JP2016509483A - 微細藻類シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマスおよびその調製方法 - Google Patents

微細藻類シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマスおよびその調製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）およびパルミチン酸を多量に産生する能力を有する、番号Ｉ−４７０２として２０１２年１１月２２日にＣＮＣＭに申請されたシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株、対象の前記脂質化合物を含有する対応するバイオマスの製造方法、ならびにこの株から調製された産生物および組成物を含有するバイオマスに関する。

Description

本発明は、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）、パルミチン酸、およびリン脂質、特にホスファチジルコリンに富んだ微細藻類のバイオマス、スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、より具体的にはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の微細藻類のバイオマス、好適な例としてはシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の特定の株のバイオマスに関する。
脂質は、タンパク質および炭水化物と共に、３大主要栄養素の１つを構成する。
脂質のうち、トリグリセリドおよびリン脂質は、以下のように特に際立っている。
− トリグリセリド（トリアシルグリセロールまたはトリアシルグリセリドまたはＴＡＧとも呼ばれる）は、グリセロールの３個のヒドロキシル基が脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。それは、植物油および動物脂肪の主成分である。
トリグリセリドは、ヒトが摂取する食物脂質の約９５％を占める。体内では、それは、主に脂肪組織に存在し、エネルギー貯蔵の主要な形態を構成する。
− リン脂質は、両親媒性脂質、すなわち、極性（親水性）の「頭部」と、２つの脂肪族（疎水性）の「尾部」とからなる脂質である。
リン脂質は細胞膜の構成成分であり、特に流動性を提供する構造脂質である。
ほとんどのリン脂質はホスホグリセリドであり、その頭部は、極性分子でエステル化されたグリセロール−３−リン酸残基を中心に構成され、２つの尾部は、２つの脂肪酸の脂肪族鎖である。
他のリン脂質は、スフィンゴミエリンであり、これは、構造的には、グリセロールからではなくスフィンゴシン由来であり、スフィンゴシンが２つの脂肪族尾部の１つを構成する。
生体組織から単離された最初のリン脂質は、卵黄レシチンから特徴付けられた。これは、より具体的には、ホスファチジルコリンであった。これはさらに、ホスファチジルコリンがレシチンとしても知られる所以である。
ホスファチジルコリンは、天然では肝臓で産生される。これは、胆汁の重要な成分であり、十二指腸に存在する脂肪を乳化する。これはまた、胆汁酸塩に加えて、脂肪滴の再凝集を防止するためにも必要である。
リン脂質として、ホスファチジルコリンは細胞膜に関与して、その粘弾性を維持するのに役立つ。これは神経系の必須成分であり、脳の乾燥重量の３０％および神経の１５％近くを構成する。
トリグリセリドおよびリン脂質の大部分は、両方ともに食事により提供される脂肪酸、そのいくつかは生物により合成される脂肪酸で構成されている。
生化学的分類（脂肪酸分子中に含まる二重結合の数に基づく）では、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、および多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に区分される。
生理学的観点からは、以下のように区分される。
− 必須脂肪酸。これは、人体の成長および正常な機能のために必要とされるが、我々の体では合成できない。
− 「条件付き」必須脂肪酸。これは、細胞の正常な成長および生理学的機能のために必須であるが、食事により提供されれば、前駆体から産生可能である。したがって、その必須な前駆体が存在しない場合は、厳密に必要とされる。
− 非必須脂肪酸。
一群の必須脂肪酸および「条件付き」必須脂肪酸は、必須脂肪酸を構成する。
他の脂肪酸は、非必須と記される。
非必須脂肪酸に属するのは、具体的には以下のとおりである。
− ω３脂肪酸系のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、
− 我々の食事に含まれる主要な一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸、および
− ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸などの飽和脂肪酸。
多価不飽和脂肪酸は、末端のメチル基から出発して最初の二重結合の位置に基づいて分類される。
したがって、命名法で、ω「ｘ」または「ｎｘ」の場合、「ｘ」は、最初の不飽和の位置に対応する。
