CN105209497A - 能够特异性结合组织因子途径抑制物上的两个表位的抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了两种单特异性TFPI抗体的组合，其中一种抗体能够特异性结合TFPI？(1-181)，另一种抗体能够特异性结合TFPI？(182-276)，以及来源于两种所述单特异性抗体的双特异性抗TFPI抗体。甚至在TFPI的浓度异常升高时，两种单特异性抗体的组合和双特异性抗体两者通过中和全长TFPIα，大大提高凝血酶产生。

Description

能够特异性结合组织因子途径抑制物上的两个表位的抗体
发明领域
本发明涉及能够与存在于组织因子途径抑制物alpha(TFPIα)和TFPIbeta(TFPIβ)两者上的N端区(残基1-181)的表位和仅存在于全长TFPIα上的C端部分(残基182-276)内的另一个表位结合的抗体及其组合物。本发明还涉及所述抗体的药物和治疗用途。
发明背景
在出血的个体中，当血管外TF暴露于血液中的FVIIa时，组织因子/因子VIIa(TF/FVIIa)复合物引发凝血。TF/FVIIa复合物形成导致因子X(FX)激活成为FXa，FXa与活化的因子V(FVa)一起产生有限量的凝血酶。少量的凝血酶激活血小板，血小板进而导致血小板磷脂的表面暴露，这支持由活化因子VIII(FVIIIa)和因子IX(IXa)组成的tenase复合物的组装和结合。tenase复合物是FX活化的非常有效的催化剂，且在该第二步产生的FXa用作在负责最终的凝血酶爆发的FVa/FXa凝血酶原酶复合物中的活性蛋白酶。凝血酶裂解血纤蛋白原产生血纤蛋白单体，其聚合形成封住渗漏的血管并停止出血的血纤蛋白网。快速和大规模的凝血酶爆发是结实稳定的血纤蛋白凝块形成的先决条件。
由FVIII或FIX缺乏引起的FXa的不当增多和凝血酶的产生分别是A型和B型血友病患者的出血素质的根本原因。在患有血友病的人中，FXa产生主要由TF/FVIIa复合物驱动，因为FVIII或FIX缺乏导致由tenase复合物引起的初步FXa产生。然而，TF/FVIIa介导的FX活化成为FXa是暂时的，因为组织因子途径抑制物(TFPI)抑制自体调节环中的因子Xa和TF/FVIIa复合物。反馈抑制导致TF/FVIIa/FXa/TFPI复合物的形成。中和TFPI抑制在引发凝血期间延长TF/FVIIa介导的FX活化，因此在患有血友病的人中以因例如FVIII或FIX缺乏所致tenase活性减低引起的不足FXa产生来促进止血。
TFPI是一种慢的紧密结合竞争抑制物，通过抑制TF-FVIIa和FXa两者来调节FX活化和活性。FXa的TFPI抑制发生在二相反应中，其最初导致疏松的TFPI-FXa复合物，这使紧密结合性TFPI-FXa复合物慢慢重排，其中TFPI(KPI-2)的第二Kunitz型抑制剂结构域结合并封闭FXa的活性部位。在引发凝血后，TF/FVIIa介导的FXa产生通过TFPI被严格下调。当FXa与TF/FVIIa复合物结合或在其邻近膜的附近结合时，TF/FVIIa在作为涉及FXa的TFPI抑制的限速步骤的过程中被TFPI抑制(Baugh等,1998,JBC,273:4378-4386)。TFPI(KPI-1)的第一Kunitz型抑制剂结构域促进紧密TFPI-FXa复合物的形成，它直接结合并封闭TF结合的FVIIa的活性部位。由第三Kunitz型抑制剂结构域、KPI-3和碱性C端尾组成的TFPI的C端部分不具有任何直接的抑制活性，但它提高TFPI-FXa复合物的形成，而且它与S蛋白并与参与使TFPIα定位于血管表面的肝素样分子结合。
TFPIα通过生理相关TFPIα浓度的凝血酶原酶复合物抑制FXa介导的凝血酶产生。这种反馈抑制主要作为凝块形成的引发阶段的临时障碍起作用。凝血酶原酶复合物中FXa的TFPIα抑制通过当最初被FXa激活时暴露于血小板FVa和暴露于FVa上的TFPIα的碱性区和FV中的酸性区之间的高亲和力相互作用介导。当FVa被通过凝血酶原酶复合物产生的凝血酶进一步裂解时，TFPIα的FVa依赖性抑制活性在脱去酸性区时丧失。TFPIβ缺乏C端碱性区，因此不是凝血酶原酶活性的抑制剂(Wood等,2013,PNAS,110:17838-843)。
能够结合TFPI的抗体是本领域已知的。例如，WO2010/072691、WO2012/001087和WO2012/135671公开了单克隆抗体(mAb)，其每一种能够与TFPI的一个特定表位结合。下面的限制可应用于靶向通常受限于由单一可变区界定的抗体的抗原互补位区域的单一TFPI表位(例如KPI结构域上的TFPI表位)的这类抗体。首先，TF/FVIIa/FXa复合物的最终抑制依赖于散布在TFPI和TF/FVIIa/FXa复合物的互补区域间的若干相互作用。这不仅仅适用于TFPI的KPI-1和KPI-2分别与FVIIa和FXa的活性部位直接结合，而且还适用于与涉及TFPI的N端区和C端区的TF/FVIIa/FXa外结合位点(exosite)的相互作用。结合例如单一KPI的单克隆抗体可能不能够完全阻断TFPI的所有抑制功能，特别在生理上升高浓度的TFPI下。第二，用单克隆抗体或其片段靶向TFPI可能作为TFPI-mAb复合物的肾清除降低的结果或作为因TFPI-mAb复合物形成被降低的其它清除机制的结果，引起TFPI在循环中蓄积。给予一些单克隆抗体还可引起从内皮释放TFPI，快速提高血浆TFPI水平，与在给予肝素或适体后所观察到的类似，所述肝素或适体与KPI-3和TFPI的C端尾结合(Wong等,Haemophilia,2012,18:LB-WE03.1第831页；Hoppensteadt等,Thromb.Res.,77:175-185)。第三，可能需要靶向特定的TFPI库。全长循环TFPIα被认为对于在创伤部位凝血的调节非常重要。所有的TFPI库中，仅全长TFPIα具有暴露的C端区(残基182-276)的事实使之可能选择性地靶向全长TFPIα库。通过只靶向全长TFPIα库，且不靶向例如TFPIβ或脂蛋白缔合的TFPI，可降低靶向介导的药物分配，导致体内药物半寿期延长和较低的剂量需要。然而，特异性靶向TFPIα的C端区的已知抗体不能够完全中和TFPIα活性，尤其在升高的TFPI浓度下。本发明人预期本文公开的抗体及其组合可克服这类限制。
发明概述
本发明涉及能够特异性结合TFPI上的两个表位的双特异性抗体，第一表位位于TFPI(1-181)(SEQIDNO:1)内，第二表位位于TFPI(182-276)(相对于SEQIDNO:1编号)内。所述表位的第一个可在TFPI的KPI-1结构域上。或者，所述表位的第一个可在TFPI的KPI-2结构域上。所述表位的第二个可在TFPI的KPI-3结构域上。双特异性抗体可以是全长抗体或可以是两个抗体片段的缀合蛋白或融合蛋白，例如Fab-Fab缀合蛋白或融合蛋白。
本发明还涉及两个单特异性抗体的组合，其中第一单特异性抗体能够特异性结合TFPI(1-181)，第二单特异性抗体能够特异性结合TFPI(182-276)。第一抗体可特异性地结合TFPI的KPI-1结构域或TFPI的KPI-2结构域，第二抗体可特异性地结合TFPI的KPI-3结构域。
此外，本发明涉及选择性靶向全长TFPIα的双特异性抗体。
本发明还涉及包含本发明的双特异性抗体或单特异性抗体的组合的药物制剂，其任一个可用作药物。
附图简述
图1显示在TFPI水平提高的A型血友病样病况的情况下通过在人血浆中TFPI的KPI-2和KPI-3的联合抗体靶向强有力地提高凝血酶产生。用10μM磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸囊泡，用正常人血浆(NHP)库测量凝血酶产生(TGT测定法)。通过再钙化和加入1pM脂质化组织因子(Innovin?)诱导凝血的引发。曲线(a)显示在没有其它添加情况下在NHP中获得的结果。曲线(b)显示当通过加入100μg/ml绵羊抗人FVIII抗体(可市购获得)获得A型血友病样病况时的结果。曲线(c)显示将20nM全长TFPIα加入A型血友病样血浆中完全抑制凝血酶产生。曲线(d)显示由于20nM全长TFPIα以及FVIII中和的结果，凝血酶产生的抑制仅通过加入200nM特异性结合KPI-2的mAb2021被部分逆转。曲线(e)显示这些相同条件完全防止了200nM特异性结合KPI-3的mAb4F110逆转TFPI抑制以例如允许可检出凝血酶产生的逆转。曲线(f)显示相比之下，100nM结合KPI-3的mAb4F110以及100nM结合KPI-2的mAb2021的组合有效逆转TFPI抑制，并恢复凝血酶产生至大约在无FVIII抗体时在NHP中获得的水平(曲线(a))。
图2A-D显示细胞表面上TF/FVIIa介导的FXa产生的TFPIβ抑制被mAb和Fab-Fab缀合物中和。将EA.hy926wt细胞与递增浓度的mAb或Fab-Fab缀合物一起孵育。用50pMFVIIa和50nMFX在37℃下与不同浓度(0–60nM)的mAb2021(A)、mAb4F110:(B)、Fab-Fab缀合物9002(C)或Fab-Fab缀合物9004(D)一起孵育后，测量上清液中的FXa活性。正方形显示0.5mg/ml山羊抗人TF多克隆抗体以及60nMmAb或Fab-Fab缀合物的作用。结果表示为均值±SD，(n=3)。
图3显示使用不对称的双特异性抗体形式在TFPI水平提高的A型血友病样病况的情况下通过在人血浆中TFPI的KPI-2和KPI-3的联合抗体靶向强有力地提高凝血酶产生。
序列简述
SEQIDNO:1表示人TFPIα的氨基酸序列。
SEQIDNO:2表示TFPI(1-181)的氨基酸序列。
SEQIDNO:3表示Fab0088重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:4表示Fab0088轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:5表示Fab0094重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:6表示Fab0094轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:7表示Fab0095重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:8表示Fab0095轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:9表示Fab0089重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:10表示Fab0089轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:11表示mAb22F66重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:12表示mAb22F66轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:13表示mAb22F71重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:14表示mAb22F71轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:15表示mAb22F74重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:16表示mAb22F74轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:17-21表示引物的核苷酸序列。
SEQIDNO:22表示mAb1F91重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:23表示mAb1F91轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:24表示mAb2F3重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:25表示mAb2F3轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:26表示mAb2F22重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:27表示mAb2F22轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:28表示mAb2F35重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:29表示mAb2F35轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:30表示mAb2F45重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:31表示mAb2F45轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:32表示mAb2021重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:33表示mAb2021轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:34表示mAb0094重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:35表示mAb0094轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:36表示mAb0095重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:37表示mAb0095轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:38表示mAb4F110重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:39表示mAb4F110轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:40表示Fab2F22重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:41表示Fab2F22轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:42表示mAb22F132重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:43表示mAb22F132轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:44表示mAb22F79重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:45表示mAb2F79轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:46表示mAb41F41重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:47表示mAb41F41轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:48表示mAb4F110重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:49表示mAb4F110轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:50表示mAb2021重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:51表示mAb2021轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:52表示Fab0296重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:53表示Fab0296轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:54表示mAb0094重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:55表示mAb0094轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:56表示mAb0095重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:57表示mAb0095轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:58表示Fab0313重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:59表示Fab0313轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:60表示mAb41F30重链可变结构域(VH)的氨基酸序列。
SEQIDNO:61表示mAb41F30轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。
SEQIDNO:62表示标记的TFPIKPI-1/N端的氨基酸序列。
SEQIDNO:63表示mAb0309重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:64表示mAb0309轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:65表示mAb0312重链(HC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:66表示mAb0312轻链(LC)的氨基酸序列。
SEQIDNO:67表示mAb0325重链1(HC1)的氨基酸序列。
SEQIDNO:68表示mAb0325轻链1(LC1)的氨基酸序列。
SEQIDNO:69表示mAb0325重链2(HC2)的氨基酸序列。
SEQIDNO:70表示mAb0325轻链2(LC2)的氨基酸序列。
发明详述
发现组织因子途径抑制物(TFPI)存在于体内几个区室中。TFPI的主要部分与血管内皮缔合，少部分在血液中循环。已描述了人中的TFPI的两种剪接变体TFPIalpha(TFPIα)和TFPIbeta(TFPIβ)。据推测TFPIβ是在内皮细胞表面上表达的主要形式，而胞内贮存的TFPIα在某些刺激下可释放到循环中。TFPIα作为全长或截短的蛋白质、与脂蛋白缔合或在血小板中在血液中循环。
成熟的人TFPIα是276个氨基酸蛋白质(SEQIDNO:1)，由酸性N端区、中间散布着接头区的3个串联排列的Kunitz型抑制剂结构域(KPI-1、KPI-2和KPI-3)和碱性C端尾组成。KPI-1、KPI-2和KPI-3结构域分别定义为SEQIDNO:1的残基26-76、残基97-147和残基189-239。成熟的TFPIβ为193个氨基酸蛋白质，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与内皮细胞表面共价连接。TFPIβ的前181个氨基酸与TFPIα的相同(相当于SEQIDNO:1的残基1-181)，而C端序列的最后12个氨基酸与TFPIα无关，并具有与残基193连接的GPI锚。
本发明涉及结合TFPIα上的两个不同的和/或独特表位的两种单特异性抗体的组合。本发明还涉及来源于两种这类单特异性抗体的双特异性抗体。双特异性抗体的抗原识别部位(或“臂”)来源于其中的单特异性抗体之一针对TFPI的KPI-1/KPI-2区的表位，本文定义为TFPI(1-181)，其可以是人TFPI(1-181)(SEQIDNO:2)。双特异性抗体的第二抗原识别部位(或“臂”)来源于其中的第二单特异性抗体针对只存在于TFPIα中的“KPI-3区”，本文定义为TFPI(182-276)。
“KPI-1/KPI-2区”本文称为TFPI的氨基酸残基1-181(即TFPI(1-181))，其可以是人TFPI(1-181)(SEQIDNO:2)，因此包括TFPI的KPI-1和KPI-2结构域。“KPI-3区”本文称为TFPI的氨基酸残基182-276(即TFPI(182-276))，因此包括TFPI的KPI-3结构域和C端尾。因此，一种单特异性抗体或双特异性抗体或抗体片段的一臂能够特异性地结合位于TFPI的KPI-1/KPI-2区(即TFPI1-181)内的表位，包括接近N端的酸性区，KPI-1、KPI-2、KPI-1和KPI-2之间的接头区和TFPI的KPI-2和KPI-3之间的接头区的第一部分。第二单特异性抗体或双特异性抗体的第二臂能够特异性地结合位于只存在于全长TFPIα、但不存在于TFPIβ的氨基酸残基182-276内的表位。残基182-276相当于KPI-2和KPI-3之间的接头区、KPI-3结构域和碱性C端尾。
当将本发明的两种单特异性抗体的组合或本发明的双特异性抗体的促凝血作用与其所来源的各个抗体的预期相加效应相比时，其具有优异性质。例如，组合的两种单特异性抗体或双特异性抗体能够阻断TFPIα的所有抑制功能，甚至当与例如正常生理水平相比TFPIα的浓度升高时。针对本发明的两个独立表位的两个抗原结合部分的连接以获得双特异性抗体或Fab-Fab缀合物可因亲合力作用(avidityeffect)而导致比两个独立的抗原结合部分的联合作用所获得的TFPIα活性的中和更有效。当单独测试时，本发明的组合或本发明的双特异性抗体来源于其中的两个单特异性抗体具有可检出的促凝血活性不是先决条件，一个特别预料不到的结果。产生于针对KPI-1/KPI-2区的抗体或双特异性抗体的一个臂的作用，可调节所有TFPI库的活性，而两种单特异性抗体的组合或双特异性抗体的优良作用将优先调节全长TFPIα的活性。
本发明的双特异性抗体能够选择性调节一个特定的TFPI库即TFPIα的活性。像单特异性抗体一样，能够结合KPI-1/KPI-2区的双特异性抗体的单臂本身不能够显著防止TFPI的抑制活性。然而，当双特异性抗体的第二臂与TFPIα的KPI-3区结合时，可更显著地促进TFPIα抑制的特异性阻断。这类双特异性抗体因此能够中和全长TFPIα的抑制。与所述双特异性抗体的TFPIβ的结合将唯一依赖于靶向KPI-1/KPI-2区的臂。与KPI-1/KPI-2区结合的弱化将优先降低与TFPIβ结合，而由于双特异性抗体的第二臂靶向KPI-3区所致，TFPIα抑制的中和仍保持基本完整。由于靶向TFPIβ或脂蛋白缔合的TFPI降低或缺乏，因此对所述双特异性抗体中一臂的KPI-1/KPI-2区的亲和力的这类弱化还将导致靶向药物分配减少，导致长的体内药物半寿期和/或较低的抗体剂量要求。
双特异性抗体的KPI-3区靶向组分的亲和力可能单独足以确保TFPI的有效占用。由于亲合力作用，因此有可能基本上减少与内皮细胞上的TFPIβ结合，同时仍保持在血浆中具有TFPIα活性中和的有效作用。这可如下实现，通过将双特异性抗体的KPI-1/KPI-2靶向组分的结合弱化至其中连接在一起的两个抗原互补位的亲合力作用仍存在的某个点上。可通过本领域技术人员已知的方法，通过选择靶向某位表位的抗体，并通过调节双特异性抗体的KPI-1/KPI-2和KPI-3结合组分的绝对和相对亲和力，来构建所述抗体。另外，可通过改变双特异性形式，来调节所述双特异性抗体的选择性和其它性质。
