JP2016502553A - アミロイドベータ１−４２の可溶性オリゴマー種に関連する疾患を治療するための方法 - Google Patents

アミロイドベータ１−４２の可溶性オリゴマー種に関連する疾患を治療するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維に対する親和性よりも高い、アミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を有する、抗体またはその抗体断片を使用して、可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる疾患を治療するための方法およびキットであり、本抗体は、タウ治療剤またはアミロイドベータ生成もしくは凝集の阻害剤と組み合わされている。

Description

緒論
本出願は、２０１２年１２月４日出願の米国特許出願第13/693,362号の優先権の利益を主張し、当該出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の進行性喪失、ならびに学習および記憶に関連する領域におけるアミロイドベータ（Ａβ）斑の蓄積を特徴とする。Ａβ斑は、これまで、ＡＤの発病において中心的役割を果たすと考えられてきたが、Ａβの可溶性オリゴマー種が、疾患関連性神経機能障害および認知低下の原因となり得ることを示唆する証拠が増えてきている（Walsh & Selkoe (2004) Protein Pept. Lett. 11:213-228;Selkoe (2008) Behavioral Brain Res. 192:106-113;Sakano & Zako (2010) FEBS J. 277:1348-58）。Ａβ誘導拡散性リガンド（ADDL;Lambert et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-53）または毒性可溶性Ａβオリゴマー（Walsh, et al. (2002) Nature 416:535-539; Selkoe (2008） Handb. Clin. Neurol. 89:245-60）とも呼ばれる、Ａβの可溶性球状非線維オリゴマー種は、ＡＤにおいて高濃度に見られるが、正常な脳においてはそうではない（McLean, et al. (1999) Ann. Neurol. 46:860-866; Gong, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10417-10422）。In vitro試験では、ＡＤ脳から単離されたＡＤＤＬまたは合成調製物は皮質および海馬ニューロンの一部に結合するが（Gong, et al. (2003)上記参照;Klein, et al. (2004) Neurobiol. Aging 25:569-580;Lacor, et al. (2004) J. Neurosci. 24:10191-10200;Shughrue, et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:189-202）、線維またはモノマーＡβ調製物においては、結合はほとんど、または全く検出されないことが示されている（Lacor, et al. (2004)上記参照;Hepler, et al. (2006) Biochemistry 45:15157-15167）。より具体的には、ＡＤＤＬ結合は、海馬ニューロンのシナプスに局在化することが示されている（Rammes, et al. (2011) Neuropharmacol. 60:982）。
さらに、ニューロンへのＡＤＤＬ結合は、ＡＤＤＬに対して生成されたポリクローナル抗体（Gong, et al. (2003)上記参照）およびモノクローナル抗体（Lee, et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:4292-4299;De Felice, et al. (2007) Neurobiol. Aging 29:1334-1347;Shughrue, et al. (2010)上記参照）の両方で減衰され得る。
げっ歯類モデルにおいて、ＡＤＤＬの中枢投与は、げっ歯類の長期増強（ＬＴＰ）および記憶形成の障害を誘導する（Walsh, et al. (2002)上記参照;Cleary, et al. (2004) Nat. Neurosci. 8:79-84;Klyubin, et al. (2005) Nat. Med. 11:556-561）。オリゴマーのＬＴＰに対する効果は、ＡＤＤＬが抗Ａβ抗体と同時投与された場合、またはＡβペプチドで予防接種された動物に投与された場合減衰される（Rowan, et al. (2004) Exp. Gerontol. 39:1661-1667）。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を生成する形質転換マウス等の、ＡＤの形質転換モデルにおいて、加齢関連認知障害がＡＤＤＬレベルの増加と共に観察されている（Westerman, et al. (2002) J. Neurosci. 22:1858-1867;Ashe (2005) Biochem. Soc. Trans. 33:591-594;Lee, et al. (2006)上記参照;Lesne, et al. (2006)上記参照）。ｈＡＰＰマウスが抗Ａβオリゴマー抗体で治療された場合、Ａβ 斑負荷の低下を伴わずに認知機能が観察された（Lee, et al. (2006)上記参照）。これらの発見は総合的に、Ａβ斑ではなくＡＤＤＬが認知機能障害の主要原因であり、抗ＡＤＤＬ抗体の使用がＡＤの治療において有効であることが判明され得ることを示唆している。また、米国特許第7,731,962号、米国特許第7,780,963号；国際公開第WO2007/050359号；米国特許出願公開第2007/0218499号、国際公開第WO2006/014478号；米国特許第7,700,099号；米国特許出願公開第2008/01758835号、国際公開第2006/055178号；および米国特許第7,811,563号を参照されたい。
したがって、ＡＤの予防および治療のためのＡＤＤＬ選択的治療抗体が必要とされている。本発明は、この必要性を満たす。
本発明は、可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる疾患を治療することを、それを必要とする患者において、（ａ）アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維に対する親和性よりも高い、アミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を有する、１０ｍｇ／ｋｇ体重未満の用量の抗体またはその抗体断片と、（ｂ）ベータ−セクレターゼもしくはガンマ−セクレターゼ阻害剤、アミロイドベータ凝集阻害剤、タウ治療剤、またはそれらの組合せ等の第２の治療剤と、を投与することにより行うための方法である。さらなる実施形態において、抗体はまた、競合結合アッセイにおいて、少なくとも５００：１の、アミロイドベータ１−４０モノマーと比較したアミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を示し、アミロイドベータ１−４２オリゴマーのニューロンへの結合を遮断し、アミロイドベータ１−４２オリゴマーのアミロイド斑への組み込みを遮断し、急性アミロイドベータ１−４２オリゴマー媒介性長期増強機能不全を逆転し、および／または、抗体もしくは抗体断片を受けていない対象と比較して、認知試験における改善を提供する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗体断片は、
（ａ）軽鎖可変領域であって、
（ｉ）配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐである）を有するＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ （配列番号２）（式中、Ｘａａ１ は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａである）を有するＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（式中、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）を有するＣＤＲ３
を含む、前記軽鎖可変領域と、
（ｂ）重鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号４のＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ３
を含む、前記重鎖可変領域とを有する。
さらに他の実施形態において、ベータ−セクレターゼまたはガンマ−セクレターゼ阻害剤は、ＣＴＳ−２１１６６、Ｐｏｓｉｐｈｅｎ、ＡＣＩ−９１、ＭＫ−８９３１、ＴＡＫ−０７０、ＭＫ−０７５２、ＧＳＫ１８８９０９、ＯＭ９９−２、ＫＭＩ−４２９、ＧＲＬ−８２３４、スタチン阻害剤、フェニルノルスタチン阻害剤、ヒドロキシエチルアミン阻害剤、カルビナミン阻害剤、アシルグアニジン阻害剤、アミノイミダゾール阻害剤、アミノヒダントイン阻害剤、アミノキナゾリン阻害剤、セマガセスタット、アバガセスタット、またはＥＶＰ−０９６２であり、アミロイドベータ凝集阻害剤は、ＰＢＴ２、ＥＬＮＤ０００５、Ｎ−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−２−｛Ｎ’−［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジノ｝−アセトアミド、２−｛［１−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシフェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−（５−ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミドまたは（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（１−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチレン）ベンゾヒドラジドであり、タウ治療剤は、ＥＣ−１０２、ダブネチド、メチルチオニニウムクロリドまたはチデグルシブである。
本発明はまた、アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維に対する親和性よりも高い、アミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を有する、抗体またはその抗体断片と、ベータ−セクレターゼおよび／もしくはガンマ−セクレターゼ阻害剤、アミロイドベータ凝集阻害剤、タウ治療剤、またはそれらの組合せ等の第２の治療剤とを含むキットを特徴とする。
モノマーＡβ、ＡＤＤＬおよび線維Ａβに対する、ヒト化（ｈ３Ｂ３）ならびに親和性成熟抗ＡＤＤＬ（１４．２、７．２、１１．４、９．２、１３．１、１７．１、および１９．３）抗体ならびに３つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１、２、および３）のパネルのＥＬＩＳＡ結合のグラフ表示である。このアッセイのバックグラウンドは、ＥＬＩＳＡから捕捉抗体を除去することにより決定された（ｍＡｂなし）。エラーバーは、標準誤差を表す。
１１点滴定曲線により評価された、ＡＤＤＬまたはモノマーＡβ（Ａβ１−４０）に対する抗ＡＤＤＬ抗体１９．３および抗体３Ｂ３のＥＬＩＳＡ結合のグラフ表示である。
抗ＡＤＤＬ抗体１９．３および３Ｂ３が、増加する濃度の抗体とのプレインキュベーション後に初代海馬神経細胞へのＡＤＤＬ結合を遮断する能力のグラフ表示である。ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断する抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の能力は、抗体の熱変性後に減衰された。エラーバーは、標準誤差を表す。
図４Ａ〜４Ｃは、抗体安定性を評価するために様々な温度で１ヶ月までインキュベートした後の、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３（図４ＡにおいてＷＴと示される）ならびに２つの１９．３誘導抗ＡＤＤＬ抗体（図４Ｂおよび４Ｃ）の、ＡＤＤＬへのＥＬＩＳＡ結合のグラフ表示である。１９．３誘導抗ＡＤＤＬ抗体は、軽鎖ＣＤＲ１内のＡｓｎ３３の、Ｓｅｒ３３（１９．３Ｓ３３）またはＴｈｒ３３（１９．３Ｔ３３）（それぞれ配列番号４２および４３）への単一のアミノ酸置換を有していた。Ａｓｎ３３のＳ３３（図４Ｂ）またはＴ３３（図４Ｃ）との置換は、親１９．３抗体に対する改善された抗体安定性を改善した。
は、BIACORE（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）により評価した場合の、固定化ヒトＦｃＲｎへの抗ＡＤＤＬ抗体の結合および解離のグラフ表示である。調節されたセンサグラムは、ｐＨ６．０における最初の結合、次いで１８０秒からのｐＨ７．３における抗体の解離を示している。ｐＨ６．０での結合の終了から５秒後に報告点（安定性）が挿入され、「結合％」は、Ｕ安定性／ＲＵ結合（％）として計算された。
太字の活字で示された、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するヒト生殖細胞系との、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の重鎖および軽鎖可変領域のアライメントを示す図である。抗体１９．３重鎖可変領域（配列番号７）、抗体３−６６ヒト重鎖可変領域（配列番号８）、抗体１９．３軽鎖可変領域（配列番号９）、抗体３−６６ヒト軽鎖可変領域（配列番号１０）。
ヒト化抗体１９．３の相対的親和性および最大結合特性を示す、Ａβオリゴマー（三角）またはＡβモノマー（四角）でコーティングされたプレートを用いた片側ＥＬＩＳＡを示す図である。
溶液中の競合種の存在下での、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＡβオリゴマー（三角）およびＡβモノマー（四角）に対する１９．３の競合ＥＬＩＳＡおよび相対的親和性を示す図である。
図８Ａおよび８Ｂは、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中で検出されたＡβオリゴマーのレベルのグラフ表示である。図８Ａは、盲検的評価において、Ａβオリゴマーレベルが、年齢適合対照、すなわち非ＡＤ患者と比較して、ＡＤ患者において４倍高かったことを示している。差異は、集団が非ガウス分布であることを仮定して、両側ｔ検定およびマンホイットニー順位分析を使用して決定されるように、ｐ≦０．０００４まで統計的に有意であった。図８Ｂは、盲検的評価において、Ａβオリゴマーレベルが、若年対照、すなわち非ＡＤ患者と比較して、ＡＤ患者において８倍高かったことを示している。この差異もまた、図８Ａの場合と同じ統計的方法を使用して、これらの群の間でｐ値≦０．００２１まで統計的に有意であった。
図９Ａおよび９Ｂは、ＡＤ試料におけるＡβ１−４２モノマーのレベルの低下およびＡβ１−４０モノマーの不変のレベルに対応する、臨床的に確認されたＡＤまたは若年対象、すなわち非ＡＤ患者のＣＳＦにおける、Ａβモノマーレベルのグラフ表示である。これは、ＡＤ患者に対して観察される一般的パターンの代表例であり、図８Ｂにおいて評価された試料の疾患状態を確認した。図９Ａは、ＡＤ ＣＳＦ試料におけるＡβ１−４２モノマーの低減されたレベルを示す。差異は、集団が非ガウス分布であることを仮定して、両側ｔ検定およびマンホイットニー順位分析を使用して決定されるように、ｐ≦０．００２まで統計的に有意であった。図９Ｂは、Ａβ１−４０モノマーの２つの群の間の不変のレベルを示す。
単回１０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）投与後のヘテロ接合２７６ヒトＦｃＲｎマウス（Jackson Laboratory (Bar Harbor、ME)）において評価された、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３および３Ｂ３の薬物動態（ＰＫ）プロファイルのグラフ表示である。抗体の濃度は、遊離抗体の半減期（ｔ１／２）を決定するために、様々な時間間隔で測定された（１９．３：７７±６時間；３Ｂ３：２９±９時間）。
５ｍｇ／ｋｇの用量のボーラス静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与後の６匹のアカゲザルにおいて評価された、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３（血清中）のＰＫのグラフ表示である。ＩＶ投与後に２５４±２８（２７４±９）時間の半減期（ｔ１／２）が、およびＳＣ投薬後に２０４±４９（２１９±５２）時間の半減期が決定された。
５ｍｇ／ｋｇの用量のボーラスＩＶ投与後の大槽ポートアカゲザルモデルを用いて、霊長類（３匹の雄のアカゲザル）脳脊髄液（ＣＳＦ）において評価された、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３のＰＫのグラフ表示である。投薬から約４８時間後、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３は、血清中０．１％の濃度でＣＳＦ中に存在した。
図１３Ａ〜１３Ｄは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を過剰発現する形質転換マウスモデルにおける血液脳関門を横断する、２つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１およびＣｏｍｐ２）に対する抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の能力を示す図である。マウスに、１２５Ｉ標識化抗ＡＤＤＬ抗体１９．３、またはコンパレータ抗体を静脈内投与（ＩＶ）し、投薬から２時間後に、血液、ＣＳＦおよび脳試料を採取した。放射能分布を評価すると、０．０２％の抗ＡＤＤＬ抗体１９．３がＣＳＦ中に存在し（図１３Ａ）、０．１９％が脳内に見られた（図１３Ｂ）。２つのコンパレータ抗体に関して、同様のレベルが見られた。免疫細胞化学分析では、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３が、血漿から脳に移動し、投薬後に濃縮されること（図１３Ｃ、矢印）、およびいくつかの抗ＡＤＤＬ抗体１９．３は、斑の周縁部付近に関連すること（図１３Ｄ）が示された。これは、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３が脳を貫通してＡＤＤＬに結合し得ることを示している。
