JP2016512214A - 組織因子系凝固インヒビター上の2つのエピトープに特異的に結合することが可能な抗体 - Google Patents
組織因子系凝固インヒビター上の2つのエピトープに特異的に結合することが可能な抗体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
mAb1(又は断片)-mAb2(又は断片)
mAb1(又は断片)-リンカー-mAb2(又は断片)
別の特定の実施形態では、本発明による使用のためのPEGは多分散である。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号3のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号3又は配列番号5又は配列番号7のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列:及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号3のアミノ酸99〜110に対応するCDR3配列。
・配列番号4のアミノ酸24〜39に対応するCDR1配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸55〜61に対応するCDR2配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸94〜102に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号9のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号9のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号9のアミノ酸99〜107に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号10のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号10のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号10のアミノ酸89〜97に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号11のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号11のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号11のアミノ酸99〜106に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号12のアミノ酸24〜33に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号12のアミノ酸49〜55に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号12のアミノ酸88〜96に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号13のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号13のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号13のアミノ酸99〜111に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号14のアミノ酸24〜38に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号14のアミノ酸54〜60に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号14のアミノ酸93〜101に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号15のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号15のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号15のアミノ酸99〜106に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号16のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号16のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号16のアミノ酸89〜97に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号22のアミノ酸31〜36に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号22のアミノ酸51〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号22のアミノ酸99〜104に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号23のアミノ酸24〜33に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号23のアミノ酸49〜55に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号23のアミノ酸88〜96に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号24のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号24のアミノ酸50〜65に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号24のアミノ酸98〜110に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号25のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号25のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号25のアミノ酸89〜96に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号28のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号28のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号28のアミノ酸99〜105に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号29のアミノ酸24〜39に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号29のアミノ酸55〜61に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号29のアミノ酸94〜102に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号30のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号30のアミノ酸50〜65に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号30のアミノ酸98〜110に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号31のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号31のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号31のアミノ酸89〜96に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号42のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号42のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