本文所用术语“TFPI”包括可来源于任何合适的生物体的天然存在形式的组织因子途径抑制物(TFPI)。例如，按本文所述使用的TFPI可以是哺乳动物TFPI，例如人、小鼠、大鼠、灵长类动物、牛、羊、兔或猪TFPI。优选TFPI是人TFPI。TFPI可以是成熟形式的TFPI，例如在合适细胞内进行翻译后加工的TFPI蛋白。所述成熟的TFPI蛋白可被例如糖基化。TFPI可以是全长TFPI蛋白。术语TFPI还包括所述TFPI分子的变体、同种型和其它同源物。TFPI活性是指其抑制活性。变异TFPI分子的一般的特征可在于具有与天然存在的TFPI相同类型的活性，例如中和FXa的催化活性的能力或抑制TF-FVIIa/FXa的复合物的能力。
术语“抗体”在本文是指来源于免疫球蛋白序列、能够与抗原或其部分特异性结合的蛋白质。术语抗体包括但不限于任何类别(或同种型)的全长抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和/或IgY。该术语还可包括全长抗体的一个或多个抗原结合片段。与抗原或其部分特异性结合的抗体可唯一地与该抗原或其部分结合，或可与有限数目的同源抗原或其部分结合。
天然的全长抗体通常包含至少4条多肽链：通过二硫键连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。在一些情况下，天然的抗体包含小于4条链，如仅存在于骆驼(camelid)中的抗体的重链(VHH片段)和存在于软骨鱼纲(Chondrichthyes)的IgNAR的情况。有特殊药物意义的免疫球蛋白的一个类别是IgG。在人中，可根据其重链恒定区的序列，把IgG类别再分为4个亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可根据其序列组成的差异，把轻链分成两个类型κ和λ链。IgG分子由通过两个或更多个二硫键互连的2条重链和通过一个二硫键各与重链连接的2条轻链组成。IgG重链可包含重链可变区(VH)和至多3个重链恒定(CH)区：CH1、CH2和CH3。轻链可包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步再分成超变区域，称为互补决定区(CDR)或超变区(HvR)，中间散布有更保守的区域，称为构架区(FR)。VH和VL区通常由按以下顺序从氨基端到羧基端排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。具有重链和轻链的超变区的可变结构域形成能够与抗原相互作用的结构域，同时抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的C1复合物的第一组分(C1q)。
可以分离本发明的抗体。术语“分离的抗体”是指从其所产生的环境中的其它组分中分离和/或回收和/或从存在于其所产生的环境中的组分的混合物中纯化的抗体。
本文所用术语“单特异性抗体”是指具有单一抗原识别部位(即单价)或两个相同的抗原识别部位(即二价)的抗体，所述两个相同的抗原识别部位的每一个对一个共同的靶抗原有特异性。
本发明的单特异性抗体可以是单克隆抗体，其意义在于它们表示从单一B细胞或通过B细胞克隆群表达的单一的一组重链和轻链可变结构域序列。本发明的抗体可采用本领域技术人员已知的各种方法产生并纯化。例如，抗体可从杂交瘤细胞产生。抗体可通过B细胞扩增产生。抗体或其片段可在哺乳动物或微生物表达系统中或通过体外翻译重组表达。还可通过例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或核糖体或mRNA展示，重组表达抗体或其片段为细胞表面结合分子。一旦产生，便可针对其结合TFPI(1-181)、全长TFPIα和TFPIβ例如人TFPI(1-181)、全长人TFPIα和人TFPIβ的能力筛选抗体。
抗体的各种抗原结合片段还可以是本发明的单特异性抗体，因为它显示通过全长抗体的片段可进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性结合或识别本文所述以下抗原的能力的抗体的一个或多个片段：例如TFPIα，例如人TFPIα(SEQIDNO:1)，例如人TFPI(1-181)(SEQIDNO:2)，例如人TFPI(182-276，按照SEQIDNO:1编号)，例如TFPIβ，例如人TFPIβ或其它靶分子。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、Fab2、Fab’2、FabS、Fv(通常抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv；参见例如Bird等，Science(1988)242:42S-426;和Huston等,PNAS(1988)85：5879-5883)、dsFv、Fd(通常为VH和CH1结构域)和dAb(通常为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的单价分子；微型抗体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体、四抗体和κ体(kappabodies)(参见例如Ill等,ProteinEng(1997)10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能性抗原互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起使得形成功能性抗体片段。在例如Holliger和Hudson，NatBiotechnol(2005)23:1126-1136；WO2005040219和公开的美国专利申请号20050238646和20020161201中描述并回顾了不同类型的抗体片段。可采用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并可按与完整抗体相同的方式，筛选实用的片段。
抗体的“Fab片段”，包括“Fab”、“Fab’”和”Fab’2”片段，可通过在连接抗体重链的铰链半胱氨酸残基的N端或C端侧切割铰链区中的重链来获得。“Fab”片段包括轻链的可变和恒定结构域和可变结构域及重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab'2”片段包含一般通过其铰链半胱氨酸共价连接的一对“Fab'”片段。Fab'一般通过切割Fab'2中连接重链的铰链二硫键而来源于Fab'2片段。抗体片段的二硫键以外的其它化学偶联也是本领域已知的。Fab片段可能以低亲和力保持亲本抗体与其抗原结合的能力。Fab'2片段能够二价结合，而Fab和Fab’片段可单价结合。Fab片段一般缺乏CH2和CH3恒定结构域，即其中可与Fc受体发生相互作用的Fc部分。因此，Fab片段一般没有效应子功能。Fab片段可采用本领域已知方法通过抗体的酶促切割产生，例如使用木瓜蛋白酶获得Fab或使用胃蛋白酶获得Fab'2，包括Fab、Fab'，Fab'2的Fab片段可采用本领域技术人员熟知的技术重组产生。
“Fv”片段是含有完全抗原识别和结合部位的抗体片段，一般包含缔合(其性质上可为共价)的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体，例如在单链可变结构域片段(scFv)中。正是这个构型，各可变结构域的3个超变区相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。总的来说，6个超变区或其亚单元赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至只包含对抗原有特异性的3个超变区的单一可变结构域都可保持识别和结合抗原的能力，尽管通常在比完整结合部位低的亲和力下(Cai和Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:6280-6285)。例如，只具有重链可变结构域(VHH)的天然存在的骆驼抗体可结合抗原(Desmyter等,J.Biol.Chem.(2002)277:23645-23650;Bond等,J.Mol.Biol.(2003)332:643-655)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述参见Pluckthun,1994,载于:ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，其中片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH和VL)。通过使用太短以致于不允许同一链上的两个可变结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合部位。双抗体更全面地描述于例如EP404,097；WO93/11161和Hollinger等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448。
表述“线性抗体”是指Zapata等,1995,ProteinEng.,8(10):1057-1062中描述的抗体。简单地说，这些抗体含有与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
本文所用术语“单抗体(monobody)”是指具有重链可变结构域和没有轻链可变结构域的抗原结合分子。单抗体可在轻链不存在时与抗原结合，并且通常具有3个超变区，例如命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR。重链IgG单抗体具有通过二硫键连接的2个重链抗原结合分子。重链可变结构域包含一个或多个超变区，优选CDRH3或HVL-H3区。
抗体片段可采用常规重组或蛋白质工程技术获得，并且可按与完整抗体相同的方式，筛选与TFPI(1-181)、全长TFPIα和TFPIβ结合或另一种功能的片段。
可通过截短，例如通过从多肽的N末端和/或C末端脱去一个或多个氨基酸，来制备本发明的抗体片段。片段还可以通过一个或多个内部缺失产生。
术语“双特异性抗体”在本文是指具有两个截然不同和/或独特的抗原识别部位或“臂”的抗体，这使得它能够占用两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同的表位。术语“多特异性抗体”是指具有占用两个或更多个不同的抗原或同一抗原上的两个或更多个不同的表位的能力的抗体。多特异性抗体因此包含双特异性抗体。
可如下产生模拟天然抗体的呈全长IgG形式的双特异性抗体：通过使两个单独的杂交瘤融合形成杂交的四源杂交瘤，其产生包括双特异性异二聚化抗体的一部分的抗体混合物(CheliusD.等;MAbs.2010May-Jun;2(3):309-319)。或者，双特异性异二聚化抗体可采用重组技术产生。还可通过工程改造Fc区的二聚化界面以促进异二聚化，来实现异二聚化。其一个实例是其中将大位阻侧链(结(knob))引入一个Fc中，在Fc的对面与小位阻侧链(孔(hole))匹配的所谓的孔-结(knob-in-hole)突变，从而产生促进异二聚化的空间互补性。用于工程改造的异二聚化Fc界面的其它方法是静电互补性、与非IgG异二聚化结构域融合或利用人IgG4的天然Fab臂交换现象以控制异二聚化。在文献中充分描述了异二聚化双特异性抗体的实例，例如KleinC,等;MAbs.2012Nov-Dec;4(6):653-663。要特别注意异二聚体抗体中的轻链。可通过使用共同轻链实现正确的LC和HC配对。可再次使用工程改造的LC/HC界面以促进如CrossMAb中的异二聚化或轻链交叉工程改造。在微弱还原条件下从含有适当突变的两个单独的IgG的抗体的体外重新组装也可用于产生双特异性(例如Labrijn等,PNAS,110,5145-5150(2013))。同样，报告了天然Fab臂交换方法以确保正确的轻链配对。
如文献所述，基于多特异性抗体的分子还可重组表达为联合IgG的天然模件形成多特异性和多价抗体衍生物的融合蛋白。融合抗体的实例为DVD-Ig、IgG-scFV、双抗体、DART等(Kontermann,MAbs.2012Mar-April4(2):182-197)。可将特异性检测或纯化标签、半寿期延长部分或其它组分掺入融合蛋白中。还可将其它的非IgG形式掺入融合蛋白中。不考虑LC配对方法，通常将基于FC异二聚化的双特异性全长抗体称为不对称IgG。
如文献所述，还可通过各个全长IgG的化学缀合或偶联或IgG片段的偶联以形成多特异性和多价抗体衍生物，来产生基于多特异性抗体的分子。融合抗体的实例是化学偶联的Fab’2、IgG-二聚体等(Kontermann,MAbs.2012Mar-April4(2):182-197)。可将特异性检测或纯化标签、半寿期延长分子或其它组分掺入缀合蛋白中。还可将其它的非IgG多肽掺入融合蛋白中。在实施例中提供了所述双特异性抗体的实例。
还可通过将重组和化学方法联合，包括上文所述方法，来产生多特异性分子。
本发明的双特异性抗体可包含mAb2021抗体的抗原结合片段，mAb2021是一种单克隆抗体，首次描述于WO2010/072691，其通过引用结合到本文中。
本发明的双特异性抗体可包含mAb2F22抗体的抗原结合片段。
本发明的双特异性抗体可包含mAb2F3抗体、mAb2F45抗体、mAb1F91抗体或2F35抗体抗的原结合片段。
本发明的双特异性抗体还可包含mAb4F110抗体、mAb22F66抗体或mAb22F71抗体的抗原结合片段，所述抗体是单克隆抗体，首次描述于WO2012/001087；其通过引用结合到本文中；或备选地，本文所公开的mAb22F74抗体的抗原结合片段。例如，本发明的双特异性抗体可包含上述抗体之一的Fab片段。本发明的双特异性抗体还可包含本文公开的基于上述抗体之一的变异Fab片段，例如Fab0094或Fab0095或Fab0313(mAb2021的衍生物)。
本发明的双特异性或双功能抗体可通过与TFPI的不同表位结合的两种抗体或其片段的化学缀合来获得：
mAb1(或片段)-mAb2(或片段)
mAb1(或片段)-接头-mAb2(或片段)
键可以是单个共价键(直键)或包含一般描述为以下的双游离基：
其中X为但不限于选自碳、氧、硫、磷和氮的至少一个原子。*显示该双游离基连接的位置。术语“双游离基”是指具有两个彼此独立起作用的自由基中心的偶电子化合物。
在一个实施方案中，接头是由不超过40个原子组成的链。
在一个实施方案中，接头中所用的化学部分包含具有以下结构的双游离基：
在一个实施方案中，接头部分包含具有对称结构的双游离基(同双官能化接头)。
接头还可以是与上述类似的结构的聚合物。
在一个实施方案中，接头中所用的化学部分包含聚合物：由通过共价化学键连接的两个或更多个重复结构单元组成的大分子。所述聚合物可以是亲水的。
术语亲水的或“水溶性的”是指在水中具有某种可检测的溶解度的部分。检测和/或量化水溶性的方法是本领域众所周知的。
本发明的示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有混合序列或可由单一氨基酸组成，例如聚赖氨酸。示例性的多糖为多聚唾液酸。示例性的聚醚为聚乙二醇。聚乙烯亚胺是示例性的聚胺，聚丙烯酸是代表性的聚羧酸。
许多其它的聚合物也适于本发明。是水溶性的聚合物骨架特别可用于本发明。合适的聚合物的实例包括但不限于例如描述于美国专利号5,629,384(其通过引用以其整体结合于本文)中的其它聚亚烷基二醇例如聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚([α]-羟酸)、聚乙烯醇、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰基吗啉)，及其共聚物、三元共聚物和混合物。
聚合接头优选为线性的。
尽管每个单独的聚合物链的分子量可变化，但聚合物的平均分子量通常的范围为约1000Da(1kDa)-约40,000Da(40kDa)，例如约1000Da-约12,000Da，例如约2,000Da-约11,000Da，例如约2000Da-约3,000Da；约3000Da-约4,000Da、约4000-约5,000Da、约5000-约6,000Da、约6,000-约7,000Da、约7,000-约8,000Da、约8,000-约9,000Da、约9,000-约10,000Da或约10,000-约11,000Da。应了解，这些大小表示估计值，而不是确切测量值。按照优选的实施方案，本发明的分子与异质群的亲水聚合物缀合。
在一个具体的实施方案中，接头中所用的化学部分包含聚乙二醇(PEG)。
术语“PEG”在本文是指包含以下结构的双游离基
，
其中n’为大于1的整数。
PEG通过环氧乙烷的聚合来制备，并且在大的分子量范围内是市购可获得的。可按照本发明使用的PEG优选为线性的。
此外，“PEG”可指具有或没有偶联剂、偶联部分或激活部分(例如具有羧酸/活性酯、酮、烷氧基胺、硫醇基、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、炔、叠氮化物或马来酰亚胺部分)的聚乙二醇化合物或其衍生物。本文提及的其它接头还可具有或没有偶联剂、偶联部分或激活部分(例如具有羧酸/活性酯、酮、烷氧基胺、硫醇基、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、炔、叠氮化物或马来酰亚胺部分)。
在一个具体的实施方案中，可按照本发明使用的PEG是单分散的。在另一个具体的实施方案中，可按照本发明使用的PEG多分散的。
多分散PEG由具有不同分子量的PEG分子组成。大小分布在统计上可通过其重均分子量(Mw)及其数均分子量(Mn)表征，重均分子量与数均分子量的比例称为多分散指数(Mw/Mn)(参见例如“PolymerSynthesisandCharacterization”,J.A.Nairn,UniversityofUtah,2003)。Mw和Mn可通过质谱法测量。
多分散指数可为大于或等于1的数，且可从凝胶渗透色谱数据估算。当多分散指数为1时，产物为单分散的，因此由具有单一分子量的化合物组成。当多分散指数大于1时，聚合物是多分散的，多分散指数显示具有不同分子量的聚合物的分布有多宽。多分散指数通常随PEG的分子量增加。在具体的实施方案中，可按照本发明使用的PEG的多分散指数为i)低于1.06，ii)低于1.05，iii)低于1.04，iv)低于1.03或v)在1.02和1.03之间。
可获得不同形式的PEG，这取决于用于聚合过程的引发剂。
用于PEG取代基的缀合的多种方法描述于AdvancedDrugDeliveryReviews,2002,54,459-476；NatureReviewsDrugDiscovery,2003,2,214-221DOI:10.1038/nrd1033,AdvPolymSci,2006,192,95-134,DOI10.1007/12_022,Springer-Verlag,BerlinHeidelberg,2005和其中的参考文献。或者，通过使用酶的方法，可发生亲水聚合物取代基的缀合。所述方法例如描述于WO2006134148中的谷氨酰胺酶的使用。
为了实现多肽的聚合物分子的有效连接，提供呈活化形式的聚合物分子的末端基团，即为反应性官能团。合适的活化聚合物分子是市购可获得自例如Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,MO,USA；RappPolymereGmbH,Tübingen,Germany或PolyMASCPharmaceuticalsplc,UK。或者，聚合物分子通过本领域已知常规方法(例如WO90/13540公开的方法)激活。活化PEG聚合物的具体实例公开于美国专利号5,932,462和5,643,575。此外，下列公开文本公开了有用的聚合物分子和/或聚乙二醇化化学法：WO2003/031464、WO2004/099231。
单克隆抗体或其片段与活化的聚合物分子的缀合可通过采用例如描述于下列参考文献(其还描述了用于聚合物分子活化的合适方法)的任何常规方法进行：R.F.Taylor,(1991),“Proteinimmobilisation.Fundamentalandapplications”,MarcelDekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),“ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking”,CRCPress,BocaRaton；G.T.Hermanson等,(1993),“ImmobilizedAffinityLigandTechniques”,AcademicPress,N.Y.,BioconjugateTechniques,第二版,GregT.Hermanson,2008,Amsterdam,Elsevier)。技术人员应知道，待采用的活化方法和/或缀合化学法取决于多肽的连接基团(上文更多地给出其实例)以及聚合物的官能团(例如为胺、羟基、羧基、醛、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯基砜或卤代乙酸酯)。聚乙二醇化可指向与多肽上可获得的连接基(即暴露在多肽表面上的这类连接基)缀合或可指向一个或多个特定的连接基，例如N端氨基或硫醇基。此外，缀合可在一个步骤中实现或以逐步方式实现。
在另一个实施方案中，用作接头的化学部分是羟乙基淀粉。本文所用术语“羟乙基淀粉”(HES/HAES)是指非离子淀粉衍生物。通常通过其平均分子量(通常为约130-200kDa)描述不同类型的羟乙基淀粉。
在另一个实施方案中，接头中所用的化学部分包含多聚唾液酸。
在另一个实施方案中，接头中所用的化学部分包含heparosan聚合物，其描述于例如Glycobiology(2011)21:1331-1340。
在另一个实施方案中，使用接头中的化学部分使蛋白质的至少一种与以下聚糖连接：与蛋白质连接的多糖或寡糖。
在另一个实施方案中，使用接头中的化学部分使蛋白质的至少一种与O-联聚糖连接。
在另一个实施方案中，使用接头中的化学部分使蛋白质的至少一种与N-联聚糖连接。
通过产生这些蛋白质的细胞，使N-聚糖和O-聚糖两者与蛋白质例如mAb连接。在新生蛋白质从核糖体转移到内质网中时，细胞N-糖基化机器识别氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T基序)并使之糖基化(Kiely等,J.Biol.Chem.1976,251:5490；Glabe等,J.Biol.Chem.,1980,255,9236)。同样地，O-聚糖与氨基酸链中特定的O-糖基化位点连接，但是与N-糖基化信号相比，引发O-糖基化的基序更异质得多，我们预测氨基酸序列中O-糖基化位点的能力仍不足(Julenius等,Glycobiology,2005,15:153)。使多肽与各种聚合侧基缀合的方法描述于例如WO0331464。
在另一个实施方案中，接头中所用的化学部分包含这样化学部分，其用于使所述接头与具有以下双游离基的选定结构的蛋白质的至少一种连接：
、、、、
本发明的单特异性和双特异性抗体可为人抗体或人源化抗体。本文所用术语“人抗体”欲包括具有其中至少一部分构架区和/或至少一部分CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。(例如，人抗体可具有其中构架和CDR区两者来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区)。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区或其部分也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括非通过人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
所述人抗体可以是人单克隆抗体。所述人单克隆抗体可通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)、具有包含与永生化细胞融合的人免疫球蛋白重链和轻链基因区段库的基因组的B细胞。