必須脂肪酸の２つの主要な系は、ω６脂肪酸（またはｎ−６ ＰＵＦＡ）（その前駆体および主要な代表例はリノール酸（ＬＡ）である）と、ω３脂肪酸（またはｎ−３ ＰＵＦＡ）（その前駆体はα−リノレン酸（ＡＬＡ）である）と、に区分される。
生物学的に関心をひく多価不飽和脂肪酸の大部分は、ω６系（アラキドン酸もしくはＡＲＡ）またはω３系（エイコサペンタエン酸もしくはＥＰＡ、ドコサヘキサエン酸もしくはＤＨＡ）に属する。
それに加えて、命名法では、鎖を構成する炭素数もまた定義され、したがって、ＥＰＡはＣ２０：５として、ＤＨＡはＣ２２：６として記述される。
「５」および「６」は、この場合、それぞれ、ＥＰＡおよびＤＨＡに存在する炭素鎖の不飽和数に対応する。
ω３脂肪酸系のＤＨＡは、生物がα−リノレン酸から合成可能な脂肪酸であるか、または油の多い魚（マグロ、サケ、ニシンなど）を摂取することにより提供される脂肪酸である。
ＤＨＡは、膜の構造ならびに脳および網膜の発達および機能に重要な役割を果たす。
魚油は、主に、ＤＨＡやＥＰＡなどのω３脂肪酸の供給源として使用されるが、それらは、微細藻類の油にも見いだされており、この場合、たとえば、ＥＰＡは痕跡量にすぎないがＤＨＡは高含有量で含まれるシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）な
どの特定の選択された株から得られる油の場合のように、混合物として、または単独に抽出される。
ＤＨＡに富んだ微細藻類のバイオマスの市販の調製物が入手可能である。
したがって、たとえば、
− ワムシ水産養殖で栄養摂取のために提案されたものでＡｑｕａｆａｕｎａ Ｂｉｏ−Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｃ．より販売されているＡｌｇａｍａｃ系列の製品、
− ＤＨＡ Ｇｏｌｄ（登録商標）というブランド名でＤＳＭ社により販売されている製品、
が挙げられうる。
しかしながら、高ＤＨＡ含有量を有する品質で、かつ長鎖飽和または多価不飽和脂肪酸およびリン脂質のまったく特異的なプロファイルを有する微細藻類のバイオマスを提供する必要性が残っている。
最初に、
− ＤＨＡ以外の多価不飽和脂肪酸（たとえば、ＥＰＡ）の含有量が低く、
− 特定の長鎖飽和脂肪酸（たとえば、ミリスチン酸およびラウリン酸）の含有量が限られており、
− リン脂質（これまで市販の調製物で見いだされた量の２倍まで）、より具体的にはホスファチジルコリンの含有量が高い、
ＤＨＡに富んだ微細藻類の新規なバイオマスを提供したことは、本出願人会社の功績であった。
同様に、従来技術に記載のものよりも効率的ではるかに安価な製造プロセスを開発することが切望されていることから、本出願人の会社は、研究中に、ＤＨＡを産生するとともに、
− 極めて少ない高コレステロール血症性飽和脂肪酸（当業者の知るかぎり最も高コレステロール血症性であることが知られるラウリン酸およびミリスチン酸が６％未満）、
− ４０％超のパルミチン酸（ここで、％は全脂肪酸の重量を基準にしていると理解される）、
を産生するという特殊性を有する、シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の新規な株を同定した。
パルミチン酸は、ヘキサデカン酸またはセチル酸とも呼ばれ、動物および植物で最も一般的なＣ１６：０飽和脂肪酸の１つである。
パルミチン酸は、脂質生成時に産生される最初の脂肪酸であり、前記パルミチン酸からより長い脂肪酸を産生することができる。
さらに、それは、ＡＴＰを合成するために優先的に使用される脂肪酸である。その燃焼のエネルギー収支は、１２９分子のＡＴＰを示す。したがって、それは、優れたエネルギー食品を構成する。
工業的には、パルミチン酸はまた、マーガリンおよび硬石鹸を製造するためにも使用される。
塗料分野では、飽和であることを考えると、パルミチン酸は、大気中の酸素に接触しても、重合して剛性になることはできない（オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸と
は異なる）。したがって、それは、その軟質な固体形態が維持され、（ステアリン酸と共に）重合油性バインダー用の可塑剤として作用する。このように、ステアリン酸と共に、それは油を含有する絵画材料の良好な経時保存に必要とされる弾性を提供する。
さらに、本発明に係るシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ
ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマスは、
− １．５〜２％、そのうちの１〜１．３％はホスファチジルコリンからなる、リン脂質含有量、
− Ｎ×６．２５で表される１０〜２０％の全アミノ酸含有量（ここで、％は、乾物が９９％である、バイオマス１００ｇに対する重量として理解される）、
を有する。
シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のこの株は、フランス国のパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）の国立微生物カルチャーコレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］（ＣＮＣＭ）（２５ ｒｕｅ ｄｕ ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅ）にＣＮＣＭ Ｉ−４７０２の番号で２０１２年１１月２２日に寄託された。