号42のアミノ酸99〜105に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号43のアミノ酸24〜38に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号43のアミノ酸54〜60に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号43のアミノ酸93〜101に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号44のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号44のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号44のアミノ酸99〜109に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号45のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号45のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号45のアミノ酸89〜97に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号46のアミノ酸31〜36に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号46のアミノ酸51〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号46のアミノ酸99〜106に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号47のアミノ酸24〜38に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号47のアミノ酸54〜60に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号47のアミノ酸93〜101に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号60のアミノ酸31〜35に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸残基によって置換されてもよい、配列番号60のアミノ酸50〜66に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号60のアミノ酸99〜107に対応するCDR3配列。
・それらのアミノ酸残基の1つ、2つ又は3つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号61のアミノ酸24〜34に対応するCDR1配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号61のアミノ酸50〜56に対応するCDR2配列;及び/又は
・それらのアミノ酸残基の1つ又は2つが異なるアミノ酸によって置換されてもよい、配列番号61のアミノ酸89〜97に対応するCDR3配列。
1. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能な多重特異的抗体。
2. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)の第1のエピトープ及びTFPIの第2のエピトープに特異的に結合することが可能な多重特異的抗体であって、第1のエピトープは配列番号1の1〜181位の中に位置するアミノ酸残基を含み、第2のエピトープは配列番号1の182〜276のTFPI位の中に位置するアミノ酸残基を含む。
3. 第1のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-1ドメインの中のアミノ酸残基を含む、態様1又は2に記載の多重特異的抗体。
4. 第1のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-2ドメインの中のアミノ酸残基を含む、態様1又は2に記載の多重特異的抗体。
5. 第2のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-3ドメインの中のアミノ酸残基を含む、態様1〜4のいずれか1つに記載の多重特異的抗体。
6. 二重特異的抗体である、態様1〜5のいずれか1つに記載の多重特異的抗体。
7. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のLeu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71及びMet 75からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-1エピトープに結合することが可能である、態様6に記載の二重特異的抗体。
8. 配列番号1のアミノ酸残基Arg 41、Arg 65及び/又はGlu 67を含むKPI-1エピトープに結合することが可能である、態様7に記載の二重特異的抗体。
9. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のGlu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Arg 107、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126及びLeu 140からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-2エピトープに結合することが可能である、態様6に記載の二重特異的抗体。
10. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のアミノ酸残基Arg 107を含むKPI-2エピトープに特異的に結合することが可能である、態様9に記載の二重特異的抗体。
11. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のTyr 207、Asn 208、Ser 209、Val 210、Ile 211、Gly 212、Lys 213、Arg 215、Lys 232、Gln 233、Leu 236及びLys 240からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、態様6〜10のいずれか1つに記載の二重特異的抗体。
12. 配列番号1のアミノ酸残基Ile 211、Lys 213及び/又はArg 215を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、態様11に記載の二重特異的抗体。
13. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のLeu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71及びMet 75からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-1エピトープ;並びに配列番号1のTyr 207、Asn 208、Ser 209、Val 210、Ile 211、Gly 212、Lys 213、Arg 215、Lys 232、Gln 233、Leu 236及びLys 240からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、態様6〜8のいずれか1つに記載の二重特異的抗体。
14. 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のGlu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Arg 107、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126及びLeu 140からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-2エピトープ;並びに配列番号1のTyr 207、Asn 208、Ser 209、Val 210、Ile 211、Gly 212、Lys 213、Arg 215、Lys 232、Gln 233、Leu 236及びLys 240からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、態様9〜12のいずれか1つに記載の二重特異的抗体。