図１４Ａ〜１４Ｃは、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３が、ｈＡＰＰを過剰発現する形質転換マウスモデルにおいて、成長する斑へのＡＤＤＬの堆積を遮断することを示す図である。１２ヶ月齢のマウスの海馬に４週間注入（１週間あたり１回注射）されたビオチニル化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）（図１４Ａ）が、既存の斑を標識化した（ビヒクルのみ：図１４Ｂ；抗体１９．３：図１４Ｃ、リング）。免疫細胞化学分析を使用して、新たな物質（ＡＤＤＬ）の堆積を評価した（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。
脳内の抗体１９．３の血液脳関門貫通および標的結合を示す図である。抗体１９．３のＩＶ注射から２４時間後の雌（左パネル）および雄（右パネル）のＴｇ２５７６マウスの脳における抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体のレベルを測定した。アスタリスクは、ビヒクル対照レベルからの統計的有意差を示す。（ＲＬＵ、相対発光量。）
親抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３が、マウス海馬スライスにおける長期増強（ＬＴＰ）の急性Ａβ機能不全を逆転させることを示すグラフである。ＬＴＰの大きさは、最後の１０分の記録から平均化されたｆＥＰＳＰ（興奮性シナプス後場電位）勾配値の正規化された増強として示されている。
抗体１９．３の行動的影響を示すグラフである。それぞれ抗体１９．３（３０ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクルによる処理前のベースライン活性に対するパーセント変化として表現される、７、１４および２１日目におけるＴｇ２５７６および非形質転換対照マウスの自発運動の比較が示されている。抗体１９．３による処置から１４および２１日後に、自発運動の有意な低下が観察された。Ｗ−Ｖｅｈ＝非形質転換マウス；Ｔ−Ｖｅｈ：対照ＩｇＧで治療されたＴｇ２５７６マウス；Ｔ−３０ｍｐｋ １９．３＝３０ｍｇ／ｋｇの抗体１９．３で処置されたＴｇ２５７６。
本発明の詳細な説明
本発明は、in vivoで高い親和性でＡβ１−４２の可溶性オリゴマー種に選択的および特異的に結合し、そのニューロンおよびアミロイド斑への結合をin vivoで遮断する抗体を使用して、アミロイドβ１−４２（Ａβ１−４２）の可溶性オリゴマー種の神経毒性作用により引き起こされる、それからもたらされる、またはそれに関連する疾患の治療に関する。本発明の方法は、急性の行動的利益（投与から１、２または３ヶ月以内）および慢性的な疾患の調整を提供するために使用され得る。さらに、本明細書における方法に従い、抗体は、単独の治療法として使用することができ、または、他のＡβ−および／もしくはタウ標的化治療と組み合わせて使用され得る。
本発明の抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）と対照ヒト脳抽出物との間を区別することができる、ＡＤ脳スライスにおける内因性オリゴマーを特定することができる、ならびに溶液中の内因性および合成ＡＤＤＬを中和することができる、追加的利点を有する。本発明の抗体は、ＡＤＤＬの１つ以上の多次元構造に特異的に結合し、Ａβ１−４２のオリゴマー化から得られた特定のＡＤＤＬに結合すると共に、アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維を含むＡβ種に対する有意に低い親和性を有する、または親和性を実質的に有さない。
本発明は、特に、優先的にＡＤＤＬに結合し、ＡＤＤＬに対するその特異性および選択性に関して特性決定されている、抗体１７．１、１４．２、１３．１、１９．３、７．２、９．２、１１．４、およびそれらの誘導体の使用に関する。重要なことには、本発明の抗体の特異性および選択性は、それらが結合するＡβの直線状エピトープからは予測不可能であり、またこの活性は、ウェスタンブロット分析によりＡＤＤＬを検出するそれらの能力から、またはニューロンに結合する免疫染色ＡＤＤＬを検出するそれらの能力からは予測不可能であった。さらに、ＡＤＤＬを中和し、初代海馬ニューロンへの結合を遮断する本発明の抗ＡＤＤＬ抗体の差別的能力は、本発明の抗体が、より関連した立体構造エピトープへの結合を介して作用し、これによってＡβ１−４２の可溶性オリゴマー種がニューロンおよびアミロイド斑に結合するのが防止されるという考えを支持している。本発明の一実施形態において、抗体１９．３は、初代ニューロンへのＡＤＤＬの結合を遮断しただけではなく、海馬脊椎形態へのＡＤＤＬ誘導性変化を弱め、ＡＤＤＬ−神経結合の障害が有意な生理学的結果、例えば、ニューロンの生存、ニューロンの接続性およびシグナル伝達を有することを示した。抗体１９．３はまた、in vitroおよびin vivoモデルの両方において評価した場合、以前に知られていた抗ＡＤＤＬ抗体、３Ｂ３と比較して、改善された薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有していた。さらに、ヒト形態のアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を過剰発現する形質転換マウスに投与された場合、抗体１９．３は、血液脳関門を貫通し、脳内に濃縮し、アミロイド斑へのＡＤＤＬの組み込みを遮断することが示された。ＡＤＤＬは、脳内に局在化し、そこで神経機能に悪影響を及ぼすように作用するため、当業者には、脳内の抗体の貫通および濃縮が、免疫治療に有益であることが理解および認識される。総合すると、これらのデータは、抗体１９．３等の選択的抗ＡＤＤＬ抗体が、学習および記憶に極めて関与するＡＤＤＬの海馬ニューロンへの結合を遮断することができることを示している。
本明細書における治療の方法は、アミロイド斑自体ではなくＡＤＤＬが、この疾患に関連する認知低下において根本的な役割を果たすことを示す証拠に基づいている（Walsh & Selkoe (2004) Protein Pept. Lett. 11:213-228）。ＡＤＤＬは、ＡＤ脳において高く、げっ歯類に中枢投与されると、行動学的および電気生理学的評価項目における障害を誘導する（Walsh, et al. (2002) Nature 416:535-539;Cleary, et al. (2004) Nat. Neurosci. 8:79-84;Klyubin, et al. (2005) Nat. Med. 11:556-561;Balducci, et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:2295-2300）。学習および記憶における障害はまた、増加したＡＤＤＬレベルに関連する機能不全の発症と共に、ｈＡＰＰ発現マウスモデルにおいても観察されている（Westerman, et al. (2002) J. Neurosci. 22:1858-1867;Ashe (2005) Biochem. Soc. Trans. 33:591-594;Lee, et al. (2005) J. Biol. Chem. 281:4292-4299;Lesne, et al. (2006) Nature 440:352-357）。認知に対するこれらの影響を媒介する細胞および下位細胞イベントは、完全には理解されていないが、ＡＤＤＬが海馬ニューロンの樹状突起上に局在化するシナプス末端に結合すること（Lacore, et al. (2004) J. Neurosci. 24:10191-1022）、また樹状突起棘の形態および数を改変することは明らかである（Lacor, et al. (2007) J. Neurosci. 27:796-807;Shankar, et al. (2007) J. Neurosci. 27:2866-2875;Shughrue, et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:189-202）。海馬において、ＡＤＤＬが学習および記憶に極めて関与するニューロンであるＧＡＢＡ性およびグルタミン酸ニューロンの両方に結合し（Shughrue, et al. (2010)上記参照）、これがＡＭＰＡ受容体の内在化をもたらす（Zhao, et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:7619-7632）という知見は、ＡＤＤＬがこれらの神経伝達物質系を直接的または間接的に調整するという示唆をさらに支持している（例えば、Venkitaramani, et al. (2007) J. Neurosci. 27:11832-11837を参照されたい）。
本明細書に記載のように、抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３（米国特許第7,780,963号および米国特許第7,811,563号）から得られた抗ＡＤＤＬ抗体のパネルが、初代海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断するその能力に関して評価された。次いで、選択されたモノクローナル抗体がヒト化され、さらなる特性決定のために親和性成熟化された。ＡＤＤＬに結合する能力に関して選択されたリード抗体が、モノマーＡβ、ＡＤＤＬおよび線維Ａβへの抗体結合を決定するために、三方向ＥＬＩＳＡを使用して単一濃度でさらに評価された。図１に示されるように、７つの親和性成熟抗ＡＤＤＬ抗体のうちの６つ、具体的には抗体１４．２、７．２、１１．４、１３．１、１７．１、および１９．３が、モノマーＡβおよび線維Ａβと比較してＡＤＤＬ優先的であった。
その後、１１点滴定曲線およびＥＬＩＳＡを使用して、広範な濃度にわたり抗ＡＤＤＬ抗体のＡＤＤＬおよびモノマーＡβ（Ａβ１−４０）への結合親和性を確認した。図２に示されるように、抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３および１９．３は、極めてＡＤＤＬ選択的であった。さらに、細胞ベース結合アッセイにおいて抗体を比較し、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断する抗体の能力を決定した。図３に示されるように、増加する濃度の抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３および１９．３でプレインキュベートされたＡＤＤＬを初代海馬ニューロンに添加し、滴定曲線を使用してニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断する抗体の能力を定量的に示した。総合すると、これらの結果は、抗ＡＤＤＬ抗体が細胞ベース形式で神経結合を大きく減衰させることを示している。
アミノ酸配列の評価を行って、脱アミドの潜在的部位を特定した。治療抗体のＣＤＲ内に存在するアスパラギンおよびアスパラギン酸残基は、脱アミドおよびイソアスパラギン酸塩形成を生じ得（Valsak & Ionescu (2008) Curr. Pharm. Biotech. 9:468-481;Aswad, et al. (2000) J. Pharm. Biomed. Anal. 21:1129-1136）、その形成は、抗体の結合能を改変し、それが治療剤としての使用のための抗体の有効性を低減し得る。したがって、当業者には、１９．３抗体のＣＤＲ内のアスパラギンまたはアスパラギン酸の存在が望ましくないことが認識される。したがって、軽鎖ＣＤＲ１の３３位におけるアスパラギン残基は、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の安定性を最適化するために改変された。１９．３抗体の誘導体は、ＣＤＲ１における３３位のアスパラギンのセリン（配列番号４２）、トレオニン（配列番号４３）、またはグルタミン酸（配列番号４５）による置換により生成された。３３位としてのアスパラギンのアスパラギン酸（配列番号４６）による置換もまた、対照として生成された。これらの変更は、ＣＤＲ１内の３３位におけるアスパラギンの脱アミドの可能性を取り除く。１９．３誘導体は、例に記載のように生成および特性決定された。それぞれ図４Ｂおよび４Ｃに示されるように、２つの代表的誘導体、１９．３Ｓ３３（配列番号４２）および１９．３Ｔ３３（配列番号４３）は、様々な温度での１ヶ月のインキュベーション後に結合安定性を向上させた。軽鎖ＣＤＲ１内の３３位および３５位におけるアスパラギンの他のアミノ酸置換（配列番号４７〜５０）、ならびに軽鎖ＣＤＲ２内の５８位におけるアスパラギンの他のアミノ酸置換（配列番号５２〜５５）は、さらなる評価のためにそれぞれ表７および８に列挙される。
本発明の親和性成熟抗ＡＤＤＬ抗体の薬物動態を決定するために、一連のin vitroおよびin vivo試験を行った。ｐＨ６．０において（Zalevsky, et al. (2010) Nat. Biotech. 28 (2): 157-159）、およびｐＨ７．３において（米国仮特許第61/307,182号）、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体の結合が、ヒトにおける抗体半減期を予測することが示されている。本発明の抗ＡＤＤＬ抗体の固定化ヒトＦｃＲｎへの結合および解離が、BIACORE（商標） Life Sciences、BIACORE （商標）Ｔ−１００（GE Healthcare、Piscataway、NJ）により提供されているもの等の無標識相互作用分析により評価された。ｐＨ６．０における最初の結合、次いで１８０秒からのｐＨ７．３における抗体の解離を示すために、調節されたセンサグラムが使用されている。ｐＨ６．０での結合の終了から５秒後に報告点（安定性）が挿入され、「結合％」は、Ｕ安定性／ＲＵ結合（％）として計算された。図５に示されるように、ヒト化３Ｂ３に対するオフ速度は、抗体１９．３および３つのコンパレータ抗体を含む本発明の７つの抗ＡＤＤＬ抗体よりも顕著に遅かった。遅いオフ速度は、低いin vivo ＰＫを示すものであると考えられることから、形質転換ＦｃＲｎマウス（ヘテロ接合２７６ヒトＦｃＲｎマウス、Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）において、追加のin vivo試験を行った。形質転換ＦｃＲｎマウスに１０ｍｇ／ｋｇの抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３または１９．３を静脈内（ＩＶ）投与した場合、薬物動態における有意な差が特定された。図１０に示されるように、抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３の半減期（ｔ１／２）は比較的短く（２９±９時間）、これはin vitro BIACORE（商標）データからの予測と一致し、一方、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の半減期は、有意により長かった（７７±６時間）。より望ましいＰＫを考慮して、１９．３は、そのバイオアベイラビリティにより治療剤として役立つ。
霊長類における予測される抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の半減期を確認するために、大槽ポートアカゲザルのコホートにおける抗体に対して、霊長類薬物動態試験を行った。動物に、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３（５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内（ＩＶ）ボーラスまたは皮下（ＳＣ）注射を施し、抗体投与後に血液試料を採取した。同時に、時間間隔を置いて大槽ポートからＣＳＦ試料を採取し、抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイにより、血清およびＣＳＦ中の抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の濃度を決定した。単回ＩＶボーラス注射により抗ＡＤＤＬ抗体１９．３を動物に投与すると、２５４±２８時間のｔ１／２が観察され（図１１）、一方、皮下投与の場合、２０４±４９時間のｔ１／２が観察された。さらに、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３は、霊長類ＣＳＦ内に横断することができ、最初の４８時間の間に濃度が増加し、投与された抗体の約０．１％でピークを迎えることが判明した（図１２）。
ＡＤ患者の脳内に存在するＡβオリゴマー種の量を確認するために、年齢適合（図８Ａ）および若年（図８Ｂ）対照と比較して、ＡＤ脳においてＡβオリゴマー種を測定した。観察されたＡβオリゴマーの絶対レベルは、ＡＤにおいて約２ｐｇ／ｍＬ、対照ＣＳＦ試料において０．２ｐｇ／ｍＬであった。Ａβオリゴマー種のレベルを、血液脳関門を横断する抗体の量と比較するために、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３および２つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１およびＣｏｍｐ２）を１２５Ｉ標識化し、ＡＤのげっ歯類モデルであるｈＡＰＰを過剰発現する老齢（１２ヶ月齢）マウスに投与した。ＩＶ投薬から２時間後、約０．０２％の抗体１９．３がＣＳＦ内に見られ（図１３Ａ）、一方約０．１９％の抗体１９．３が脳内に見られた（図１３Ｂ）。２つのコンパレータ抗体に対して、同様のレベルが見られた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。投薬したマウスの脳切片に対して免疫細胞化学分析を行い、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の局在化を測定すると（図１３Ｃ中の矢印）、Ａβの斑内への堆積に関連した抗体の濃縮が観察された（図１３Ｄ）。最近、外因性ＡＤＤＬは、ｈＡＰＰを過剰発現するマウスに投与された場合、斑内に堆積することが示された（Gaspar, et al. (2010) Exp. Neurol. 223:394-400）。したがって、本明細書における知見は、局在化した抗ＡＤＤＬ抗体１９．３が斑に関連した循環ＡＤＤＬに結合することを確証している。全体的に、この分析は、脳内に存在するＡβの可溶性オリゴマー種に結合するのに十分なレベルで、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３がＣＳＦおよび脳内に貫通することを示した。さらに、動物モデル試験では、脳内の抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体を有意に上昇させるための最小有効用量が、１０ｍｇ／ｋｇであることが示された（図１５）。