それは、１８Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子：
を配列決定することにより特徴付けられ、これにより、シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）タイプの株であるとして同定可能であった。
したがって、本発明は、ＣＮＣＭにＩ−４７０２の番号で２０１２年１１月２２日に寄託されたシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株に関する。
この株は、本出願では、これ以降「ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２」で表すことがある。
本発明はまた、この株の変異株またはそれから誘導される株に関する。ただし、前記変異株または前記誘導株は、高含有量のＤＨＡおよびパルミチン酸を産生する性質を保持する。
特に、本発明は、突然変異誘発または遺伝子形質転換によりＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株から取られたシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株に関する。突然変異誘発は、部位指向および／またはランダムであってもよい。この株は、高含有量のＤＨＡおよびパルミチン酸を産生する性質を保持する。特
に、それは、特に実施例１に記載の条件下で培養したとき、３５％を超えるＤＨＡおよび４０％を超えるパルミチン酸を産生可能であり、これらの２つの％は、全脂肪酸の重量を基準にして表される。それに加えて、それは、乾物が９９％であるバイオマスの重量基準で１〜１．３％のホスファチジルコリンを産生する。
本発明はまた、ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株の突然変異誘発または遺伝子形質転換と、必要に応じて、
− ３５％超のＤＨＡ、
− ４０％超のパルミチン酸（これらの２つの％は全脂肪酸の重量を基準にして表される）、
− １〜１．３％のホスファチジルコリン（この％は、乾物が９９％であるバイオマスの重量を基準にして表される）、
を産生する株を選択するためのスクリーニング工程と、を含むそのような株の調製方法に関する。
本発明は、好適な発酵条件で適切な媒体中で株を培養する工程を含む、ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株またはＤＨＡおよびパルミチン酸を産生する能力を保持するその変異株の培養方法に関する。
さらに、本発明は、一連の以下の工程、すなわち、
○ 全脂肪酸の重量基準で３５〜４０％のＤＨＡと、全脂肪酸の重量基準で４０〜５０ｗｔ％のパルミチン酸と、バイオマスの重量基準の％で１〜１．３％のホスファチジルコリンと、を有するバイオマスを産生するように、従属栄養条件で株を培養する工程、
○ こうして調製されたバイオマスを集める工程、
○ 前記バイオマスを乾燥する工程、
により調製することを特徴とする、シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマスの調製方法に関する。
培養は、従属栄養条件下で行われる。一般的には、培養工程は、株を復活させるための前培養工程と、次いで、正常の培養工程または発酵工程と、を含む。この後者の工程は、対象の脂質化合物を産生する工程に対応する。
本出願人会社は、これ以降で例証されるように、ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株では、３工程の好気性発酵を行うことを推奨する。
先行する前培養工程後、３つの醗酵工程は、炭素源の供給が微生物によるグルコース消費に基づいて調節される媒体中でＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株を培養することにより特徴付けられる。
これ以降で例示されるように、この場合、グルコース消費が、発酵の最初の時間では徐々に行われ、次いで、発酵の終了まで一定に維持されることは、留意されたい。
本発明は、続いて、対象の脂質化合物、ここでは、ＤＨＡおよびパルミチン酸に富んだバイオマスの発酵終了時の回収に関する。
発酵工程後、バイオマスは、
− バイオマス自体だけでなく培養培地にも存在する脂質分解酵素（リパーゼ）を不活性化するために低温殺菌され、
− 当業者にそれ自体公知の任意の方法により、発酵培地から回収される。たとえば、バイオマスは、発酵槽から抽出され、そして精密濾過もしくは遠心分離により単に濃縮さ
れるか、または一連の濃縮−水溶液希釈により洗浄されうる。
発酵後、バイオマスは、
− 全脂肪酸の重量基準で３５〜４０％のＤＨＡ、
− 全脂肪酸の重量基準で４０〜５０ｗｔ％のパルミチン酸、
− バイオマスの重量基準の％で１．５〜２％のリン脂質（その１〜１．３％はホスファチジルコリンからなる）、
を含有しうる。
最後に、本発明は、食品分野、特に動物栄養であるが、それだけでなくヒト栄養をも意図した組成物の調製における、本発明に係る方法のいずれかの１つにより製造されたＤＨＡ、パルミチン酸、およびホスファチジルコリンに富んだバイオマスの使用に関する。
したがって、本発明は、本発明に係る方法のいずれか１つによりＤＨＡ、パルミチン酸、およびホスファチジルコリンに富んだバイオマスを製造することと、次いで、食品分野を意図した組成物を調製することと、を含む、食品分野を意図した組成物の調製方法に関する。
