JP6514198B2 - 光シート顕微鏡検査用の装置 - Google Patents

Description

本発明は、光シート顕微鏡検査用の装置に関する。そのような装置には、試料キャリア上の媒質の中にある試料に照射ビームパスを介して光シートを照射するための１つの照射用対物レンズを有する１つの照射光学系が含まれるが、ここで、この試料キャリア（時には液体を受け入れるための、側壁が備えられた試料容器としても構成される）の位置合わせが、１つの平坦な基準面に関して行われ、ここで、この照射用対物レンズの光軸と光シートとが、基準面の法線とゼロ以外の照射角βをなして交わる１つの平面内に位置するようになっている。最後にこの装置には、検出ビームパス内に１つの検出用対物レンズを有する１つの検出光学系も含まれる。この検出用対物レンズの光軸は、基準面の法線とゼロ以外の検出角δをなして交差する。この装置にはそれ以外にも、媒質を照射用対物レンズおよび検出用対物レンズから隔離する所定厚さの所定材料からなる少なくとも１つの層を有する１つの隔離層系が含まれる。その際にこの隔離層系は、１つの底面が基準面に対して平行となるように位置合わせが行われており、また、少なくとも照射用対物レンズおよび検出用対物レンズが照射または検出のために接近可能な領域内においては、この底面により媒質と接触している。最後にこの装置には、照射光および検出対象である光のうちの少なくとも一方が隔離層系の界面を斜めに横切ることにより発生するような収差を低減するために利用される、少なくとも１つの補正レンズを有する１つの補正レンズ系も含まれる。

一般に照射用対物レンズと検出用対物レンズは、異なる２つの対物レンズであるが、例えば（特許文献１）に説明されているような、いわゆる二重対物レンズとして構成されたものであっても構わない。この場合は両方の対物レンズが１つの共通モジュラーユニットにまとめられて、それぞれの光学系（すなわち、対物レンズとその付属ビームパス、およびその中に配置される光学素子）は、このときには幾つかの素子を共有することになる。

そのような装置は特に、検出光軸とゼロ以外の角度をなして交わる平面を持つ光シートを使用して試料の照射が行われる、生物試料の調査において導入されるようになっている。ここで、この光シートが一般に、検出用対物レンズの光軸と通例は合致する検出方向と直角に交差するようになっている。ＳＰＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：選択的平面照明顕微鏡法）とも呼ばれるこの技術により、厚肉の試料であっても、比較的短時間のうちに３次元撮影画像を作成することができる。光学断層像を、断層面に対して垂直な向きへの相対運動と組み合わせることによって、試料を拡大して立体画像で再構築することが可能となる。

このＳＰＩＭ技術は、主に蛍光顕微鏡検査法において導入されるものであるが、ＬＳＦＭ（Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：光シート蛍光顕微鏡法）とも呼ばれている。共焦点レーザ走査顕微鏡法または２光子顕微鏡法など、他の定着している方法と比べ、このＬＳＦＭ技術には幾つかの長所がある。ワイドスクリーンでの検出を行うことができるため、試料のより大きな領域を捕捉することができる。確かに分解能は、共焦点レーザ走査顕微鏡法の場合よりも若干低下するとはいえ、侵入深さはそれよりも大きくなるため、このＬＳＦＭ技術により、より厚みのある試料を分析することができる。それ以外にもこの方法では試料の露光が最小限となり、それにより何よりも特に試料の褪色の怖れが低減されることになる、というのも試料は、薄い光シートだけによって、検出方向に対してゼロ以外の角度で照射されるからである。