15. 配列番号3のアミノ酸残基99〜110に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号4のアミノ酸残基94〜102に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の二重特異的抗体。
16. 重鎖が、
配列番号3のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号3又は配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が:
配列番号4のアミノ酸残基24〜39に対応するCDR1配列;並びに
配列番号4のアミノ酸残基55〜61に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様15に記載の二重特異的抗体。
17. 配列番号9のアミノ酸残基99〜107に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号10のアミノ酸残基89〜97に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の抗体。
18. 重鎖が、
配列番号9のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号9のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が、
配列番号10のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;
配列番号10のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様17に記載の二重特異的抗体。
19. 配列番号11のアミノ酸残基99〜106に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号12のアミノ酸残基88〜96に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の二重特異的抗体。
20. 重鎖が、
配列番号11のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号11のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が、
配列番号12のアミノ酸残基24〜33に対応するCDR1配列;並びに
配列番号12のアミノ酸残基49〜55に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様19に記載の二重特異的抗体。
21. 配列番号13のアミノ酸残基99〜111に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号14のアミノ酸残基93〜101に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の二重特異的抗体。
22. 重鎖が、
配列番号13のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号13のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が、
配列番号14のアミノ酸残基24〜38に対応するCDR1配列;並びに
配列番号14のアミノ酸残基54〜60に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様21に記載の二重特異的抗体。
23. 配列番号15のアミノ酸残基99〜106に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号16のアミノ酸残基89〜97に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の二重特異的抗体。
24. 重鎖が、
配列番号15のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号15のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が
配列番号16のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;並びに
配列番号16のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様23に記載の二重特異的抗体。
25. 配列番号26のアミノ酸残基98〜110に対応するCDR3配列を含む重鎖;
及び、
配列番号27のアミノ酸残基89〜96に対応するCDR3配列を含む軽鎖;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様6に記載の二重特異的抗体。
26. 重鎖が、
配列番号26のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;並びに
配列番号26のアミノ酸残基50〜65に対応するCDR2配列;
を更に含み、軽鎖が、
配列番号27のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;並びに
配列番号27のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;
を更に含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様25に記載の二重特異的抗体。
27. 完全長抗体フォーマットの形である、態様6に記載の二重特異的抗体。
28. Fab-Fabコンジュゲート又は融合タンパク質である、態様6〜31のいずれか1つに記載の二重特異的抗体。
29. 第1のFab及び第2のFabを含み、第1のFabは第1の重鎖(HC)及び第1の軽鎖(LC)を含み、第1の重鎖は、
配列番号3のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;
配列番号3又は配列番号5及び配列番号7からなる群から選択される配列のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;並びに
配列番号3のアミノ酸残基99〜110に対応するCDR3配列;
を含み、第1の軽鎖(LC)は、
配列番号4のアミノ酸残基24〜39に対応するCDR1配列;
配列番号4のアミノ酸残基55〜61に対応するCDR2配列;並びに
配列番号4のアミノ酸残基94〜102に対応するCDR3配列;
を含み、第2のFabは第2の重鎖及び第2の軽鎖を含み、第2の重鎖(HC)は、
配列番号9のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;
配列番号9のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;並びに
配列番号9のアミノ酸残基99〜107に対応するCDR3配列;
を含み、第2の軽鎖(LC)は、
配列番号10のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;
配列番号10のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;並びに
配列番号10のアミノ酸残基89〜97に対応するCDR3配列;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様28に記載のFab-Fabコンジュゲート。
30. 第1のFab及び第2のFabを含み、第1のFab断片は第1の重鎖(HC)及び第1の軽鎖(LC)を含み、第1の重鎖は、
配列番号26のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;
配列番号26のアミノ酸残基50〜65に対応するCDR2配列;及び
配列番号26のアミノ酸残基98〜110に対応するCDR3配列;
を含み、第1の軽鎖(LC)は、
配列番号27のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;
配列番号27のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;及び
配列番号27のアミノ酸残基89〜96に対応するCDR3配列;
