JP2016520318A - Ii型crisprシステムにおける新規のコンパクトなcas9足場 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ゲノム標的化のためのCRISPR-Casシステムの分野の発明である。本発明は、新規の操作されたCas9足場およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ゲノム標的化のための方法、細胞工学および治療における応用に関する。本発明は、本発明の新規のCas9足場が用いられている、ベクター、組成物、およびキットにも関する。
部位特異的ヌクレアーゼは、複雑なゲノム内のDNA配列を特異的かつ効率的に標的化および修飾するための強力な試薬である。部位特異的ヌクレアーゼによるゲノム工学の応用は数多く存在し、基礎研究から生物工業的応用およびヒト治療法にまで及ぶ。この目的のためにDNA結合タンパク質を再操作することは、天然に存在するLADLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)、人工亜鉛フィンガータンパク質(ZFP)、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALE-ヌクレアーゼ)などのタンパク質のデザインおよび作出に主に限定されてきた。
本発明は、互いに組み合わされて、よりコンパクトでありかつ/またはより特異的な組換えCas9足場(すなわち、アミノ酸1100個未満の人工融合タンパク質)を生じる新規のRuvC配列モチーフおよびHNH配列モチーフを提供する。Cas9タンパク質は、標的核酸配列をガイドRNAとともにまたはガイドRNAと別個にプロセッシングしうる2つの別個のスプリットCas9 RuvCおよびHNHドメインに分けることができる。これらの足場は遺伝子標的化のための方法において、特に遺伝子編集のための特異的ヌクレアーゼとして用いられる。これらの新規の足場をコードする発現ベクター、およびこれらのベクターで形質転換され操作された細胞も、本発明の主題である。
(表1)Cas9相同体のRuvCドメインの多重配列アライメント。
(表2)化膿性連鎖球菌のCas9のRuvCドメインの二次構造予測およびRuvCドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 12)。
(表3)Cas9相同体のHNHドメインの多重配列アライメント。
(表4)化膿性連鎖球菌のCas9のHNHドメインの二次構造予測および関連するHNHドメイン配列(SEQ ID NO: 23)。
(表5)より短いCas9相同体の多重配列アライメント。
(表6)Cas9のより短いバージョンの二次構造予測および関連するより短い化膿性連鎖球菌のCas9配列。
(表7)化膿性連鎖球菌のCas9のDNA/RNA結合領域のリスト。
(表8)化膿性連鎖球菌のCas9(SEQ ID NO: 61)およびサーモフィラス菌(S. thermophilus)のCas9(SEQ ID NO: 64)ならびに大腸菌(E.coli)およびサーモフィラス菌のRuvCドメインの2つのpdb構造の配列(SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 63)の間の多重配列アライメント。
(表9)8つの選択配列ならびに化膿性連鎖球菌の野生型Cas9およびサーモフィラス菌のCas9および4EP4 pdbcodeの多重配列アライメント。G247の位置は、黒矢印で印が付けられている。
(表10)PSIPREDを用いた化膿性連鎖球菌の野生型Cas9配列の二次構造エレメント予測。当該配列は2つのスプリットドメイン: N末端ドメインおよびC末端ドメインに分けられている。当該C末端ドメインの配列中のバリンに変異したロイシン248は、太字で印が付けられている。
本明細書において具体的に定義されない限り、用いられる全ての技術的および科学的用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、分子生物学および免疫学の分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
Csn1(COG3513)とも名付けられているCas9は、crRNA生合成および侵入性DNAの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Cas9は、サーモフィラス菌(Sapranauskas NAR 2011)、リステリア菌(listeria innocua)(jinek Science 2012)および化膿性連鎖球菌(Deltcheva, Chylinski et al. 2011)などのさまざまな細菌種において記述されている。大きなCas9タンパク質(アミノ酸1200個超)は、予測される2つのヌクレアーゼドメイン、すなわち当該タンパク質の中央に位置するHNH(McrA様)ヌクレアーゼドメインと、分割されたRuvC様ヌクレアーゼドメイン(RNase Hフォールド)とを含む(Haft, Selengut et al. 2005; Makarova, Grishin et al. 2006)。RNAse HフォールドへのHNHヌクレアーゼドメインの挿入から、2つのヌクレアーゼ活性が密接に関係していることが示唆される。最近になって、HNHドメインは標的二本鎖DNAの一方の鎖のニッキングに関与しており、RuvC様RNase Hフォールドドメインは二本鎖DNA標的の他方の鎖の切断に関わっていることが実証された(Jinek, Chylinski et al. 2012)。ともに、これらの2つのドメインは各々、PAMのすぐ近くにおいてプロトスペーサー内の標的DNA鎖にニックを入れ、これによって侵入DNAの平滑切断をもたらす(Jinek, Chylinski et al. 2012)。本発明によれば、コンパクトなCas9変異体は、RuvCドメインおよびHNHドメインをコードする、1100個未満、好ましくは1000個未満、より好ましくは900個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは800個未満のアミノ酸を含む、エンドヌクレアーゼである。