例えば円柱レンズを利用して発生される静的光シートも、また準静的光シートも使用することができる。準静的光シートは、光ビームにより試料を高速で走査することによって発生することができる。光ビームが、観察される試料に対して非常に高速で相対運動され、かつその際には時間的に連続して何重にも並べることによって、光シート状の照明を生じることになる。試料は最終的にはカメラのセンサ上に結像されるが、このカメラの積分時間は、そこでは、この積分時間の間に走査が完了するように選定される。検出光学系においては、２次元検出フィールドを持つカメラの代わりに、ＣＣＤイメージセンサが、再走査（リスキャン）と組み合わせて使用されるようにしてもよい。他にも検出は、共焦点方式で行われても構わない。

ＳＰＩＭ技術については、これまでの間に文献で数多く取り上げられている（例えば、特許文献２およびこれに基づいた特許文献３、またはレビュー論文である非特許文献１を参照）。

光シート顕微鏡検査法の主な適用例の１つは、サイズが数１００μｍから数ミリメートルまでの中くらいの大きさの生体のイメージングにある。通例これらの生体はアガロース・ゲル中に埋め込まれるが、このアガロース・ゲルもまたガラス毛管内に入っている。このガラス毛管は、上側または下側から水で充満された１つの試料チャンバーの中に入れられて、試料の一部が毛管から押し出される。アガロース中の試料は、光シートにより照射されて、その蛍光が、この光シートに対して垂直に、またそのために光シート光学系に対しても垂直に位置している１つの検出用対物レンズを使用して、カメラ上に結像される。

この方式の光シート顕微鏡検査法には、３つの大きな短所がある。第１に、調査対象となる、発生生物学に由来する試料は、かなり大きなものとなっている。他にも、試料プレパラートと、試料チャンバーの寸法諸元のせいで、光シートがかなり分厚くなり、それにより達成可能な軸方向の分解能が制限されている。それに加え、試料プレパラートの作製には手間暇がかかる上に、蛍光顕微鏡検査法において個々の細胞を調査するために一般に使用されるような、標準型の試料プレパラートおよび標準型の試料ホルダーとの互換性もない。

これらの制約を、少なくとも一部については回避できるようにするために、最近数年の間に、照射用対物レンズと検出用対物レンズとが互いに直交し合うとともに、いずれも上側から４５°の角度で試料の方に向けられている、ＳＰＩＭ構成が実現されるにいたっている。基準面として、例えば試料ホルダーが置かれているテーブルの面、または別の、多くの場合は水平である平面を援用すると、照射角βおよび検出角δはいずれも４５°となる。そのような構成は、例えば（特許文献４）および（特許文献５）に説明されている。

そのような構成においては、試料が、例えば１つのペトリ皿の底の上に位置することになる。このペトリ皿は水で充満されており、照射用対物レンズおよび検出用対物レンズは液中に浸漬されるが、この水は液浸媒体の機能も受け持つようになっている。このアプローチ法により、より薄い光シートを発生することができるために、軸方向の分解能が向上されるという長所がもたらされる。分解能が向上されるために、この場合、より小さな試料の調査も可能となる。また試料プレパラートの作製も、格段と簡素化されるにいたっている。それにもかかわらず、依然として試料プレパラートも、また試料ホルダーも、個々の細胞での蛍光顕微鏡検査法において現在通用しているような標準仕様には、なおも適合したものとはなっていない。このため、対物レンズを両方とも、シャーレの周縁部にぶつけることなく、シャーレ内に浸漬できるようにするためには、ペトリ皿をかなり大きなものとしなければならない。生物学の数多くの分野において標準であり、また正に個々の細胞の蛍光顕微鏡検査による分析に際しても導入される、マイクロタイター・プレート（マルチウェル・プレートとも呼ばれる）を、この方法と同時に使用することは不可能である。というのも、このプレート上にラスター状に配置されている非常に小さな凹所の中に、これらの対物レンズを浸漬させることはできないからである。さらにもう１つの短所は、異なる試料の汚染を回避するために、試料を入れ替える際に対物レンズを清掃する必要があるために、この構成によっては、短時間で多数の試料の分析（ハイ・スループット・スクリーニング）を問題なく実現できない点にある。