を含み、第2のFab断片は第2の重鎖及び第2の軽鎖を含み、第2の重鎖(HC)は、
配列番号9のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;
配列番号9のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;及び
配列番号9のアミノ酸残基99〜107に対応するCDR3配列;
を含み、第2の軽鎖(LC)は、
配列番号10のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;
配列番号10のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;及び
配列番号10のアミノ酸残基89〜97に対応するCDR3配列;
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様29に記載のFab-Fabコンジュゲート。
31. ヒト化される、態様1〜30のいずれか1つに記載の多重特異的又は二重特異的抗体。
32. 第1の単一特異的抗体及び第2の単一特異的抗体を含む医薬組成物であって、第1の単一特異的抗体は、配列番号1の組織因子系凝固インヒビター(TFPI)アミノ酸残基1〜181の中のエピトープに特異的に結合することが可能であり;
第2の単一特異的抗体は、配列番号1のTFPIアミノ酸残基182〜276の中のエピトープに特異的に結合することが可能である、医薬組成物。
33. 第1の抗体のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-1ドメイン又はTFPIのKPI-2ドメインの中のアミノ酸残基を含み、第2の抗体のエピトープがTFPIのKPI-3ドメインの中のアミノ酸残基を含む、態様32に記載の医薬組成物。
34. 第1の単一特異的抗体が、
配列番号26のアミノ酸残基98〜110に対応するCDR3配列を含む重鎖(HC);
及び、
配列番号27のアミノ酸残基89〜96に対応するCDR3配列を含む軽鎖(LC);
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様33に記載の医薬組成物。
35. 第2の単一特異的抗体が、
配列番号9のアミノ酸残基99〜107に対応するCDR3配列を含む重鎖(HC);
及び、
配列番号10のアミノ酸残基89〜97に対応するCDR3配列を含む軽鎖(LC);
を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様33に記載の医薬組成物。
36. 第2の単一特異的抗体が、
配列番号9のアミノ酸残基31〜35に対応するCDR1配列;及び
配列番号9のアミノ酸残基50〜66に対応するCDR2配列;
を更に含む重鎖(HC)を含み、第2の単一特異的抗体が、
配列番号10のアミノ酸残基24〜34に対応するCDR1配列;及び
配列番号10のアミノ酸残基50〜56に対応するCDR2配列;
を更に含む軽鎖(LC)を含み、個々のCDR配列のアミノ酸残基の1つ又は2つは、異なるアミノ酸によって保存的に置換されてもよい、態様35に記載の医薬組成物。
37. 前の態様のいずれか1つに記載の単一特異的抗体の組合せを含む多重特異的若しくは二重特異的抗体又は医薬組成物と競合する単一特異的抗体を含む多重特異的若しくは二重特異的抗体又は医薬組成物。
38. 態様1〜31のいずれか1つに記載の多重特異的又は二重特異的抗体を含む医薬組成物。
39. 医薬として用いるための、態様1〜31又は37のいずれか1つに記載の多重特異的若しくは二重特異的抗体、又は態様32〜37のいずれか1つに記載の単一特異的抗体の組合せを含む医薬組成物。
40. 凝固障害の処置で用いるための、態様1〜19又は37のいずれか1つに記載の多重特異的若しくは二重特異的抗体、又は態様32又は37のいずれか1つに記載の単一特異的抗体の組合せを含む医薬組成物。
41. 態様1〜31のいずれか1つに記載の二重特異的抗体又はその断片を発現する真核生物細胞。
42. in vitroでTFPIαレベルを測定するための、態様6〜31のいずれか1つに記載の二重特異的抗体の使用。
43. 循環TFPIαを選択的に標的にする、態様1〜37のいずれか1つに記載の二重特異的抗体。
免疫化、融合及びスクリーニング
RBFマウスを、ヒトTFPIα(配列番号1)又はTFPI断片、例えば配列番号1の残基1〜161に対応するもので免疫化した。マウスは皮下注射した:最初の注射のために、20μgのヒトTFPIを完全フロイントアジュバントと混合した。以降の免疫化のために、不完全フロイントアジュバントを同じ濃度の抗原と使用した。最終免疫化の10日後に、ヒトTFPI特異的抗体のために、ELISAを使用してマウスからの眼血をスクリーニングした。静脈内注射によって陽性血清力価のマウスを10μgのヒトTFPIα又はTFPI(1〜161)で追加免疫し、3日後に屠殺した。脾臓を無菌的に取り出し、単一細胞懸濁液に分散させた。PEG方法又は電気融合によって、脾細胞及び骨髄腫細胞の融合を実行した。生じたハイブリドーマ細胞を限界希釈によってクローニングし、マイクロタイタープレートに入れた。完全長TFPIα又はTFPI断片に結合することが可能な抗体の発現について、個々のハイブリドーマからの上清を先ずELISAでスクリーニングした。
マウスの抗TFPI KPI-3/C末端特異的mAb、TFPI4F110、TFPI22F66及びTFPI22F71のクローニング及び配列決定
TFPI抗体のマウス重鎖及び軽鎖配列:WO2012/001087に記載の通りに、TFPI4F110、TFPI22F66及びTFPI22F71をクローニングし、配列決定をした。
5'-CTTGCCATTGAGCCAGTCCTGGTGCATGATGG-3'(配列番号17)
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGACTG-3'(配列番号18)
5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(配列番号19)
マウス抗TFPI KPI-3/C末端特異的mAb 22F74、41F41、41F30、22F132、22F79のクローニング及び配列決定並びにマウス抗TFPI KPI-1 mAb 2F3、2F22、2F45、1F91及び2F35のクローニング及び配列決定。
抗TFPI抗体のマウス重鎖及び軽鎖配列は、以下の通りにクローニングし、配列決定をした。
5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'(配列番号20)
5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(配列番号21)
mAb 2021及びmAb 2021変異体のクローニング及び操作
この実施例は、抗TFPI抗体mAb2021及びその変異体のクローニング及び操作を記載する。
5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'(配列番号20)
5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(配列番号21)
Yves Durocher(DurocherらNucleic Acid Research、2002)によって開発されたHEK293-6E EBNAをベースとした発現系での抗TFPI抗体/抗体断片の一時的発現のために、一連のCMVプロモータをベースとした発現ベクター(pTTベクター)を生成した。CMVプロモータに加えて、pTTをベースとしたベクターは、pMB1起点、EBV起点及びAmp耐性遺伝子を有する。
移植されるHzTFPI4F36の軽鎖(LC)及び重鎖(HC)で、一連のヒトからマウスへの逆突然変異(復帰突然変異と呼ぶ)を生成した。
1.点突然変異及び組合せ突然変異を導入するために、Stratagene社からのQuikChange(登録商標) Site-Directed又はMulti Site-Directed Mutagenesisキットを使用した。キットは、製造業者のプロトコルに従って用いた。
2.点突然変異を導入するために、及び組合せ突然変異を生成するために、標準的な2ステップ重複PCR方法も使用した。