人抗体可从建立在人种系序列选择之上的序列文库中分离，可用天然和合成序列多样性使之进一步多样化。
可通过人淋巴细胞的体外免疫，接着将淋巴细胞用EB病毒转化，来制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种作用剂或抗体的缀合物。
本文所用术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的序列(CDR区或其部分)的人/非人嵌合抗体。因此，人源化抗体是其中至少来自受体超变区的残基被来自非人物种例如来自小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的抗体(供体抗体)超变区的残基置换的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述抗体具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能性。在一些实例中，人免疫球蛋白的构架(FR)残基被相应的非人残基置换。这类修饰的实例是引入一个或多个所谓的回复突变，其通常是来源于供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可采用本领域技术人员已知的重组技术进行(参见例如AntibodyEngineering,MethodsinMolecularBiology,第248卷,BennyK.Lo编辑)。用于轻链和重链可变结构域两者的合适的人受体构架可通过例如序列或结构同源性来鉴定。或者，可根据例如结构知识、生物生理和生物化学性质，使用固定的受体构架。受体构架可以是种系来源的或来源于成熟的抗体序列。来自供体抗体的CDR区可通过CDR移植转移。可通过鉴定其中来自供体抗体的氨基酸残基的重新引入(回复突变)对人源化抗体的性质具有有益作用的决定性构架位置，针对例如亲和力、功能性和生物生理性质，对CDR移植的人源化抗体进行进一步优化。除供体抗体来源的回复突变以外，可通过在CDR或构架区引入种系残基、清除免疫原性表位、位点定向诱变、亲和力成熟等，对人源化抗体进行改造。
此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步精修抗体性能。一般来说，人源化抗体可包含至少一个(通常两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区相当于非人免疫球蛋白的CDR区，且其中所有或基本上所有FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体还任选可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。
术语“人源化抗体衍生物”是指人源化抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种化学剂或抗体或抗体片段或多肽的缀合物。
本文所用术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过遗传工程，从起源于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可通过人恒定区连接。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/“Fc结构域”)是抗体的C端区，其包含CH2和CH3恒定结构域。Fc结构域可与称为Fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区使抗体能够与免疫系统相互作用。本发明的一个方面，可对抗体进行改造以包括Fc区内的修饰，通常改变其功能性质的一个或多个，尤其例如血清半寿期、补体结合、Fc-受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性或其缺乏。此外，可对本发明的抗体进行化学修饰(例如可将一个或多个化学部分与抗体连接)或修饰以改变其糖基化，以再次改变抗体的一个或多个功能性质。IgG1抗体可携带包含一个或多个和或许所有下列突变的修饰的Fc结构域，所述突变将分别导致对某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和导致C1q介导的补体结合降低(A330S和P331S)(残基编号按照EU索引)。
本发明抗体的同种型可以是IgG，例如IgG1，例如IgG2，例如IgG4。如有需要，抗体的类别可通过已知技术“转换”。例如，起初作为IgM分子产生的抗体可类别转换成IgG抗体。还可采用类别转换技术将一个IgG亚类转变为另一个亚类，例如从IgG1转变为IgG2或IgG4；从IgG2转变为IgG1或IgG4；或从IgG4转变为IgG1或IgG2。还可通过来自不同IgG亚类的区域的组合，进行抗体的改造以产生恒定区嵌合分子。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法进一步描述于例如Bodmer等人的美国专利号5,677,425。
可修饰恒定区以稳定抗体，例如减小二价抗体分成两个单价VH-VL片段的风险。例如在lgG4恒定区中，可使残基S228(按照EU编号索引，Kabat的S241)突变成脯氨酸(P)残基以稳定铰链上的重链间二硫桥形成(参见例如Angal等,MolImmunol.1993；30:105-8)。
结合TFPI上的两个独特表位的双特异性抗体或两种单特异性抗体可通过本领域技术人员已知的方法产生。例如通过两个抗体片段(例如两个Fab或scFv片段)的直接化学缀合或通过提供适当功能所需柔性的接头的化学缀合，制备双特异性形式。用于偶联Fab片段的一种具体方法是利用Fab片段中适当定位的半胱氨酸残基的硫醇基官能性。
抗体或其片段可根据其互补决定区(CDR)定义。当本文使用时，术语“互补决定区”或“超变区”是指其中参与抗原结合的氨基酸残基所处的抗体的区域。超变区或CDR被鉴定为抗体可变结构域的氨基酸比对中具有最高变化性的区域。数据库(例如Kabat数据库)可用于CDR鉴定，例如CDR被界定为包含轻链可变结构域中的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242(美国卫生与公共事务部国立卫生研究院颁布号91-3242))。或者CDR可界定为来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域的残基26-33(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol1987；196:901-917)。通常，该区中氨基酸残基的编号通过Kabat等人(出处同上)所述方法进行。短语例如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“按照Kabat”在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号系统。采用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有与可变结构域构架(FR)或CDR缩短或插入相应的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域在CDRH2的残基52之后可包括单个氨基酸插入(按照Kabat的残基52a、52b和52c)，在重链FR残基82之后可包括插入残基(例如按照Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，残基的Kabat编号由通过该抗体序列与“标准”Kabat编号的序列在同源区进行比对来确定。
术语“构架区”或“FR”残基是指不在本文定义的CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。
本发明的抗体可包含来自本文公开的一种或多种特定抗体的CDR区，例如来自SEQIDNO:3-61内的CDR区，如采用Kabat编号或按照本文公开的顺序氨基酸编号界定的CDR区。
因此，能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有结合TFPI(1-181)的本发明的双特异性抗体的部分，所述结合TFPI(1-181)的抗体也可包含所述CDR区。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:3的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:3的氨基酸99-110的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:4的氨基酸24-39的CDR1序列；和/或
相当于SEQIDNO:4的氨基酸55-61的CDR2序列；和/或
相当于SEQIDNO:4的氨基酸94-102的CDR3序列。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:9氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:9的氨基酸99-107的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:10的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:10的氨基酸89-97的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:11的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:11的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:11的氨基酸99-106的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:12的氨基酸24-33的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:12的氨基酸49-55的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:12的氨基酸88-96的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
结合TFPI(182-276)的本发明的双特异性抗体的部分还可包含所述CDR区。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:13的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:13的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:13的氨基酸99-111的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:14的氨基酸24-38的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:14的氨基酸54-60的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:14的氨基酸93-101的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:15的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:15的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:15的氨基酸99-106的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:16的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:16的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:16的氨基酸89-97的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
结合TFPI(182-276)的本发明的双特异性抗体的部分可包含所述CDR区。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:22的氨基酸31-36的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:22的氨基酸51-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:22的氨基酸99-104的CDR3序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:23的氨基酸24-33的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:23的氨基酸49-55的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:23的氨基酸88-96的CDR3序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:24的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:24的氨基酸50-65的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:24的氨基酸98-110的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:25的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:25的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:25的氨基酸89-96的CDR3序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:28的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:28的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:28的氨基酸99-105的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:29的氨基酸24-39的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:29的氨基酸55-61的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:29的氨基酸94-102的CDR3序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:30的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:30的氨基酸50-65的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:30的氨基酸98-110的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(1-181)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:31的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:31的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:31的氨基酸89-96的CDR3序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:42的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:42的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:42的氨基酸99-105的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:43的氨基酸24-38的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:43的氨基酸54-60的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:43的氨基酸93-101的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:44的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:44的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:44的氨基酸99-109的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:45的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:45的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:45的氨基酸89-97的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:46的氨基酸31-36的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:46的氨基酸51-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:46的氨基酸99-106的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:47的氨基酸24-38的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:47的氨基酸54-60的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:47的氨基酸93-101的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的重链：
相当于SEQIDNO:60的氨基酸31-35的CDR1序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:60的氨基酸50-66的CDR2序列，其中这些氨基酸的1、2或3个可被不同的氨基酸残基置换；和/或
相当于SEQIDNO:60的氨基酸99-107的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
能够结合TFPI(182-276)的本发明的单特异性抗体可具有包含以下的轻链：
相当于SEQIDNO:61的氨基酸24-34的CDR1序列，其中这些氨基酸残基的1、2或3个可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:61的氨基酸50-56的CDR2序列，其中这些氨基酸残基之一可被不同的氨基酸置换；和/或
相当于SEQIDNO:61的氨基酸89-97的CDR3序列，其中这些氨基酸残基的1或2个可被不同的氨基酸置换。
所述单特异性抗体可以组合形成KPI-1/KPI-3双特异性抗体。
在一个实施方案中，KPI-1结构域特异性抗体或其片段与C端区(SEQIDNO:1的182-276)特异性抗体或其片段组合形成尤其为全长形式或Fab-Fab缀合物的双特异性抗体。
在一个这样的实施方案中，mAb1F91(SEQIDNO:22和23)或其片段与mAb22F74(SEQIDNO:15和16)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb1F91(SEQIDNO:22和23)或其片段与mAb22F132(SEQIDNO:42和43)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb1F91(SEQIDNO:22和23)或其片段与mAb22F79(SEQIDNO:44和45)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb1F91(SEQIDNO:22和23)或其片段与mAb41F41(SEQIDNO:46和47)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb1F91(SEQIDNO:22和23)或其片段与mAb41F30(SEQIDNO:60和61)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F3(SEQIDNO:24和25)或其片段与mAb22F74(SEQIDNO:15和16)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F3(SEQIDNO:24和25)或其片段与mAb22F132(SEQIDNO:42和43)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F3(SEQIDNO:24和25)或其片段与mAb22F79(SEQIDNO:44和45)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F3(SEQIDNO:24和25)或其片段与mAb41F41(SEQIDNO:46和47)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F3(SEQIDNO:24和25)或其片段与mAb41F30(SEQIDNO:60和61)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F22(SEQIDNO:26和27)或其片段与mAb22F74(SEQIDNO:15和16)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F22(SEQIDNO:26和27)或其片段与mAb22F132(SEQIDNO:42和43)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F22(SEQIDNO:26和27)或其片段与mAb22F79(SEQIDNO:44和45)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F22(SEQIDNO:26和27)或其片段与mAb41F41(SEQIDNO:46和47)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F22(SEQIDNO:26和27)或其片段与mAb41F30(SEQIDNO:60和61)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F35(SEQIDNO:28和29)或其片段与mAb22F74(SEQIDNO:15和16)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F35(SEQIDNO:28和29)或其片段与mAb22F132(SEQIDNO:42和43)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F35(SEQIDNO:28和29)或其片段与mAb22F79(SEQIDNO:44和45)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F35(SEQIDNO:28和29)或其片段与mAb41F41(SEQIDNO:46和47)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F35(SEQIDNO:28和29)或其片段与mAb41F30(SEQIDNO:60和61)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F45(SEQIDNO:30和31)或其片段与mAb22F74(SEQIDNO:15和16)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F45(SEQIDNO:30和31)或其片段与mAb22F132(SEQIDNO:42和43)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F45(SEQIDNO:30和31)或其片段与mAb22F79(SEQIDNO:44和45)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F45(SEQIDNO:30和31)或其片段与mAb41F41(SEQIDNO:46和47)或其片段组合。