これらの短所を取り除くには、β＝δ＝４５°という相対配位を維持する一方で、両方の対物レンズを上側から試料の方に向けるのではなく、試料容器の透明な底部越しに照射と検出が行われる一種の倒立顕微鏡のように、下側から試料の方に向けてやるというやり方がある。その場合は、この透明な底部が、底部と対物レンズとの間に位置する空気層とともに、隔離層系を形成することになる。検出については、これと等価な形で、試料容器が透明なカバーにより覆われている限り、またはまたそのようなカバーなしに（この場合隔離層系は空気層だけからなることになる）引き続き上側から行うようにしてもよい。こうすることによって、例えばマイクロタイター・プレート、ペトリ皿、およびスライドガラスなど、あらゆる代表的な試料容器を利用することが可能となり、特にハイ・スループット分析においては試料の汚染がもはや不可能となる。

しかしながら、この長所により、さらにもう１つの重大な短所を代償として支払うことになる。というのも、（例えばカバーガラスまたは容器底部とそれに隣接した空気層の）隔離層系を使用することにより、小さな開口数ですでに、例えばＮＡ＝０．３時にはすでに、隔離層系を斜めに横切ることにより、例えば球面収差、コマ収差、および非点収差などの極端な結像誤差を来たし、それにより標準型対物レンズを利用した場合は、正確なイメージングが不可能となるからである。

（特許文献６）においては、これらの短所を取り除くために、補正レンズまたはレンズ群の形態をとる補正手段を、照射用対物レンズおよび／または検出用対物レンズに組み込むことが提案されている。そこでは補正レンズとして、例えば円柱レンズ、光軸に対して傾斜したレンズ、軸上には配置されないレンズが提案されており、その際に、これらの補正レンズには、非球面または自由形状面を有するような素子も含まれるようになっている。他にもスライドガラスの材料として、水の屈折指数に近い屈折指数を持つ材料が使用されるようになっており、そこでは、それ以外の誤差も取り除くために、照射光および／または検出光の位相面を操作するためのアダプティブ光学素子が提案される。（非特許文献２）の論文およびそれに基づく特許である（特許文献７）には、この関係ではスライドガラスとして解釈することができる１つのビーム・スプリッターを斜めに横切る際に生じる空気中の収差を補正することが提案される。

欧州特許第０８６６９９３号明細書 独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書 国際公開第２００４／０５３５５８号 国際公開第２０１２／１１０４８８号 国際公開第２０１２／１２２０２７号 独国特許出願公開第１０２０１３１０７２９７号明細書 米国特許第４，４１２，７２３号明細書

ジェー・ヒューイスキン（Ｊ．Ｈｕｉｓｋｅｎ）他「発生生物学における選択的平面照明顕微鏡法技術（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｌａｎｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、Ｖｏｌ．１３６、２００９年に発行、ｐ．１９６３ ヴィクター・ジェー・ドハーティ（Ｖｉｃｔｏｒ Ｊ．Ｄｏｈｅｒｔｙ）およびデイヴィッド・シェーファー（Ｄａｖｉｄ Ｓｈａｆｅｒ）「集束光の中のビーム・スプリッターの収差を補正する簡単な方法（Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ Ｂｅａｍ Ｓｐｌｉｔｔｅｒ ｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇ Ｌｉｇｈｔ）」、Ｐｒｏｃ．ｏｆ ＳＰＩＥに掲載、Ｖｏｌ．０２３７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｎｓ Ｄｅｓｉｇｎ、発行１９８０

本発明の課題は、照射光および検出光が、スライドガラス、試料容器の底部またはカバーガラスを斜めに横切る際に発生する結像誤差を、特に既存の対物レンズを引き続いて使用することを可能にする、可能な限りシンプルに構成された補正レンズ系により補正することにある。