mAb 2021を得るための抗TFPI4F36A1B2のヒト化の過程で、いくつかのより低い親和性の変異体が同定された。変異体は、上記の通り部位特異的突然変異誘発によって生成された。mAb 2007及びmAb 2014は、そのようなより低い親和性の変異体の2つであった。mAb 2007は、移植されたHzTFPI4F36の配列と比較してVHドメインに単一のA60P復帰突然変異を有する(Kabatによる番号付け)。移植されるHzTFPI4F36のための配列と比較して、mAb 2014はVLドメインに4つの復帰突然変異(Y36L、K39R、Q42E、Q45K)を有するFR2領域を有し、フレームワーク配列を元のマウスFR2に同一にする(Kabatによる番号付け)。mAb 2014の重鎖は、移植されるHzTFPI4F36に対応する。2つの変異体は、mAb 2021と比較して、それぞれ少なくとも1桁又は2桁低いTFPI結合親和性を有する。最初の移植されたHzTFPI4F36変異体(mAb 2000)は、mAb 2021と比較しておよそ3桁低いTFPI結合性親和性を示した。
マウス/ヒトキメラTFPI4F110、TFPI22F66、TFPI22F71、TFPI2F22 mAbのための発現ベクターの生成
Yves Durocher(DurocherらNucleic Acid Research、2002)によって開発されたHEK293-6E EBNAをベースとした発現系、又はInvitrogen社からのEXPI293F系でのマウス/ヒトキメラ抗TFPI抗体/抗体断片の一時的発現のために、一連のCMVプロモータをベースとした発現ベクター(pTTベクター)を生成した。CMVプロモータに加えて、pTTをベースとしたベクターは、pMB1起点、EBV起点及びAmp耐性遺伝子を有する。実施例7に記載の通り、LC及びHC発現ベクターの同時トランスフェクションによって、Fab断片を含む抗TFPI抗体変異体をHEK293-6E又はEXPI293F細胞で一時的に発現させた。キメラ抗TFPI mAb及びFab断片の一時的発現のために、pTTをベースとしたLC発現ベクターを生成した。最初に、N及びC末端配列に特異的なプライマーを用いて、元のTOPO配列決定クローンからTFPI4F110、TFPI22F66、TFPI22F71又はTFPI2F22のVLドメインに対応する領域を2ステップ反応でPCR増幅させた。2ステップ重複PCRによって、元のマウスシグナルペプチドをヒトCD33シグナルペプチドに交換した。一次センスプライマーはCD33シグナルペプチド配列のC末端部分を有し、二次センスプライマーはクローニング目的のためのHindIII制限部位、ATG開始コドンの直ぐ上流のKozak配列(5'-GCCGCCACC-3')、及びCD33シグナルペプチド配列のN末端部分を有した。アンチセンスプライマーは、VL/CL移行配列にインフレームBsiWI制限部位を有した。
二重特異的分子のためのFab成分
Fab-Fab化学的コンジュゲートのために適するFab断片を生成するために、トランケーションされたmAb 4F110 HCの発現のための発現ベクターを生成した。ヒトIgG4定常領域の227位のシステインの後のヒンジ領域に対応するものにおいて、mAb 4F110のIgG4をベースとしたHCをトランケーションした(配列番号50による番号付け)。トランケーションは、化学的コンジュゲーションに利用可能なC末端システインを残す。Stratagene社からのQuikChange (登録商標) Site-Directed突然変異誘発キットを用いて、部位特異的突然変異誘発によってシステイン残基の後に終止コドンを導入することによって、トランケーションされた配列を生成した。最終構築物の配列は、DNA配列決定によって検証した。上記のmAb 4F110 LCベクター及びトランケーションされたHCベクター(配列番号9及び配列番号10)を用いて、mAb 4F110のFab断片をFab 0089として発現させた。
mAb及びFabの発現及び精製
LC及びHC発現ベクターの同時トランスフェクションによって、Fab断片を含む抗TFPI抗体変異体をHEK293-6E細胞又はEXPI293F細胞の懸濁培養で一時的に発現させた。以下の手順は、懸濁適合HEK293-6E細胞又はEXPI293F細胞のために使用される一般的なトランスフェクションプロトコルを記載する。
25μg/mlジェネテシン(Gibco)、0.1v/v%の界面活性剤Pluronic F-68(Gibco)及び1v/v%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を追加したFreeStyle(商標) 293発現培地(Gibco)において、HEK293-6E細胞を懸濁状態で成長させた。37℃、8% CO2及び125rpmで細胞を振盪インキュベーター中のエルレンマイヤー振盪フラスコで培養し、細胞数0.1〜1.5×106/mlの細胞密度に維持した。
・ トランスフェクションのために使用する培養の細胞密度は、細胞数0.9〜2.0×106/mlであった。
・ 1mlの細胞培養につき0.5μg LCベクターDNA+0.5μg HCベクターDNAの混合物を使用した。
・ DNAをOpti-MEM培地(Gibco)に30μl培地/μg DNAで希釈し、混合し、5分の間室温(23〜25℃)でインキュベートした。
・ 293Fectin (商標)(Invitrogen)を1μgのDNAにつき1μlの濃度でトランスフェクション試薬として使用した。
・ 293Fectin (商標)をOpti-MEM培地(Gibco)に30×で希釈し、混合し、5分の間室温(23〜25℃)でインキュベートした。
・ DNA及び293Fectin溶液を混合し、25分間室温(23〜25℃)に放置してインキュベートさせた。
・ 次に、DNA-293Fectin混合物を細胞培養へ直接加えた。
・ トランスフェクション細胞培養を、37℃、8% CO2及び125rpmの振盪インキュベーターに移した。
・ トランスフェクションの3〜6日後、細胞培養上清を遠心分離によって収集し、続いて0.22μmのPESフィルター(Corning社)で濾過した。
・ ForteBio Octetシステム及びプロテインAバイオセンサー又は定量的プロテインA HPLCを用いて、清澄化細胞培養上清での直接のBiolayer干渉法によって抗体産生の定量分析を実施した。
Expi293 (商標)発現培地(Life Technologies社)において、EXPI293F細胞を懸濁状態で増殖させた。36.5℃、8% CO2及び85〜125rpmで細胞をオービタル振盪インキュベーター中のエルレンマイヤー振盪フラスコで培養し、細胞数0.4〜4×106/mlの細胞密度に維持した。
1) DNA及びトランスフェクション試薬の別々の希釈溶液を最初に調製する。
a) 1mlの細胞培養につき合計1μgのベクターDNA(0.5μg LCベクター及び0.5μg HCベクター)を使用する。DNAをOpti-MEM培地(Gibco)に50μl培地/μg DNAで希釈し、混合し、5分の間室温(23〜25℃)でインキュベートする。
b) トランスフェクション試薬として、Expifectamin (商標) 293(Life Technologies社)を1μg DNAにつき2.7μlの濃度で使用する。Expifectamin (商標)溶液をOpti-MEM培地(Gibco社)に18.5×で希釈し、混合し、5分の間室温(23〜25℃)でインキュベートする。
2) DNA及びExpifectamin (商標)293希釈溶液を混合し、10分間室温(23〜25℃)に放置してインキュベートさせる。
3) DNA-Expifectamin (商標)293混合液を、EXPI293F細胞培養に直接加える。
a) トランスフェクションの時に、EXPI293F培養の細胞密度は、細胞数2.8〜3.2×106/mlであるべきである。
4) トランスフェクション細胞培養を、36.5℃、8% CO2及び85〜125rpmのオービタル振盪インキュベーターに移す。
5) トランスフェクションの18時間後、5μlのExpifectamin (商標) 293トランスフェクションエンハンサー1/ml培養及び50μlのExpifectamin (商標) 293トランスフェクションエンハンサー2/ml培養を加え、36.5℃、8% CO2及び85〜125rpmのオービタル振盪インキュベーターに培養を戻す。
6) トランスフェクションの5日後、細胞培養上清を遠心分離によって収集し、続いて0.22μmのPESフィルターユニット(Corning社)で濾過した。
GE Healthcare社からのMabSelectSuRe樹脂を製造業者の指示に従って用いて、mAb変異体を標準の親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製された抗体は、pH7.2のPBS緩衝液に緩衝液交換した。
1,8-N,N'-ビス(マレイミド)-3,6-ジオキサオクタンによるFab 0088及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9000)
