１および第２の板状素子１５または１６を有している。これらの板状素子１５および１６のいずれにおいても、内部界面１２は外部界面１３に対して平行に配置されている。沈降部１４の最深箇所のところで、両方の板状素子１５および１６は、少なくとも１つの地点において接触しているが、そこでは、第１板状素子１５の界面１２、１３の法線が照射用対物レンズ６の光軸７と、第２板状素子１６の界面１２、１３の法線が検出用対物レンズ８の光軸９と合致している。照射角βと検出角δの合計は、ここでは９０°であるが、それ以外の値をとってもかまわない。この装置は、光が斜めに界面１２、１３を通り抜ける際に発生するような収差を完全に回避可能であるという、大きな長所を有している。通例は０．３オーダの小さな開口数を有している照射用対物レンズ６については、生成されることになる光シートを可能な限り薄いものとすべきであるために、この場合はそれ以上の補正がどうしても不可欠だ、というわけではもはやない。しかしながら、通例は１．０オーダの高い開口数を有している検出用対物レンズ８については、さらに補正が行われると有利であるが、これは、特殊なケースにおいては、照射用対物レンズについてもいえる。補正手段は、例えば照射用対物レンズ６の内部または検出用対物レンズ８の内部の補正レンズからなるか、またはほかにも、照明用ビームパス内もしくは検出用ビームパス内に配置される、変形可能なミラー、３次元光変調器、もしくは位相板として構成されることが好ましい、照射光および検出光のうちの少なくとも一方の位相面を操作するためのアダプティブ光学素子からなっていてもよい。

界面１２、１３における散乱や屈折を完全に回避するために、容器底部１１は、試料３が入っている媒質２の屈折指数との差が５％未満である屈折指数を有する材料から形づくることもできる。これに適しているのは特に、材料が冷えたときに、正確に所望の屈折指数を有しているようにガラス転位温度を調整することができる、アモルファス・ポリマーである。ほかにも、例えば、ナノ多孔質シリカ、すなわち、多数の円柱状の通路を有するシリカからなる、ナノ構造化混合材料を、容器底部１１用の材料として使用することができる。いずれのケースにおいても、収差を可能な限り良好に抑止するためには、容器底部１１の板厚を可能な限り薄肉に選定すべきである。図１に示される例は、照射用対物レンズ６および検出用対物レンズ８が直立型に配置される場合にも、これと等価の形で転用することができるが、その場合、容器底部１１内の１つの沈降部１４の代わりに、容器キャップがそれに対応する１つの隆起部を備えて設けられることになる。

図２には、細胞のハイ・スループット分析に適している試料容器１の１例が示される。示されているのは、試料容器１のある１つの切片の中の、互いに対して平行に配置されている、２つの溝状の沈降部１４である。これらの沈降部１４はいずれも、ブレース１７により個々の凹所に分割されているが、これらの凹所により、１つの沈降部１４の内部に、相互汚染の可能性を生じることなく、複数の試料を並べて配置することが可能となる。

この試料底部１１の代わりに、１つのこれに相当する容器キャップについて、これと同様に構想設計を練るようにしてもよい。図３には、１つの容器キャップ１８を切り取った１切片が示されるが、その上には多数の角錐形の隆起部１９が配置されており、これらの隆起部１９はいずれも、試料容器１内の凹所を１つずつ覆い隠すようになっている。容器底部１もまた、これと同様に、等価に構成されたものであってもよい。

沈降部１４または隆起部１９の内部の内部界面１３には、この界面の表面で細胞を成長させるために、例えば、それ以外の補助手段がなくとも、細胞が隆起部１９の内部に沈殿できるようにするために、機能性を持たせるとよい。ほかにも沈降部１４または隆起部１９は、試料の固定化のために、ゲルまたはアルギン酸塩により充満されてもよい。