この課題は、冒頭に記した種類の光シート顕微鏡検査用の装置において、補正レンズ系が、照射用対物レンズと隔離層系の間、および検出用対物レンズと隔離層系の間のうちの少なくとも一方に配置されていることにより解決される。これにより、既存の対物レンズセットに、補正レンズ系を簡単に後付けすることができるが、この補正レンズ系は使用されるそれぞれのカバーガラスに対する適合化を必要とする。この補正レンズ系により、例えば水中または空気中のカバーガラス越しの水の結像を補正することができる。この場合は補正レンズ系が、使用されるカバーガラスだけに対して適合化されると充分である。使用される対物レンズに対する個別適合化は、必ずしも必要というわけではないが、これを実行することで、より良好な補正を達成することができる。その場合のピント合わせは、例えば、対物レンズが補正レンズ系と一緒に基準面の法線に沿って軸方向に移動されることにより行われるが、これについては、対物レンズのピント合わせを、ＩＦ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）方式により実施してもよく、この場合は、移動は行われないことになる。補正レンズ系は、対物レンズに剛結されていることが好ましく、対物レンズとともに移動されるようになっている。異なる対物レンズに対する適合化が不要であれば、補正レンズ系の準備を対物レンズに関係なく行うことも可能となり、例えば試料容器、試料テーブル、または顕微鏡構造の別の適切な地点に備えられる補正レンズ系用の１つのホルダーの中に、補正レンズを組み込むことができる。

好ましい一構成形態においては、照射ビームパス内にも、また検出ビームパス内にも、補正レンズ系の少なくとも１つのレンズが配置されている。すなわち、この場合は同じ補正レンズが、照射ビームパスの補正のためにも、また検出ビームパスの補正のためにも使用されることになる。こうすることによって、レンズの使用数を低減することができ、それにより製造および組付け時の作業工数ならびに経費を低減することができる。補正レンズ系は、例えば、半球体を想起させる形状を持つ複数のレンズを組み合わせて構成されたものであってもよいが、その際にレンズ面は必ずしも球面である必要はなく、それよりも好ましくはむしろ、非球面であったり、自由形状であったりしてもよい。

さらにもう１つの好ましい構成形態においては、光シート顕微鏡検査用の装置が、さらにもう１つの検出ビームパス内にさらにもう１つの検出用対物レンズを有しているが、そこでは補正レンズ系の少なくとも１つのレンズが、このさらなる検出ビームパス内にも配置されている。この場合は、両方の検出用対物レンズと照射用対物レンズが、同じ１つの補正レンズ系を共有することになるが、あるいはその代わりに、それぞれの系に専用の補正レンズ系を持たせるようにしてもよい。その場合は、３つの対物レンズの光軸が、それぞれ２つずつ互いに対して９０°の角度で交差するとともに、例えば容器底部またはカバーガラスが位置している平面により定義される基準面の法線に関して４５°傾斜していることになる。そこでは３つの対物レンズはみな交互に照射用対物レンズとして利用され、残りの２つは検出用対物レンズとして利用されるようになっている。続いて、個々の画像をコンピュータ支援により結合することにより、深部の分解能が高い１枚の全体画像を決定することができる。

さらにもう１つの好ましい構成形態において、補正レンズ系は試料を拡大して結像するように構成されている。すなわち照射光または検出光が斜めに横切る場合の補正とならび、さらに拡大画像も生成されることになる。これには、それにより補正素子の後方の開口数が小さくなるという長所があるが、これによってもまた、開口数の小さくなった検出用対物レンズを使用することが可能となり、その結果、一方では作動距離の拡大が許容され、他方では補正に対する要求が若干軽減されることになる。というのも、特に開口数が大きい場合には、レンズの外部領域の結像誤差が極めて顕著に表面化するからである。

それ以外の従属請求項には、補正レンズ系のさらに他の特段の適合化が図られた実施形態が提示されている。補正レンズ系は、例えば２つまたはそれ以上の球面レンズおよび非球面レンズのうちの少なくとも一方を組み合わせて構成されたものであってもよいか、または他にも、この場合、片側もしくは両側のレンズ面が非球面に形成されている１つのレンズだけからなっていてもよい。