別の局面において、本発明は、標的核酸切断から標的遺伝子制御に及ぶさまざまな応用のための本発明によるポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの使用のための方法に関する。ゲノム操作実験において、本特許出願において言及されているCas9/CRISPRシステムの効率、例えばある遺伝子座の位置で所望の事象(相同遺伝子標的化、標的突然変異誘発、配列除去または切除)を誘導するその能力は、ヌクレアーゼの特異的活性、おそらく標的の接近可能性、ならびに所望の事象を引き起こす修復経路(遺伝子標的化のための相同修復、標的突然変異誘発のためのNHEJ経路)の効力および結果を含むいくつかのパラメータに依存する。
(a)細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
(c)該細胞においてCas9が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9を該細胞内に導入する段階。
(a)細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)標的核酸配列と相補的な配列を含むcrRNAを提供する段階;
(c)該crRNAの一部分と相補的な配列を含むTracrRNAおよび上記のCas9を提供する段階;
(d)該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNA、および該Cas9を該細胞内に導入する段階
を含む。
(a)細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
(c)上記の少なくとも1つのスプリットCas9ドメインを提供する段階;
(d)該細胞において該スプリットCas9ドメインが該標的核酸配列をプロセッシングするように、該スプリットCas9ドメインを該細胞内に導入する段階
を含む。
本発明による方法で用いるために種々の細胞が適している。細胞は、任意の原核生物または真核生物の生細胞、これらの生物に由来するインビトロ培養用の細胞株、動物または植物由来の初代細胞であることができる。
Cas9、スプリットCas9タンパク質、ガイドRNAを細胞または胚に導入することにより、動物が作出されうる。具体的には、本発明は、遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階; 本発明によるcas9を導入することによって標的核酸配列内に切断を生じさせる段階; および切断が起こった細胞またはその子孫から動物を作出する段階を含む、動物を作出するための方法に関する。典型的には、当該胚は、受精した1細胞期胚である。ポリヌクレオチドは、胚の核または細胞質へのマイクロインジェクションを含む当技術分野において公知の方法のいずれかにより細胞内に導入されうる。特定の態様において、動物を作出するための方法は、所望の外因性核酸を導入する段階をさらに含む。当該外因性核酸は、例えば、相同組換え後に遺伝子を破壊する核酸配列、相同組換え後に遺伝子を置換する核酸配列、相同組換え後に遺伝子に変異を導入する核酸配列、または相同組換え後に調節部位を導入する核酸配列を含むことができる。その後、当該胚を培養して動物を発生させる。本発明の1つの局面において、少なくとも関心対象の標的核酸配列が操作されている動物が提供される。例えば、操作された遺伝子は、それが転写されないかもしくは正しく翻訳されないように、または当該遺伝子の他の形態が発現するように、不活性になりうる。動物は、当該操作された遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性でありうる。
本明細書において開示される方法には、種々の応用がありうる。1つの態様において、本方法は、臨床または治療への応用に用いることができる。本方法は、例えば鎌状赤血球病における単一ヌクレオチド変化のような疾患原因遺伝子を修復または修正するために用いることができる。本方法は、特定の疾患または疾患状態に関与している他の遺伝子または染色体配列におけるスプライス部位変異、欠失、挿入などを修正するために用いることができる。
上記の説明のなかで、いくつかの用語が広く使われている。以下の定義は、本態様の理解を容易にするために提供される。
本発明者らは、トランスフェクションおよびベクター化の有効性を増加させるために、化膿性連鎖球菌のCas9タンパク質(gi|15675041|)のトランケーションを行う。トランケーションされた形態のCas9をNHEJおよびHRの有効性について哺乳類細胞で試験する。最初の戦略は、化膿性連鎖球菌のCas9の相同体の保存された配列セグメントの特定に基づく半合理的手法を意味する。この戦略は、化膿性連鎖球菌のCas9の配列の特徴に由来するデータ、すなわち配列相同体ならびに二次構造予測およびタンパク質ドメイン境界予測を用いることに基づく。
RuvC配列モチーフを用いて見出された358配列のなかで、8つの配列(SEQ ID NO: 5〜SEQ ID NO: 12)を抽出し、化膿性連鎖球菌のCas9のオリジナル配列(SEQ ID NO: 3)とアライメントさせた。標準的な多重配列アライメントソフトウェア(DIALIGN 2.2.1ソフトウェア)(Morgenstern 2004)を用いてアライメントを作成した。Cas9相同体のアライメントを以下のように表1に提示する:
1) 化膿性連鎖球菌のCas9(SEQ ID NO: 4) 1368アミノ酸(AA)
2) D8IJI3_LACSC (SEQ ID NO: 5) 183 AA
3) F0K1W4_LACD2 (SEQ ID NO: 6) 669 AA
4) E1NX15_9LACO (SEQ ID NO: 7) 142 AA
5) C5F1Z4_9HELI (SEQ ID NO: 8) 344 AA
6) F3ZS86_9BACE (SEQ ID NO: 9) 349 AA
7) H1D479_9FUS0 (SEQ ID NO: 10) 198 AA
8) K1M766_9LAC0 (SEQ ID NO: 11) 857 AA
9) Q7VG48_HELHP (SEQ ID NO: 12) 131 AA
HNH配列モチーフ(Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S)を用いて見出された187配列のなかで、9つの配列(SEQ ID NO: 14〜22)を抽出し、上記のようにDIALIGN 2.2.1ソフトウェアを用いて化膿性連鎖球菌のCas9のオリジナル配列(SEQ ID NO: 3)とアライメントさせた(表3参照)。Cas9相同体のアライメントを以下のように表3に提示する。
1) D8IJI4_LACSC (SEQ ID NO: 14) 897 AA
2) FOK1W6_LACD2 (SEQ ID NO: 15) 544 AA
3) D4FGK2_9LACO (SEQ ID NO: 16) 534 AA