本発明は、特に、ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株またはＤＨＡを産生する能力を保持するその変異株を含む製品または組成物、およびその培養または発酵の後に得られるバイオマスに関する。
好ましくは、この製品またはこの組成物は、食品組成物または食品サプリメントもしくは栄養補助食品である。
それは、液体形態または固体形態でありうる。
この製品またはこの組成物は、粉末、顆粒、ジェルカプセル、カプセル、または錠剤の形態、好ましくは粉末形態でありうる。
本発明は、以下の実施例を利用すれば、より明確に理解されるであろうが、これらの実施例は、例示を意図したものであり、限定を意図したものではない。
実施例１：シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）株ＣＮＣＭ Ｉ−４７０２によるＤＨＡおよびパルミチン酸に富んだバイオマスの産生
培地の組成および発酵条件を以下の表に示す。
１０ｍ３発酵槽の滅菌培地中の初期グルコース濃度を１５〜１６ｇ／ｌに固定する。
１０ｍ３での発酵時のグルコースの供給方針は、以下のとおりである。
∨ グルコース供給溶液の濃度が５０〜６０％であり、
∨ ４８時間前に残留グルコース濃度（ＲＣＳ）が１ｇ／ｌに減少した場合、グルコースが使い尽くされて発酵が終了するまで、０．６５ｇ／ｌのグルコースを含有する溶液を一度に供給する。
種々の発酵の結果を以下の表に示す。
アミノ窒素のほぼ７０％は、発酵の最初の２４時間で消費され、リンもまた、細胞成長工程時に消費され、その後、もはや消費されない（空気流量および発酵温度の制御との関連では）。
脂質蓄積のレベルおよびＤＨＡ産生のレベルは、徐々に増加し、７２時間で最大に達する。
したがって、細胞の回収は、この発酵時間に達し次第が最適である。
８１時間で発酵を停止するように選択する。
実施例２：動物栄養およびヒト栄養の用途のためのＣＮＣＭ Ｉ−４７０２株のバイオマスの回収および調整
実施例１に記載の発酵の終了時に回収されたバイオマスは、以下の組成を有する。
回収されたバイオマスを６０００ｇで１回目の遠心分離を行い、次いで、回収された細胞を無菌水（１．５／１比）で希釈し、次いで、２回目の遠心分離を行う。
次いで、７０℃で１５分間の熱処理に付す。
２．５５ｔの湿潤バイオマス（１６．７％の乾物）を回収する。
動物栄養を意図した配合物では、それに以下のものを添加する。
− １８のＤＥ（デキストロース当量）を有する２％のマルトデキストリン、
− ０．５％のモノグリセリドおよびジグリセリド、
− １％のクエン酸、
− ０．２％のアントラシン２７２７（抗酸化剤として）、および
− ０．２％のリン酸三カルシウム。
ヒト栄養を意図した配合物では、トコフェロールタイプの食品グレードの酸化防止剤またはローズマリーの抽出物を使用する。
このバイオマスを以下の表７に与えられた条件で一段式噴霧乾燥機（当業者に公知の従来の運転）により噴霧乾燥させる。
乾燥バイオマスの組成は、以下のとおりである（表８）。
実施例３．市販のものと比較した本発明に係るバイオマスの脂質プロファイルの比較試験
脂肪酸を、メタノール塩酸混液とのエステル交換およびクロロホルムでの抽出後に、メチルエステルの形態でガスクロマトグラフィにより測定した。結果を％分布として表記する；分析は内標準方法により行う。
タップフォーカス（ｔａｐｆｏｃｕｓ）ライナー付きスプリット−スプリットレスインジェクターおよびフレームイオン化検出器を備えたクロマトグラフ（Ｖａｒｉａｎ３８００）を使用した。
メタノール１ｍｌあたりに対して正確に０．５ｍｇのヘプタデカン酸メチルを含有する内部標準溶液を調製した。ヘプタデカン酸メチルは、クロマトグラフィー標準点として機能した。
ほぼ正確に３０ｍｇの予め乾燥させたサンプルを６ｍｌチューブに計量した。１ｍｌの内部較正溶液、次いで、２ｍｌの３Ｎメタノール塩酸混液を、２つの計測ラインでピペットを用いて添加した。次いで、チューブに蓋をし、１１０℃に恒温化した乾燥浴に４時間入れた。
冷却した後、約０．５ｍｌの水および０．５ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液を添加し、１ｍｌのクロロホルムで３回抽出した。クロロホルム相を６ｍｌチューブに回収し、これらを硫酸ナトリウムを含有するカラムで乾燥させた。これらを窒素気流下で約１ｍｌに濃縮して注入した。
各脂肪酸（ｉ）の％分布を、ヘプタデカン酸メチルピークを排除したラウリン酸（Ｃ１２：０）からＤＨＡ（Ｃ２２：６Δ４ｃ、７ｃ、１０ｃ、１３ｃ、１６ｃ、１９ｃ）（端点を含む）におよぶクロマトグラム上で位置を特定したすべてのピークの面積の和に比し
たこの脂肪酸のピーク下の面積の比により得た。
バイオマスの破砕および冷浸を次の条件下で行った後、リン脂質を分析する。
バイオマスの破砕
正確に２００ｍｇの新鮮なバイオマスをネジ蓋付きパイレックス（登録商標）チューブ内に秤取する。約１〜１．５ｃｍのガラスビーズ（参照２２．２２２．０００３のＲｅｔｓｃｈ）および０．１ｍｌのメタノールを添加する。チューブを密閉し、ボルテックスミキサーを利用して少なくとも５分間撹拌する。
冷浸
マイクログラム天秤を用いて、正確に２ｍｇのリン酸トリフェニル（純度≧９８％）を小さいアルミニウムボート内に秤取する。