当然ながら上記で指摘し以下でさらに解説する特徴は、提示される組み合わせにおいてだけではなく、他の組み合わせにおいても、または単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく導入することができる。

以下では本発明を添付の図面に基づき例を挙げてさらに詳しく解説するが、これらの図面にも本発明の重要な特徴が開示される。

補正レンズ系を備えた光シート顕微鏡検査装置の構成原理を示す図。 そのような装置の第１の特殊な構成形態を示す図。 そのような装置のさらにもう１つの特殊な構成形態を示す図。 第１の補正レンズ系の詳細図。 第２の補正レンズ系の詳細図。 第３の補正レンズ系の詳細図。

最初に図１には光シート顕微鏡検査用の装置の基本構造が示される。ここではこの装置に、媒質２（例えば水または培養液）に入れた試料３を受け入れるための、試料容器１として、例えばペトリ皿として構成された、１つの試料キャリアが含まれる。そこでは、この試料容器１の位置合わせが１つの平坦な基準面４に関して行われている。この平坦な基準面４は、ここでは試料容器１の底部により形成される。試料容器１の代わりに、それ以外の、通常の板状のスライドガラスなどの試料キャリア、または他にもマイクロタイター・プレートなどのハイ・スループット用の容器を使用することもできる。この光シート顕微鏡検査用の装置には、他にも、照射ビームパスを介して試料３に光シートを照射するための１つの照射用対物レンズ５を有する１つの照射光学系が含まれるが、そこではこの照射用対物レンズ５の光軸６と光シートは、基準面４の法線とゼロ以外の照射角βをなして交わる１つの平面内に位置している。この装置には他にも、検出ビームパス内に、基準面４の法線とゼロ以外の検出角δをなして交わる光軸８を持つ１つの検出用対物レンズ７を有する１つの検出光学系が含まれる。最後にこの装置には、媒質２を照射用対物レンズ５および検出用対物レンズ７から隔離する所定厚さの所定材料からなる少なくとも１つの層を有する１つの隔離層系も含まれる。この隔離層系は、そこでは基準面に対して平行に向けられた底面９を有しており、隔離層系は、少なくとも照射用対物レンズ５および検出用対物レンズ７が照射または検出のために接近可能な領域内においては、この底面により媒質２と接触している。隔離層系は、ここでは、厚さおよび材料組成が通例は既知である容器底部、ならびに、この容器底部の下側のさらにもう１つの媒質からなっている。このさらなる媒質は空気であってもよいが、容器底部と補正レンズ系の試料に最も近接したレンズとの間の領域を充満する水または水溶液、例えば生理食塩水であることが好ましい。その余の領域についても、さらにもう１つの液状媒質により充満されているとよいが、それにより補正レンズ系はこのさらなる媒質中に完全に位置することになる。液状媒質において後者が特に有意であるのは、補正レンズ系が結合されることになる対物レンズが、浸漬型の対物レンズである場合である。底面９は、媒質２と対向している容器底部の上側により形成される。ここに示される倒立型のコンフィギュレーションの代わりに、正立型のコンフィギュレーションを使用することもできるが、この場合は隔離層系に、何よりも特に試料容器１用の容器カバーの形態をとる１つのカバーが含まれていてもよい。そのようなカバーを放棄することもできるが、このケースでは底面が媒質２の表面に相当することになり、隔離層系は、このケースでは１つの水の層だけからなることになるだろう。