4) E1NX12_9LACO (SEQ ID NO: 17) 667 AA
5) E7NSW3_TREPH (SEQ ID NO: 18) 591 AA
6) H1D477_9FUSO (SEQ ID NO: 19) 387 AA
7) C2KFJ4_9LACO (SEQ ID NO: 20) 544 AA
8) K1MRU9_9LACO (SEQ ID NO: 21) 206 AA
9) E3ZTQ9_LISSE (SEQ ID NO: 22) 874 AA
10)化膿性連鎖球菌のCas9(SEQ ID NO: 3) 1368 AA
本研究は、より短い配列を有する4種の推定上の天然Cas9相同体の特定(SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 29)をさらに可能とする。上記のようにDIALIGN 2.1.1ソフトウェアを用いて、これらの天然の、Cas9のより短いバージョンを化膿性連鎖球菌のCas9とアライメントさせた。より短いCas9相同体のアライメントを以下のように表5に提示する。
1) D4IZM9_BUTFI (SEQ ID NO: 26) 765 AA
2) Q9CLT2_PASMU (SEQ ID NO: 27) 1056 AA
3) E0G5X6_ENTFL (SEQ ID NO: 28) 936 AA
4) E0XXB7_9DELT (SEQ ID NO: 29) 1011 AA
5) 化膿性連鎖球菌のCas9(SEQ ID NO: 3) 1368 AA
本研究において、ガイドRNAおよびPAMモチーフの結合に関与するCas9残基を特定することにより、新規のCas9足場を遺伝子操作により作成することが可能となり、ひいては、選択された標的に対する親和性を調節することが可能となるであろう。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列は、COG3513(McrA/HNHヌクレアーゼドメインおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインを含有する、予測上のCRISPR関連ヌクレアーゼ)に属する。COG3513の配列のメンバーのアライメントを用いて、2つの配列モチーフ(それぞれが2つの既知の触媒ドメイン: RuvCおよびHNHの1つに隣接する)を構築した。当該2つの配列モチーフを用いて、Uniprotに提示されているタンパク質配列のうち、2つのドメインの各々を持つ配列を全て(PROSITEを用いて)抽出した。RuvCモチーフ(D-[IL]-G-x(2)-S-x-G-W-A)の使用によって358配列の抽出が可能となり、HNHモチーフ(Y-2x-D-H-2x-P-x-S-3x-D-x-S)の使用によって187配列の抽出が可能となる。
染色体に組み込まれた、ガイドRNA認識配列を含むGFPレポーター遺伝子(SEQ ID NO: 56)を含有するCHO-KI(π10)細胞を、2 mM l-グルタミン、ペニシリン(100 IU/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml)、アンフォテリシンB(Fongizone: 0.25 μg/ml, Life Technologies,)および10% FBSを補充したF12-K完全培地中、5% CO2にて37℃で培養した。Nucleofector機器(Amaxa, Cologne, Germany)を用いて製造元の使用説明書にしたがって細胞のトランスフェクションを行った。接着CHO-KI細胞を培養0日目に収集し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、トリプシン処理し、Tヌクレオフェクション溶液に細胞1×106個/100 μLの濃度で再懸濁した。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列(SEQ ID NO: 12)
化膿性連鎖球菌のCas9の二次構造
化膿性連鎖球菌のCas9の配列
二次構造予測(Psipred)
化膿性連鎖球菌のCas9の配列
二次構造予測(Psipred)
化膿性連鎖球菌のCas9の配列
N末端ドメイン
C末端ドメイン
二次構造予測(Psipred)
N末端ドメイン
C末端ドメイン
本発明は、互いに組み合わされて、よりコンパクトでありかつ/またはより特異的な組換えCas9足場(すなわち、アミノ酸1100個未満の人工融合タンパク質)を生じる新規のRuvC配列モチーフおよびHNH配列モチーフを提供する。Cas9タンパク質は、標的核酸配列をガイドRNAとともにまたはガイドRNAと別個にプロセッシングしうる2つの別個のスプリットCas9 RuvCおよびHNHドメインに分けることができる。これらの足場は遺伝子標的化のための方法において、特に遺伝子編集のための特異的ヌクレアーゼとして用いられる。これらの新規の足場をコードする発現ベクター、およびこれらのベクターで形質転換され操作された細胞も、本発明の主題である。
[本発明1001]
HNHドメインを含むがRuvCドメインを含まないスプリットCas9であって、該HNHドメインが少なくとも1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
[本発明1002]
RuvCドメインを含むがHNHドメインを含まないスプリットCas9であって、該RuvCドメインが少なくとも1つのモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
[本発明1003]
500アミノ酸長未満である、本発明1001または1002のスプリットCas9。
[本発明1004]
RuvCドメインおよびHNHドメインを含む、アミノ酸が1100個未満のCas9変異体であって、これらのドメインが、少なくとも、1つのRuvCモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aまたは1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記Cas9変異体。
[本発明1005]
前記Cas9変異体のC末端ドメインが、HNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sの後ろでトランケーションされている、本発明1001〜1004のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1006]