本発明の抗体のin vivo有効性をさらに評価するために、成長する斑へのＡＤＤＬの堆積をブロックする抗体１９．３の能力を、既存の斑を標識化するために１２ヶ月齢マウスの海馬にビオチニル化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）を週１回で４回注入した後のｈＡＰＰ形質転換マウスにおいて評価した（図１４Ａ）。次いで動物は、抗体１９．３の週１回で４回の静脈内注入を受けた（図１４Ａ）。成長する斑への新たな物質（ＡＤＤＬ）の堆積を、免疫細胞化学分析により評価した。図１４Ｂおよび１４Ｃに見られるように、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３は、ビヒクルのみで治療されたマウス（図１４Ｂ）と比較して、既存の斑の周縁部へのＡＤＤＬの堆積を有意に低減した（図１４Ｃ）が、血管斑に結合した。総合すると、これらの結果は、抗ＡＤＤＬ抗体、具体的には１９．３抗体が、血液脳関門を横断し、ＡＤＤＬに結合し、成長する斑への新たな物質の堆積を遮断することができることを示している。
ＡＤＤＬ結合はまた、ニューロンに対する長期的な効果を有し得る。最近の研究では、海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合が、タウのリン酸化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し得ることが示されている（De Felice, et al. (2006) Neurobiol. Aging 29:394-400）。このシグナル伝達カスケードの１つの成分であるＧＳＫ−３βはまた、in vivoおよびin vitroでＡＤＤＬ結合により調整されることが示されている（Ma, et al. (2006) J. Neurosci. Res. 83:374-384）。この研究において、ＡＤＤＬを低減する抗体によるｈＡＰＰマウスの受動免疫化が、ＧＳＫ−３βレベルおよび皮質内のタウのリン酸化も低減することが観察された。この知見は、Ａβとリン酸化タウとの間の関連を裏付けており、ＡＤＤＬ結合がタウの細胞内凝集をもたらすイベントを誘引し得ることを示唆している。さらに、データは、ニューロンへのＡＤＤＬの結合および関連したシナプス突起の損失を防止する抗体、例えば本発明の抗体が、アルツハイマー病および関連疾患に関連した認知および／または病理学的転帰を改善することを示している。これに関して、抗ＡＤＤＬ抗体は、マウス海馬スライスにおいて急性ＡＤＤＬ機能不全を逆転し得ること（図１６）、およびＡＤのＴｇ２５７６マウスモデルにおいて自発運動の増加を復帰させることにより、運動の活動を改変し得ること（図１７）が示された。
したがって、本発明は、ＡＤＤＬの蓄積に関連する、それから引き起こされる、またはそれからもたらされる疾患（例えば、アルツハイマー病または同様の記憶関連疾患）を予防または治療するための、抗ＡＤＤＬ抗体または抗体断片の使用を含む。当該技術分野における証拠は、必ずしも凝集した斑ではなく、増加したＡβのレベルが、アルツハイマー病関連認知症およびその後のタウ異常を引き起こすことを示している。Ａβ誘導拡散性リガンドは、アルツハイマー病に関連した神経毒性に直接関与する。当該技術分野において、ＡＤＤＬは、形質転換マウスおよびアルツハイマー病患者において増加し、動物モデルにおける記憶補助プロセスに関連した機能活性を調整することが示されている。したがって、この形態のＡβを除去することにより、アルツハイマー病に関連した神経毒性の軽減が提供される。したがって、中枢神経系ＡＤＤＬ負荷を低減する本発明の抗体による治療は、アルツハイマー病の治療に有効であることが証明され得る。
治療に適した患者は、疾患のリスクを有するが症状を示していない個人、および現在症状を示している患者を含む。アルツハイマー病の場合、十分長生きする者であれば実質的に誰でもアルツハイマー病に罹患するリスクを有する。したがって、本発明の抗体または抗体断片は、対象患者のリスクのいかなる評価も必要なく、一般集団に予防的に投与され得る。本発明の方法は、特に、アルツハイマー病の既知の遺伝的リスクを有する個人に特に有用である。そのような個人は、疾患が診断されている血縁者を有する者、および遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーの分析によりリスクが決定された者を含む。アルツハイマー病のリスクの遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子の突然変異、特に、それぞれＨａｒｄｙ変異およびＳｗｅｄｉｓｈ変異と呼ばれる、７１７位ならびに６７０および６７１位における突然変異を含む。リスクの他のマーカーは、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２、ならびにＡｐｏＥ４、アルツハイマー病、高コレステロール血またはアテローム性動脈硬化の家族歴である。現在アルツハイマー病に罹患している個人は、特徴的な認知症、および上述のリスク因子の存在から認識され得る。さらに、アルツハイマー病を有する個人を特定するための多くの診断試験が利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ１−４２レベルの測定が含まれる。アルツハイマー病に罹患している個人はまた、ＡＤＲＤＡ基準または本明細書に開示される方法により診断され得る。
無症状患者においては、治療は任意の年齢（例えば、１０、２０、３０歳）から開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、ある期間にわたる複数の投薬を伴う。治療は、経時的にＡＤＤＬの存在について分析することにより監視され得る。
治療用途においては、本発明の抗体または抗体断片を含有する薬学的組成物または医薬品は、ＡＤＤＬの蓄積に関連するそのような疾患が疑われる、またはすでにそれに罹患している患者に、疾患の発症におけるその合併症および中間的な病理学的表現型を含む疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動的）を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。予防用途においては、本発明の抗体または抗体断片を含有する薬学的組成物または医薬品は、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患が疑われる、または別様にそのリスクを有する患者に、患者における受動免疫を達成し、それにより、疾患、その合併症および疾患の発症の間に存在する中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的および／または行動的症状を含む、疾患のリスクを排除もしくは低減する、その重症度を低下させる、またはその発症を遅延させるのに十分な量で投与される。いくつかの方法において、薬剤の投与は、特徴的なアルツハイマー病状をまだ発症していない患者における筋認識機能障害を低減または排除する。具体的実施形態において、本発明の抗体または抗体断片の効果的な量は、長期増強／記憶形成の機能不全が減少するように、治療が行われない場合のＡＤＤＬの結合と比較して、患者におけるＡＤＤＬのニューロンへの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９７％の減少を達成する量である。
上述の状態の治療のための本発明の組成物の効果的な用量は、投与手段、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の薬物、および治療が予防的か治療的かを含む多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、イヌまたは形質転換哺乳動物等の非ヒト哺乳動物もまた治療され得る。
治療用量は、一般に安全性および有効性を最適化するように滴定される。抗体または抗体断片による受動免疫化の場合、用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり、より一般的には０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ宿主体重が好適である。例えば、用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、または０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内が特に企図される。一実施形態において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、±５ｍｇ／ｋｇ）である。別の実施形態において、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、±０．５ｍｇ／ｋｇ）である。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する本発明の２つ以上の抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の用量は、示される範囲内に含まれる。抗体は、通常、複数回にわたり投与され、１回の投薬の間の間隔は、１週間、１ヶ月または１年であってもよい。例示的な治療計画は、２週間に１回または毎月１回の皮下投薬を伴う。間隔は、患者におけるＡＤＤＬに対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように、不規則であってもよい。いくつかの方法において、用量は、１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法においては２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように調節される。代替として、抗体または抗体断片は、徐放製剤として投与されてもよく、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。
用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒトおよびヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を有する。上述のように、用量および投与頻度は、治療が予防的か治療的かに依存して変動し得る。予防用途においては、長期間にわたる比較的低頻度の間隔で、比較的低い用量が投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療用途においては、疾患の進行が低減または停止されるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要となることがある。その後、患者に予防計画が施されてもよい。
本発明の抗体および抗体断片は、薬学的組成物または医薬品の成分として投与されてもよい。薬学的組成物または医薬品は、一般に、活性治療薬剤および様々な他の薬学的に許容される成分を含有する。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照されたい。好ましい形態は、意図される投与形態および治療用途に依存する。薬学的組成物は、所望の製剤に依存して、動物またはヒトへの投与用に薬学的組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される非毒性担体または希釈剤を含有してもよい。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。
薬学的組成物はまた、大型の徐々に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックス官能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、アガロース、セルロース等）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）を含有してもよい。
本発明の薬学的組成物または医薬品の投与は、これらに限定されないが、経口、局所、肺内、直腸内、皮下、皮内、鼻腔内、頭蓋内、筋肉内、眼内、またはくも膜下もしくは関節内等を含む、様々な経路で行うことができる。最も典型的な投与経路は、静脈内投与に続く皮下投与であるが、他の経路も同等に効果的となり得る。
腕または脚の筋肉に筋肉内注射が行われてもよいが、いくつかの方法において、薬剤は、例えば頭蓋内またはくも膜下への注射等、堆積物が蓄積した特定の組織内に直接注射される。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、頭蓋内またはＣＤＦ中に直接注射される。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、徐放性組成物、またはＭＥＤＩＰＡＤ（商標）デバイス等のデバイスとして投与される。
非経口投与の場合、本発明の抗体または抗体断片は、水、油、生理食塩水、グリセロールまたはエタノール等の無菌液体であってもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤中の物質の溶液または懸濁液の注射可能な用量として投与され得る。さらに、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が、組成物中に存在してもよい。薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、および鉱物油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールが、特に注射溶液に好適な液体担体である。抗体は、活性成分の徐放を可能とするような様式で製剤化され得る蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与されてもよい。
例示的な組成物は、等張緩衝生理食塩水（１０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ ８０、ｐＨ６．０）中少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度の無菌透明液体として製剤化された、単離された本発明の抗体、またはその抗体断片を含有する。例示的な抗体製剤は、単回投与として、バイアル当たり０．３ｍｌの溶液が充填された０．６ｍｌのガラスバイアルに充填される。各バイアルは、TEFLON（登録商標）コーティングされた栓で塞がれ、アルミニウムキャップで封止される。
典型的には、組成物は、溶液または懸濁液の形態の注射剤として調製されるが、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁させるのに好適な固体形態が調製されてもよい。また、調製物は、送達の向上ために、乳化されても、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマー等のリポソームもしくはマイクロ粒子内にカプセル化されてもよい。
坐剤の場合、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、そのような坐剤は、０．５％から１０％、より望ましくは１％〜２％の範囲内で活性成分を含有する混合物から形成され得る。
経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウム等の賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放製剤または粉末の形態をとり、１０％〜９５％、またはより好適には２５％〜７０％の活性成分を含有する。
局所適用は、経皮または皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、コレラ毒素またはその解毒された誘導体もしくはサブユニット、あるいは他の同様の細菌毒素との薬剤の同時投与により促進され得る（Glenn, et al. (1998) Nature 391:851を参照されたい）。同時投与は、混合物として、または、化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現により得られる結合分子として成分を使用することにより達成され得る。
代替として、経皮送達は、皮膚パッチを使用して、またはトランスフェロソームを使用して達成され得る（Paul, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:3521-3524; Cevc, et al. (1998) Biochem. Biophys. Acta 1368:201-215）。
ＡＤ等の疾患の予防的または治療的治療を提供するために、Ａβ誘導拡散性リガンド、すなわちＡＤＤＬの多次元構造を差別的に認識するモノクローナル抗体が生成された。これらの抗体はヒト化され、いくつかの実施形態において親和性成熟化された。抗体は、アルツハイマー病と対照ヒト脳抽出物との間を有利に区別し、アルツハイマー病脳スライスおよび培養海馬細胞において内因性Ａβ１−４２オリゴマーを特定する。さらに、本発明の抗体は、溶液中の内因性および合成ＡＤＤＬを中和する。いわゆる「合成」ＡＤＤＬは、精製されたＡβ１−４２を、ＡＤＤＬを生成する条件下で混合することにより、in vitroで生成される。米国特許第6,218,506号を参照されたい。本明細書において開示される抗体は、ＡＤＤＬに対する高度の選択性を示し、モノマーＡβ種の検出は最小限である。さらに、これらの抗体は、海馬ニューロンおよび固定化神経芽腫細胞株の初代培養物に結合するＡＤＤＬ含有調製物の能力を差別的に遮断すると共に、アミロイド斑へのＡＤＤＬ組み込みを遮断する。これらの知見は、これらの抗体が、同様の直線配列認識および親和性にもかかわらず、ＡＤＤＬの多次元構造を認識する差別的能力を有することを示している。ＡＤＤＬは、ニューロンのサブセットに関連し、正常な神経機能を妨害することが知られているため、本発明の抗体は、ニューロンへのＡＤＤＬ結合および斑へのＡＤＤＬの集合の防止における使用が見出され、一方で、アルツハイマー病を含むＡＤＤＬ関連疾患の治療に使用され得る。
したがって、本発明の一実施形態は、ＡＤＤＬの１つ以上の多次元構造を差別的に認識する単離された抗体である。本発明の「単離された」抗体は、他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、分子は、抗体の基本的特徴（例えば、結合特異性、中和活性等）に悪影響を及ぼさないいくつかの追加的薬剤または部分を含んでもよい。
ＡＤＤＬの１つ以上の多次元構造に特異的および選択的に結合することができる抗体は、Ａβ１−４２のオリゴマー化から得られる特定のＡＤＤＬに結合するが、本明細書において開示されるようなウェスタンブロット分析により決定されるように、他のＡβペプチド、すなわちモノマーＡβ１−１２、Ａβ１−２８、Ａβ１−４０、およびＡβ１２−２８と交差反応せず、溶液中でＡＤＤＬに優先的に結合する。２つの実体の間の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を指す。特異的結合を達成するには、１０８Ｍ−１を超える親和性が望ましい。
具体的実施形態において、１つ以上のＡＤＤＬの多次元構造に特異的に結合することができる抗体はまた、ＡＤＤＬの多次元構造に対して産生され、すなわち、動物は、それにより免疫化される。他の実施形態において、１つ以上のＡＤＤＬの多次元構造に特異的に結合することができる抗体は、Ａβ１−４２［Ｎｌｅ３５−Ｄｐｒｏ３７］等の低ｎ量体形成ペプチドに対して産生される。