最後にこの光シート顕微鏡検査用の装置には、照射光および検出対象である光のうちの少なくとも一方が隔離層系の界面を斜めに横切ることにより発生するような収差を低減するための少なくとも１つの補正レンズを有する１つの補正レンズ系も含まれる。この補正レンズ系は、結像誤差をどのくらいの工数をかけて補正すべきであるかに応じて、照射用対物レンズと隔離層系の間、または検出用対物レンズと隔離層系の間、または両対物レンズと隔離層系の間のいずれかに配置されている。この場合、照射用対物レンズの開口数は、通例は検出用対物レンズの開口数よりも小さいために、補正はどちらかというと検出ビームパス内で実施されるか、または両方のビームパス内で実施されるようになっている。図示のケースでは、補正レンズ系が、照射用対物レンズ５と隔離層系の間にも、また検出用対物レンズ７と隔離層系の間にも配置されている。この隔離層系は２つの個別補正レンズ１０および１１からなるが、第１の補正レンズ１０が照射用対物レンズ５と隔離層系の間に配置され、第２の補正レンズ１１が検出用対物レンズ７と隔離層系の間に配置されている。これらの補正レンズ１０、１１は、球面、非球面、または自由形状面を有していてもよく、補正レンズ系は、ビームパスごとに複数のレンズからなっていても構わない。

図２に示される非常に好ましい一構成形態においては、１つの補正レンズ１２が、照射ビームパス内にも、また検出ビームパス内にも配置されている。すなわち照射用対物レンズ５と検出用対物レンズ７は、この補正レンズ１２を共有している。この補正レンズ１２では、例えば両側の面の一方が非球面に構成されていてもよい。照射用対物レンズ５の開口数は０．５であることが好ましく、検出用対物レンズ７の開口数は、１．０であると好適である。試料と検出用対物レンズ７との間の作動距離は８ｍｍである。照射用対物レンズはよりコンパクトな構造とすることができるために、検出用対物レンズを基準面４の法線に対してより小さな角度で配置することが可能となるが、この角度はここでは３２°となっている。この場合は、照射光の入射は、直角の相対配位を維持すべきである限り、対応してより大きな照射角β＝５８°で行われることになるが、しかしながらこれは、必ずしもそうしなければならないものではない。

図３には類似の一構成形態が示されるが、ここに示される装置には、さらにもう１つの検出用対物レンズ７’を有するさらにもう１つの検出ビームパスが含まれており、このビームパス内にも補正レンズ系の補正レンズ１２が配置されている。図を見やすくするために、同じ構造を持つ第３の対物レンズを図示するのは放棄されているが、この対物レンズも補正レンズ１２を利用できるようになっている。３つの対物レンズはみな交互に照射に利用され、この場合、残りの２つは検出に利用されるようになっている。ここでも補正レンズ１２の面の一方は非球面に構成されている。作動距離は、開口数がＮＡ＝０．８６である場合は水中でそれぞれ８ｍｍであるが、それにより機械同士の衝突を回避することが可能であり、検出用対物レンズ７、７’は両方とも同一に構成されている。それ以外にも、補正レンズ系により空気中の試料が結像されて、かつこれに隣接する１つのエアレンズが使用される場合には、試料が拡大されて結像されるように補正レンズ系を構成することができる。これにより複数の検出用対物レンズ７、７’が使用される正にこのコンフィギュレーションにおいては、これらの対物レンズの開口数を小さくすることが可能となる。

図４〜図６には、特に隔離層系において使用される材料およびその厚さに目を向けて特段の最適化が図られている、補正レンズ系のさらに他の構成形態が示される。
図４には、２つの球面レンズ１３および１４からなる補正レンズ系が示されている。試料とレンズ１４の頂点間の基準面に対して垂直な距離は５．５８ｍｍである。試料容器１のガラス底部用の材料として、そこでは厚さ１７０μｍのクラウンガラスＮ−Ｋ５を使用した。波長がλ_ｅ＝５４６．０７ｎｍであるとき、屈折指数はｎ_ｅ＝１．５２４６、アッベ数はｖ_ｅ＝５９．２２である。試料に近い方の球面レンズ１３が、屈折指数ｎ_ｅ＝１．４３９９およびアッベ数ｖ_ｅ＝９４．４９のガラスＳ−ＦＰＬ６３から製造され、かつ対物レンズと対向している球面レンズ１４が、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）社が販売している、波長がλ_ｄ＝５７８．５８ｎｍであるときに屈折率ｎ_ｄ＝１．４８７４９および逆分散率ｖ_ｄ＝７０．４１、ならびに屈折指数ｎ_ｅ＝１．４８９１およびアッベ数ｖ_ｅ＝７０．２３を有する材料Ｎ−ＦＫ５から製造される場合は、極めて良好な補正がもたらされる。