1,16-N,N'-ビス(マレイミド)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンの調製
1,16-N,N'-ビス(マレイミド)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 0088及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9002)
1,16-N,N'-ビス(マレイミド)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 2F22及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9028)
1,16-N,N'-ビス(マレイミド)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 0094及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9004)
1,16-N,N'-ビス(マレイミド)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 0095及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9005)
ビス(ブロモアセチル)エチレンジアミンの調製
ビス(ブロモアセチル)エチレンジアミンを用いるFab 0088及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9029)
ビス(ブロモアセチル)エチレンジアミンを用いるFab 0094及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9030)
ビス(ブロモアセチル)エチレンジアミンを用いるFab 0313及びFab 0089のコンジュゲーション(ref. 9031)
トロンビン生成アッセイ
10μMのPS/PC:ホスファチジルセリン/ホスファチジルコリン25/75%を追加した正常なヒト血漿(NHP、HemosIL較正血漿)で、トロンビン生成に及ぼす抗体の効果を研究した。カルシウム再添加及びInnovin(登録商標)(1.0pm)の添加によって、凝固を開始させた。100μg/mlのヒツジ抗ヒトFVIII抗体(市販品)の添加によって、血友病A様血漿が得られた。
結合相互作用分析
結合相互作用分析は、Biacore T200機器での表面プラズモン共鳴によって得られた。
Biacore T-200コントロールソフトウェア(GE Healthcare社)で利用可能なアミン結合プロトコル及びアミン結合キット(GE Healthcare社)で提供される試薬を用いて、Human Fab Binder (Human Fab Captureキット、GE Healthcare社)を、10000応答単位(RU)でフローセル1〜4のシリーズS CM4センサーチップ(GE Healthcare社)に固定化した。関連するFab断片又はFab-Fabコンジュゲートは、固定された濃度でフローセル2、3又は4で捕捉された。TFPIをランニングバッファ(10mM Hepes、pH7.4、300mM NaCl、5mM CaCl2、0.05%界面活性剤P20、1mg/mlのBSA)で希釈することによって、TFPIの異なる濃度を試験した。300秒の接触時間及び続く50μl/分の流量での600秒の解離時間を用いて、各試料を分析した。緩衝液ブランクも分析した。センサー表面は、各々50μl/分の流量で30秒間の2つのサイクルで、10mMグリシンpH2.1で再生した。
ヒト血友病A血漿での組織因子によって誘導されるトロンビン生成に及ぼす抗TFPI抗体の効果
ヒト血友病A血漿での組織因子によって誘導されるトロンビン生成に及ぼす抗TFPI抗体の相乗効果は、TFPIのKPI-1/KPI-2領域のエピトープを標的にする抗体とのKPI-3領域のエピトープを標的にする抗体の組合せ又は融合によって得ることができる。
ヒト血友病A血漿での組織因子によって誘導されるトロンビン生成に及ぼす抗TFPI性Fab断片コンジュゲートの相乗効果
ヒトTFPIへの結合親和性を判定するために、実施例6、7、10、12、13及び17によって調製されたFab断片及びFab-Fabコンジュゲートを、実施例19による結合相互作用分析アッセイで分析した。
Fab 0088 (KPI-2)配列番号3+4、
Fab 0094 (KPI-2)配列番号5+6
Fab 0095 (KPI-2)配列番号7+8
Fab 0313 (KPI-2)配列番号58+59
Fab 0089 (KPI-3)配列番号9+10
及び4つのKPI-2/KPI-3ドメイン特異的Fab-Fabコンジュゲート(個々のFabの配列番号は上記と同じである):
Fab 0088-Fab 0089 (9002とも呼ばれる;KPI-2/KPI-3)
Fab 0094-Fab 0089 (9004とも呼ばれる;KPI-2/KPI-3)
Fab 0095-Fab 0089 (9005とも呼ばれる;KPI-2/KPI-3)
Fab 0313-Fab 0089 (9031とも呼ばれる;KPI-2/KPI-3)
の平衡解離定数(KD)を示す。
Fab 2F22 (KPI-1)(配列番号40及び41)
及び1つのKPI-1/KPI-3ドメイン特異的Fab-Fabコンジュゲート(個々のFabの配列番号は上記と同じである):
Fab 2F22-Fab 0089 (9028とも呼ばれる;KPI-1/KPI-3)
の平衡解離定数(KD)を示す。
抗TFPI mAb 2F22のFab断片との複合体の可溶性TFPI KPI-1の結晶構造
抗TFPI2F22モノクローナル抗体のFab断片(配列番号:配列52及び53)との複合体の、TFPI KPI-1の前のN末端部分を含む可溶性ヒトTFPIクーニッツ型プロテアーゼ阻害剤ドメイン1 (KPI-1)(TFPI 1〜79、配列番号1による番号付け)の3D構造を、X線結晶学を使用して高分解能で判定した。結果は、抗体がTFPIのKPI-1及び先行するN末端の一部に結合することが可能なことを実証する。生じたヒトTFPIエピトープ残基は以下を含む:Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71及びMet 75 (配列番号1)。
結晶学に適するFab断片を得るために、トランケーションされたmAb 2F22 HCの発現のためのpTTをベースとした発現ベクターを生成した。制限酵素消化によってVH断片をmAb 2F22 HC発現ベクターから切除し、トランケーションされたヒトIgG4定常領域の配列を含有する線状化したpTTをベースとしたツールボックスベクターにクローニングした。IgG4をベースとしたHCは、伸長したFab 2F22 HC (化学的結合のためのFab、配列番号40)の配列の222位に対応するリジンの後のヒンジ領域でトランケーションした。クローニング反応物は、その後選択のために大腸菌に転換した。最終構築物の配列は、DNA配列決定によって検証した。mAb 2F22断片のFab断片は、EXPI293F細胞でFab 0296 (配列番号52及び53)として発現させ、実施例7に記載の通りKappaSelect樹脂を用いて標準の親和性クロマトグラフィーによって精製した。
CCP4プログラムセット[Collaborative Computational Project、N.、Acta crystallographica. Section D、Biological crystallography、(1994)、50巻、760〜763頁]のソフトウェアプログラムAreaimol [Lee、B.ら、J Mol Biol、(1971)、55巻、379〜400頁][Saff、E. B.ら、Math Intell、(1997)、19巻、5〜11頁]による、ペアワイズ相互作用で排除された平均面積の計算は、結晶構造1195Å2の可溶性ヒトTFPI断片/抗TFPI Fab 0296分子複合体を与えた。
細胞表面関連TFPIへの抗体の結合