「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／もしくはＴ細胞が反応する抗原上の部位、または、それに対して抗体が生成および／もしくは抗体が結合する分子上の部位を指す。例えば、エピトープは、エピトープを定義する抗体により認識され得る。
直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。直線状エピトープは、典型的には、唯一の配列内に少なくとも３、より一般的には少なくとも５、例えば約６から約１０のアミノ酸を含む。
立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が認識されるエピトープの唯一の定義成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、エピトープを定義する抗体により認識されるとは限らないエピトープ）である。典型的には、立体構造エピトープは、直線状エピトープに比べて増加した数のアミノ酸を包含する。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパク質の３次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて３次元構造を形成する場合、立体構造エピトープを形成するある特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格が並べて配置され、それにより抗体はエピトープを認識することができる。
エピトープの立体構造を決定する方法は、これらに限定されないが、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴分光法、および部位特異的スピン標識化、および電子常磁性共鳴分光法を含む。例えば、Methods in Molecular Biology (1996) Vol. 66, Morris (Ed.)におけるエピトープマッピングプロトコルを参照されたい。
「Ａβ１−４０ モノマー」または「Ａβ１−４２ モノマー」という用語は、本明細書において使用される場合、酵素切断、すなわち、無細胞または細胞環境におけるアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）上のβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによるアスパラギン酸プロテアーゼ活性の直接的産物を指す。β−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａｓｐ１（切断後のＡβペプチド配列に関する付番）で始まるＡβ種を生成し、一方、γ−セクレターゼは、ＡβのＣ末端、主に残基４０または４２のいずれかを解放する。
アミロイドβ誘導拡散性リガンドまたはＡＤＤＬは、望ましくはＡβ１−４２ペプチドの凝集体（例えば、８つから９つのＡβ１−４２ペプチド）で構成され、アルツハイマー病と関連することが見出されている神経毒性可溶性球状非線維オリゴマー構造を指す。米国特許第6,218,506号および国際公開第WO01/10900号を参照されたい。これは、ミセルのストリングを形成して線維形成をもたらす高分子量凝集中間体とは対照的である。「Ａβ線維」または「線維」または「線維アミロイド」という用語は、本明細書において使用される場合、チオフラビンＳ等の染料によるその複屈折性のためにヒトおよび形質転換マウス脳組織内で検出されるＡβの不溶性種を指す。Ａβモノマーで構成される繊維状構造を形成するＡβ種は、βシートを含む。これらの種は、ＡＤ脳において見られる細胞外アミロイド斑構造の直接中間体であると考えられる。
本明細書において例示されるように、本発明の抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも１つの多次元構造に特異的に結合または認識する。具体的実施形態において、抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの多次元構造に結合する。ＡＤＤＬの多次元構造は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析により定義されるような二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体等を包含することが意図される。三量体、四量体等の指定は、使用されるアッセイ方法により様々であるため（例えば、Bitan, et al. (2005) Amyloid 12:88-95を参照されたい）、三量体、四量体等の定義は、本明細書において使用される場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従う。本明細書における抗体の差別的結合能力を例示すると、ある特定の抗体は、１つの多次元構造、例えばＡＤＤＬの四量体（米国特許第7,780,963号、マウス抗体２Ｄ６および４Ｅ２）を認識し、一方他の抗体は、いくつかの多次元構造、例えばＡＤＤＬの三量体および四量体（米国特許第7,780,963号、マウス抗体２Ａ１０、２Ｂ４、５Ｆ１０、および２０Ｃ２ならびにヒト化抗体２０Ｃ２）を認識することが判明している。したがって、本発明の抗体は、オリゴマー特異的特性を有する。具体的実施形態において、ＡＤＤＬの多次元構造は、本発明の抗体により認識される立体構造エピトープをもたらす特定のポリペプチド構造に関連する。他の実施形態において、本発明の抗体は、５０ｋＤａを超える分子量を有するほぼ三量体から四量体のサイズ範囲を有する多次元構造ＡＤＤＬに特異的に結合する。
好ましくは、本発明の抗体は、Ａβオリゴマーに対して選択性であり、すなわち、抗体は、Ａβ１−４２モノマー、Ａβ１−４０モノマー、斑および／またはアミロイドベータ線維に対する親和性よりも高い、Ａβ１−４２オリゴマーまたはＡＤＤＬに対する親和性を有する。本明細書において示されるように、選択性は、これらに限定されないが、競合結合アッセイ、例えば片側ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡまたは競合ＥＬＩＳＡアッセイ等を含む、様々な方法を使用して評価され得る。この分析に基づき、本発明の抗体は、従来のアッセイ、例えばBIACORE、KINEXAまたは片側ＥＬＩＳＡにおいて評価された際に、Ａβ１−４２モノマー、Ａβ１−４０モノマー、斑またはアミロイドベータ線維の１つ以上と比較してＡβオリゴマーに対して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍高い親和性を示す場合、Ａβオリゴマーに特異的であると定義される。具体的実施形態において、競合結合アッセイにおけるＡβ１−４０ モノマーと比較したＡβ１−４２オリゴマーに対する捕捉抗体の親和性は、少なくとも５００：１である。他の実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおけるアミロイドベータ１−４２モノマーと比較したアミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する抗体の親和性は、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、または、より好ましくは少なくとも１０００：１である。
本発明の抗体は、同様の直線状エピトープを有し得るが、当業者に周知であるように、直線状エピトープは抗原のエピトープの一部に対応し得るのみであるため、そのような直線状エピトープは、これらの抗体の結合特性、すなわち、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断し、タウリン酸化を防止し、斑へのＡＤＤＬ組み込みを阻害する能力を完全に示してはいない（例えば、Breitling and Duebel (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115を参照されたい）。本発明の抗体は、多次元ＡＤＤＬを差別的に認識することができる、したがってニューロンへのＡＤＤＬ結合を差別的に遮断し、タウリン酸化を差別的に防止し、アミロイド斑へのＡＤＤＬの組み込みを差別的に阻害することができるものとして、当該技術のものから区別され得る。
本発明に従って使用されるような抗体は、限定されないが、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、およびそのキメラ、ヒト（例えば、Ｂ細胞から単離された）、ヒト化、中和、二重特異性または一本鎖抗体を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の生成のために、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ラット、マウス、ヒト、およびその他を含む様々な宿主を、合成または天然ＡＤＤＬの注射により免疫化することができる。抗体を生成するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497;Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい。
宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用して免疫反応を増加させることができる。本発明に従い使用されるアジュバントは、望ましくは、反応の定性的形態に影響する免疫原に構造的変化をもたらすことなく、ＡＤＤＬに対する固有反応を増強する。特に好適なアジュバントは、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（MPL（商標）；RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton、MT;GB2220211を参照されたい）、および随意にモノホスホリル脂質Ａ等の免疫刺激剤と組み合わせた水中油エマルション、例えばスクアレンまたは落花生油（Stoute, et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336:86-91を参照されたい）、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（Ｅ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ））、または他の細菌細胞壁成分を含む。水中油エマルションの具体例は、Ｍｏｄｅｌ ＨＯＹマイクロフルダイザー（Microfluidics, Newton, MA）等のマイクロフルダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％ TWEEN（商標）８０、および０．５％ ＳＰＡＮ ８５（随意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）を含有するＭＦ５９（国際公開第WO90/14837号）；サブミクロンエマルションにマイクロ流体化された、またはより大きな粒径のエマルションを生成するようにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％ TWEEN（商標）８０、５％ PLURONIC（登録商標）遮断ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；ならびに、２％スクアレン、０．２％ TWEEN（商標）８０、および１種以上の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含有するRIBI（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT）を含む。
別のクラスのアジュバントは、サポニンアジュバント、例えばSTIMULON（商標）（QS-21, Aquila, Framingham, MA）またはそれから生成された粒子、例えばISCOM（免疫刺激複合体）、およびISCOMATRIX（登録商標）（CSL Ltd., Parkville, Australia）である。他の好適なアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および表面活性物質、例えばリゾレシチン、PLURONIC（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、ＣｐＧ（国際公開第WO98/40100号）、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。ヒトにおいて使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウムパルヴムが、特に好適である。
多次元構造ＡＤＤＬに対する抗体は、動物をＡＤＤＬで免疫化することにより生成される。一般に、ＡＤＤＬは、合成的に、または組み換え断片発現および精製により生成され得る。合成ＡＤＤＬは、本明細書において開示されるように、または米国特許第6,218,506号および米国特許第7,811,563号において開示される方法に従って調製され得る。さらに、ＡＤＤＬは、キーホールリンペットヘモシアニン等の別のタンパク質と融合させて、キメラ分子に対する抗体を生成することができる。ＡＤＤＬは、本明細書に記載のように有用なエピトープを形成するように立体配座的に制限されてもよく、またさらに、本発明の抗体により認識される立体配座の生成を可能とするような様式で、表面と関連する、例えば表面に物理的に付着また化学的に結合してもよい。
ＡＤＤＬの多次元構造に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術を使用して調製され得る。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Kohler, et al. (1975) Nature 256:495-497;Kozbor, et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42;Cote, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;Cole, et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）が含まれるが、これらに限定されない。
具体的実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化される。ヒト化またはキメラ抗体は、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライスして、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得ることにより生成され得る（Morrison, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855;Neuberger, et al. (1984) Nature 312:604-608;Takeda, et al. (1985) Nature 314:452-454;Queen, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033；国際公開第WO90/07861号を参照されたい）。例えば、マウス抗体は、ファージ選択ベクターにおいてＦｖまたはＦａｂ断片として発現される。軽鎖の遺伝子（および並行実験において重鎖の遺伝子）は、ヒト抗体遺伝子のライブラリと交換される。次いで、まだ抗原に結合するファージ抗体が特定される。チェーンシャフリングとして一般に知られるこの方法は、その元となるマウス抗体と同じエピトープに結合するはずのヒト化抗体を提供した（Jespers, et al. (1994) Biotechnology NY 12:899-903）。代替として、チェーンシャフリングは、タンパク質レベルで実行されてもよい（Figini, et al. (1994) J. Mol. Biol. 239:68-78を参照されたい）。
ヒト抗体はまた、ファージ提示法を使用して得ることができる。例えば、国際公開第WO91/17271号および国際公開第WO92/01047号を参照されたい。これらの方法において、ファージのライブラリが生成され、メンバーはその外側表面上に異なる抗体を提示する。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を有するファージ提示抗体は、ＡＤＤＬへの親和性濃縮により選択される。ＡＤＤＬに対するヒト抗体はまた、少なくともヒト免疫グロブリン遺伝子座および不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座の断片をコードする導入遺伝子を有する、非ヒト形質転換哺乳動物から生成され得る。例えば、国際公開第WO93/12227号および国際公開第WO91/10741号を参照されたい。ヒト抗体は、特定のマウス抗体と同じエピトープ特性を有するように、競合結合実験により、または別様に選択され得る。そのような抗体は、一般に、マウス抗体の有用な機能的特性を保持する。ヒトポリクローナル抗体もまた、免疫原で免疫化されたヒトからの血清の形態で提供され得る。随意に、そのようなポリクローナル抗体は、親和性試薬としてＡＤＤＬを使用した親和性精製により濃縮され得る。
本明細書において例示されるように、ヒト化抗体はまた、マウス抗体の張り合わせ(veneering)または表面再構成(resurfacing)により生成され得る。張り合わせは、マウス重鎖および軽鎖可変領域における表面固定領域アミノ酸のみを、相同ヒト抗体配列のそれらのアミノ酸と置き換えることを含む。マウス表面アミノ酸の相同ヒト配列からの同じ位置におけるヒト残基との置き換えは、マウス抗体の免疫原性を低減しながら、そのリガンド結合を保存することが示されている。外側残基の置き換えは、一般に、内部ドメインに対し、またはドメイン間接触部に対し、影響がほとんど、または全くない。例えば、米国特許第6,797,492号を参照されたい。
ヒトまたはヒト化抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを有するように設計され得る。具体的実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧもしくはＩｇＭ、またはそれらの組み合わせである。１つの具体的実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ２である。当業者には、本明細書において他のアイソフォームが使用されてもよいことが理解される。これらのアイソフォームの例示的配列は、配列番号５６〜５８に示される。本発明の他の実施形態は、ヒトＩｇＧ４配列の標準ヒトＩｇＧ２定常領域内への選択的組み込みにより形成される定常領域を包含する。例示的な突然変異ＩｇＧ２ Ｆｃは、本明細書において配列番号５９として記載されるＩｇＧ２ｍ４である。抗体は、２つの軽鎖および重鎖を含有する四量体として、別個の重鎖および軽鎖として、または重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサを介して連結した一本鎖抗体として発現され得る。一本鎖抗体の生成のための技術は、当該技術分野において周知である。