前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1005のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1007]
前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、本発明1006のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1008]
前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1009]
前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、本発明1008のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1010]
前記RuvCドメインおよびHNHドメインが、ペプチドリンカーによって分離されている、本発明1001〜1009のいずれかのCas9変異体。
[本発明1011]
前記ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 49〜SEQ ID NO: 50の群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1010のCas9変異体。
[本発明1012]
SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1011のCas9変異体。
[本発明1013]
非機能的RuvCまたはHNH触媒ドメインのいずれかを含む、本発明1001〜1012のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1014]
SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、本発明1001〜1013のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1015]
SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、本発明1001〜1014のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1016]
標的核酸配列を切断するために、該標的核酸配列上で少なくとも1つのガイドRNAと複合体を形成させるための、本発明1001〜1015のいずれかにおいて定義されたCas9変異体またはスプリットCas9の使用。
[本発明1017]
以下の段階を含む、細胞におけるゲノム標的化の方法:
(a)PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)該標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
(c)本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
(d)Cas9またはスプリットCas9が該細胞において該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
[本発明1018]
以下の段階を含む、本発明1017の細胞におけるゲノム標的化の方法:
(a)PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)該標的核酸配列と相補的でありかつ3'伸長配列を有する配列を含むcrRNAを提供する段階;
(c)該crRNAの該3'伸長配列の一部分と相補的な配列を含むTracrRNAを提供する段階;
(d)本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
(e)該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
[本発明1019]
前記crRNAおよび前記tracrRNAが融合されて一本鎖のガイドRNAを形成する、本発明1018の方法。
[本発明1020]
標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な少なくとも1つの配列を含む外因性核酸配列を導入する段階をさらに含む、本発明1017〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記細胞が植物細胞である、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記細胞が哺乳類細胞である、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9を含む、単離された細胞。
[本発明1024]
以下の段階を含む、動物を作出するための方法:
(a)遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階;
(b)本発明1017〜1020のいずれかの方法により該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
(c)切断が起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階。
[本発明1025]
前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記細胞内に導入する段階、および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
以下の段階を含む、植物を作出するための方法:
(a)遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む植物細胞を提供する段階;
(b)本発明1017〜1020のいずれかの方法により、該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
(c)切断が起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階。
[本発明1027]
前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記植物細胞内に導入する段階; および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階をさらに含む、本発明1026の方法。
Claims (27)