試料の観察を容易にするとともに、マイクロタイター・プレートの凹所についても、横方向の直径を可能な限り僅かにして構想設計を練ることができるようにするために、直立姿勢での観察用として企図されているそのような試料容器は、試料容器１１の、その深さに関して上側の領域内の、照射用対物レンズと検出用対物レンズの作動距離の範囲内に、試料を位置決めするための手段、または、容器キャップ１８内の隆起部１９の内部の作動距離の範囲内への、これに準じる位置決めを行うための手段を有していることが好ましい。そのような手段は、図４ａ）〜ｃ）に示されている。箱型の素子はいずれも、直立姿勢での観察用の試料容器１の内部の、１つのマルチウェル・プレートの１つの凹所２０を表している。図４ａ）においては、上側の領域に１つの透過膜２１が配置されており、試料３はその上に置かれているが、この膜により比較的大容量の栄養液との接触が保証されることによって、細胞が成長できるようにしている。この膜２１は、栄養剤の拡散も、また試料３の支持も可能とする。１つの膜２１の代わりに、穴を設けた１つの例えば平坦なプラットフォーム２２を使用することもできるが、これは図４ｂ）に示されている。このプラットフォームは、例えばガラス製であってもよいが、それにより試料プレパラートの調製を、実質的に標準プロトコルに従って行うことが可能となる。培養された細胞は、マトリックスゲル中に固定化されていてもかまわない。図４ａ）には、凹所２０の上に、容器キャップ１８の、１つの溝、または１つの溝の切片の形状をとる１つの隆起部１９が描かれている。基本的には、扁平なカバー、例えば図４ｂ）に示されるような１つのフィルム２３を使用することも考えられる。このフィルム２３は、試料容器に接着または溶接されてもよい。図４ｃ）には、さらに、もう１つの構成が示されている。そこには、凹所の中心に突出している１つのウェブ２４が描かれている。隆起部１９は、ここでは半樽形を有している。支持素子である上述の膜２１、プラットフォーム２２、およびウェブ２４は、十分な剛性を示すものである限り、ゲル製であってもかわない。

図５に示されるように、回転式のマイクロタイター・プレートを使用することも考えられる。その場合は、まず、最初に試料３を、マイクロタイター・プレートの（ここでは模範例としてファネル形の）１つの凹所２０の内部に沈降させる。この凹所２０は、媒質２により充満されている。続いて、小径側の端部に１つの膜２１が配置されている、１つのファネル形の素子２５が、ファネル形の凹所２０内にはめ込まれる。次にマイクロタイター・プレートは、容器底部１１により封止される。引き続いてプレートを逆さにした後、光シート顕微鏡検査用の直立型装置を使用して、試料を観察することができる。

１ 試料容器
２ 媒質
３ 試料
４ 試料テーブル
５ 光源
６ 照射用対物レンズ
７ 光軸
８ 検出用対物レンズ
９ 光軸
１０ 検出器
１１ 容器底部
１２ 内部界面
１３ 外部界面
１４ 沈降部
１５ 第１板状素子
１６ 第２板状素子
１７ ブレース
１８ 容器キャップ
１９ 隆起部
２０ 凹所
２１ 膜
２２ プラットフォーム
２３ フィルム
２４ ウェブ
２５ ファネル形素子

Claims (16)