０．９ｍｌのメタノールおよび２ｍｌのクロロホルムと共にボートを直径５ｍｍのパイレックス（登録商標） ＮＭＲチューブ内に配置する。チューブを密閉し、ボルテックスミキサーを利用して１分間撹拌する。
チューブを冷蔵庫内に配置する。沈降後（最低１時間）、透明な上相を注意深く回収し、ガラスジャー内に移し、窒素気流下、周囲温度で蒸発乾固させる。
固体抽出物を０．５ｍｌのＣＤＣｌ３および０．１ｍｌのＣＤ３ＯＤに溶解させ、ＮＭＲチューブ内に移す。
ＮＭＲにより得られたリン含有量に基づいてリン脂質含有量を表すために、４つの主要なリン脂質により提供されるリンを考慮し、オレイン酸を用いてそれらの各モル質量を計算する。
リン脂質含有量は、このように計算されたこれらの４つのリン脂質の量の和と等しい。本発明に係るものに加えて、この方法に従って解析されたバイオマス（以下の表９および１０中）は、Ａｑｕａｆａｕｎａ Ｂｉｏ−Ｍａｒｉｎｅ Ｉｎｃ．社、ＤＳＭ／Ｍａｒｔｅｋ社、およびＮｅｗ Ｈｏｒｉｚｏｎ社により販売されているバイオマスである。
本明細書に提示された結果を解読すれば、脂肪酸プロファイルに関して、次のように思われる。
− 本発明に係るバイオマスは、市販のＤＨＡに富むバイオマスよりもわずかに低いＤＨＡ含有量を有するが、本発明に係るシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマスの明らかな特徴となるパルミチン酸含有量が２倍であり、
− 等価なＤＨＡ含有量およびパルミチン酸含有量を有する市販の油と比較して、本発明に係るバイオマスは、リン脂質（より具体的にはホスファチジルコリン）の含有量が２倍であり、
− アミノ窒素含有量が非常に高い。

Claims (11)

  1. 番号Ｉ−４７０２で２０１２年１１月２２日にＣＮＣＭに寄託されたシゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株。
  2. 請求項１に記載の株の培養と対象の脂質化合物に富んだバイオマスの回収とを含む、対象の脂質化合物を含有する微細藻のバイオマスの製造方法。
  3. 前記対象の脂質化合物がドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）およびパルミチン酸である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記バイオマスが、一連の以下の工程、すなわち、
    ○ 全脂肪酸の重量基準で３５〜４０％のＤＨＡと、全脂肪酸の重量基準で４０〜５０ｗｔ％のパルミチン酸と、を有するバイオマスを産生するように、従属栄養条件で株を培養する工程、
    ○ こうして調製された前記バイオマスを回収する工程、
    ○ 前記バイオマスを乾燥する工程、
    により調製されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. ○ 全脂肪酸の重量基準で３５〜４０％のＤＨＡ、
    ○ 全脂肪酸の重量基準で４０〜５０ｗｔ％のパルミチン酸、および
    ○ 乾物が９９％であるバイオマスにおいて、重量基準で１．５〜２％のリン脂質、
    を含むことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法により取得可能な、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）やパルミチン酸などの対象の脂質化合物を含有するバイオマス。
  6. パーセントがバイオマスの重量基準で表されるものとして、Ｎ×６．２５として表される、１０〜２０％の全アミノ酸含有量を含むことを特徴とする、請求項５に記載のバイオマス。
  7. ヒト栄養または動物栄養を意図した食品または食品サプリメントであることを特徴とする、請求項５または６に記載のバイオマス。
  8. 食品分野を意図した組成物の調製における、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法により製造されたバイオマス、または請求項５もしくは６に記載のバイオマスの使用。
  9. 請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法により製造されたバイオマス、または請求項５もしくは６に記載のバイオマスを含む食品。
  10. 請求項１に記載の株が突然変異誘発または遺伝子形質転換により得られることと、高含有量のＤＨＡおよびパルミチン酸を産生する性質を保持する株が選択されることとを特徴とする、シゾキトリウム・マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の株の調製方法。
  11. 全脂肪酸の重量基準で３５％超のＤＨＡ、
    全脂肪酸の重量基準で４０％超のパルミチン酸、および
    乾物が９９％であるバイオマスにおいて、重量基準で１〜１．３％のホスファチジルコリン、を産生可能な場合に前記株が選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3031984B1 (fr) * 2015-01-27 2019-05-24 Roquette Freres Procede d'enrichissement de la biomasse de microalgues du genre traustochytrium en dha et en acides amines arg et glu