４つのレンズ面の半径は、対物レンズ側から順に、ｒ_１＝−１６．４２ｍｍ、ｒ_２＝−１７．０４ｍｍ、ｒ_３＝−１４．７０ｍｍ、およびｒ_４＝−１３．９５ｍｍである。この補正レンズ系は、図２に示される、検出角がδ＝３２°であり、かつ検出用対物レンズの開口数が、少なくともサジタル方向にＮＡ＝１であるコンフィギュレーションを用いた使用に非常に適している。それぞれ頂点のところで、レンズ１３の厚さは０．２７ｃｍであり、レンズ１４の厚さは０．４３ｃｍである。この補正レンズ系は、水中または生理食塩水中での使用を想定してレイアウトされており、レンズは両方とも水で取り囲まれるようになっている。

図５には、補正レンズ系のさらにもう１つの構成形態が示されている。補正レンズ系には、ここでは１つの非球面レンズ１５が含まれるが、この補正レンズ系も特に図２に示される構成における使用に適したものとなっている。容器底部の材料および厚さは、図４に関して記載したものと同じである。試料３と、対物レンズと対向している外側の、同じく非球面に形成された面であるレンズ面との間の距離は、ここでは６ｍｍである。レンズ用の材料としては、屈折指数ｎ_ｄ＝１．５１６８、およびｖ_ｄ＝６４．１７のアッベ数を有するホウケイ酸クラウンガラス（ＢＫ７）を使用した。凹型球面の半径はｒ＝−７．１２２ｍｍであり、頂点における厚さは１．２６７ｍｍである。対物レンズと対向している凸型面は、非球面に形成されている。この非球面に形成された面、ここでは回転対称形の円錐曲線の非球面は、この場合次の関係式

により記述される。Ｋはコーニック定数であり、ｉおよびＮは自然数である。ｃ_２ｉはｈの多項式係数を記述する。ρについては、関係式ρ＝１／Ｒが成立し、Ｒは、この面の頂点のところの仮想円錐曲線面の半径、すなわちこの頂点から最も近い焦点までの距離を記述する。そこでは、この頂点も、また円錐曲線面の焦点も、光軸上に位置している。ｈは、この光軸のところで関数ｆ（ｈ）の値が決定される光軸までの距離を記述し、ｆは、光軸からの距離がｈである、円錐曲線面の頂点において光軸と直交する１つの平面からの、レンズ表面の距離である。係数ｃ２ｉ、コーニック定数Ｋ、および半径Ｒは、反復法により決定される。図示の例において、コーニック定数の値はＫ＝０．１１０７８であり、また頂点半径はＲ＝−８．０１７９ｍｍである。レンズ高さが一般的な約３０ｍｍであると仮定すると、ｈからｉ＝３までの次の多項式係数が成立する：ｃ_２＝２．７０５１１６・１０^−５、ｃ_４＝６．４８１２８３・１０^−９、およびｃ_６＝６．７９６６６０・１０^−９。