ＣＤＲ移植および張り合わせにより生成される例示的ヒト化抗体は、米国特許第7,780,963号、米国特許第7,731,962号および米国特許第7,811,563号において開示されている。
ジアボディもまた企図される。ジアボディは、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を分離し、同じポリペプチド鎖上の重鎖および軽鎖を結合する、または作用可能に連結する連結部分を供給し、それにより結合機能を保存することにより調製される、改変抗体コンストラクトを指す（Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444: Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい）。これは、本質的に、抗原への結合に必要な可変ドメインのみを有する、極めて短縮された抗体を形成する。同じ鎖上の２つのドメインの間で対を形成させるには短過ぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成し、２つの抗原結合部位を形成する。これらの二量体抗体断片、またはジアボディは、二価および二重特異性である。当業者には、ジアボディを生成する任意の方法が使用され得ることが理解される。好適な方法は、Holliger, et al. (1993)上記参照;Poljak (1994)上記参照;Zhu, et al. (1996) Biotechnology 14:192-196および米国特許第6,492,123号により説明されている。
本発明の単離された抗体の断片もまた、明示的に本発明に包含される。断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体およびＦａｂ発現ライブラリにより生成された断片、ならびにペプチドアプタマーを含むことが意図される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、本発明の抗体分子のペプシン消化により生成され、一方Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成される。代替として、Ｆａｂ発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な特定を可能とすることができる（Huse, et al. (1989) Science 254:1275-1281を参照されたい）。具体的実施形態において、本発明の抗体断片は、その可変領域結合部位を保持する中和抗体の断片、すなわち、抗原結合断片である。その例は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、およびＦａｂ断片である。一般に、Immunology: Basic Processes (1985) 2nd edition, J. Bellanti (Ed.) pp. 95-97を参照されたい。
単一ドメイン抗体またはナノボディもまた、本発明に包含される。ナノボディは、一般的なヒトまたはマウスＩｇＧからの二量体可変ドメインをモノマーに分割し、いくつかの主要な残基をラクダ化することにより調製される。例えば、Davies & Riechmann (1994) FEBS Lett. 339:285-290およびReichman & Muyldermans (1999) J. Immunol. Meth. 231:25-38を参照されたい。
ＡＤＤＬの多次元構造を差別的に認識するペプチドアプタマーは、アプタマーのライブラリ（例えば、Aptanomics SA, Lyon, Franceにより提供される）において合理的に設計またはスクリーニングされ得る。一般に、ペプチドアプタマーは、その設計が抗体の構造に基づく合成認識分子である。ペプチドアプタマーは、タンパク質骨格に両端で結合する可変ペプチドループで構成される。この二重の構造的制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大きく増加させる（ナノモル範囲）。
本発明の抗体および抗体断片の生成における使用のための、軽鎖および重鎖可変領域をコードする例示的核酸配列は、本明細書において、それぞれ配列番号６０および ６１に開示される。当業者により理解されるように、本明細書において開示される重鎖可変領域、例えば配列番号６１に示されるものは、本明細書において開示される軽鎖可変領域のいずれか１つと組み合わせて使用され、修正された親和性、解離、エピトープ等を有する抗体を生成し得る。
本発明の抗体または抗体断片は、それに結合した追加的部分を有してもよい。例えば、米国特許第4,493,825号に記載のように、ミクロスフェアまたはマイクロ粒子が抗体または抗体断片に結合してもよい。
さらに、具体的実施形態は、増加した抗原親和性、中和活性（すなわち、神経細胞へのＡＤＤＬの結合を遮断する能力、またはアミロイド斑へのＡＤＤＬ集合もしくは組み込みを遮断する能力）、あるいは修正された解離定数のために突然変異および選択された抗体または抗体断片を包含する。大腸菌の突然変異誘発株（Low, et al. (1996) J. Mol. Biol. 260:359-368）、チェーンシャフリング（Figini, et al. (1994)上記参照）、およびＰＣＲ突然変異生成が、抗体をコードする核酸分子の突然変異のための確立された方法である。例示として、抗体が結合のために競合するように、大量のファージ抗体を少量のビオチニル化抗原と接触させることにより、増加した親和性が選択され得る。この場合、抗原分子の数は、ファージ抗体の数を上回るべきであるが、抗原の濃度は、解離定数を若干下回るべきである。したがって、親和性が増加した主に突然変異したファージ抗体が、ビオチニル化抗原に結合し、一方、より弱い親和性のファージ抗体の大部分は未結合のままとなる。次いで、ストレプトアビジンが、混合物からのより高い親和性の突然変異抗体の濃縮を補助し得る（Schier, et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:28-43）。
本発明の具体的実施形態において、抗体ｈ３Ｂ３の変異体（すなわち、１４．２、７．２、１１．４、１３．１、１７．１、１９．３）または抗体１９．３の変異体（すなわち、１９．３ Ｎ３３Ｓ、１９．３ Ｎ３３Ｔ、１９．３ Ｎ３３Ａ、１９．３ Ｎ３３Ｅ、１９．３ Ｎ３３Ｄ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｑ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｓ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｔ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ａ、１９．３ Ｎ５８Ｑ、１９．３ Ｎ５８Ｓ、１９．３ Ｎ５８Ｔ、１９．３Ｎ３５Ａ）が、本発明の方法において使用される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（式中、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐである）を有するＣＤＲ１、配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号２）（式中、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａである）を有するＣＤＲ２、および配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（式中、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）を有するＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号４）を有するＣＤＲ１、配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号５）を有するＣＤＲ２、および配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号６）を有するＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを有する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（式中、Ｘａａ１は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＡｓｐであり、または、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ｔｈｒである）を有するＣＤＲ１、配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号２）（式中、Ｘａａ１は、Ｔｈｒである）を有するＣＤＲ２、および配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（式中、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）を有するＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号４）を有するＣＤＲ１、配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号５）を有するＣＤＲ２、および配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号６）を有するＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを有する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法の抗体は、抗体ｈ３Ｂ３の変異体（すなわち、１４．２、７．２、１１．４、１３．１、１７．１、１９．３）である。この実施形態によれば、抗体は、配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号４１）を有するＣＤＲ１、配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号５１）を有するＣＤＲ２、およびＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（式中、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）のＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを有する。
他の実施形態において、本発明の方法の抗体は、抗体１９．３の変異体であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が突然変異されている（すなわち、１９．３ Ｎ３３Ｓ、１９．３ Ｎ３３Ｔ、１９．３ Ｎ３３Ａ、１９．３ Ｎ３３Ｅ、１９．３ Ｎ３３Ｄ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｑ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｓ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ｔ、１９．３ Ｎ３３Ｓ−Ｎ３５Ａ）。この実施形態によれば、抗体は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１８）を有するＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを有する。
さらに他の実施形態において、本発明の方法の抗体は、抗体１９．３の変異体であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ２が突然変異されている（すなわち、１９．３ Ｎ５８Ｑ、１９．３ Ｎ５８Ｓ、１９．３ Ｎ５８Ｔ、１９．３Ｎ３５Ａ）。この実施形態によれば、抗体は、配列番号４１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、配列番号１７のＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを有する。
ある特定の実施形態において、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（式中、Ｘａａ１は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ｔｈｒである）を有する。他の実施形態において、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号２）（式中、Ｘａａ１は、Ｔｈｒである）を有する。
本発明における使用の例示的抗体は、配列番号７にあるような重鎖可変領域配列（すなわち、それぞれ配列番号４、５および６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、配列番号９にあるような軽鎖可変領域配列（すなわち、配列番号４１、５１、１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを有する抗体１９．３である。図６を参照されたい。ある特定の実施形態において、本発明の方法において使用される抗体は、３Ｂ３ではない。
本発明の方法における抗体の生成を促進し、その保存および使用を向上させるために、ある特定の実施形態は、Ａβオリゴマーを用いたＥＬＩＳＡベースアッセイにおいて、４０℃で１ヶ月保存された場合、ＥＣ５０の１０倍未満の減少を示す抗体の使用を含む。より好ましくは、抗体は、４０℃で１ヶ月保存された場合、ＥＣ５０の６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍未満の減少を示す。抗体安定性は、本明細書の例において説明されるように評価され得る。高い温度でそのような安定性を有する抗体は、例７に記載される。
いくつかの治療用途において、抗原からの抗体の解離を低減することが望ましくなり得る。これを達成するためには、ファージ抗体をビオチニル化抗原に結合させ、過剰のビオチニル化抗原を追加する。ある期間の後、主により低い解離定数を有するファージ抗体が、ストレプトアビジンにより回収され得る（Hawkins, et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-96）。
本明細書において開示されるものを含む様々な免疫測定法が、ＡＤＤＬの多次元構造に対して所望の特異性を有する抗体またはその断片を特定するためのスクリーニングに使用され得る。競合結合の様々なプロトコル（例えばＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの断片を使用した反応速度（例えばBIACORE（商標）分析）が、当該技術分野において周知である。そのような免疫測定法は、典型的には、特異的抗体とその同種抗原との間の複合体形成の測定を含む。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を使用した二部位モノクローナルベース免疫測定法が好適であるが、競合結合アッセイもまた使用され得る。そのようなアッセイはまた、試料中のＡＤＤＬの多次元構造の検出に使用され得る。
抗体または抗体断片はまた、中和または薬理活性、および予防剤または治療剤としての潜在的有効性を評価するために、ニューロンもしくは培養海馬細胞へのＡＤＤＬ結合の移動、またはＡＤＤＬ集合もしくはアミロイド斑へのＡＤＤＬ組み込みの遮断等の他の生物活性アッセイに供され得る。そのようなアッセイは、本明細書において説明されており、当該技術分野において周知である。
抗体および抗体の断片は、ハイブリドーマとして生成および維持され得るか、または、代替として、これらに限定されないが、大腸菌、酵母（例えば、サッカロミセス種およびピキア種）、バキュロウイルス、哺乳動物細胞（例えば、骨髄腫、ＣＨＯ、ＣＯＳ）、植物、または形質転換動物を含む、十分に確立された任意の発現系において組み換えにより生成され得る（Breitling & Duebel (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pp. 119-132）。抗体および抗体の断片は、これらに限定されないが、親和性クロマトグラフィー、免疫グロブリン結合分子（例えば、タンパク質Ａ、Ｌ、ＧまたはＨ）、抗体または抗体断片に作用可能に連結したタグ（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｃ−ｍｙｃタグ）等を含む、任意の適切な方法を使用して単離され得る。Breitling & Duebel (1999)上記参照を参照されたい。
ＡＤＤＬに関連した疾患の予防または治療を評価するために、本発明の抗体および抗体断片の活性が、神経細胞へのＡＤＤＬの結合を遮断もしくは阻害する、より高次のオリゴマーの集合を阻害する、アミロイド斑へのＡＤＤＬ組み込みを遮断する、および／またはＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止する能力に関して分析され得る。
神経細胞へのＡＤＤＬの結合を遮断または阻害する抗体または抗体断片の能力は、ＡＤＤＬが抗体または抗体断片の存在下でニューロンに結合するかどうかを測定することにより決定される。抗体がニューロンへのＡＤＤＬの結合を遮断することができる程度は、本明細書に記載の方法、すなわち、免疫細胞化学、または細胞ベースアルカリホスファターゼアッセイ、または任意の他の好適なアッセイに従って決定され得る。具体的実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の非存在下でのＡＤＤＬの結合と比較して、ＡＤＤＬの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９７％の減少を達成する。
ＡＤＤＬの集合を遮断または阻害する抗体または抗体断片の能力は、Ａβ１−４２のより大きなオリゴマー種、例えば八量体または十量体の集合が、抗体または抗体断片の存在下で阻害されるかどうかを測定することにより決定され得る。抗体がＡＤＤＬのより大きなオリゴマー種の集合を遮断することができる程度は、例えば、ＦＲＥＴまたは蛍光偏光または任意の他の好適なアッセイにより決定され得る。
Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止する抗体または抗体断片の能力は、タウタンパク質が抗体または抗体断片の存在下でリン酸化されるかどうかを測定することにより決定され得る。抗体がＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止することができる程度は、本明細書において開示される方法または任意の他の好適なアッセイに従い決定され得る。