KR101777217B1 (ko) * 2015-09-15 2017-09-11 한국생명공학연구원 Dha를 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 스키조키트리움 속 sh103 균주 및 이의 용도
WO2017131188A1 (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 日本水産株式会社 高度不飽和脂肪酸を含む油脂の製造方法
GB201701014D0 (en) * 2017-01-20 2017-03-08 Megatech Res Gmbh Composition and method of production thereof
CN109938193A (zh) 2017-12-20 2019-06-28 罗盖特公司 Dha生物质、ara残余物和玉米蛋白粉用于白虾饲料的应用
WO2020061445A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Heliae Development, Llc Compositions and methods for introduction of odd-chain fatty acids into poultry eggs
EP4198136A3 (en) 2021-12-16 2023-08-30 Indian Oil Corporation Limited Methods and formulations for enhancing high value lipids
CN116555362A (zh) 2022-01-29 2023-08-08 罗盖特公司 使用解脂耶氏酵母生产脂质的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5346296A (en) * 1995-04-17 1996-11-07 Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fa tty acids by using the microorganisms
BRPI0520823A2 (pt) * 2005-12-16 2011-04-12 Avesthagen Ltd variedade de traustoquitrìdeo -sc1 produtora de ácidodocosaexaenóico (dha)
AU2007351658B2 (en) * 2006-08-01 2013-05-30 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and methods of modification thereof
AU2009303354C9 (en) * 2008-10-14 2017-09-07 Corbion Biotech, Inc. Food compositions of microalgal biomass
CN102839129A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 法国罗凯特兄弟公司 一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株
JP6055469B2 (ja) * 2011-07-13 2016-12-27 オールテック，インク． 藻類脂質組成物ならびにその調製方法および利用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAI-CHUANG CHAUNG,ET AL: "Effect of cultrue conditions on growth,lipid content,and fatty acid composition of Aurantiochytrium", AMB EXPRESS, vol. 2:42,, JPN6017040957, 2012, pages 1-11 *
KANOKWAN CHODCHOEY,ET AL: "GROWTH,FATTY ACID PROFILE IN MAJOR LIPID CLASSES AND LIPID FLUIDITY OF AURANTIOCHYTRIUM MANGRAVEI SK", BRAZILIAN J MICROBIOLOGY, JPN6017040952, 2012, pages 187-200 *
UNAGUL,P.ET AL: "Properties of the docosahexaenoic acid-producer schizochytrium mangrovei Sk-02;effects of glucose,te", BOTANICA MARINA, vol. 48,, JPN6017040954, 2005, pages 387-394 *
YUE JIANG, ET AL: "Fatty Acid Composition and Squalene Content of the Marine Microalga Schizochytrium mangrovei.", J AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 52,5, JPN6017040956, 2004, pages 1196-1200 *

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