最後に図６には補正レンズ系のさらにもう１つの例が示されるが、ここで使用される補正レンズは非球面レンズ１６として構成されている。これも同様に、図２に示される、検出角がδ＝３２°、検出用対物レンズ７の開口数がＮＡ＝１である、光シート顕微鏡検査装置における使用に適したものとなっている。図５との関連で説明した例とは異なり、この非球面レンズ１６では、両側の面が、すなわち凸型面も、また凹型面も、非球面に形成されている。試料容器１の容器底部用および非球面レンズ用の材料は、図５との関連ですでに説明した材料と同じである。試料３と非球面レンズの外側の凸型に形成された面との間の好ましい距離は５．４９ｍｍである。凹型に形成された非球面については、次の値が成立する：Ｒ＝−５．２９４５０９、Ｋ＝１．１２６３３４、ｃ_２＝−５．５８０３６８・１０^−３、ｃ_４＝６．２９２４２３・１０^−４、およびｃ_６＝−２．４７８３３２・１０^−５。凸型に形成された非球面については、次の値が成立する：Ｒ＝−５．８０６４６９、Ｋ＝０．９７７６６４１２、ｃ_２＝−３．２２０２１２、ｃ_４＝２．７８０７６９・１０^−４、およびｃ_６＝−８．２６３９５６・１０^−６。

１ 試料容器
２ 媒質
３ 試料
４ 基準面
５ 照射用対物レンズ
６ 光軸
７、７’ 検出用対物レンズ
８ 光軸
９ 底面
１０ 補正レンズ
１１ 補正レンズ
１２ 補正レンズ
１３、１４ 球面レンズ
１５、１６ 非球面レンズ
β 照射角
δ 検出角

Claims (6)

1. 光シート顕微鏡検査用の装置であって、
   試料キャリア上の媒質（２）の中にある試料（３）に照射ビームパスを介して光シートを照射するための１つの照射用対物レンズ（５）を有する１つの照射光学系と、ここで該試料キャリアの位置合わせが、前記試料キャリアの底部によって形成された１つの平坦な基準面（４）に関して行われ、ここで該照射用対物レンズ（５）の光軸（６）と該光シートとが、該基準面（４）の法線とゼロ以外の照射角（β）をなして交わる１つの平面内に位置しており、
   検出ビームパス内に１つの検出用対物レンズ（７）を有する１つの検出光学系があり、該検出用対物レンズ（７）の光軸（８）は、該基準面（４）の法線とゼロ以外の検出角（δ）をなして交差しており、
   該媒質（２）を該照射用対物レンズ（５）および該検出用対物レンズ（７）から隔離する、所定厚さの所定材料からなる少なくとも１つの層を有する１つの隔離層系と、該隔離層系は、該基準面（４）に対して平行に位置合わせされ、かつ少なくとも該照射用対物レンズ（５）および該検出用対物レンズ（７）が照射または検出のために接近可能な領域内においては該媒質（２）と接触している１つの底面（９）を含み、
   照射光および検出対象である光のうちの少なくとも一つが、該隔離層系の界面を斜めに横切ることにより発生するような収差を低減するための少なくとも１つの補正レンズ（１０、１１、１２）を有する１つの補正レンズ系と
   が含まれる装置において、
   該補正レンズ系が、照射用対物レンズ（５）と隔離層系の間、および検出用対物レンズ（７）と隔離層系の間のうちの少なくとも一方に配置されていることを特徴とする、装置。
2. 前記補正レンズ系の前記少なくとも１つの補正レンズ（１２）が、前記照射ビームパス内にも、また前記検出ビームパス内にも配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
3. さらにもう１つの検出用対物レンズ（７’）を有するさらにもう１つの検出ビームパスを含み、前記補正レンズ系の前記少なくとも１つの補正レンズ（１２）が、該さらなる検出ビームパス内にも配置されている、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記補正レンズ系が、前記試料（３）を拡大して結像するように構成されていることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置。
5. 前記補正レンズ系が、１つの第１の球面レンズおよび１つの第２の球面レンズ（１３，１４）から組み合わせて構成されていることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
6. 前記補正レンズ系に、少なくとも１つの非球面を有する１つのレンズが含まれることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。