在一个这样的实施方案中，mAb2F45(SEQIDNO:30和31)或其片段与mAb41F30(SEQIDNO:60和61)或其片段组合。
变异抗体可包含来自上述具体序列和片段的1、2、3、4、5、多达10个或更多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可包含个别氨基酸的缺失、小群氨基酸例如1、2、3、4或5个氨基酸的缺失或较大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其它特征的缺失。“插入”变体可包含个别氨基酸的插入、小群氨基酸例如1、2、3、4或5个氨基酸的插入或较大氨基酸区域的插入，例如特定氨基酸结构域或其它特征的插入。“置换”变体优选包括一个或多个氨基酸被相同数目的氨基酸替换，并使之为保守氨基酸置换。例如，氨基酸可被具有类似性质的替代氨基酸置换，例如被另一个碱性氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电荷的氨基酸、另一个亲水氨基酸、另一个疏水氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳族氨基酸或另一个脂族氨基酸置换。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：
优选的“衍生物”或“变体”包括其中除天然存在的氨基酸以外在序列中出现的是其结构类似物的氨基酸的那些。用于序列中的氨基酸还可被衍生化或修饰，例如被标记，只要抗体的功能不受重大的不利影响。
置换可以是，但不限于保守置换。
可在抗体合成期间或通过生产后修饰或当抗体呈采用位点定向诱变、随机诱变或核酸的酶促切割和/或连接的已知技术的重组形式时，来制备上述衍生物和变体。
本发明还涉及编码本发明的抗体的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可编码本文所述的任何抗体。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以分离或纯化形式提供。
“编码”选定多肽的核酸序列是当置于合适的调节序列控制下在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由在5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子决定。对于本发明的目的，所述核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA；来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码本文所述VH或VL氨基酸序列的序列。例如，本发明的多核苷酸可编码包含本文所述SEQIDNO:11的序列或其变体或片段的多肽。合适的多核苷酸序列可备选地为这些具体的多核苷酸序列之一的变体。例如，变体可以是上述核酸序列的任一个的置换、缺失或添加变体。变异多核苷酸可包含序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30、多达40、多达50、多达75个或更多个核酸置换和/或缺失。
合适的变体可与编码本发明多肽的多核苷酸有至少70%同源性、优选与之有至少80或90%、更优选至少95%、97%或99%同源性。测量同源性的方法是本领域众所周知的，本领域技术人员应了解在本文的情况下，同源性根据核酸同一性计算。所述同源性可存在于至少15个、优选至少30个、例如至少40、60、100、200个或更多个连续核苷酸的区域内。所述同源性可存在于全长的未修饰多核苷酸序列中。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供可用来计算同源性的BESTFIT程序(例如以其默认设置使用)(Devereux等,(1984)NucleicAcidsResearch12:387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或对序列排位(通常以其默认设置)，例如描述于AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300；Altschul,S.F.等,(1990)JMolBiol215:403-10。
进行BLAST分析的软件通过NationalCentreforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。这种算法包括当与数据库序列中相同长度的字码比对时，通过鉴定匹配或满足一些正值阈值评分T的查询序列中的短字码长度W，首先鉴定出高评分序列对(highscoringsequencepair，HSP)。T称为邻域字码评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始邻域字码命中(wordhits)作为用于开始查找包括它们的HSP的种子的作用。字码命中沿每个序列的两个方向延长直到可提高累积的比对评分。当由于一个或多个负评分残基比对累积所致累积的比对评分趋于零或以下时，或者当达到任一序列的末端时，每个方向上字码命中的延长停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。以字码长度(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)比对(B)为50，预期(E)为10，M=5，N=4和双链比较的默认值，应用BLAST程序。
BLAST算法进行两个序列间相似性的统计分析；参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787。
术语“抗原”(Ag)在本文是指用于免疫有免疫能力的脊椎动物以产生识别Ag的抗体(Ab)的实体。在本发明的情况下，合适的抗原包括人TFPI(1-181)和全长人TFPIα。在本文中，Ag的命名更广泛，一般欲包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括用于免疫过程或用于产生Ab的其它过程(例如噬菌体展示)的分子的片段或模拟物。
在“抗原结合性多肽”例如抗体(Ab)与其相应的抗原(Ag)之间的分子相互作用的情况下定义本文所用术语“表位”。“表位”一般是指Ab与之特异性结合的Ag上的区或区域，即与Ab物理接触的区或区域。对于Ab和Ag分子中的原子，可通过各种标准来定义物理接触(例如2-6?、例如3?、例如4?、例如5?的距离截止值(cut-off)；或溶剂可及性)。蛋白质表位可包含Ag中直接参与结合Ab的氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被Ab有效封闭的Ag的氨基酸残基，即Ab的“溶剂排斥表面(solvent-excludedsurface)”和/或“足迹(footprint)”内的氨基酸残基。
术语“表位”在本文包含与单特异性或双特异性TFPI抗体或本发明的另一种TFPI特异性作用剂特异性结合的TFPI的任何特定区域中的两种类型的结合区，除非另有说明。TFPI可包含多个不同的表位，其可包括而不限于，(1)线性肽表位，(2)由在成熟TFPI构象中彼此靠近定位的一个或多个非连续氨基酸组成的构象表位，和(3)全部或部分由与TFPI共价连接的分子结构(例如糖基)组成的翻译后表位。
可采用各种实验和计算表位作图方法，在不同的细节层次上描述和表征给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢氘交换质谱法(HydrogendeuteriumeXchangeMassSpectrometry，HX-MS)和各种竞争结合方法、本领域已知的方法。由于每种方法依赖于独特的原理，因此表位的描述与测定表位的方法密切相关。因此，根据所采用的表位作图方法，可对给定Ab/Ag对的表位进行不同的描述。
在其最详细的层次上，可通过界定存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触空间坐标，以及有关其对结合热力学的相对贡献的信息，描述Ag和Ab之间相互作用的表位。在较少细节的层次上，表位可通过界定Ag和Ab之间原子接触的空间坐标表征。在甚至更少细节的层次上，表位可通过其包含的通过具体标准(例如Ab:Ag复合物中原子之间的距离或溶剂可及性)界定的氨基酸残基来表征。在进一步更少细节的层次上，表位可通过功能(例如通过与其它Ab的竞争结合)来表征。表位还可更通用地定义为包含被另一个氨基酸置换便将改变Ab和Ag之间的相互作用的特征的氨基酸残基。
在由Ab(例如Fab片段)与其Ag之间的复合物的空间坐标界定的源于X射线的晶体结构的情况下，除非另有说明或在文中抵触，否则术语表位在本文特别定义为在Ab中距重原子4?距离内具有重原子(即非氢原子)的TFPI残基。
从取决于所用表位作图方法、在不同的细节层次上获得的表位的描述和定义的事实来看，因此断定相同Ag上不同Ab的表位的比较可在不同的细节层次上进行。
如果它们含有相同类型的氨基酸残基，则认为在氨基酸水平上描述(例如从X射线结构确定)的表位是相同的。如果至少一个氨基酸被表位所共有，则认为表位重叠。如果氨基酸残基不被表位所共有，则认为表位是分开的(特有的)。
术语“抗原互补位”的定义通过将所述观点调转，而来源于“表位”的上述定义。因此，术语“抗原互补位”是指Ag与之特异性结合的Ab上的区或区域，即用其使之与Ag物理接触。
在通过Ab(例如Fab片段)与其Ag之间的复合物的空间坐标界定的X射线来源的晶体结构的情况下，除非另有说明或在文中抵触，否则术语抗原互补位在本文被特别定义为特征在于距TFPI中的重原子4?距离内具有重原子(即非氢原子)的Ag残基。
给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和抗原互补位可通过常规方法鉴定。例如，可通过评价抗体与不同片段或变异TFPI多肽结合的能力，来决定表位的总体位置。TFPI内与抗体接触的特定氨基酸(表位)和抗体内与TFPI接触的特定氨基酸(抗原互补位)也可采用常规方法确定。例如，可将抗体和靶分子混合，并可使Ab:Ag复合物结晶。可测定复合物的晶体结构，并可用来鉴定抗体及其靶标之间相互作用的具体部位。
可就抗体与其共同抗原同时结合的能力，来表征与相同抗原结合的抗体，并且可对抗体进行“竞争结合”/“框并(binning)”。本文中，术语“框并”是指将与相同抗原结合的抗体归类的方法。抗体的“框并”可以基于标准技术(例如表面等离振子共振(SPR)、ELISA或流式细胞术)的测定法中两种抗体与其共同抗原的竞争结合为基础。
使用参比抗体来定义抗体的“框(bin)”。如果第二抗体不能在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于与参比抗体相同的“框”，在这种情况下，参比抗体和第二抗体竞争性地结合抗原的相同部分，并被称为“竞争性抗体”。如果第二抗体能够在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于单独“框”。在这种情况下，参比抗体和第二抗体不竞争性地结合抗原的相同部分，并被称为“非竞争性抗体”。
抗体“框并”不提供有关表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同“框”的抗体可具有相同表位、重叠表位或甚至各自的表位。后者是这样的情况：如果与其抗原上的表位结合的参比抗体占据第二抗体与其抗原上的表位接触所需要的空间(“位阻”)。非竞争性抗体一般具有各自的表位。
例如就提供与TFPIα选择性结合同时仍提供TFPI抑制的完全阻断而言，调节TFPI(1-181)和TFPI(182-276)的单特异性抗体或双特异性抗体的两个抗原识别部位的相对和绝对亲和力可能是有利的。
术语“结合亲和力”在本文用作两个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用来描述单价相互作用(固有活性)。
可通过测定平衡解离常数(KD)，来量化两个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力。进而，例如可用SPR方法，通过测量复合物形成和解离的动力学，来测定KD。与单价复合物缔合和解离相应的速率常数分别被称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。通过等式KD=kd/ka将KD与ka和kd相关联。
根据上述定义，与不同分子相互作用有关的结合亲和力，例如不同抗体对给定抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值来进行比较。
本发明的抗体能够与另一个分子(例如天然存在的配体或受体或另一个抗体)竞争结合TFPI，从而实现与这些相互作用有关的功能。抗体与天然配体/受体竞争的能力可通过测量对TFPI抑制的表观KI的作用的各种活性测定法来评价。然后可从表观KI值推导KD值。通常，抗体相对于靶标(TFPI)的目标KD值将是其它TFPI配体KD的1/2倍，优选1/5倍，更优选1/10倍。更优选KD可为1/50倍，例如1/100倍或1/200倍；甚至更优选1/500倍、例如1/1,000倍或1/10,000倍。
该解离常数的值可通过众所周知的方法直接测定。评价配体(例如针对靶标的抗体)的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹法、RIA、等温滴定量热法和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力也可通过本领域已知的标准测定法(例如SPR)评价。
可进行竞争结合测定法，其中将抗体与靶标的结合与所述靶标被该该靶标的另一配体(例如另一抗体)的结合进行比较。
本发明的单特异性抗体或双特异性抗体的任一臂对其靶标的KD可为1x10-7M或更小，1x10-8M或更小，或1x10-9M或更小，或1x10-10M或更小，1x10-11M或更小，或1x10-12M或更小。本发明的抗体的KD可小于0.8nM，例如小于0.7nM，例如小于0.6nM，例如小于0.5nM，例如小于0.4nM，例如小于0.3nM，例如小于0.2nM，例如小于0.1nM，例如小于0.05nM，例如小于0.025nM，例如小于0.015nM，例如介于0.015nM和0nM之间。
一方面，本发明包含与本发明的抗体竞争达到所述竞争性抗体是双特异性的程度的抗体。
另一方面，本发明提供包含本发明的分子的组合物和制剂，例如本文所述双特异性抗体。例如，本发明提供与药学上可接受的载体一起配制的包含本发明的一种或多种双特异性TFPI抗体的药物组合物。
因此，本发明的一个目的是提供包含以0.25mg/ml-250mg/ml的浓度存在的所述双特异性TFPI抗体的药物制剂，且其中所述制剂的pH为2.0-10.0。制剂还可包含缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂或表面活性剂的一种或多种及其不同组合。药物组合物中防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂的使用是技术人员所熟知的。参照Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995。
在一个实施方案中，药物制剂是含水制剂。所述制剂通常是溶液剂或混悬剂，但还可包括胶体、分散剂、乳剂和多相材料。术语“含水制剂”定义为包含至少50%w/w水的制剂。同样地，术语“含水溶液剂”定义为包含至少50%w/w水的溶液剂，而术语“含水混悬剂”定义为包含至少50%w/w水的混悬剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是冻干制剂，医生或患者在用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。
又一方面，药物制剂包含所述抗体和缓冲剂的含水溶液剂，其中抗体以1mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述制剂的pH为约2.0-约10.0。
本发明的双特异性抗体或包含两种单特异性抗体的药物制剂可用于治疗患有凝血病的受试者。
本文所用术语“受试者”包括任何人类患者或非人脊椎动物。
本文所用术语“凝血病”是指由任何正常凝血级联的促凝固组分的任何定性或定量缺乏或任何血纤蛋白溶解上调引起的出血倾向增加。所述凝血病可以是先天性和/或获得性和/或医源性的，可通过本领域技术人员鉴定。
先天性凝血功能不全的非限制性实例为A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、冯维勒布兰德病(vonWillebrand’sdisease)和血小板减少例如Glanzmann血小板机能不全和伯-索综合征(Bernard-Souliersyndrome)。所述A型血友病或B型血友病可以是重度、中度或轻度的。血友病的临床严重程度通过血液中FIX/FVIII功能单位的浓度确定，并且归类为轻度、中度或重度。重度血友病的定义是凝血因子水平<0.01U/ml，相当于<正常水平的1%，而中度和轻度患者的水平分别为1-5%和>5%。含“抑制物”(即针对因子VIII的同种抗体)的A型血友病和含“抑制物”(即针对因子IX的同种抗体)的B型血友病是部分先天性和部分获得性的凝血病的非限制性实例。
获得性凝血病的非限制性实例是由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏症；所述维生素K-缺乏症可由于给予维生素K拮抗剂(例如华法林)引起。获得性凝血病也可发生在大规模创伤之后。在另称为“血液恶性循环”的这种情况下，其特征在于血液稀释(haemodilution)(稀释性血小板减少(dilutionalthrombocytopaenia)和凝血因子稀释)、低温、凝血因子消耗和代谢紊乱(酸中毒)。输液疗法和血纤蛋白溶解增加会加重这种情况。所述出血可来自身体的任何部分。
医源性凝血病的非限制性实例是可处方给予以治疗血栓栓塞性疾病的抗凝药物(例如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制剂)过量。第二，医源性凝血病的非限制性实例是由过度和/或不当输液疗法诱发的凝血病，例如由输血诱发的凝血病。
在本发明的一个实施方案中，出血与A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与有获得性抑制物的A型或B型血友病有关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少有关。在另一个实施方案中，出血与冯维勒布兰德病有关。在另一个实施方案中，出血与重度组织损伤有关。在另一个实施方案中，出血与重度创伤有关。在另一个实施方案中，出血与手术有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎有关。在另一个实施方案中，出血是子宫大出血，例如在胎盘早剥时。在另一个实施方案中，出血发生在对于机械止血的可能性有限的器官中，例如颅内、耳内或耳眼。在另一个实施方案中，出血与抗凝血疗法有关。
本文所用术语“治疗”是指有需要的任何人或其它脊椎动物受试者的医学疗法。预期所述受试者已经历由医师进行的身体检查，医师已做出试验性或确定性诊断，该诊断可表明使用所述特定治疗有益于所述人类或其它动物受试者的健康。所述治疗的时机和目的可依据受试者的健康现状而在个体间不同。因此，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。就本发明而言，预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的治疗可表示本发明的各个方面。
本发明的抗体可经胃肠外(例如静脉内，例如肌内，例如皮下)给予。或者，本发明的抗体可通过非胃肠外途径(例如经口或局部)给予。本发明的抗体可预防性地给予。本发明的抗体可治疗性地给予(一经要求)。
在一个实施方案中，体外使用本发明的双特异性抗体以测量TFPIα水平。
下面是本发明的非限制性方面：
1.一种能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的多特异性抗体。
2.一种能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的第一表位和TFPI的第二表位的多特异性抗体，其中第一表位包含位于SEQIDNO:1的1-181位内的氨基酸残基，第二表位包含位于SEQIDNO:1的TFPI182-276位内的氨基酸残基。
3.方面1或2的多特异性抗体，其中第一表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-1结构域内的氨基酸残基。
4.方面1或2的多特异性抗体，其中第一表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-2结构域内的氨基酸残基。
5.方面1-4中任一个的多特异性抗体，其中第二表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-3结构域内的氨基酸残基。
6.方面1-5中任一个的多特异性抗体，其是双特异性抗体。
7.方面6的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含选自以下SEQIDNO:1的一个或多个氨基酸残基的KPI-1表位：Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71和Met75。
8.方面7的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Arg41、Arg65和/或Glu67的KPI-1表位。