1. 光シート顕微鏡検査用の装置であって、
   媒質（２）に入っている試料（３）を受け入れるための１つの試料容器（１）であって、該試料容器（１）は１つのカバーを有しており、また該試料容器（１）の位置合わせは、１つの平坦な基準面に関して行われる、前記試料容器（１）と、
   該試料（３）に光シートを照射するための１つの照射用対物レンズ（６）を有する１つの照射光学系であって、該照射用対物レンズ（６）の光軸（７）と該光シートは、該基準面の法線とゼロ以外の照射角βをなして交わる同じ１つの平面内に位置している、前記照射光学系と、
   該基準面の該法線とゼロ以外の検出角δをなして交わる光軸（９）を持つ１つの検出用対物レンズ（８）を有する１つの検出光学系と
   を備え、
   該カバーに、内部界面（１２）と外部界面（１３）とを有している、照射光および検出光に対する透過性を示す少なくとも１つの膨出部が、該膨出部の内部に該試料（３）を受け入れるように構成されており、
   該少なくとも１つの膨出部の形状、その観察時の位置、ならびに該照射用対物レンズ（６）および検出用対物レンズ（８）の該光軸（７，９）の姿勢については、少なくとも該光軸（７，９）が界面を通り抜ける領域においては、該光軸（７，９）が該界面（１２，１３）の法線とある最小角度をなして交わるようにすることによって、相互チューニングがはかられていることを特徴とする、光シート顕微鏡検査用の装置。
2. 前記少なくとも１つの膨出部が、前記カバーから、および前記試料容器から突出している、平行な界面（１２，１３）を持つ２つの板状素子（１５，１６）を有しており、該板状素子（１５，１６）が、前記膨出部とは別の試料容器（１）の部分から最も離れている前記膨出部の箇所において少なくとも１つの地点において接触しており、一方の第１板状素子（１５）の界面（１２，１３）の法線が前記照射用対物レンズ（６）の前記光軸（７）と、もう一方の第２板状素子（１６）の界面（１２，１３）の法線が前記検出用対物レンズ（８）の前記光軸（９）と合致し、照射角βと検出角δの合計が好ましくは９０°であることを特徴とする、請求項１に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
3. 前記少なくとも１つの膨出部が、溝形または角錐形に形成されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
4. 前記少なくとも１つの膨出部の前記内部界面（１２）には、細胞を成長させるために、機能性を持たせてあることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
5. 照射用対物レンズ（６）および検出用対物レンズ（８）が、前記試料容器（１）の下側に配置されており、前記カバーが容器底部（１１）として、前記少なくとも１つの膨出部が沈降部（１４）として形成されていることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
6. 前記試料容器（１）が、多数の凹所を有するマイクロタイター・プレートとして構成されており、それぞれの凹所のところに角錐形の沈降部（１４）が１つずつ構成されていることを特徴とする、請求項５に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
7. 前記少なくとも１つの沈降部（１４）が、ゲルまたはアルギン酸塩により充満されていることを特徴とする、請求項５または６に記載の装置。
8. 照射用対物レンズ（６）および検出用対物レンズ（８）が前記試料容器（１）の上側に配置されており、前記カバーが容器キャップ（１８）として形成されており、前記少なくとも１つの膨出部が隆起部（１９）として形成されており、さらに前記試料容器（１）の、その深さに関して上側の領域内の、照射用対物レンズ（６）と検出用対物レンズ（８）の作動距離の範囲内に、前記試料（３）を位置決めするための手段、および前記少なくとも１つの隆起部（１９）の内部に位置決めするための手段のうちの少なくとも一方が、配置されていることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
9. 前記試料容器（１）が、前記容器キャップ（１８）内の多数の角錐形の隆起部（１９）を有するマイクロタイター・プレートとして構成されていることを特徴とする、請求項８に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
10. 前記マイクロタイター・プレートが回転式に形成されていることを特徴とする、請求項９に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
11. 前記試料（１）を、前記試料容器の前記上側の領域内に、または前記少なくとも１つの隆起部（１９）の内部に位置決めするための前記手段が、栄養溶液浸透性を示す１つの半透膜（２１）、多数の穴を有する１つのプラットフォーム（２２）、または１つのウェブ（２４）からなることを特徴とする、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
12. 前記半透膜（２１）、前記プラットフォーム（２２）、または前記ウェブ（２４）が、ゲルからなることを特徴とする、請求項１１に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
13. 照射用対物レンズおよび検出用対物レンズのうちの少なくとも一方に、照射光および検出対象のうちの少なくとも一方である光が前記界面を斜めに通り抜けることにより生じるような収差を低減するための補正手段が含まれることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
14. 前記補正手段が、前記照射用対物レンズ（６）の内部および前記検出用対物レンズ（８）の内部のうちの一方の補正レンズ、好ましくは円柱レンズ、傾斜レンズ、もしくは軸上には配置されないレンズ、または非球面もしくは自由形状面を備えた補正素子からなるか、あるいは、照射ビームパス内および検出ビームパス内のうちの少なくとも一方に配置される、前記照射光および前記検出光ののうちの少なくとも一方の位相面を操作するためのアダプティブ光学素子、好ましくは変形可能なミラー、３次元光変調器、または位相板からなることを特徴とする、請求項１３に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
15. 容器底部（１１）および容器キャップ（１８）のうちの少なくとも一方が、前記試料（３）が入っている前記媒質（２）の屈折指数との差が５％未満である屈折指数を有する材料からなることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
16. 前記材料が、１つの第１成分と１つの第２成分とからなるナノ構造化混合材料であり、前記媒質（２）の屈性指数よりも、該第１成分の屈折指数が小さく、該第２成分の屈折指数が大きくなっており、さらに該第１成分の材料からなる領域の構造の平均サイズが、前記照射のために使用される検出対象である光の光波長よりも小さい平均直径を有することを特徴とする、請求項１５に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。

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