ニューロンへのＡＤＤＬの結合の遮断もしくは減少、ＡＤＤＬのより大きなオリゴマー種の集合の阻害、および／またはＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化の防止は、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患が、予防的または治療的に治療されていることの指標として使用され得る。
本明細書における方法によれば、本発明の抗体または抗体断片は、アミロイド生成疾患の治療に少なくとも部分的に効果的な他の薬剤と随意に組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗体は、アルツハイマー病に対する既存の緩和治療、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばARICEPT（商標）（ドネペジル塩酸塩）、EXELON（商標）（リバスチグミン酒石酸塩）、およびREMIYL（商標）（ガランタミン臭化水素酸塩）、ならびにＮＭＤＡ拮抗剤、NAMENDA（商標）（メマンチンＨＣｌ）と共に投与され得る。これらの既知の治療に加えて、具体的実施形態は、Ａβ生成および凝集の阻害剤（例えば、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤、Ａβ−モノマー凝集阻害剤、Ｐａｎ−Ａβ免疫治療剤、および／または線維もしくはアミロイド斑免疫治療剤）ならびに／あるいはタウ治療剤と組み合わせた本発明の１つ以上の抗体の使用を特徴とする。
セクレターゼ酵素調整。Ａβのレベルを低減するための１つのアプローチは、Ａβの生成を阻害するように、β−およびγ−セクレターゼ切断酵素の活性を調整することを含む。β−およびγ−セクレターゼ酵素は、ＡＰＰ をＡβに変換するアスパルチルプロテアーゼであり、これらの２つの酵素の阻害を含む治療戦略は、脳のアミロイドのレベルを低減することを目的とする（Marlatt, et al. (2005) Curr. Med. Chem. 12 (10): 1137-47;Lundkvist & Naslund (2007) Curr. Opin. Pharmacol. 7 (1): 112-8）。β−セクレターゼ阻害剤ＣＴＳ−２１１６６（CoMentis, Inc.）、Ｐｏｓｉｐｈｅｎ（QR Pharma Inc.;Sabbagh (2009) Am. J. Geriatr. Pharmacother. 7:167-185;Neugroschl & Sano (2009) Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 9:368-376）、ＡＣＩ−９１（AC Immune SA)、MK-8931(Merck & Co. Inc.）、ＬＹ２８１１３７６（Eli Lilly & Co.）、ΤΑΚ−０７０（Takeda Pharmaceutical Company Limited）、ＧＳＫ１８８９０９（Hussain, et al. (2007) J Neurochem. 100:802-809）、ＫＭＩ−４２９（Asai, et al. (2006) J. Neurochem. 96:533-40）、ＧＲＬ−８２３４（Chang, et al. (2010) FASEB J. 25:775-784）、およびＯＭ９９−２、ならびにスタチン、フェニルノルスタチン、ヒドロキシエチルアミン、カルビナミン、アシルグアニジン、アミノイミダゾール、アミノヒダントイン、およびアミノキナゾリン系阻害剤（Ghosh, et al. (2012) J. Neurochem. 120:71-83）を含む、これらの酵素を標的化するいくつかの薬剤が知られている。ガンマ−セクレターゼ阻害剤は、これらに限定されないが、ＭＫ−０７５２（Merck & Co Inc.）、セマガセスタット（LY-450139; Eli Lilly & Co; NCT00762411およびNCT00594568)(Lundkvist & Naslund (2007)上記参照;Barten, et al. (2005) J. Pharmacol. Exp. Ther. 312.(2): 635-643;Wong, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279 (13): 12876-82）、アバガセスタット（BMS-708163; Bristol-Myers Squib）、ＥＶＰ−０９６２（EnVivo Pharmaceuticals）を含む。
ベータ−アミロイド凝集の調節。ベータ−アミロイド毒性を防止する亜鉛および銅イオノフォアであるＰＢＴ２（Prana Biotechnology Ltd.）、ならびにＥＬＮＤ０００５（ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール；Elan Corporation, PLC）を含む、ベータ−アミロイド凝集のいくつかの阻害剤が開発されている。神経毒性ベータ−アミロイド種の形成を阻害するための追加的化合物は、国際公開第WO2009/008891号に記載されており、限定されないが、２−ヒドロキシ安息香酸［３−オキソ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジド、２−ヒドロキシ安息香酸［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジド、２−ヒドロキシ安息香酸［３−オキソ−３フラン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジド、Ｎ−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−２−｛Ｎ’−［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジノ｝−アセトアミド、２｛［１−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２ヒドロキシナフタレン−１−イル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシフェニル）−メタ（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル２−（３−エチル−５−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、２−（５ヒドロキシ−３−プロピル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、２−（５ヒドロキシ−３−イソプロピル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、２−（５ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、（５ヒドロキシ−３−プロピル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メタノン、Ｎ−（４−ブロモフェニル）２−（３−エチル−５−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソアセトアミド、２−（５−ヒドロキシ−３−プロピル−５（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソ−Ｎ−フェネチルアセトアミド、Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−（５−ヒドロキシ−３プロピル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソアセトアミド、２−（３−ブチル−５−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソ−Ｎ−フェネチルアセトアミド、２−（５−ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソ−Ｎ−フェネチルアセトアミド、Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−（５−ヒドロキシ−３−ペンチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソアセトアミド、２−（５−ヒドロキシ−３−ペンチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソアセトアミド、２−（５−ヒドロキシ−３−イソペンチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−オキソ−Ｎ−フェネチルアセトアミド、２−（５−ヒドロキシ−３−イソペンチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、２−（３−ヘキシル−５−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、２−（３−シクロヘキシル−５−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミド、（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチレン）ベンゾヒドラジド、（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（１−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチレン）ベンゾヒドラジド、（Ｅ）−Ｎ’−（３，５−ジブロモ−２−ヒドロキシベンジリデン）−２−ヒドロキシベンゾヒドラジド、または（Ｅ）−Ｎ’−（５−ブロモ−２−ヒドロキシベンジリデン）−２−ヒドロキシベンゾヒドラジドを含む。具体的実施形態において、アミロイドベータ凝集の阻害剤は、Ｎ−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−２−｛Ｎ’−［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジノ｝−アセトアミド、２−｛［１−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシフェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾｌｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−（５−ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミドまたは（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（１−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチレン）ベンゾヒドラジドである。
タウベース治療。治療的介入のための標的を提供するＡＤ病状の別の重要な側面は、高リン酸化形態の微小管結合タンパク質タウである。タウ高リン酸化および神経原線維変化における凝集形態のこのタンパク質の存在は、ＡＤに罹患した患者における認知低下に関連する（Castellani, et al. (2006) Acta Neuropathol. 111:503-509;Nunomura, et al. (2006) Sci. Aging Knowledge Environ. 2006:e10）。したがって、高リン酸化タウタンパク質を標的とする治療戦略は、ＡＤの治療に適切である可能性がある。
凝集した高リン酸化タウの破壊的作用はまた、ユビキチンプロテオソーム系またはマクロオートファジーを介したタンパク質の細胞内分解の上方制御により排除され得る（Brunden, et al. (2009) Nat. Rev. Drug Discov. 8:783-93）。ユビキチンプロテオソーム分解経路において、標的化されたタンパク質は、ユビキチンによりタグ化され、その後プロテオソーム複合体により認識および分解される（Ravikumar, et al. (2003) Clin. Neurosci. Res. 3:141-148）。ユビキチンプロテオソーム系は、標的タンパク質がプロテオソームの狭い開口部に通されることを必要とするため、この系の活性化は、非線維リン酸化タウのみを分解する。それにもかかわらず、Ｈｓｐ９０阻害剤は、より小さい非線維リン酸化タウの分解を媒介した。Ｈｓｐ９０は、主に変性タンパク質のＡＴＰ駆動リフォールディングを担うため、このタンパク質の阻害は、このシャペロンがリン酸化タウを保存しようとするのを効果的に停止し、それによりタウ分解を促進する（Dickey, et al. (2007) J. Clin. Invest. 117:648-658）。例えば、ヒトタウ発現Ｔｇマウスに７日間投与されたＨｓｐ９０阻害剤ＥＣ−１０２は、脳内の高リン酸化タウのレベルを低減した（Dickey, et al. (2007)上記参照;Luo, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:9511-16）。さらに、ＥＣ−１０２は、ＡＤに罹患した患者の脳からの皮質ホモジネートにおけるＨｓｐ９０／非線維リン酸化タウ複合体の形成を、対照ホモジネートの濃度よりも１０００倍低い濃度で効果的に阻害し（Dickey, et al. (2007)上記参照）、したがって、ＥＣ−１０２の臨床的に安全な用量が可能である。
タウを標的化する追加的な薬剤は、ダブネチド（ＡＬ−１０８；ＮＡＰＶＳＩＰＱ、配列番号６２；Allon Therapeutics）、メチルチオニニウムクロリド（REMBER;TauRx Pharmaceuticals Ltd.）、およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害剤であるチデグルシブ（NYPTA/ZENTYLOR;Noscira）を含む。本発明のさらに別の実施形態は、ＡＤＤＬに結合する単離された抗ＡＤＤＬ抗体、またはその抗原結合断片を含む、ＡＤＤＬを検出するためのキットである。
そのような併用治療に従い、本発明はまた、Ａβ生成および凝集の阻害剤、ならびに／またはタウ治療剤と組み合わせて、Ａβ１−４２の可溶性オリゴマーに選択的および特異的に結合する１つ以上の抗体を含むキットを含む。そのようなキットは、すでにある用量の個々の活性成分を含有する様々な容器を、投与形態に関する指示を有する単一パッケージ（キット）内に含有し得る。
治療に加えて、本発明の抗体および抗体断片はまた、ニューロン（例えば、海馬細胞）へのＡＤＤＬの結合を防止する治療薬剤の特定における用途が見出され、それによりＡＤＤＬに起因する下流側のイベントを防止する。そのようなアッセイは、薬剤の存在下でニューロンをＡＤＤＬと接触させ、本発明の抗体または抗体断片を使用して、その薬剤の存在下でニューロンに対するＡＤＤＬの結合を決定することにより行われる。当業者に理解されるように、ニューロンへのＡＤＤＬの結合を遮断する薬剤は、薬剤と接触されていないニューロンと比較して、ニューロンに結合したＡＤＤＬの量を減少させ、その量は、本発明の抗体または抗体断片を使用した免疫測定法において検出可能である。ニューロン結合ＡＤＤＬを検出するための好適な免疫測定法は、本明細書において開示される。
本明細書において提供される方法を使用してスクリーニングされ得る薬剤は、多くの化学的クラスを包含するが、典型的には、それらは有機分子、好ましくは１００ダルトンを超え約２，５００ダルトン未満の分子量を有する有機小分子化合物である。薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を包含し、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能性化学基の少なくとも２つを含む。薬剤は、多くの場合、上記官能基の１つ以上で置換された、環状炭素もしくはヘテロ環式構造、および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含有する。薬剤はまた、ペプチド、抗体、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見出すことができる。薬剤は、天然または合成化合物のライブラリを含む広範な源から得られる。
塩および中性タンパク質等の様々な他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれ得る。また、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等の、アッセイの効率を別様に改善する試薬が使用されてもよい。成分の混合物が、必要な結合を提供する任意の順番で添加されてもよい。
本発明のスクリーニングアッセイにより特定された薬剤は、アミロイド生成疾患および／またはタウオパチーの治療のために有益となる。さらに、これらの概念を例示するために使用された実験システムは、タウリン酸化のアミロイドベータ誘導に関連する新規薬物標的の評価、特定およびスクリーニングのための研究手段を表すことが企図される。
本明細書において引用される全ての参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、以下の限定されない例によって、より詳細に説明される。
例１：材料および方法
ＡＤＤＬ選択的モノクローナル抗体の生成。本明細書においてその種が「合成」ＡＤＤＬと呼ばれる可溶性Ａβオリゴマーを、完全フロイントアジュバント（第１および第２のワクチン接種）、または不完全フロイントアジュバント（後続の全てのワクチン接種）と１：１で混合し、皮下（最初の２回のワクチン接種）または腹腔内注射により、３匹のマウスに１ｍＬ／マウスの総量で投与した。各注射は、１９４±２５μｇ全タンパク質に相当する精製ＡＤＤＬを含んでいた。ほぼ３週間毎にマウスに注射した。６回の注射後、１匹のマウスが死亡し、その脾臓を凍結した。次いで、最も高い力価の血清を有するマウスからの脾臓を、ポリエチレングリコールの存在下でＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合し、６つの９６ウェルプレートに播種した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２と共に１０日間、２００μＬのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地中で培養したが、この培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１μｇ／ｍＬ ＨＹＢＲＩ−ＭＡＸ（登録商標）（アザセリン−ヒポキサンチン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）、およびＳＰ２／０細胞培養から回収された３０％調整培地が添加されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）等の濃縮合成培地で構成される。１０日目に、１０％ＦＢＳが添加されたＩＭＤＭ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を一度培養物に加え、１４日目に培養上清を除去して、ＥＬＩＳＡにおいて陽性ウェルについてスクリーニングした。ウェル当たり０．３細胞の確率で限界希釈法により陽性培養物をさらにクローニングした。陽性クローンをＥＬＩＳＡにおいて確認し、さらに増殖させた。次いで、モノクローナル抗体を生成し、使用のために精製した（QED Bioscience, San Diego, CA）。