9.方面6的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-2表位：Glu100、Glu101、Asp102、Pro103、Arg107、Tyr109、Thr111、Tyr113、Phe114、Asn116、Gln118、Gln121、Cys122、Glu123、Arg124、Phe125、Lys126和Leu140。
10.方面9的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够特异性结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Arg107的KPI-2表位。
11.方面6-10中任一个的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-3表位：Tyr207、Asn208、Ser209、Val210、Ile211、Gly212、Lys213、Arg215、Lys232、Gln233、Leu236和Lys240。
12.方面11的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Ile211、Lys213和/或Arg215的KPI-3表位。
13.方面6-8中任一个的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-1表位：Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71和Met75；和
包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-3表位：Tyr207、Asn208、Ser209、Val210、Ile211、Gly212、Lys213、Arg215、Lys232、Gln233、Leu236和Lys240。
14.方面9-12中任一个的能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-2表位：Glu100、Glu101、Asp102、Pro103、Arg107、Tyr109、Thr111、Tyr113、Phe114、Asn116、Gln118、Gln121、Cys122、Glu123、Arg124、Phe125、Lys126和Leu140；和
包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-3表位：Tyr207、Asn208、Ser209、Val210、Ile211、Gly212、Lys213、Arg215、Lys232、Gln233、Leu236和Lys240。
15.方面6的包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:3的氨基酸残基99-110的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基94-102的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
16.方面15的双特异性抗体，其中重链还包含：
相当于SEQIDNO:3的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:5和SEQIDNO:7的序列的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
轻链还包含：
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基24-39的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基55-61的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
17.方面6的包含重链和轻链的抗体，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基99-107的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基89-97的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
18.方面17的双特异性抗体，其中所述重链还包含：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
其中所述轻链还包含：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基24-34的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基50-56的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
19.方面6的包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:11的氨基酸残基99-106的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:12的氨基酸残基88-96的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
20.方面19的双特异性抗体，其中所述重链还包含：
相当于SEQIDNO:11的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:11的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
其中所述轻链还包含：
相当于SEQIDNO:12的氨基酸残基24-33的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:12的氨基酸残基49-55的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
21.方面6的包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含
相当于SEQIDNO:13的氨基酸残基99-111的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:14的氨基酸残基93-101的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
22.方面21的双特异性抗体，其中所述重链还包含：
相当于SEQIDNO:13的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:13的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
其中所述轻链还包含：
相当于SEQIDNO:14的氨基酸残基24-38的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:14的氨基酸残基54-60的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
23.方面6的包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:15的氨基酸残基99-106的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:16的氨基酸残基89-97的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
24.方面23的双特异性抗体，其中所述重链还包含：
相当于SEQIDNO:15的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:15的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
其中所述轻链还包含：
相当于SEQIDNO:16的氨基酸残基24-34的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:16的氨基酸残基50-56的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
25.方面6的包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基98-110的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基89-96的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
26.方面25的双特异性抗体，其中所述重链还包含：
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基50-65的CDR2序列；
其中所述轻链还包含：
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基24-34的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基50-56的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
27.方面6的双特异性抗体，其为全长抗体形式。
28.方面6-31中任一个的双特异性抗体，其是Fab-Fab缀合蛋白或融合蛋白。
29.方面28中的包含第一Fab和第二Fab的Fab-Fab缀合物，其中第一Fab包含第一重链(HC)和第一轻链(LC)，第一重链包含：
相当于SEQIDNO:3的氨基酸残基31-35的CDR1序列；
相当于选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:5和SEQIDNO:7的序列的氨基酸残基50-66的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:3的氨基酸残基99-110的CDR3序列；
第一轻链(LC)包含
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基24-39的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基55-61的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:4的氨基酸残基94-102的CDR3序列；
且第二Fab包含第二重链和第二轻链，第二重链(HC)包含：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基31-35的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基50-66的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基99-107的CDR3序列；
且第二轻链(LC)包含：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基24-34的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基50-56的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基89-97的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
30.方面29中的包含第一Fab和第二Fab的Fab-Fab缀合物，其中第一Fab片段包含第一重链(HC)和第一轻链(LC)，第一重链包含：
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基31-35的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基50-65的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基98-110的CDR3序列；
且第一轻链(LC)包含：
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基24-34的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基50-56的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基89-96的CDR3序列；
第二Fab片段包含第二重链和第二轻链，第二重链(HC)包含：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基31-35的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基50-66的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基99-107的CDR3序列；
且第二轻链(LC)包含：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基24-34的CDR1序列；
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基50-56的CDR2序列；和
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基89-97的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
31.方面1-30中任一个的多特异性或双特异性抗体，其是人源化的。
32.一种包含第一单特异性抗体和第二单特异性抗体的药物组合物，其中第一单特异性抗体能够与SEQIDNO:1的组织因子途径抑制物(TFPI)氨基酸残基1-181内的表位特异性结合；
且第二单特异性抗体能够与SEQIDNO:1的TFPI氨基酸残基182-276内的表位特异性结合。
33.方面32的药物组合物，其中第一抗体的表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-1结构域内或TFPI的KPI-2结构域内的氨基酸残基，且其中第二抗体的表位包含TFPI的KPI-3结构域内的氨基酸残基。
34.方面33的药物组合物，其中第一单特异性抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:26的氨基酸残基98-110的CDR3序列；
所述轻链包含：
相当于SEQIDNO:27的氨基酸残基89-96的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
35.方面33的药物组合物，其中第二单特异性抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，所述重链包含：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基99-107的CDR3序列；
所述轻链(LC)包含：
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基89-97的CDR3序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
36.方面35的药物组合物，其中第二单特异性抗体包含还包含以下的重链(HC)：
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基31-35的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:9的氨基酸残基50-66的CDR2序列；
且第二单特异性抗体包含还包含以下的轻链(LC)
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基24-34的CDR1序列；和
相当于SEQIDNO:10的氨基酸残基50-56的CDR2序列；
其中各个CDR序列中的一个或两个氨基酸残基可被不同的氨基酸保守置换。
37.一种多特异性或双特异性抗体或包含与多特异性或双特异性抗体竞争的单特异性抗体的药物组合物或包含前述方面任一个的单特异性抗体的组合的药物组合物。
38.一种药物组合物，其包含方面1-31中任一个的多特异性或双特异性抗体。
39.用作药物的方面1-31或37中任一个的多特异性或双特异性抗体或包含方面32-37中任一个的单特异性抗体的组合的药物组合物。
40.用于治疗凝血病的方面1-19或37中任一个的多特异性或双特异性抗体或包含方面32或37中任一个的单特异性抗体的组合的药物组合物。
41.一种真核细胞，其表达方面1-31中任一个的双特异性抗体或其片段。
42.方面6-31中任一个的双特异性抗体用于体外测量TFPIα水平的用途。
43.方面1-37中任一个的双特异性抗体，其选择性地靶向循环TFPIα。
实施例
实施例1：免疫、融合和筛选
RBF小鼠用人TFPIα(SEQIDNO:1)或TFPI片段(例如相当于SEQIDNO:1的残基1-161)免疫。给小鼠皮下注射：与完全弗氏佐剂混合的20μg人TFPI用于第一注射。对于后续免疫，使用具有相同抗原浓度的不完全弗氏佐剂。最终免疫后10天，采用ELISA，从小鼠眼血中筛选人TFPI特异性抗体。通过静脉内注射，用10μg人TFPIα或TFPI(1-161)给具有阳性血清效价的小鼠加强免疫，3天后处死。无菌下取出脾，并分散成单细胞悬液。通过PEG方法或通过电融合进行脾细胞和骨髓瘤细胞的融合。所得杂交瘤细胞通过有限稀释进入微量滴定板来克隆。通过ELISA，针对能够结合全长TFPIα或TFPI片段抗体的表达，对各杂交瘤的上清液进行初步筛选。
抗体通过标准A蛋白亲和色谱法从上清液中纯化，并用于测定与人TFPI的结合和亲和力和血浆中的TFPI中和活性(稀释凝血酶原时间)。通过有限稀释，使产生目标抗体的杂交瘤亚克隆，并针对来自亚克隆杂交瘤的材料，证实最初的抗体特征。来自亚克隆杂交瘤的细胞用于分离RNA和随后的抗体克隆和序列鉴定。
实施例2：小鼠抗TFPIKPI-3/C端特异性mAbTFPI4F110、TFPI22F66和TFPI22F71的克隆和测序
如WO2012/001087中所述，将鼠TFPI抗体：TFPI4F110、TFPI22F66和TFPI22F71的重链和轻链序列克隆并测序。
使用来自Qiagen的RNeasy-MiniKit，从杂交瘤细胞中提取总RNA，并用作cDNA合成的模板。使用来自Clontech的SMART?RACEcDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。使用PhusionHotStart聚合酶(Finnzymes)和SMART?RACE试剂盒中所包括的全引物混合物(UPM)作为正向引物，通过PCR进行HC和LC序列随后的靶标扩增。具有下列序列的反向引物用于HC(VH结构域)扩增：
5’-CTTGCCATTGAGCCAGTCCTGGTGCATGATGG-3’(SEQIDNO:17)
具有下列序列的反向引物用于TFPI22F66和TFPI22F71LC(VL结构域)扩增：
5’-GTTGTTCAAGAAGCACACGACTG-3’(SEQIDNO:18)
具有下列序列的反向引物用于TFPI4F110LC扩增：
5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’(SEQIDNO:19)
PCR产物通过凝胶电泳分离，采用来自GEHealthcareBio-Sciences的GFXPCRDNA&GelBandPurificationKit提取并使用ZeroBluntTOPOPCRCloningKit和化学感受态TOP10大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen)克隆用于测序。使用来自AppliedBiosystems的AmpliTaqGoldMasterMix和M13uni/M13rev引物，在所选择的菌落中进行菌落PCR。菌落PCR清理使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)进行。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)测序引物，在德国EurofinsMWGOperon进行测序。应用VectorNTI程序，分析并注释序列。所有试剂盒和试剂均按生产商说明书使用。
对于以下各杂交瘤，鉴定单一独特的鼠κ型LC和单一独特的鼠HC、亚类IgG1：TFPI4F110、TFPI22F66和TFPI22F71。氨基酸序列在序列表中提供：不包括前导肽序列。
实施例3：小鼠抗TFPIKPI-3/C端特异性mAb22F74、41F41、41F30、22F132、22F79的克隆和测序及小鼠抗TFPIKPI-1mAb2F3、2F22、2F45、1F91和2F35的克隆和测序。
抗TFPI抗体的鼠重链和轻链序列如下克隆并测序。
使用来自Qiagen的RNeasy-MiniKit，从杂交瘤细胞中提取总RNA，并用作cDNA合成的模板。使用来自ClontechSMART?或SMARTer?RACEcDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。使用PhusionHotStart聚合酶(Finnzymes)和SMART?/SMARTer?RACE试剂盒所包括的全引物混合物(UPM)作为正向引物，通过PCR进行随后的HC和LC序列的靶标扩增。具有下列序列的反向引物用于HC(VH结构域)扩增：
5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3’(SEQIDNO:20)
具有下列序列的反向引物用于LC扩增：
5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’(SEQIDNO:21)
PCR产物通过凝胶电泳分离，采用来自GEHealthcareBio-Sciences的GFXPCRDNA&GelBandPurificationKit提取，并使用ZeroBluntTOPOPCRCloningKit和化学感受态TOP10大肠杆菌(Invitrogen)克隆用于测序。使用来自AppliedBiosystems的AmpliTaqGoldMasterMix和M13uni/M13rev引物，在所选择的菌落中进行菌落PCR。菌落PCR清理使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)进行。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)测序引物，在德国EurofinsMWGOperon进行测序。应用VectorNTI程序，分析并注释序列。所有试剂盒和试剂均按生产商说明书使用。
鉴定出各杂交瘤的单一独特鼠κ型LC和单一独特鼠IgGHC、亚类。氨基酸序列在序列表中提供：不包括前导肽序列。
实施例4：mAb2021和mAb2021变体的克隆和工程改造
该实施例描述了抗TFPI抗体：mAb2021及其变体的克隆和工程改造。
使用来自Qiagen的RNeasy-MiniKit，从M-hTFPI4F36A1B2杂交瘤细胞中提取总RNA，并用作cDNA合成的模板。使用来自Clontech的SMART?RACEcDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。使用PhusionHotStart聚合酶(Finnzymes)和SMART?RACE试剂盒中所包括的全引物混合物(UPM)作为正向引物，通过PCR进行随后HC和LC序列的靶标扩增。具有下列序列的反向引物用于HC(VH结构域)扩增：