in vitroで内皮細胞表面に関連したTFPIに結合する抗TFPI抗体、Fab断片又はFab-Fabコンジュゲートの能力を、フローサイトメトリーを使用して研究した。アッセイ緩衝液(2%のFCSを追加したPBS)の中で、ヒト臍静脈細胞系EA.hy926細胞(ATCC)を、抗TFPI mAb 2021、Fab 0088、Fab 0094、Fab 0095又はFab 0313、又はFab 0088-Fab 0089コンジュゲート9002又はFab 0094-Fab 0089コンジュゲート9004の異なる濃度と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、その後アッセイ緩衝液の中で、APCコンジュゲート型二次抗体(Allophycocyanin-AffiniPure F(ab')2断片ロバ抗ヒトIgG (H+L)、Jackson Immuno Research、カタログ709-136-149)と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、BD LSRFortessaフローサイトメーターで分析した。異なる抗体濃度で中央蛍光強度を用いて結合プロファイルをプロットし、最大半減結合値(EC50)を計算した。
mAb及びFab-Fabコンジュゲートによる、TF/FVIIaによって媒介されるFXa生成のTFPIβによる阻害の中和
10% FCS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM (Gibco社)の中で、ヒト臍静脈細胞系EA.hy926細胞(ATCC)を96ウェルプレートで100%集密度まで増殖させた。20ng/ml TNFα及び20ng/ml IL-1βで細胞を3時間刺激し、細胞表面TF依存性FX活性化の中和試験のために使用した。細胞を25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、pH7.4で2回洗浄した後、FX活性化を25mM HEPES、137mM NaCl、3.5mM KCl、5mM CaCl2、1mg/ml BSA pH7.4で測定した。37℃の15分間のインキュベーションの後、0〜60nM mAb又はFab-Fabコンジュゲートの添加によってTFPIの中和を120分間誘導した。これに続いて、50pM rFVIIa (Novo Nordisk A/S)と15分間インキュベートした。次に、37℃で40分間の50nM FXの添加によって、FXaの生成を開始した。40μlの上清を10μl (75mM) EDTAと混合することによって反応を停止し、0.6mM発色基質S-2765 (Chromogenix社)で最後にFXa活性を測定した。TF/FVIIa活性は、0.5mg/mlの中和性ヤギ抗ヒトTFポリクローナル抗体を添加した対照実験で検証した。
非対称の二重特異的抗体の生成
非対称のIgGフォーマットに基づいて、すなわちFCヘテロ二量体化を通して、二重特異的TFPI KPI-2/KPI-3結合抗体を生成した。FCヘテロ二量体化を達成するために、mAb 2021及びmAb 4F110のhIgG1変異体のFC領域に1セットの適合する突然変異を組み入れた。
配列番号1は、ヒトTFPIアルファのアミノ酸配列を表す。
配列番号2は、TFPI(1〜181)のアミノ酸配列を表す。
配列番号3は、Fab 0088の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号4は、Fab 0088の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号5は、Fab 0094の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号6は、Fab 0094の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号7は、Fab 0095の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号8は、Fab 0095の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号9は、Fab 0089の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号10は、Fab 0089の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号11は、mAb 22F66の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号12は、mAb 22F66の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号13は、mAb 22F71の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号14は、mAb 22F71の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号15は、mAb 22F74の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号16は、mAb 22F74の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号17〜21は、プライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号22は、mAb 1F91の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号23は、mAb 1F91の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号24は、mAb 2F3の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号25は、mAb 2F3の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号26は、mAb 2F22の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号27は、mAb 2F22の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号28は、mAb 2F35の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号29は、mAb 2F35の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号30は、mAb 2F45の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号31は、mAb 2F45の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号32は、mAb 2021の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号33は、mAb 2021の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号34は、mAb 0094の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号35は、mAb 0094の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号36は、mAb 0095の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号37は、mAb 0095の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号38は、mAb 4F110の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号39は、mAb 4F110の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号40は、Fab 2F22の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号41は、Fab 2F22の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号42は、mAb 22F132の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号43は、mAb 22F132の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号44は、mAb 22F79の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号45は、mAb 2F79の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号46は、mAb 