ＡＤＤＬおよびｂＡＤＤＬの調製。以前に説明された方法（Hepler, et al. (2006) Biochemistry 45:15157-15167;Shughrue, et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:189-202）を使用して、ＡＤＤＬを調製した。簡潔に説明すると、合成Ａβ１−４２ペプチド（American Peptide, Sunnyvale, CA）を、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ペプチド溶液を、ポリプロピレン製１．５ｍｌ微小遠心管内の５０μｌアリコートに分注した。ＳＰＥＥＤＶＡＣ（登録商標）（Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA）を使用してＨＦＩＰを除去し、得られたペプチド膜を必要となるまで−７０℃で乾燥保存した。０．５ｍｇの乾燥ＨＦＩＰ膜を、２２μｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、ボルテックスミキサー上で１０分間撹拌しながら溶解した。その後、フェノールレッドを含まない１ｍｌの低温ハムＦ１２培地（United Biosource, San Francisco, CA）をＤＭＳＯ／ペプチド混合物に速やかに添加した。管に蓋をし、反転して確実に完全混合させ、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、２〜８℃で作動させたＢｅｃｋｍａｎ微小遠心分離機（Beckman Coulter, Brea, CA）で、試料を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＹＭ５０（５０，０００ｋＤａ分子カットオフ）CENTRICON（登録商標）遠心分離フィルタ（Millipore, Billerica, MA）を通して濾過して、オリゴマー種を濃縮した。同じ方法を使用してビオチニル化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）を調製したが、Ｎ末端ビオチニル化Ａβ１−４２ペプチド（American Peptide, Sunnyvale, CA）で開始した。ｂＡＤＤＬのそのような調製物は、免疫細胞化学分析により、ＡＤＤＬと同様の様式でラット海馬ニューロンの成熟シナプスに結合することが示されている（Shughrue, et al. (2010)上記参照）。
モノマーおよび線維調製物。モノマー調製物を生成するために、室温Ａβ１−４０またはＡβ１−４２ペプチド膜を、ペプチドのｍｇ当たり２ｍＬの２５ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、アリコートに分割し、使用まで−７０℃で凍結した。Ａβ１−４２ペプチド膜のｍｇ当たり２ｍＬの１０ｍＭ塩酸を添加することにより、線維調製物を作製した。ボルテックスミキサー上で可能な限り低速で５分から１０分間溶液を混合し、得られた調製物を、使用まで３７℃で１８時間から２４時間保存した。
初代ニューロン。ＢｒａｉｎＢｉｔｓ（Springfield, IL）から購入したラット海馬および／または皮質組織から、初代ニューロン培養物を調製した。解離後、細胞を、３５，０００細胞／ウェルで、ラミニンおよびポリ−Ｄ−リシンでプレコーティングされた９６ウェルプレート（Corning Life Sciences, Lowell, MA）に播種した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２と共に、培地（２％Ｂ２７、１％ Ｌ−グルタミン、および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地；Invitrogen, Carlsbad, CA)中で２〜３週間維持し、次いで結合試験に使用した。
細胞ベースＡＤＤＬ結合アッセイ。ＡＤＤＬ結合の遮断に関する抗ＡＤＤＬ抗体の効果を測定するために、１．８ｎＭから４５０ｎＭの範囲の最終抗体濃度で抗ＡＤＤＬ抗体を５００ｎＭ ｂＡＤＤＬと混合した。対照として、同じ濃度の熱変性抗体（９８℃で３０分間）をｂＡＤＤＬと混合した。抗体−ｂＡＤＤＬ混合物を、シリコン処理微小遠心管（Fischer Scientific, Pittsburgh, PA）内で３７℃で１時間、低速での一定の全体回転と共にインキュベートした。次いで、混合物を初代海馬および／または皮質培養物に適用し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションは、培養培地を除去することにより停止した。細胞を、既知の方法を使用して固定化および固定化後処理に供した。次いで、細胞を、アルカリホスフェート（ＡＰ）と複合化したストレプトアビジンと共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、TROPIX（登録商標）CDP（登録商標）−Ｓｔａｒ化学発光基質（LIFE TECHNOLOGIES（商標）, Carlsbad, CA）と室温で３０分間反応させた。ENVISION（登録商標）マイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Waltham, MA）により、ｂＡＤＤＬ結合強度を測定および記録した。
ＥＬＩＳＡ。ビオチニル化ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬｓ）またはモノマーＡβ１−４０もしくはＡβ１−４２を、ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１μΜのコーティング試薬と共に大容量ストレプトアビジンコーティングプレート（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）に加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴＷＥＥＮを含むＰＢＳで（６回）、次いでＰＢＳ単独で（３回）洗浄してから、ＰＢＳ中５％の無脂肪乾燥乳で、ウェルを室温で１時間遮断した。次いで、ウェルを洗浄し、抗体試料の連続希釈物をプレートに添加し、室温で２時間結合させた。インキュベーションおよび洗浄の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に複合化された（１：１０００；室温で１時間）ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ二次抗体で抗体結合を検出した。ＨＲＰ標識を、基質としてテトラメチルベンジジン（Ｖｉｒｏｌａｂｓ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を用いて可視化し、マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍで読み出した。
例２：抗−ＡＤＤＬ抗体の選択
ヒト化抗体ライブラリのパニング。ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体、ｈ３Ｂ３の親和性成熟ライブラリ（米国特許出願公開第2006/0228349号および米国特許出願公開第2008/0175835号を参照されたい）を構築し、軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の一部をランダム突然変異生成に供した。全ＣＤＲ３領域を網羅するため、２つのサブライブラリを構築した。一方のライブラリは、親重鎖可変領域、および軽鎖ＣＤＲ３の左半分の突然変異アミノ酸で構成され、他方は、軽鎖ＣＤＲ３の右半分で構成された。重鎖ＣＤＲランダム突然変異生成に対しては、３つのサブライブラリを用いて同様の戦略を使用した。
ヒト化３Ｂ３（ｈ３Ｂ３）を、当該技術分野において知られている方法を使用して親和性成熟に供した。ｈ３Ｂ３可変領域をＦａｂディスプレイベクター（ｐＦａｂ３Ｄ）においてクローニングした。このベクターにおいて、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ定常領域のＣＨＩドメインおよびカッパ定常領域に適合するようにインフレーム挿入された。Ｆａｂ３Ｄにおいて、ｍｙｃエピトープおよび６つの連続ヒスチジンアミノ酸はＣＨＩ配列に従い、次いでこれがディスプレイのためにファージｐＩＩＩタンパク質に連結される。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３における全ての位置が、ＰＣＲプライマー中に構築された縮重オリゴヌクレオチド配列を使用してランダムに突然変異された。物理的サイズに対応するために、サブライブラリを、それぞれ５〜６アミノ酸に集中するように構築した。ヒト３Ｂ３（ｈ３Ｂ３）のベクターＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用して、突然変異ＰＣＲプライマーにより重鎖および軽鎖の両方を増幅した（表１）。ＰＣＲ増幅の後、合成されたＤＮＡ断片を１．３％アガロースゲル上で分離し、プライマーを除去し、軽鎖可変クローニングのクローニング部位に対しては制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩを用い、重鎖可変クローニングに対してはＸｈｏＩおよびＡｐａＩを用いて可変断片を分解させた。
ｐＦａｂ３Ｄファージディスプレイベクターにおいて親和性成熟化ライブラリを構築するために、ｐＦａｂ３Ｄ−３Ｂ３ ＤＮＡを制限酵素の同じ対で分解し、精製し、重鎖または軽鎖可変領域のＰＣＲ断片を、１６℃で一晩、Ｔ４リガーゼ（Invitrogen）でライゲーションした。次いで、ライゲーション生成物を大腸菌ＴＧＩエレクトロポレーションコンピテント細胞（Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA）内にトランスフェクトし、細菌培養物のアリコートを、ＬＢ寒天−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上に播種して、ライブラリサイズを滴定した。残りの培養物を、カルベニシリンを含む大型プレート上に播種して、大腸菌ライブラリストックのために３０℃で一晩インキュベートするか、または、室温および３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Invitrogen, Carlsbad, CA、１０１１ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。次いで、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含む２ＹＴ培地を添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、カナマイシン（７０μｇ／ｍＬ）を添加し、培養物を振盪しながら３０℃で一晩成長させた。ファージ培養上清を濾過し、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール／ＮａＣｌ、ＰＢＳ中に再懸濁、０．２２μｍフィルタで滅菌、およびファージライブラリパニング用にアリコートを作製）での沈殿により濃縮した。
次いで、ファージライブラリパニングを、表２に要約されるように行った。
Ｆａｂディスプレイファージライブラリからの入力ファージ（１００μｌ、約１０１１〜１２ｐｆｕ）を、９００μｌの遮断溶液（ＰＢＳ３％の無脂肪乾燥乳）で遮断して、ファージ表面への非特異的結合を低減した。磁気分離機内で２００μΤのビーズ懸濁液を回収し、上清を除去することにより、ストレプトアビジンコーティングビーズを調製した。次いでビーズを１ｍＬの遮断溶液に懸濁させ、回転ミキサー上に３０分間設置した。非特異的ストレプトアビジン結合ファージを除去するために、遮断されたファージライブラリを、遮断されたストレプトアビジンコーティングビーズと混合し、回転ミキサー上に３０分間設置した。除外プロセスからのファージ懸濁液を、新たな管に移し、２００μｌの抗原、１０％ ｂＡＤＤＬを添加し、抗体および抗原結合のために２時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を遮断されたストレプトアビジンコーティングビーズに添加し、回転ミキサー上で１時間インキュベートして、ストレプトアビジンビーズ上に抗体／抗原複合体を捕捉した。捕捉された１０％ ｂＡＤＤＬ／ファージ複合体を、ＰＢＳ／０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０で５回、次いでＰＢＳ単独で２回洗浄した。結合したファージを、ｂＡＤＤＬから２００μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）で溶出し、２０分間インキュベートした。次いで、溶出されたファージを、５０ｍＬ管に移し、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和し、０．６〜０．８の間のＯＤ６００ｎｍを有する１０ｍＬの大腸菌ＴＧＩ細胞に添加した。振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした後、培養物アリコートをＬＢ寒天−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上に播種して出力ファージ数を滴定し、残りの細菌を遠心分離して、５００μｌの２ｘＹＴ培地（Teknova, Hollister, CA）で懸濁させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％グルコースを含有するバイオアッセイＹＴ寒天プレート（Teknova, Hollister, CA）上に播種した。バイオアッセイプレートを３０℃で一晩成長させた。各パニングラウンド後、単一のコロニーをランダムに選択して、９６ウェルプレート内でファージを生成した。９６ウェルプレート内でのファージ調製のための手順は、上述の手順と同様であるが、但しファージ沈殿ステップは使用しなかった。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む１２０μｌの２ｘＴＹ培地中で成長するコロニーを含有する培養プレートを、HIGRO（登録商標）振盪機（Genomic Solutions, Ann Arbor, MI）において、４５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。ファージ上清（約１００μｌ）を、上述のＡＤＤＬ結合ＥＬＩＳＡにおける分析に直接使用した。１つの違いは、ＡＤＤＬへのファージの結合が、ＨＲＰに複合化した抗Ｍｌ３抗体（Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha、WI）で検出されたことである。
例３：抗ＡＤＤＬ抗体の特定
軽鎖親和性成熟化研究から、７つのクローン（１１．４、１７．１、１４．２、１３．１、１９．３、７．２および９．２）のパネルが、ファージ／Ｆａｂ ＥＬＩＳＡにおいて、ｈ３Ｂ３と比較して、ＡＤＤＬへの強い結合活性を示した。表３は、親抗体ｈ３Ｂ３に対する、軽鎖親和性成熟化ライブラリから選択されるクローンのアミノ酸類似性を示す。
表４は、親抗体ｈ３Ｂ３の軽鎖のＣＤＲ３と比較した、選択されたクローンの軽鎖（ＬＣ）のＣＤＲ３におけるアミノ酸配列を要約している。
表５は、選択されたクローンおよび親抗体ｈ３Ｂ３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の位置（２１〜１１７位）の配列を示す。各クローンのＣＤＲ３は、太字で示されている。
例４：親和性成熟３Ｂ３抗体のＩｇＧ変換
７つのリードＦａｂクローン（１１．４、１７．１、１４．２、１３．１、１９．３、７．２および９．２）を、ＩｇＧ変換のために選択した。変換されたＩｇＧは、プラスミド系ベクターを使用して発現された。発現ベクターは、それらが可変領域を除く全ての必要な成分を含有するように構築された。基本ベクターにおいて、軽鎖および重鎖の両方の発現は、ヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより駆動された。ＩｇＧ変換に選択された７つのクローンにおいて、重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（配列番号３３および３４）とインフレーム融合され、一方軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域（配列番号３５および３６）とインフレーム融合された。培養培地内への抗体の分泌を媒介する重鎖（配列番号３７および３８）ならびに軽鎖（配列番号３９および４０）リーダー配列はまた、それに従って可変領域とインフレーム融合された。重鎖発現ベクターの場合、定常領域は、異なるサブクラスアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２から選択され得る。リーダー配列と定常領域との間で、遺伝子間配列は、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮクローニング戦略（Clontech, Mountain View, CA）を使用した、導入される可変領域と５’端でのリーダー配列および３’端での定常領域との継ぎ目のないインフレーム融合のためのクローニング配列を含有する。IN-FUSION Dry-Down PCR Cloning Kit（Clontech, Mountain View, CA）は、可変領域のＰＣＲ増幅に使用された。ドライダウンクローニングキットは、ＰＣＲ反応に必要な全ての成分を含有していた。ＰＣＲプライマーおよびテンプレートＤＮＡが追加された。発現ベクターは、ＥＢＶウイルスゲノムからのｏｒｉＰを保有する。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１対は、多くの場合、トランスフェクトされた細胞内の発現ベクターの存在を長期化するために使用され、また、２９３ＥＢＮＡ細胞、カナマイシン選択マーカーのための細菌配列、および大腸菌内の複製源における長期化された発現のための、発現期間の延長に広く使用される（Lindner, et al. (2007) Plasmid 58:1-12）。可変領域が挿入されると、ＩｇＧは哺乳動物細胞内で直接発現した。本明細書における全ての重鎖可変領域は、ＩｇＧ１発現ベクター（ｐＶ１ ＪＮＳＡ−ＢＦ−ＨＣＧ１）内にクローニングされ、軽鎖可変領域は、適合するカッパまたはラムダ発現ベクター（ｐＶ１ ＪＮＳＡ−ＧＳ−ＦＢ−ＬＣＫ）内にクローニングされた。