5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3’(SEQIDNO:20)
具有下列序列的反向引物用于LC扩增：
5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’(SEQIDNO:21)
PCR产物通过凝胶电泳分离，采用来自GEHealthcareBio-Sciences的GFXPCRDNA&GelBandPurificationKit提取，并使用ZeroBluntTOPOPCRCloningKit和化学感受态TOP10大肠杆菌(Invitrogen)克隆用于测序。使用来自AppliedBiosystems的AmpliTaqGoldMasterMix和M13uni/M13rev引物，在所选择的菌落中进行菌落PCR。菌落PCR清理使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)进行。使用M13uni(-21)/M13rev(-29)或T3/T7测序引物，在德国EurofinsMWGOperon进行测序。应用VectorNTI程序，分析并注释序列。所有试剂盒和试剂均按生产商说明书使用。
鉴定出单一独特鼠κ型LC和单一独特鼠HC，亚类IgG1。
用于移植抗HzTFPI4F36A1B2的表达载体的产生
在由YvesDurocher研发的基于HEK293-6EEBNA的表达系统中，产生一系列基于CMV启动子的表达载体(pTT载体)用于抗TFPI抗体/抗体片段的瞬时表达(Durocher等,NucleicAcidResearch,2002)。除CMV启动子以外，基于pTT的载体含有pMB1起点、EBV起点和Amp抗性基因。
根据克隆的鼠抗TFPI4F36A1B2VH和VL序列，通过人种系序列中的CDR移植，设计了抗TFPI4F36的人源化形式。按照上述抗体的人源化设计，合成了用于移植的HzTFPI4F36VH和VL区的DNA序列(GENEARTAG)。用基本最小CDR移植且没有额外的回复突变，获得序列。构建体中包括相应的LC和HC种系前导肽序列以及紧接ATG起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)。
产生基于pTT的表达载体用于作为人κ/IgG4(S241P)同种型的移植的TFPI4F36抗体的瞬时表达。将241位(按照Kabat编号，相当于按EU编号系统的残基228(EdelmanG.M.等,Proc.Natl.Acad.USA63,78-85(1969))的脯氨酸突变引入IgG4铰链区以排除单体抗体片段的形成，即由一个LC和一个HC组成的“半抗体”。
将VH片段从GENEART克隆载体上切下，并克隆到含有人IgG4(S241P)CH结构域的序列的基于线性化pTT的载体中，随后转化至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。将VL片段从GENEART克隆载体中切下，克隆至含有人κCL结构域的序列的基于线性化pTT的载体中，随后转化至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。
位点定向诱变以分离mAb2021
在移植HzTFPI4F36的轻链(LC)和重链(HC)中产生一系列人-小鼠回交突变(称为回复突变)。
进行位点定向诱变以在移植HzTFPI4F36LC/HC构建体中的特定残基上引入人-小鼠回交突变(此后称为回复突变)以优化移植构建体。通过两种不同的方法引入突变：
1.使用来自Stratagene的QuikChange?Site-Directed或MultiSite-DirectedMutagenesis试剂盒以引入点突变和组合突变。试剂盒按照生产商的方案使用。
2.还采用标准两步重叠PCR方法以引入点突变和生产组合突变。
移植HzTFPI4F36的LC和HC表达质粒用作诱变的模板。所有的最终构建体的序列通过DNA测序证实。
mAb2021HC的最终序列携带具有4个回复突变的FR2区，赋予与最初的小鼠FR2和3CDR2突变体相同的构架序列，即与最初的移植序列相比共7个HC回复突变(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)(按照Kabat编号)。LC序列是移植HzTFPI4F36LC序列。CDR和构架按照Kabat定义。
最终mAb2021的HC和LC的氨基酸序列分别列为SEQIDNO:50和SEQIDNO:51。
为了改进表达收率，将HC和LC两者最初的信号肽序列(人种系序列)交换为人CD33信号肽(SP)。用含有Kozak元件(GCCGCCACC)、起始密码子和CD33信号序列(有义引物)和终止密码子和EcoRI限制位点(反义引物)的引物，通过HC或LC片段的标准PCR扩增，交换信号肽序列。将扩增的片段克隆至基于线性化pTT的载体中，并转化至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。
mAb2021的产生的较低亲和力变体的产生
在抗TFPI4F36A1B2的人源化以获得mAb2021期间，鉴定出多个较低亲和力变体。如上所述，通过位点定向诱变产生变体。mAb2007和mAb2014是两种这样的较低亲和力变体。与移植HzTFPI4F36的序列(按照Kabat编号)相比，mAb2007在VH结构域中携带单一A60P回复突变。与移植HzTFPI4F36的序列相比，mAb2014在VL结构域中携带具有4个回复突变(Y36L、K39R、Q42E、Q45K)的FR2区，赋予与最初的小鼠FR2相同的构架序列(按照Kabat编号)。mAb2014的重链相当于移植HzTFPI4F36。两个变体具有与mAb2021相比低至少1或2个数量级的TFPI结合亲和力。最初的移植HzTFPI4F36变体(mAb2000)显示与mAb2021相比低约3个数量级的TFPI结合亲和力。
按实施例6所述，产生用于mAb2021和mAb2021变体的Fab片段表达的表达载体。在铰链区内在相当于mAb2021(SEQ.ID.NO:50)的HC序列227位的半胱氨酸之后将基于IgG4的HC截短。截短留下可用于化学缀合的C端半胱氨酸。使用上述mAb2021LC载体和截短mAb2007HC载体，使mAb2007的Fab片段表达为Fab0094。使用上述mAb2014LC载体和截短mAb2014HC载体，使mAb2014的Fab片段表达为Fab0095。使用mAb2021LC载体和移植HzTFPI4F36的截短HC，使mAb2000Fab片段的表达为Fab0313。
实施例5：小鼠/人嵌合TFPI4F110、TFPI22F66、TFPI22F71TFPI2F22mAb的表达载体的产生
在由YvesDurocher研发的基于HEK293-6EEBNA的表达系统(Durocher等,NucleicAcidResearch,2002)或来自Invitrogen的EXPI293F系统中，产生一系列基于CMV启动子的表达载体(pTT载体)用于小鼠/人嵌合抗TFPI抗体/抗体片段的瞬时表达。除CMV启动子以外，基于pTT的载体含有pMB1起点、EBV起点和Amp抗性基因。通过实施例7中所述LC和HC表达载体的共转染，使包括Fab片段的抗TFPI抗体变体在HEK293-6E或EXPI293F细胞中瞬时表达。产生基于pTT的LC表达载体用于嵌合抗TFPImAb和Fab片段的瞬时表达。最初，使用特别用于N和C端序列的引物，在两步反应中使相当于TFPI4F110、TFPI22F66、TFPI22F71或TFPI2F22的VL结构域的区域从最初的TOPO测序克隆中进行PCR扩增。将起始鼠信号肽通过两步重叠PCR交换成为人CD33信号肽。初级有义引物携带CD33信号肽序列的C端部分，二级有义引物含有用于克隆目的的HindIII限制位点、紧接ATG起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)和CD33信号肽序列的N端部分。反义引物在VL/CL转换序列中含有符合读框的BsiWI限制位点。
将扩增的片段克隆至含有人κCL结构域的序列的基于线性化pTT的载体中，随后转化至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。
产生基于pTT的HC表达载体用于嵌合抗TFPImAb的瞬时表达。最初，使用特别用于N端和C端序列的引物，在两步反应中将相当于TFPI4F110、TFPI22F66、TFPI22F71或TFPI2F22的VH结构域的区域从最初的TOPO测序克隆中PCR扩增。通过两步重叠PCR将起始鼠信号肽交换为人CD33信号肽。初级有义引物携带CD33信号肽序列的C端部分，二级有义引物含有用于克隆目的HindIII限制位点、紧接ATG起始密码子上游的Kozak序列(5’-GCCGCCACC-3’)和CD33信号肽序列的N端部分。反义引物在VH/CH转换处含有符合读框的NheI限制位点。
将所产生的VH结构域PCR片段进行限制性酶消化，并克隆至含有改造的人IgG4(S241P)CH结构域的序列的基于线性化pTT的载体中，随后转化至大肠杆菌中用于选择。在IgG4铰链区中241位(按照Kabat编号，相当于按EU编号系统的残基228(EdelmanG.M.等,Proc.Natl.Acad.USA63:78-85(1969))引入脯氨酸突变以排除单体抗体片段的形成，即由一个LC和一个HC组成的“半抗体”。最终构建体的序列通过DNA测序证实。
使用TFPI4F110LC和HC载体，使嵌合形式的TFPI4F110重组表达为mAb4F110。
使用TFPI22F66LC和HC载体，使嵌合形式的TFPI22F66重组表达为mAb22F66。
使用TFPI22F71LC和HC载体，使嵌合形式的TFPI22F71重组表达为mAb22F71。
使用TFPI2F22LC和HC载体，使嵌合形式的TFPI2F22重组表达为mAb2F22。
实施例6：用于双特异性分子的Fab组分
为了产生适于Fab-Fab嵌合缀合物的Fab片段，产生用于表达截短mAb4F110HC的表达载体。在相当于人IgG4恒定区227位(按照SEQIDNO:50编号)的半胱氨酸之后的铰链区，将mAb4F110的基于IgG4的HC截短。截短留下可用于化学缀合的C端半胱氨酸。通过使用来自Stratagene的QuikChange?位点定向诱变试剂盒，通过位点定向诱变在半胱氨酸残基之后引入终止密码子，来产生截短序列。最终构建体的序列通过DNA测序证实。使用上述mAb4F110LC载体和截短HC载体(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10)，使mAb4F110的Fab片段表达为Fab0089。
对于Fab-Fab嵌合缀合物，还产生了用于表达截短的mAb2021HC的表达载体。mAb2021的克隆、人源化和表达描述于WO2010/072691，其通过引用结合到本文中。在mAb2021HC(SEQIDNO:50)的人IgG4恒定区227位的半胱氨酸之后，在铰链区将mAb2021的基于IgG4的HC截短。截短留下可用于化学缀合的C端半胱氨酸。通过使用来自Stratagene的QuikChange?位点定向诱变试剂盒，通过位点定向诱变，在半胱氨酸残基之后引入终止密码子，来产生截短序列。所有的最终构建体的序列通过DNA测序证实。使用上述mAb2021LC载体和截短HC载体(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)，使mAb2021的Fab片段表达为Fab0088。
还产生了用于表达mAb2021的较低亲和力变体的重链表达载体。mAb2021变体起源于mAb2021的人源化，并描述于WO2010/072691。在相当于mAb2021HC(SEQIDNO:50)的人IgG4恒定区227位的半胱氨酸之后，在铰链区将基于IgG4的HC截短。截短留下可用于化学缀合的C端半胱氨酸。为了装配表达载体，使用基于标准限制性内切酶的克隆，将相当于描述于实施例4的mAb2000、mAb2007和mAb2014的HC的VH结构域的区域克隆至含有截短的人IgG4CH结构域的序列的基于线性化的pTT的toolbox载体中。在上述227位的半胱氨酸之后在铰链区将基于IgG4的HC截短。最终构建体的序列通过DNA测序证实。mAb2007、mAb20014和mAb2000的较低亲和力Fab片段分别表达为Fab0094(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)、Fab0095(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)和Fab0313(SEQIDNO:58和SEQIDNO:59)。
还将用于产生Fab0094、0095、0313的截短HC表达载体的上述方法用于本发明的其它Fab片段例如Fab2F22(SEQIDNO:40和SEQIDNO:41)的产生中。
实施例7：mAb和Fab的表达和纯化
通过LC和HC表达载体的共转染，在HEK293-6E细胞或EXPI293F细胞的悬液培养物中瞬时表达包括Fab片段的抗TFPI抗体变体。下列程序描述了用于悬浮适应的HEK293-6E细胞或EXPI293F细胞的通用转染方案。
HEK293-6E方案
使HEK293-6E细胞在补充25μg/ml遗传霉素(Gibco)、0.1%v/v表面活性剂PluronicF-68(Gibco)和1%v/v青霉素-链霉素(Gibco)的FreeStyle?293表达培养基(Gibco)的悬液中生长。将细胞在37℃、8%CO2和125rpm的振荡器培养箱中在Erlenmeyer振荡器培养瓶中培养，并在0.1-1.5x106个细胞/ml之间的细胞密度下维持。
HEK293-6E转染
·用于转染的培养物的细胞密度为0.9-2.0x10 6 个细胞/ml。
·每ml细胞培养物使用0.5μgLC载体DNA+0.5μgHC载体DNA的混合物。
·将DNA在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释，30μl培养基/μgDNA，混合，并在室温(23-25℃)下孵育5分钟。
·293Fectin?(Invitrogen)以1μl/μgDNA的浓度用作转染试剂。
·将293Fectin?在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释30X，混合，并在室温(23-25℃)下孵育5分钟。
·将DNA和293Fectin溶液混合，置于室温(23-25℃)下孵育25分钟。
·然后将DNA-293Fectin混合物直接加入细胞培养物中。
·将转染的细胞培养物转移到在37℃、8%CO2和125rpm下的振荡器培养箱中。
·转染后3-6天，通过离心收获细胞培养上清液，接着通过0.22μmPES过滤器(Corning)过滤。
·使用FortéBioOctet系统和A蛋白生物传感器或定量A蛋白HPLC，直接在澄清的细胞培养上清液中，通过BiolayerInterferometry进行抗体产生的定量分析。
EXPI293F方案
使EXPI293F细胞在Expi293?表达培养基(LifeTechnologies)的悬液中生长。在36.5℃、8%CO2和85-125rpm下的定轨振荡器培养箱中将细胞在Erlenmeyer振荡器培养瓶中培养，并维持0.4-4x106个细胞/ml之间的细胞密度。
EXPI293F转染
1)最初制备个别稀释的DNA和转染试剂。
a)每ml细胞培养物使用共1μg的载体DNA(0.5ugLC载体和0.5ugHC载体)。在Opti-MEM培养基(Gibco)中稀释DNA，50μl培养基/μgDNA，混合，并在室温(23-25℃)下孵育5分钟。
b)以2.7μl/μgDNA的浓度使用Expifectamin?293(LifeTechnologies)作为转染试剂。在Opti-MEM培养基(Gibco)中将Expifectamin?溶液稀释18.5X，混合，并在室温(23-25℃)下孵育5分钟。
2)将DNA和Expifectamin?293稀释液混合，置于室温(23-25℃)下孵育10分钟。
3)将DNA-Expifectamin?293混合物直接加入EXPI293F细胞培养物中。
a)在转染时，EXPI293F培养物的细胞密度应为2.8-3.2x106个细胞/ml。
4)将转染的细胞培养物转移到36.5℃、8%CO2和85-125rpm下的定轨振荡器培养箱中。
5)转染后18小时，加入5ulExpifectamin?293Enhancer1/ml培养物和50ulExpifectamin?293Enhancer2/ml培养物，将培养物放回36.5℃、8%CO2和85-125rpm下的定轨振荡器培养箱中。
6)转染后5天，通过离心收获细胞培养上清液，接着通过0.22μmPES过滤器单元(Corning)过滤。
通用纯化方案
按照生产商说明书，使用来自GEHealthcare的MAbelectSuRe树脂，通过标准亲和色谱法纯化mAb变体。使纯化的抗体缓冲液交换为PBS缓冲缓冲液pH7.2。
使用由GEHealthcare研发的ΚSelect树脂，通过标准亲和色谱法纯化Fab片段。使纯化的Fab片段缓冲液交换成PBS缓冲液pH7.2。
质量评价和浓度测定通过SEC-HPLC进行。
实施例8：Fab0088和Fab0089与1,8-N,N’-双(马来酰亚胺)-3,6-二氧杂辛烷的缀合(查阅号9000)
将含Fab0088(MAb2021的Fab片段)(5mg，3.92mg/ml，0.104mmol)的PBS缓冲液与三(3-磺酸酯基苯基)膦钠盐水合物(3.2ml，10mg/ml，工业级，(AlfaAesar#39538，CAS：63995-70-0)的溶液混合。使反应置于环境温度下1小时和30分钟。使用AmiconUltra离心过滤装置(5kDaMWCO，Millipore)，将混合物经缓冲液交换成50mM乙酸盐缓冲液(用氢氧化钠调节稀乙酸至pH5；缓冲液A)。使蛋白质固定在预处理的HiTrapSPHP柱(GEHealthcare)上，并进行梯度洗脱，其中缓冲液B是含有300mM氯化钠的缓冲液A。
将洗脱的蛋白质(3ml，0.6mg)与1,8-N,N’-双(马来酰亚胺)-3,6-二氧杂辛烷(ThermoScientific/Pierce，产品号22336；6.2mg的2ml缓冲液中)的溶液混合。将所得混合物在环境温度下孵育2.5小时。使用AmiconUltra离心过滤装置(5kDaMWCO，Millipore)，将混合物经缓冲液交换成50mM乙酸盐缓冲液(用氢氧化钠调节稀乙酸至pH5；缓冲液A)。使蛋白质固定在预处理的HiTrapSPHP柱(GEHealthcare)上，并进行梯度洗脱，其中缓冲液B是含有300mM氯化钠的缓冲液A。
将含Fab0089(mAb4F110的Fab片段)(5mg，3.58mg/ml，0.105mmol)的PBS缓冲液与三(3-磺酸酯基苯基)膦钠盐水合物(3.2ml，10mg/ml，工业级，(AlfaAesar#39538，CAS：63995-70-0)的溶液混合。
将反应物置于环境温度下2小时和15分钟。使用AmiconUltra离心过滤装置(5kDaMWCO，Millipore)，将混合物经缓冲液交换成50mM乙酸盐缓冲液(用氢氧化钠调节稀乙酸至pH5；缓冲液A)。使蛋白质固定在预处理的HiTrapSPHP柱(GEHealthcare)上，并进行梯度洗脱，其中缓冲液B是含有300mM氯化钠的缓冲液A。
将两种溶液(还原并与接头偶联的Fab0088，4ml；和还原的Fab0089，4ml)混合。将所得混合物置于环境温度下过夜。使用?ktaFPLC仪器使溶液浓缩，加载到Superdex20010/300GL柱(GEHealthcare)上，并在缓冲液(9.7mMHistidin、2.3mMCaCl2、308mMNaCl、8.8mM蔗糖、0.01%Tween80，pH7.0)中洗脱。通过SDS-PAGE分析、分析型大小排阻色谱法和Edman序列测定，对分离的流分进行分析。
实施例9：1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷的制备
将N-马来酰基-β-丙氨酸(1.26g，7.4mmol)溶于DCM(20ml)中。加入N,N’-二异丙基碳二亚胺(1.15ml，7.4mmol)。搅拌混合物30分钟。在60分钟时间内，将含1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷的DCM溶液滴加到搅拌的溶液中。搅拌混合物1小时。将溶液真空浓缩至干。将粗制固体悬浮于存在一些乙酸的水/MeCN(2:1)。使用RPHPLC(0-50%含MeCN的水溶液，0.1%TFA，C18柱)纯化混合物。产物用LCMS(ESI)：451([M+H]+:)和NMR表征。
实施例10：Fab0088和Fab0089与1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷的缀合(查阅号9002)
对Fab0089(5mg，3.58mg/ml，1.42ml，104nmol)进行缓冲液交换至25mM磷酸钠缓冲液(pH7)中。最终体积为2000微升(50微摩尔，2.5mg/ml)。加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度(将二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐，CAS：151888-20-9，Sigma-Aldrich；2.24mg，4.19微摩尔)溶于1ml25mM磷酸钠缓冲液(pH7)中，得到4.19mM的浓度(稀释因子：20.9)；将95微升加入蛋白质溶液中。(2000微升总体积))。
将1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷(5mg，11微摩尔)加入溶液中。将混合物在环境温度下孵育45分钟。
样品用5mM乙酸盐缓冲液(pH5)稀释。将样品加载到HiTrapSPHP柱(1ml)中。柱用5mM乙酸盐和25mM乙酸盐缓冲液洗涤。化合物用含有1MNaCl的25mM乙酸盐缓冲液洗脱。
对Fab0088(5mg，3.92mg/ml，1.27ml，104nmol)进行缓冲液交换至25mM磷酸钠缓冲液(pH7)中。最终体积为2000微升(50微摩尔，2.5mg/ml)。加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度(将二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐，CAS：151888-20-9，Sigma-Aldrich；2.24mg，4.19微摩尔)溶于1ml25mM磷酸钠缓冲液(pH7)，得到4.19mM的浓度(稀释因子：20.9)；将95微升加入蛋白质溶液中(2000微升总体积))。
将两种蛋白质溶液混合，进行缓冲液交换至25mM乙酸盐缓冲液(pH5)中，并浓缩至一半体积。将混合物在环境温度下孵育3小时。将溶液加载至已在10mML-组氨酸、150mMNaCl(pH7)中预处理的Superdex20010/300GL柱中。化合物使用所述缓冲液洗脱。合并选定的流分，采用SDS-PAGE分析、LCMS(m/z：96144，[M-NH3+H]+)、反相HPLC和Edman序列测定进行分析。该缀合物命名为9002。
实施例11：Fab2F22和Fab0089与1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷的缀合(查阅号9028)
以与上述实施例完全类似的方法，使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，对Fab2F22(3.9mg)和Fab0089(8.0mg)进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水中。调节两种蛋白质的浓度至50微摩尔。