41F41の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号47は、mAb 41F41の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号48は、mAb 4F110の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号49は、mAb 4F110の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号50は、mAb 2021の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号51は、mAb 2021の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号52は、Fab 0296の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号53は、Fab 0296の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号54は、mAb 0094の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号55は、mAb 0094の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号56は、mAb 0095の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号57は、mAb 0095の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号58は、Fab 0313の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号59は、Fab 0313の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号60は、mAb 41F30の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号61は、mAb 41F30の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号62は、標識をつけたTFPI KPI-1/N末端のアミノ酸配列を表す。
配列番号63は、mAb 0309の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号64は、mAb 0309の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号65は、mAb 0312の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号66は、mAb 0312の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号67は、mAb 0325の重鎖1(HC1)のアミノ酸配列を表す。
配列番号68は、mAb 0325の軽鎖1(LC1)のアミノ酸配列を表す。
配列番号69は、mAb 0325の重鎖2(HC2)のアミノ酸配列を表す。
配列番号70は、mAb 0325の軽鎖2(LC2)のアミノ酸配列を表す。
Claims (19)
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能な二重特異的抗体。
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)の第1のエピトープ及びTFPIの第2のエピトープに特異的に結合することが可能であり、第1のエピトープは配列番号1の1〜181位の中に位置するアミノ酸残基を含み、第2のエピトープは配列番号1の182〜276のTFPI位の中に位置するアミノ酸残基を含む、請求項1に記載の二重特異的抗体。
- 第1のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-1ドメインの中のアミノ酸残基を含む、請求項1又は2に記載の二重特異的抗体。
- 第1のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-2ドメインの中のアミノ酸残基を含む、請求項1又は2に記載の二重特異的抗体。
- 第2のエピトープが組織因子系凝固インヒビター(TFPI)のKPI-3ドメインの中のアミノ酸残基を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の二重特異的抗体。
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のLeu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71及びMet 75からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-1エピトープに結合することが可能である、請求項1、2、3又は5に記載の二重特異的抗体。
- 配列番号1のアミノ酸残基Arg 41、Arg 65及び/又はGlu 67を含むKPI-1エピトープに結合することが可能である、請求項6に記載の二重特異的抗体。
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のGlu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Arg 107、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126及びLeu 140からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-2エピトープに結合することが可能である、請求項1、2、4又は5に記載の二重特異的抗体。
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のアミノ酸残基Arg 107を含むKPI-2エピトープに特異的に結合することが可能である、請求項8に記載の二重特異的抗体。
- 組織因子系凝固インヒビター(TFPI)に特異的に結合することが可能であり、配列番号1のTyr 207、Asn 208、Ser 209、Val 210、Ile 211、Gly 212、Lys 213、Arg 215、Lys 232、Gln 233、Leu 236及びLys 240からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の二重特異的抗体。
- 配列番号1のアミノ酸残基Ile 211、Lys 213及び/又はArg 215を含むKPI-3エピトープに結合することが可能である、請求項10に記載の二重特異的抗体。
- Fab-Fabコンジュゲート又は完全長抗体フォーマット形である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の二重特異的抗体。
- ヒト化されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の二重特異的抗体。
- TFPIαを選択的に標的にする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の二重特異的抗体。
- 第1の単一特異的抗体及び第2の単一特異的抗体を含む医薬組成物であって、第1の単一特異的抗体は、配列番号1の組織因子系凝固インヒビター(TFPI)アミノ酸残基1〜181の中のエピトープに特異的に結合することが可能であり;
第2の単一特異的抗体は、配列番号1のTFPIアミノ酸残基182〜276の中のエピトープに特異的に結合することが可能である、医薬組成物。 - 請求項1〜15のいずれか一項に規定の単一特異的抗体の組合せを含む多重特異的若しくは二重特異的抗体又は医薬組成物と競合する単一特異的抗体を含む二重特異的抗体又は医薬組成物。
- 請求項1〜14又は16のいずれか一項に記載の二重特異的抗体を含む医薬組成物。
- 凝固障害の処置で用いるための、請求項1〜14若しくは16のいずれか一項に記載の二重特異的抗体、又は請求項15に記載の単一特異的抗体の組合せを含む医薬組成物。
- in vitroでTFPIαレベルを測定するための、請求項1〜14又は16のいずれか一項に記載の二重特異的抗体の使用。
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