- HNHドメインを含むがRuvCドメインを含まないスプリットCas9であって、該HNHドメインが少なくとも1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
- RuvCドメインを含むがHNHドメインを含まないスプリットCas9であって、該RuvCドメインが少なくとも1つのモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
- 500アミノ酸長未満である、請求項1または2に記載のスプリットCas9。
- RuvCドメインおよびHNHドメインを含む、アミノ酸が1100個未満のCas9変異体であって、これらのドメインが、少なくとも、1つのRuvCモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aまたは1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記Cas9変異体。
- 前記Cas9変異体のC末端ドメインが、HNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sの後ろでトランケーションされている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、請求項6に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、請求項8に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 前記RuvCドメインおよびHNHドメインが、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のCas9変異体。
- 前記ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 49〜SEQ ID NO: 50の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のCas9変異体。
- SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜11に記載のCas9変異体。
- 非機能的RuvCまたはHNH触媒ドメインのいずれかを含む、請求項1〜12に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
- 標的核酸配列を切断するために、該標的核酸配列上で少なくとも1つのガイドRNAと複合体を形成させるための、請求項1〜15のいずれか一項において定義されたCas9変異体またはスプリットCas9の使用。
- 以下の段階を含む、細胞におけるゲノム標的化の方法:
(a)PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)該標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
(c)請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
(d)Cas9またはスプリットCas9が該細胞において該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。 - 以下の段階を含む、請求項17に記載の細胞におけるゲノム標的化の方法:
(a)PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
(b)該標的核酸配列と相補的でありかつ3'伸長配列を有する配列を含むcrRNAを提供する段階;
(c)該crRNAの該3'伸長配列の一部分と相補的な配列を含むTracrRNAを提供する段階;
(d)請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
(e)該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。 - 前記crRNAおよび前記tracrRNAが融合されて一本鎖のガイドRNAを形成する、請求項18に記載の方法。
- 標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な少なくとも1つの配列を含む外因性核酸配列を導入する段階をさらに含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が植物細胞である、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9を含む、単離された細胞。
- 以下の段階を含む、動物を作出するための方法:
(a)遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階;
(b)請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法により該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
(c)切断が起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階。 - 前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記細胞内に導入する段階、および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 以下の段階を含む、植物を作出するための方法:
(a)遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む植物細胞を提供する段階;
(b)請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法により、該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
(c)切断が起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階。 - 前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記植物細胞内に導入する段階; および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階をさらに含む、請求項26に記載の方法。
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