加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度。将所得混合物在室温下孵育过夜。对Fab2F22进行缓冲液交换至15mM乙酸钠缓冲液、1M氯化钠(pH5.0)中。
对Fab0089进行缓冲液交换至15mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中。将1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷(刮勺尖)加入溶液中。将所得混合物置于室温下30分钟。将混合物加载到预处理的HiTrapSPHP柱(GEHealthcare，1ml)中。固定化蛋白质用15mM乙酸钠缓冲液(pH4.5、25CV)洗涤。用15mM乙酸钠缓冲液、1MNaCl(pH5.0)将蛋白质从柱中洗脱，并与ab2F22混合。将所得混合物在AmiconUltra离心旋转式过滤器(MWCO10kDa)中浓缩。最终体积：400微升。将混合物孵育20小时。将样品注入已在5mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)中预处理的凝胶渗透柱(HiLoad16/600Superdex200柱，GEHeathcare)中。使用1ml/分钟流速的水中的5mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)，将样品从柱中洗脱出。采用SDS-PAGE分析，鉴定含有所需缀合物的流分。使用AmiconUltra离心装置(MWCO10kDa)，将合并的流分浓缩至1000微升的体积。LCMS(m/z：95629，[M+H]+)。该缀合物命名为9028。
实施例12：Fab0094和Fab0089与1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷的缀合(查阅号9004)
以与上述实施例完全类似的方法，形成Fab0094和Fab0089的缀合物。LCMS(m/z：95994，[M+H]+)。该缀合物命名为9004。
实施例13：Fab0095和Fab0089与1,16-N,N’-双(马来酰亚胺)-4,13-二氮杂-7,10-二氧杂-3,14-二氧代十六烷的缀合(查阅号9005)
以与上述实施例完全类似的方法，形成与Fab0095和Fab0089的缀合物。LCMS(m/z：95928，[M-NH3+H]+)。该缀合物命名为9005。
实施例14：双(溴乙酰基)乙二胺的制备
将溴乙酸(2.1g，15mmol)溶于DCM(40ml)中。在15分钟时间内，将溶液滴加到PS树脂(N-环己基碳二亚胺-N'-甲基聚苯乙烯；Novabiochem，产品号：8.55029.0025；2.3mmol/g；10g)上的固定化碳二亚胺的悬浮液中。在20分钟的时间内，将二胺(450mg，7.5mmol)的DCM(20ml)溶液滴加到搅拌的溶液中。搅拌混合物1小时。将溶液过滤，并真空浓缩至干。LCMS(m/z：302.9，[M+H]+)。
实施例15：使用双(溴乙酰基)乙二胺的Fab0088和Fab0089的缀合(查阅号9029)
使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，对Fab0088和Fab0089进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水中。调节两种蛋白质的浓度至50微摩尔。加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度。将所得混合物在室温下孵育过夜。
对该蛋白质进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl，200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐(pH8.5)中。将Fab0089(60mg，10mg/ml)与双(溴乙酰基)乙二胺(37mg)混合。将混合物在环境温度下孵育30分钟。LCMS(m/z：47858[M-NH3+H]+)。将样品用15mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释(约10倍)。将样品加载到预处理的HiTrapSPHP柱(5ml)中。柱用15mM乙酸盐缓冲液洗涤。化合物用20mM三乙胺和1MNaCl(pH8.5)的水性缓冲液洗脱。使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，将两种蛋白质溶液混合、浓缩/进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl(pH8.5)、200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐(pH8.5)中。将混合物在环境温度下孵育24小时。将溶液加载到已在15mMHEPES，150mMNaCl(pH7.3)(HiLoad26/60Superdex200柱，GEHeathcare)中预处理的Superdex20026/60GL柱中。使用2.5ml/分钟流速的水中的15mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)，将样品从柱中洗脱出。采用SDS-PAGE分析，鉴定含有所需缀合物的流分。使用AmiconUltra离心装置(MWCO10kDa)，将合并的流分浓缩至1000微升的体积。LCMS(m/z：95834，[M-NH3+H]+)。
实施例16：使用双(溴乙酰基)乙二胺的Fab0094和Fab0089的缀合(查阅号9030)
使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，对Fab0094和Fab0089进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水中。调节两种蛋白质的浓度至50微摩尔。加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度。将所得混合物在室温下孵育过夜。对所述蛋白质进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl、200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐(pH8.5)中。
将Fab0089(60mg，10mg/ml)与双(溴乙酰基)乙二胺(37mg)混合。将混合物在环境温度下孵育30分钟。LCMS(m/z：47858[M-NH3+H]+)。
将样品用15mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释(约10倍)。将样品加载到预处理的HiTrapSPHP柱(5ml)中。柱用15mM乙酸盐缓冲液洗涤。化合物用20mM三乙胺和1MNaCl(pH8.5)的水性缓冲液洗脱。
使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，将两种蛋白质溶液混合、浓缩/进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl(pH8.5)、200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐和200微摩尔碘化钠(pH8.5)中。将混合物在环境温度下孵育24小时。将溶液加载到已在15mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)(HiLoad26/60Superdex200柱，GEHeathcare)中预处理的Superdex20026/60GL柱中。使用2.5ml/分钟流速的水中的15mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)，将样品从柱中洗脱出。采用SDS-PAGE分析，鉴定含有所需缀合物的流分。使用AmiconUltra离心装置(MWCO10kDa)，将合并的流分浓缩至1000微升的体积。LCMS(m/z：95664，[M-NH3+H]+)。该化合物命名为9030。
实施例17：使用双(溴乙酰基)乙二胺的Fab0313和Fab0089的缀合(查阅号9031)
使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，对Fab0094和Fab0089进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水中。调节两种蛋白质的浓度至50微摩尔。加入磷酸盐缓冲剂溶液中的二水合双(对-磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐至200微摩尔的终浓度。将所得混合物在室温下孵育过夜。
对该蛋白质进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl、200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐(pH8.5)中。
将Fab0089(60mg，10mg/ml)与双(溴乙酰基)乙二胺(37mg)混合。将混合物在环境温度下孵育30分钟。LCMS(m/z：47858[M-NH3+H]+)。
将样品用15mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释(约10倍)。将样品加载到预处理的HiTrapSPHP柱(5ml)中。柱用15mM乙酸盐缓冲液洗涤。化合物用20mM三乙胺和1MNaCl(pH8.5)的水性缓冲液洗脱。
使用AmiconUltra离心装置(MilliporeCorp.，10kDaMWCO)，将两种蛋白质溶液混合、浓缩/进行缓冲液交换至20mM三乙胺、1MNaCl(pH8.5)、200微摩尔二水合双(对磺酸酯基苯基)苯基膦二钾盐和200微摩尔碘化钠(pH8.5)中。将混合物在环境温度下孵育24小时。将溶液加载到已在15mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)(HiLoad26/60Superdex200柱，GEHeathcare)中预处理的Superdex20026/60GL柱中。使用2.5ml/分钟流速的水中的15mMHEPES、150mMNaCl(pH7.3)，将样品从柱中洗脱出。采用SDS-PAGE分析，鉴定含有所需缀合物的流分。使用AmiconUltra离心装置(MWCO10kDa)，将合并的流分浓缩至1000微升的体积。LCMS(m/z：95638，[M-NH3+H]+)。
实施例18：凝血酶产生测定法
在补充10μMPS/PC：磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱25/75%的正常人血浆(NHP，HemosILCalibration血浆)中，研究了抗体对凝血酶产生的作用。通过再钙化和加入Innovin?(1.0pM)引发凝血。通过加入100μg/ml绵羊抗人FVIII抗体(可市购获得)，获得A型血友病样血浆。
持续跟踪得自Bachem(Bubendorf，Switzerland)的荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl(I-1140)的转化，评价凝血酶活性。在微量滴定板FluorskanAscent荧光计(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，以分别设置为368和460nm的激发和发射波长测量荧光。使用校准物以供计算所形成的凝血酶的量，并校正所获得的内滤效应和荧光底物消耗的相对荧光单位。另外，减去凝血酶-α2-巨球蛋白复合物对底物转化的贡献。借助由SynapseBV(Maastricht，Netherlands)提供的自动校正凝血酶曲线法(calibratedautomatedthrombogram，CAT)计算机软件，自动进行这些校正。采用生成凝血酶产生曲线的数据的一阶导数，允许计算i)延迟时间，ii)曲线下总面积，内源性凝血酶潜力(endogenousthrombinpotential，ETP)，iii)凝血酶峰高(Peak)，iv)至峰值时间(ttPeak)和v)凝血酶产生的最大速率(Rate)。
实施例19：结合相互作用分析
在BiacoreT200仪器中，通过表面等离振子共振获得结合相互作用分析。使用在BiacoreT-200控制软件(GEHealthcare)内可获得的胺偶联方案和AmineCouplingKit(GEHealthcare)内提供的试剂，以10000响应单位(RU)，将人FabBinder(HumanFabCaptureKit,GEHealthcare)固定在系列SCM4传感器芯片(GEHealthcare)上的流动室1-4中。在流动室2、3或4中按固定浓度俘获有关的Fab片段或Fab-Fab缀合物。通过在运行缓冲液(10mMHepes(pH7.4)、300mMNaCl、5mMCaCl2、0.05%表面活性剂P20、1mg/mlBSA)中稀释TFPI，来测试不同浓度的TFPI。采用300秒钟的接触时间接着600秒钟的解离时间，以50μl/分钟流速测定各样品。还测定了缓冲液空白。以50μl/分钟流速、各30秒钟的两个循环，用10mM甘氨酸pH2.1使传感器表面再生。
应用BiacoreT200Evaluation软件分析数据。采用TFPI与Fab变体或目标Fab-Fab缀合物的1:1相互作用，获得结合常数(kon、koff、KD)的测定结果。
实施例20：人A型血友病血浆中抗TFPI抗体对组织因子诱导的凝血酶产生的作用
可通过靶向KPI-3区中的表位的抗体与靶向TFPI的KPI-1/KPI-2区中的表位的抗体的组合或融合，获得人A型血友病血浆中抗TFPI抗体对组织因子诱导的凝血酶产生的协同效应。
按照实施例18，在凝血酶产生测定法中研究了抗体对凝血酶产生的作用。
图1(曲线a)显示用NHP的凝血酶产生曲线。将100μg/ml绵羊抗人FVIII抗体加入NHP中以模拟A型血友病样病况(曲线b)极大地降低凝血酶产生。NHP含有约1.6nMTFPI，其中仅约0.2nM作为全长TFPIα存在。将多种抗TFPI抗体，包括mAb2021(另公开于WO2010/072691)加入FVIII中和的血浆中有效地重建近似正常的凝血酶产生曲线。然而，临床前和临床研究显示抗体或适体在体内靶向TFPI引起TFPI血浆水平显著升高。因此引人关注的是研究在升高的TFPI浓度的条件下TFPI靶向的作用。图1显示将20nM全长TFPIα加入FVIII中和的血浆中完全阻止了可测量的凝血酶产生(曲线c)，且加入200nM的针对KPI-2的高亲和力抗体(mAb2021)不能有效地消除TFPI抑制并在这些条件下建立稳固的凝血酶产生(曲线d)。加入200nM的针对KPI-3的高亲和力抗体(mAb4F110)在20nMTFPI存在下完全不能够建立显著的凝血酶产生(曲线e)。然而，出乎意料的是，通过建立明显大于由各抗体单独产生的凝血酶产生总和的稳健的凝血酶产生(曲线f)以及具有与在NHP中产生的凝血酶产生相同的数量级(曲线a)，100nMmAb2021和100nMmAb4F110的组合显示协同效应。
图1中的数据显示针对TFPI的KPI-3的抗体针对KPI-2的抗体的组合在升高的TFPI浓度下，在逆转TFPI抑制中协同起作用。从图1中的曲线推导的凝血酶峰高(Peak)的参数列于表1中。
表1.抗TFPIKPI-2和抗TFPIKPI-3单特异性抗体的组合在具有20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中对凝血酶产生的作用
之后，当与mAb2021组合时，针对对凝血酶产生的可能的协同效应，对多种针对TFPI的C端区的抗体进行了评价。在通过将20nM人TFPIα加入FVIII中和的血浆中获得的升高的TFPI浓度的条件下，C端抗体无一靠自身能够防止被TFPI抑制，并促进可测量的凝血酶产生(数据未显示)。然而，表2中的数据显示多种抗TFPIKPI-3/C端抗体(标为*)与mAb2021一起协同起作用，在A型血友病样病况下随着TFPI浓度升高在血浆中产生明显的凝血酶峰值。从凝血酶产生曲线推导的凝血酶峰高列于表2中。
表2.抗TFPIKPI-2和抗TFPIKPI-3单特异性TFPI抗体的组合对含20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中凝血酶产生的作用
当与KPI-3结构域特异性mAb4F110组合时，针对对凝血酶产生的可能的协同效应，对多种针对TFPI的KPI-1结构域的抗体进行了评价。表3和表4显示在含所添加的20nM人TFPIα的FVIII中和的血浆(HAP)中KPI-1结构域特异性mAb4903(AmericanDiagnostica，目录号ADG4903)、1F91、2F3、2F22、2F35和2F45单独和与mAb4F110组合对延迟时间、至峰值的时间和峰值的作用的数据。
只有一些KPI-1特异性抗体靠自身能够防止被TFPI抑制并促进可测量的凝血酶产生。然而，表4中的数据显示多种KPI-1结构域特异性抗体(标为*)与mAb4F110一起协同起作用，在A型血友病样病况下随TFPI浓度升高在血浆中产生明显的凝血酶峰值。凝血酶峰高自凝血酶产生曲线推导。
表3.含20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-1和抗TFPIKPI-3单特异性TFPI抗体的组合对凝血酶产生的作用
表4.含20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-1和抗TFPIKPI-3单特异性抗体的组合对凝血酶产生的作用
实施例21：人A型血友病血浆中抗TFPIFab片段缀合物对组织因子诱导的凝血酶产生的协同效应
在按照实施例19测定对人TFPI的结合亲和力的结合相互作用分析测定法中，对按照实施例6、7、10、12、13和17制备的Fab片段和Fab-Fab缀合物进行了分析。
表5显示5种Fab片段的平衡解离常数(KD)：
Fab0088(KPI-2)SEQIDNO:3+4
Fab0094(KPI-2)SEQIDNO:5+6
Fab0095(KPI-2)SEQIDNO:7+8
Fab0313(KPI-2)SEQIDNO:58+59
Fab0089(KPI-3)SEQIDNO:9+10
和4种KPI-2/KPI-3结构域特异性Fab-Fab缀合物(各个Fab的SEQIDNO与上文相同)：
Fab0088-Fab0089(亦称为9002；KPI-2/KPI-3)
Fab0094-Fab0089(亦称为9004；KPI-2/KPI-3)
Fab0095-Fab0089(亦称为9005；KPI-2/KPI-3)
Fab0313-Fab0089(亦称为9031；KPI-2/KPI-3)
表5.抗TFPIKPI-2和抗TFPIKPI-3Fab片段和Fab-Fab缀合物与人TFPIα(TFPIα)的结合
配体 靶标 ka (1/Ms) kd (1/s) 亲和力KD (M)
Fab 0088) TFPIα 1.7E+06 1.0E-04 6.0E-11
Fab 0089 TFPIα 5.0E+06 5.7E-04 1.1E-10
Fab 0094 TFPIα 1.5E+05 6.6E-04 4.4E-09
Fab 0095 TFPIα 3.9E+06 3.0E-03 7.8E-10
Fab 0313 TFPIα 4.9E+04 2.1E-03 4.2E-08
Fab 0088-Fab 0089 (9002) TFPIα 7.1E+06 3.8E-05 5.3E-12
Fab 0094-Fab 0089 (9004) TFPIα 6.2E+06 2.2E-04 3.6E-11
Fab 0095-Fab 0089 (9005) TFPIα 6.1E+06 2.3E-04 3.8E-11
Fab 0313-FAb 0089 (9031) TFPIα 4.0E+07 6.7E-03 1.7E-10
针对对凝血酶产生的可能作用(按照实施例18测量)，对针对TFPI的KPI-2结构域的Fab片段进行了评价。表6显示在含内源TFPI水平的FVIII中和的NHP(HAP)中KPI-2结构域特异性Fab片段0088、0094和0095和mAb2021对凝血酶峰值的作用的数据。Fab片段0088、0094和0095是mAb2021的变体。表7显示其中将2nM全长TFPIα加入FVIII中和的NHP(HAP)中的类似实验的结果。凝血酶峰高自凝血酶产生曲线推导。
表6.含内源TFPI水平的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-2特异性Fab片段或mAb2021对凝血酶产生的作用
表7.含2nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-2特异性Fab片段或mAb2021对凝血酶产生的作用
按照实施例6、7、10(9002)和12(9004)制备靶向KPI-2和KPI-3结构域的Fab-Fab缀合物，并与相应的非缀合Fab片段进行比较，以测定对凝血酶产生的可能作用，按照实施例18测量。表8A和8B显示含20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中KPI-2+KPI-3结构域特异性Fab0088-Fab0089(命名为9002)和Fab0094-Fab0089(命名为9004)缀合物以及非缀合形式的Fab片段对凝血酶产生的作用的数据。
因此明确得出，除与抗体或Fab片段组合获得的协同效应以外，Fab-Fab缀合物显示当与相同浓度的组合(即非缀合)的Fab片段相比时对凝血酶产生的亲合力作用。凝血酶峰高自凝血酶产生曲线推导。
表8A.含20nMTFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-2和抗TFPIKPI-3特异性Fab片段或Fab-Fab缀合物对凝血酶产生的作用
表8B.含20nMTFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中抗TFPIKPI-2和抗TFPIKPI-3特异性Fab片段或Fab-Fab缀合物对凝血酶产生(至峰值的时间)的作用
因此明确得出，Fab-Fab缀合物显示对与TFPI结合的亲合力作用，导致凝血酶产生的协同增加，其高于通过将两种抗体或两种非缀合的Fab片段组合获得的作用。
按照实施例6、7和11(9028)制备靶向KPI-1和KPI-3结构域的Fab片段和Fab-Fab缀合物，并在按照实施例19测定对人TFPI的结合亲和力的结合相互作用分析测定法中进行分析。表9显示一个Fab片段：
Fab2F22(KPI-1)(SEQIDNO:40和41)
和一个KPI-1/KPI-3结构域特异性Fab-Fab缀合物(各个Fab的SEQIDNO与上文相同)：
Fab2F22-Fab0089(亦称为9028；KPI-1/KPI-3)
的平衡解离常数(KD)。
表9.抗TFPIKPI-1Fab片段2F22和抗TFPIKPI-1和抗TFPIKPI-3Fab-Fab缀合物与人TFPIα(TFPIα)的结合。
配体 靶 ka (1/Ms) kd (1/s) 亲和力KD (M)
Fab 2F22 TFPIα 1.2E+05 2.1E-04 1.7E-09
Fab 2F22-Fab 0089 (9028) TFPIα 2.7E+06 2.0E-04 7.5E-11
将靶向KPI-1和KPI-3结构域的Fab-Fab缀合物与相应的非缀合的Fab片段进行比较，以测定对按照实施例18测量的凝血酶产生的可能作用。表10显示含20nM全长TFPIα的FVIII中和的NHP(HAP)中KPI-1/KPI-3结构域特异性Fab2F22-Fab0089缀合物以及非缀合物形式的Fab片段对凝血酶产生的作用的数据。
实施例22：与抗TFPImAb2F22的Fab片段复合的可溶性TFPIKPI-1的晶体结构
应用X射线晶体学，高分辨率地测定与抗TFPI2F22单克隆抗体的Fab片段(SEQIDNO:SEQ52和53)复合的可溶性人TFPIKunitz型蛋白酶抑制物结构域1(KPI-1)的3D结构，包括TFPIKPI-1之前的N端部分(TFPI1-79，按照SEQIDNO:1编号)。结果证实抗体能够结合TFPI的KPI-1和N端之前的部分。所得的人TFPI表位残基包含：Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71和Met75(SEQIDNO:1)。
材料与方法
为了获得适于晶体学的Fab片段，产生用于表达截短的mAb2F22HC的基于pTT的表达载体。通过限制性内切酶消化将VH片段从mAb2F22HC表达载体上切下，并克隆至含有截短的人IgG4恒定区的序列的基于线性pTT的toolbox载体中。在相当于在延长的Fab2F22HC的序列(化学偶联的Fab，SEQIDNO:40)中的222位的赖氨酸之后在铰链区中截短基于IgG4的HC。随后将克隆反应转至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。mAb2F22片段的Fab片段在EXPI293F细胞中表达为Fab0296(SEQIDNO:52和53)，并按照实施例7所述，使用ΚSelect树脂通过标准亲和色谱法纯化。
将包括人TFPI的N端部分及另外N端连接的GSSGSSG标签(SEQIDNO:62)在内的可溶性人TFPIKPI-1和Fab0296(其由相当于SEQIDNO:53的轻链和相当于SEQIDNO:52的重链片段组成)两者在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(4片在2升的水中，GIBCO目录号18912-014InvitrogenCorporation)中与略过量(1.1:1)的TFPI物类混合。然后使用具有10,000分子量截止值的AmiconUltra-4离心过滤器，使复合物浓缩至约10.0mg/ml。使用来自TTPLabTechno:4150-05800的96孔TTPIQ板和100μl沉淀剂溶液/孔，通过坐滴(sittingdrop)技术使晶体生长。沉淀剂溶液含有20%w/vPEG3350、200mM甲酸钾，并以3:1的比率与蛋白质溶液混合。总的液滴大小为200nl，晶体在几天后出现。通过将1μl含有75%沉淀剂溶液和25%甘油的冷冻溶液混合物转移到含有晶体的液滴中，来制备晶体用于低温冷冻。允许浸透约2分钟。然后掏出晶体，在液N2中速冻，并在数据采集期间，通过致冷N2气流保持在100K的温度下。在MAX-lab，Lund，Sweden，以束线BL911-3收集晶体学数据至1.65?。通过XDS软件包进行空间群测定、数据的积分和标定[Kabsch,W.,J.Appl.Crystallogr.,(1993),第26卷,第795-800页]。测定空间群为C2，测定用于同步加速数据的晶胞参数分别为89.010、66.660、106.110?，其β角为111.18°。至1.65?分辨率的R-sym为8.4%，完整性为99.5%。唯一反射(uniquereflection)的强度/∑(强度)的均值在约1.8?分辨率下等于2.0。
使用具有蛋白质数据库(PDB)检索号1NGZ的Fab分子的坐标[Yin,J.等,ProcNatlAcadSciUSA.2003.Feb.4,(100),第100卷第856-861页]，将分子置换(MR)用于结构测定[Berman,H.M.等,NucleicAcidsRes.,(2000),第28卷,第235-242页]。将Fab分子分成两个结构域，可变结构域和恒定结构域，其每一个在MR计算中用作搜索模型。应用CCP4包CCP4[CollaborativeComputationalProject,N.,Actacrystallographica.SectionD,Biologicalcrystallography,(1994),第50卷,第760-763页]的Molrep软件[Vagin,A.等,J.Appl.Crystallogr.,(1997),第30卷,第1022-1025页]，找出恒定和可变Fab结构域的位置。在MR步骤中未发现KPI-1结构域，然而，不同的电子密度图表明在该阶段KPI-1结构域分子的大致位置。在通过CCP4软件包的DM软件的电子密度改进后，接着应用ARP-wARP软件[Langer,G.等,NatProtoc,(2008),第3卷,第1171-1179页][Murshudov,G.N.等,ActaCrystallographicaSectionDBiologicalCrystallography,(2011),第67卷,第355-367页]进行自动模型建立和相改进，得到Fab0296分子和KPI-1结构域结构两者的几乎完整的结构和在KPI-1结构域之前的N端的部分。对于TFPI(SEQIDNO:1)，来自15-77的残基包括在X射线模型中，其除KPI-1以外，还包括一些KPI-1的N端残基(残基26-79)。对于Fab0296片段，观察到轻链残基1-212和重链残基1-221。进入应用Coot软件程序[Emsley,P.等,ActaCrystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.,(2004),第60卷,第2126-2132页]的电子密度图的计算机图形检查、模型校正和建立的程序，接着应用CCP4软件包的软件程序Refmac5[Murshudov,G.N.等,ActaCrystallographicaSectionDBiologicalCrystallography,(2011),第67卷,第355-367页]的晶体学精修。使该程序循环直到无可再对该模型进行显著改进。至1.65?分辨率的所有数据最终的R和自由R(R-free)分别为0.192和0.220。
结果
通过CCP4程序套[CollaborativeComputationalProject,N.,Actacrystallographica.SectionD,Biologicalcrystallography,(1994),第50卷,第760-763页]的软件程序Areaimol[Lee,B.等,JMolBiol,(1971),第55卷55,第379-400页][Saff,E.B.等,MathIntell,(1997),第19卷,第5-11页]计算排除在成对相互作用以外的平均面积，得到晶体结构1195?2的可溶性人TFPI片段/抗TFPIFab0296分子复合物。
使用在抗TFPIFab0296和TFPI片段分子之间4.0?的截止值距离，通过运行CCP4程序套的Contacts软件[Bailey,S.,ActaCrystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.,(1994),第50卷,第760-763页]，鉴定出TFPIKPI-1(包括晶体结构中观察到的TFPI的N端部分(SEQIDNO:62))和抗TFPIFab0296(SEQIDNO:52和53)之间的直接接触。来自可溶性TFPI片段/抗TFPIFab0296复合物晶体结构的结构见表11。发现包括TFPIN端、抗TFPI2F22的表位的所得TFPIKPI-1包含TFPI(SEQIDNO:1)的下列残基的一个或多个：Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71和Met75。根据距离、电荷间相互作用、氢键、极性和疏水相互作用和低溶剂可及性评价，下面的残基似乎是该表位特别重要的残基：Arg41、Arg65和Glu67。
因此，抗TFPI2F22TFPI表位包含先于KPI-1的残基，包括短的N端α-螺旋、KPI-1的β链1之前的环中的残基和α链1开始时的残基。它还包括β链2结束时的残基和在β链2和KPI-1的C端α-螺旋之间的环中的残基和KPI-1的C端α-螺旋内的残基。
TFPIKPI-1的抗TFPI2F22抗原互补位包括重(H)链(SEQIDNO:52，表11)的残基Val2、Phe27、Tyr32、Trp52、Arg53、Gly54、Gly55、Ser56、Ile57、Asp58、Tyr59、Ala61、Met64、Lys97、Ser99、His100、Asn102、Tyr103、Val104、Gly105和Tyr106及轻(L)链(SEQIDNO:53、表11)的残基Pro31、Ala32、Tyr49、Ser50、Asn53、Tyr55、Thr56、Tyr91、Thr92、Ser93和Tyr94。
表11.相互作用
对于第一晶体学依赖性复合物，TFPIKPI-1，链K，(SEQIDNO:1)与抗TFPIFab0296的重链(链H)(SEQIDNO:52)和抗TFPIFab0296的轻链(链L)(SEQIDNO:53)的相互作用。使用4.0?的距离截止值。通过CCP4套件的CONTACT计算机软件程序[CollaborativeComputationalProject,N.,Actacrystallographica.SectionD,Biologicalcrystallography,(1994),第50卷,第760-763页]鉴定出接触。在最后一栏中，“***”表明如通过CONTACT计算的在这种接触(距离<3.3?)下氢键的可能性高，“*”表明可能性弱(距离>3.3?)。空白表明该程序认为无氢键可能性。氢键在供体和接纳体之间是特定的，通常是强的，且容易鉴定。
这些结果表明，抗TFPIFab0296与TFPIKPI-1和先于N端的部分特异性结合。
这些结果显示，抗TFPIFab0296与TFPIKPI-1和先于N端的部分特异性结合。
实施例23：抗体与细胞表面缔合的TFPI结合
采用流式细胞术，体外研究了抗TFPI抗体、Fab片段或Fab-Fab缀合物结合与内皮细胞表面缔合的TFPI的能力。将人脐静脉细胞系EA.hy926细胞(ATCC)在测定缓冲液(补充2%FCS的PBS)中与不同浓度的抗TFPImAb2021、Fab0088、Fab0094、Fab0095或Fab0313或Fab0088-Fab0089缀合物9002或Fab0094-Fab0089缀合物9004在冰上一起孵育30分钟。将细胞用PBS洗涤，随后在测定缓冲液中与APC缀合的第二抗体(Allophycocyanin-AffiniPureF(ab')2片段驴抗人IgG(H+L)，JacksonImmunoResearch，目录号709-136-149)一起在冰上孵育30分钟。将细胞用PBS洗涤，并在BDLSRFortessa流式细胞仪中分析。在不同抗体浓度下使用荧光强度中位数绘出结合图，计算半最大结合值(EC50)。
表12所列数据清楚显示KPI-2TFPIFab0088、Fab0094和Fab0313(所有Fab片段来源于mAb2021)以类似亲和力与EA.hy926细胞表面缔合的TFPI和TFPIα结合，如表5所列SPR分析测定。与高亲和力结合TFPIα不同(表5)，无法检测到抗TFPIKPI-3mAb4F110与EA.hy926细胞表面缔合的TFPI的可测量的结合。数据还显示与其对TFPIα的亲和力(表5)相比，Fab0094-Fab0089缀合物9004对EA.hy926细胞表面缔合的TFPI的亲和力显著降低，表明了优先与包含C端区的TFPI类结合。
表12.抗TFPI抗体和片段EA.hy926细胞表面缔合的TFPI的结合的EC50值(n.b：无可测量的结合)
抗体(mAb/Fab/Fab-Fab缀合物) EC50 (nM)
mAb 2021 0.11
Fab 0088 0.31
Fab 0094 3.80
Fab 0313 25.90
mAb 4F110 n。b。
Fab 0088-Fab 0089缀合物(9002) 0.33
Fab 0094-Fab 0089缀合物(9004) 6.90
实施例24：TF/FVIIa介导的FXa产生的TFPIβ抑制被mAb和Fab-Fab缀合物中和
使人脐静脉细胞系EA.hy926细胞(ATCC)在96孔板中在供应10%FCS和1%青霉素/链霉素的DMEM(Gibco)中生长至100%汇合。细胞用20ng/mlTNFα和20ng/mlIL-1β刺激3小时，并用于测试细胞表面TF依赖性FX活化的中和。细胞用25mMHEPES、137mMNaCl、3.5mMKCl、pH7.4洗涤两次后，在25mMHEPES、137mMNaCl、3.5mMKCl、5mMCaCl2、1mg/mlBSApH7.4中测量FX活化。在37℃下孵育15分钟后，通过加入0–60nMmAb或Fab-Fab缀合物诱导TFPI的中和120分钟。这之后是与50pMrFVIIa(NovoNordiskA/S)一起孵育15分钟。然后通过在37℃下加入50nMFX40分钟引发FXa的产生。通过将40μl上清液与10μl(75mM)EDTA混合终止反应，最后用0.6mM显色底物S-2765(Chromogenix)测量FXa活性。在加入0.5mg/ml中和性山羊抗人TF多克隆抗体的对照实验中证实TF/FVIIa活性。
用GraphPadPrism软件(5版)分析数据。图2中显示了结果。在用50pMFVIIa和50nMFX在37℃下与不同浓度(0–60nM)的mAb2021：(A)；mAb4F110(B)；Fab0088-Fab0089缀合物9002(C)或Fab0094-Fab0089缀合物9004(D)一起孵育后，测量上清液中的FXa活性。正方形显示0.5mg/ml山羊抗人TF多克隆抗体以及60nMmAb或Fab-Fab缀合物的作用。结果表示为均值±SD，n=3。
数据显示，mAb2021，而非mAb4F110，能够中和EA.hy926细胞表面上TF/FVIIa介导的FX活化的TFPI抑制。用Fab0088–Fab0089缀合物9002，也观察到TFPIβ的中和。相比之下，Fab0094-Fab00899004对EA.hy926细胞上TF/FVIIa的TFPIβ抑制没有显著的中和作用。因此KPI-2结合抗体的亲和力调节显示对Fab-Fab缀合物针对KPI-2和KPI-3的功能作用是决定性的。
实施例25：不对称双特异性抗体的产生
根据不对称的IgG形式，即通过FC异二聚化，产生双特异性TFPIKPI-2/KPI-3结合抗体。为了实现FC异二聚化，一组相容性突变经改造进入mAb2021和mAb4F110的hIgG1变体的FC区。
通过限制性内切酶消化，从mAb2021和mAb4F110HC表达载体中切下VH片段，并克隆至含有人IgG1恒定区的序列的基于线性pTT的toolbox载体中。随后将克隆反应转至大肠杆菌中用于选择。最终构建体的序列通过DNA测序证实。
为了支持通过受控制的Fab臂交换的FC异二聚化，将单一苯丙氨酸至亮氨酸突变引入mAb2021的IgG1HC的CH3结构域中，相当于SEQIDNO:63的409位。使用来自Stratagene的QuikChange?位点定向诱变试剂盒，通过位点定向诱变引入突变。所有的最终构建体的序列通过DNA测序证实。按实施例7中所述，mAb2021的改造的IgG1形式在EXPI293F细胞中表达为mAb0309(SEQIDNO:63和64)。按照生产商说明书，使用来自GEHealthcare的MAbelectSuRe树脂，通过标准亲和色谱法进行纯化。使纯化的抗体缓冲液交换为PBS缓冲缓冲液pH7.2。
使赖氨酸匹配精氨酸突变引入mAb4F110的IgG1HC的CH3结构域中，相当于SEQIDNO:65的410位。使用来自Stratagene的QuikChange?位点定向诱变试剂盒，通过位点定向诱变引入突变。所有最终构建体的序列通过DNA测序证实。如实施例7中所述，mAb2021的改造的IgG1形式在EXPI293F细胞中表达为mAb0312(SEQIDNO:65和66)。按照生产商说明书，使用来自GEHealthcare的MAbelectSuRe树脂，通过标准亲和色谱法进行纯化。使纯化的抗体缓冲液交换为PBS缓冲缓冲液pH7.2。
通过在mAb2021的改造的IgG1变体(KPI-2结合)即mAb309和mAb4F110的改造的IgG1变体(KPI-3结合)即mAb312之间的受控的Fab臂交换，制备双特异性KPI-2/KPI-3结合抗体。双特异性抗体基本上按照已公布的方法制备(Labrijn等，PNAS，110：5145-5150(2013))。
简而言之，将mAb0309(mAb2021IgG1Phe至Leu变体SEQIDNO:63)与mAb0312(mAb4F110IgG1Lys至Arg变体SEQIDNO:65)以1:1摩尔比率(1mg/ml每抗体)在PBS缓冲液中混合。在25mM2-巯基乙胺(MEA)存在下，通过在37℃下孵育1:1混合物90分钟以形成半抗体并允许Fab臂交换，来选择性地还原抗体。最后，在除去还原剂(渗滤至不含MEA的PBS缓冲液中)并在+5℃下储存至少16小时后，达到自发重新装配和再氧化。观察到由CH3结构域突变促进的异二聚化，其效率超过90%。来源于mAb0309和0312的最终双特异性抗体命名为mAb0325(SEQIDNO:67-70)。
还产生了逆转的突变组，即Mab2021IgG1上的Lys至Arg和Mab4F110IgG1上的Phe至Leu，并测试具有类似结果。
可通过使用通过靶向TFPI的KPI-2和KPI-3区表位的抗体的FC异二聚化装配的不对称的双特异性抗体，在人A型血友病血浆中获得对组织因子诱导的凝血酶产生的协同效应。
按照实施例18的凝血酶产生测定法，研究了抗体对凝血酶产生的作用。
图3(曲线a)显示用NHP的凝血酶产生曲线。将100μg/ml绵羊抗人FVIII抗体加入NHP中以模拟A型血友病样病况(曲线b)大大降低凝血酶产生。NHP含有约1.6nMTFPI，其中仅约0.2nM以全长TFPIα存在。将多种抗TFPI抗体，包括mAb0309，mAb2021的一种FC改造形式(mAb2021另公开于WO2010/072691)加入FVIII中和的血浆中，有效地重建近似正常的凝血酶产生曲线(数据未显示)。然而，临床前和临床研究显示抗体或适体在体内靶向TFPI引起TFPI血浆水平显著升高。因此引人关注的是研究在升高的TFPI浓度的条件下TFPI靶向的作用。图3显示将20nM全长TFPIα加入FVIII中和的血浆中，完全阻止了可测量的凝血酶产生(曲线c)，且加入200nM的针对KPI-2的高亲和力抗体(mAb0309)不能有效地消除TFPI抑制以及在这些条件下建立稳固的凝血酶产生(曲线d)。加入200nM的针对KPI-3的高亲和力抗体(mAb0312，mAb4F110的一种FC改造形式)在20nMTFPI存在下完全不能够建立显著的凝血酶产生(曲线e)。相比之下，通过建立明显大于由各抗体单独产生的凝血酶产生总和的稳健的凝血酶产生(曲线f)以及具有与在NHP中产生的凝血酶产生相同的数量级(曲线a)，mAb0309和0312的不对称的双特异性抗体组合mAb0325显示协同效应。
虽然本文说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现将想到许多修改、置换、变化和等同物。因此，要了解，随附权利要求书欲涵盖落入本发明真实精神内的所有这些修改和变化。

Claims (19)

1.一种能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的双特异性抗体。
2.权利要求1的双特异性抗体，其能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)的第一表位和TFPI的第二表位，其中第一表位包含位于SEQIDNO:1的1-181位内的氨基酸残基，第二表位包含位于SEQIDNO:1的TFPI182-276位内的氨基酸残基。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中第一表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-1结构域内的氨基酸残基。
4.权利要求1或2的双特异性抗体，其中第一表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-2结构域内的氨基酸残基。
5.权利要求1-4中任一项的双特异性抗体，其中第二表位包含组织因子途径抑制物(TFPI)的KPI-3结构域内的氨基酸残基。
6.权利要求1、2、3或5的双特异性抗体，其能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-1表位：Leu16、Pro17、Leu19、Lys20、Leu21、Met22、Phe25、Cys35、Ala37、Met39、Arg41、Tyr56、Gly57、Gly58、Cys59、Glu60、Gly61、Asn62、Gln63、Arg65、Phe66、Glu67、Glu71和Met75。
7.权利要求6的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Arg41、Arg65和/或Glu67的KPI-1表位。
8.权利要求1、2、4或5的双特异性抗体，其能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-2表位：Glu100、Glu101、Asp102、Pro103、Arg107、Tyr109、Thr111、Tyr113、Phe114、Asn116、Gln118、Gln121、Cys122、Glu123、Arg124、Phe125、Lys126和Leu140。
9.权利要求8的双特异性抗体，其能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)，其中所述抗体能够特异性结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Arg107的KPI-2表位。
10.权利要求1-9中任一项的双特异性抗体，其能够特异性结合组织因子途径抑制物(TFPI)，其中所述抗体能够结合包含选自SEQIDNO:1的以下一个或多个氨基酸残基的KPI-3表位：Tyr207、Asn208、Ser209、Val210、Ile211、Gly212、Lys213、Arg215、Lys232、Gln233、Leu236和Lys240。
11.权利要求10的双特异性抗体，其中所述抗体能够结合包含SEQIDNO:1的氨基酸残基Ile211、Lys213和/或Arg215的KPI-3表位。
12.权利要求1-11中任一项的双特异性抗体，其是Fab-Fab缀合物或呈全长抗体形式。
13.权利要求1-12中任一项的双特异性抗体，其是人源化的。
14.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其选择性地靶向TFPIα。
15.一种包含第一单特异性抗体和第二单特异性抗体的药物组合物，其中第一单特异性抗体能够与SEQIDNO:1的组织因子途径抑制物(TFPI)氨基酸残基1-181内的表位特异性结合；
且第二单特异性抗体能够与SEQIDNO:1的TFPI氨基酸残基182-276内的表位特异性结合。
16.一种双特异性抗体或一种包含与多特异性或双特异性抗体竞争的单特异性抗体的药物组合物或包含前述权利要求中任一项的单特异性抗体的组合的药物组合物。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1-14或16中任一项的双特异性抗体。
18.用于治疗凝血病的权利要求1-14或16中任一项的双特异性抗体或包含权利要求15的单特异性抗体的组合的药物组合物。
19.权利要求1-14或16中任一项的双特异性抗体用于体外测量TFPIα水平的用途。
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