例５：親和性熟成３Ｂ３抗体クローニングおよび発現
７つのリードクローン（１１．４、１７．１、１４．２、１３．１、１９．３、７．２および９．２）を、モノクローナル抗体として生成し、さらなる特性決定のために精製した。得られた抗体発現ベクターに対するクローニング手順は、以下の通りであった。可変領域をＰＣＲ増幅したが、ＰＣＲ反応は、高忠実度ＰＣＲマスターミックス、テンプレート（１μＬ）、ならびに順方向および逆方向プライマー（それぞれ１μＬ）を含有する２５μＬの体積で行われた。ＰＣＲ条件：９４℃、２分間を１サイクル；９４℃、１．５分間を２５サイクル；６０℃、１．５分間；７２℃、１．５分間および７２℃、７分間；除去するまで４℃。次いで、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで分解させ、QIAQUICKプレートキット（Qiagen, Venlo, The Netherlands）で精製した。１００ナノグラムの対応する以前に線形化された重鎖または軽鎖ベクターを、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ反応（IN-FUSION Dry-Down Cloning Kit, Clontech, Mountain View, CA）により、１０ｎｇのＰＣＲ断片にアニールした。反応混合物をＸＬ２ Ｂｌｕｅ ＭＲＦコンピテント細胞に転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する寒天プレート上に一晩播種した。軽鎖コンストラクトをＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｏｔＩで分解させ、重鎖コンストラクトをＡｓｐＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで分解させて、制限分析により構造をチェックした。全てのクローンに対するＤＮＡ配列を、配列分析により確認した。
配列決定により、軽鎖および重鎖ＤＮＡが２９３ ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）内にトランスフェクトされたことが確認された。２９３ ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ細胞は、293 Transfectin（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用してトランスフェクトされた。ＥＢＮＡ単層細胞は、ポリエチレンイミン系トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で、３７℃／５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離し、０．２２μｍ濾過システム（Millipore, Billerica, MA）を通して濾過し、次いでCENTRICON遠心分離フィルタ（Millipore, Billerica, MA）により濃縮した。濃縮された培地を、結合緩衝液（Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）と１：１で混合し、その後事前に平衡化されたタンパク質Ａ／Ｇカラム（Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）またはＨＩ−ＴＲＡＰ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（GE Healthcare, Waukesha, WI）に投入した。投入されたカラムを結合緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液（Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）で溶出した。溶出された抗体を速やかに中和し、ＰＢＳ緩衝液に対して一晩透析した。透析された抗体をAMICON遠心分離フィルタ（Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）で濃縮し、タンパク質濃度をＯＤ２８０ｎｍで１．３４ｍｇ／ｍＬの吸光係数で測定した。精製された抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、またはタンパク質ＬＡＢＣＨＩＰ（Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA）を使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元条件下で実行した。
例６：親和性成熟３Ｂ３抗体の特性決定
ＥＬＩＳＡ。選択された抗ＡＤＤＬ抗体、すなわち、親抗体ｈ３Ｂ３から得られたものを、まず三方向ＡβＥＬＩＳＡにおいて評価して、抗体のモノマーＡβ、ＡＤＤＬ、および線維Ａβへの結合を評価した。ポリクローナル抗ＡＤＤＬ ＩｇＧ（Ｍ９０／１；Bethyl Laboratories, Inc.、Montgomery, TX）を、IMMULON 3 REMOVAWELLストリップ（Dynatech Labs, Chantilly, VA）上で、０．２５ｍｇ／ウェルで室温で２時間播種し、ウェルをＴＢＳ中２％ＢＳＡで遮断した。Ｆ１２中１％ＢＳＡで希釈した試料（モノマーＡβ、ＡＤＤＬ、または線維Ａβ）をウェルに添加し、４℃で２時間結合させ、室温で３回、ＢＳＡ／ＴＢＳで洗浄した。ＢＳＡ／ＴＢＳ中で希釈されたモノクローナル抗体を室温で９０分間インキュベートし、マウスＩｇＧに対するVECTASTAIN（登録商標）ＡＢＣキットで検出した。ＨＲＰ標識をBIO-RADペルオキシダーゼ基質で可視化し、Dynex MRX-TCマイクロプレートリーダー上で４０５ｎｍで読み出した。
図１に示されるように、抗体９．２を除き、抗ＡＤＤＬ抗体は全て、ｈ３Ｂ３、選択的（Ｃｏｍｐ１および３：ＡＤＤＬにのみ結合）、非選択的（Ｃｏｍｐ ２：評価した全ての形態のＡβに結合）コンパレータ、ならびに対照（抗体なし）と比べて、ＡＤＤＬへの優先的結合を示した。抗体９．２は、全ての形態のＡβへの低い結合を示したが、これは、その結合親和性が、ＩｇＧ変換および／または抗体生成の間悪影響を受けたことを示している。このアッセイにおける抗体のＡＤＤＬ：モノマーおよびＡＤＤＬ：線維結合の比の要約を、表６に示す。
細胞ベース結合アッセイ。いくつかの抗ＡＤＤＬ抗体は、ＡＤＤＬへの優先的結合を有するが、初代海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合を防止することができないことが示されている（Shughrue, et al. (2010) Neurobiol. Aging 31:189-202）。ＡＤＤＬへの優先的結合のみでは、有効性の正確な予測因子とはなり得ないことから、同時にニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断する抗ＡＤＤＬ抗体を特定することが望ましく、これは以下のように細胞ベース結合アッセイにおいて評価された。抗ＡＤＤＬ抗体を、５００ｎＭ ｂＡＤＤＬと混合し、最終抗体濃度を１．８ｎＭから４５０ｎＭの範囲とした。対照として、同じ濃度の熱変性抗体（９８℃で３０分間）をｂＡＤＤＬと混合した。抗体−ｂＡＤＤＬ混合物を、シリコン処理微小遠心管（Fischer Scientific, Pittsburgh, PA）内で３７℃で１時間、低速での一定の全体回転と共にインキュベートした。次いで、混合物を初代海馬および／または皮質培養物に適用し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションは、培養培地を除去することにより停止した。細胞を固定化および固定化後処理に供した。次いで、細胞を、アルカリホスフェート（ＡＰ）と複合化したストレプトアビジンと共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、TROPIX CDP-Star化学発光基質（Life Technologies, Carlsbad, CA）と室温で３０分間反応させた。ENVISIONマイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Waltham, MA）により、ｂＡＤＤＬ結合強度を測定および記録した。
本試験の結果は、本明細書における抗ＡＤＤＬ抗体、具体的には抗体１９．３が、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を劇的に低減することを示した（図３）。しかしながら、抗体が熱変性されると、このアッセイにおける抗体活性の顕著な低減が観察された（図３）。
同じ細胞ベースアッセイにおいて、過剰のＡβモノマーがニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断する１９．３抗体の能力を低減し得るかどうかを決定した。この分析では、過剰のＡβモノマーが抗体１９．３のin vitro有効性を低減しないことが示された。抗体１９．３単独のＩＣ５０は１５．４ｎＭであり、一方過剰モノマーの存在下での抗体１９．３のＩＣ５０は１５．３ｎＭであった。
ＥＣ５０の停止。高タンパク質結合プレート（Costar, Corning, Lowell, MA）を、ＰＢＳ中の標的リガンドで、４℃で一晩コーティングした。コーティングタンパク質の濃度は、Ａβ４０（American Peptide, Sunnyvale, CA）に対して１００ｐｍｏｌ／ウェル、ＡＤＤＬに対して５０ｐｍｏｌ／ウェルであった。ＡＤＤＬは、例１に記載のように生成した。翌日、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ ＴＷＥＥＮ−２０（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）で５回洗浄し、カゼイン遮断緩衝液（Thermo Scientific, Waltham, MA）および０．０５％ ＴＷＥＥＮ−２０で一晩遮断した。例３に記載のように生成された３つの代表的抗体、１９．３（図４Ａ）、１９．３Ｓ３３（図４Ｂ）、および１９．３Ｔ３３（図４Ｃ）を、１２点の３倍希釈系列で、１５μｇ／ｍｌから０ｇ／ｍｌで試験した。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ複合化抗ヒトＩｇＧ（ThermoScientific, Waltham, MA）を０．０８μｇ／ｍｌで添加した。室温で４５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、TROPIX（登録商標）CDP（登録商標）-Star化学発光基質（LIFE TECHNOLOGIES（商標）, Carlsbad、CA）を添加した。３０分後にENVISION（登録商標）マイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Waltham, MA）上で発光を検出した。GRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）ソフトウェアを使用して、曲線フィッティングを完了した。
例７：１９．３変異体の調製
１９．３抗体のアミノ酸配列の評価を行って、脱アミドの潜在的部位を特定した。治療抗体のＣＤＲ内に存在するアスパラギンおよびアスパラギン酸残基は、脱アミドおよびイソアスパラギン酸塩形成を生じ得（Valsak & Ionescu (2008) Curr. Pharm. Biotech. 9:468-481;Aswad, et al. (2000) J. Pharm. Biomed. Anal. 21:1129-1136）、その形成は、抗体の結合能を改変し、一方で治療剤としての使用のための抗体の有効性を低減し得る。したがって、抗体１９．３の軽鎖ＣＤＲ１の３３位におけるアスパラギン残基が改変された。１９．３抗体の変異体は、ＣＤＲ１における３３位のアスパラギンのセリン、トレオニン、またはグルタミン酸による置換により生成された（表７）。３３位としてのアスパラギンのアスパラギン酸による置換もまた、対照として生成された。
抗体１９．３の軽鎖ＣＤＲ１の３３位（Ｎ３３）におけるアスパラギンの、Ｎ３３Ｓ、Ｎ３３Ｔ、Ｎ３３Ｅ、またはＮ３３Ｄへの突然変異生成を、QUIKCHANGE II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent Technologies, La Jolla, CA）を使用して、ｐＶ１ ＪＡＳＮ−ＧＳ−１９．３−ＬＣＫの野生型発現ベクターからの部位特異的突然変異生成により行った。ＮのコドンＡＡＴは、１９．３ Ｎ３３ＳにおけるＳのＡＧＴ、１９．３ Ｎ３３ＴにおけるＴのＡＣＴ、１９．３ Ｎ３３ＥにおけるＥのＧＡＡ、または１９．３ Ｎ３３ＤにおけるＤのＧＡＴに突然変異された。また、ＣＤＲ１の３５位（Ｎ３５）におけるアスパラギンに追加的な突然変異を生成し、Ｎ３３Ｓ突然変異と組み合わせた（表７）。さらに、抗体１９．３のＣＤＲ２の５８位におけるアスパラギンでの突然変異を調製した（表８）。新たなコドンは全て、ＤＮＡ配列分析により確認した。これらの変異体の全長ＩｇＧ抗体を生成するために、各軽鎖プラスミドを、２９３ ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）における一時的トランスフェクションのための同種の重鎖プラスミド、ｐＶ１ＪＮＳＡ−１９．３−ＨＣＧ２と対形成させた。発現および精製方法は、上述されている。
表７は、親抗体１９．３の軽鎖のＣＤＲ１と比較した、変異体の軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を要約している。本発明は、軽鎖ＣＤＲ１が以下の表７に示され、またＣＤＲ２およびＣＤＲ３軽鎖ならびに全ての重鎖が１９．３自身に設定された、１９．３の変異体を提供する。
表８は、親抗体１９．３の軽鎖のＣＤＲ２と比較した、変異体の軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を要約している。本発明は、軽鎖ＣＤＲ２が以下の表８に示され、またＣＤＲ１およびＣＤＲ３軽鎖ならびに全ての重鎖が１９．３自身に設定された、１９．３の変異体を提供する。
その後、突然変異が抗体の安定性に対していかなる影響も有するかどうかを決定するために、１９．３変異体を評価した。１９．３親抗体と共に、精製された変異抗体のアリコートを、４℃、２５℃または４０℃で１ヶ月間の様々な条件下でインキュベートしてから、ＥＬＩＳＡ分析に供した。高タンパク質結合プレート（Costar, Corning, Lowell, MA）を、ＰＢＳ中の標的リガンドで、４℃で一晩コーティングした。コーティングタンパク質の濃度は、ＡＤＤＬに対して５０ｐｍｏｌ／ウェルであった。ＡＤＤＬは、例１に記載のように生成した。翌日、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）で５回洗浄し、カゼイン遮断緩衝液（Thermo Scientific, Waltham, MA）および０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０で一晩遮断した。３つの代表的抗体、１９．３、１９．３ Ｎ３３Ｓ、および１９．３ Ｎ３３Ｔを、１２点の３倍希釈シリーズで、１５μｇ／ｍｌから０μｇ／ｍｌで試験した。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ複合化抗ヒトＩｇＧ（ThermoScientific, Waltham, MA）を０．０８μｇ／ｍｌで添加した。室温で４５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、TROPIX CDP-Star化学発光基質（LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA）を添加した。３０分後にENVISIONマイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Waltham, MA）上で発光を検出した。GRAPHPAD PRISMソフトウェア（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）を使用して、曲線フィッティングを完了した。
図４Ｂおよび４Ｃに示されるように、抗体１９．３ Ｎ３３Ｓおよび１９．３ Ｎ３３Ｔは、様々な温度での１ヶ月間のインキュベーション後、１９．３親（ＷＴ、図４Ａ）と比較して向上した結合安定性を有していた。様々なインキュベーション温度におけるこれらの抗体のＥＣ５０の要約を、表９に示す。
１９．３変異体のいくつかのＥＣ５０を決定し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて変異体がＡＤＤＬに対する特異性を維持することが見出された（表１０）。
例８：抗ＡＤＤＬ抗体のIn vitro ＦｃＲｎ結合
固定化ヒトＦｃＲｎに結合および解離する抗ＡＤＤＬ抗体の能力を特性決定するために、７つのｈ３Ｂ３変異抗ＡＤＤＬ抗体を、抗体ＰＫを評価し、非ヒト霊長類における抗体の最終半減期（ｔ１／２）を予測するために使用される代理システムであるBIACORE ＦｃＲｎ結合アッセイにおいて評価した。簡潔に説明すると、精製されたヒトＦｃＲｎタンパク質をBIACORE CM5バイオセンサチップ上に固定し、ＰＢＳＰ（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／ｖ） ＴＷＥＥＮ２０）、ｐＨ７．３を流通緩衝液として使用した。モノクローナル抗体をＰＢＳＰ、ｐＨ６．０で１００ｎＭに希釈し、３分間ＦｃＲｎに結合させて平衡に到達させ、ｐＨ７．３の流通緩衝液中で解離させた。モノクローナル抗体結合の終わりの５秒の時点で報告点（安定性）が挿入され、「結合％」は、ＲＵ安定性／ＲＵ結合（％）として計算された。この分析では、同一のＦｃ配列を有するがＦａｂドメインが異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が、著しい差異をもってＦｃＲｎに結合およびそれから解離し得ることが示された。さらに、中性ｐＨにおける解離とin vivo薬物動態との間に明らかな相関が観察され、遅い解離の割合（すなわち、より高い「結合％」）を有するｍＡｂｓが、in vivoでより短いｔ１／２を示す傾向があった。この特徴は、抗体薬物動態のin vitroスクリーニングツールとして使用された。
ＦｃＲｎ結合アッセイにおける、ｈ３Ｂ３変異抗ＡＤＤＬ抗体、ならびにｈ３Ｂ３、２つのＡＤＤＬ優先抗体（Ｃｏｍｐ１および３）、ならびに非選択的（Ｃｏｍｐ２：評価した全てのＡβ形態に結合）コンパレータ。ｐＨ６．０における抗体の初期の結合、次いで１８０秒からのｐＨ７．３における抗体の解離を示すセンサグラムが生成された（図５）。図５に示されるように、ｈ３Ｂ３と評価された他の抗体との間に、認め得るほどの差があった。ｈ３Ｂ３は、ＦｃＲｎへの高い割合の結合を有したが、本発明の７つの抗ＡＤＤＬ抗体、および２つのコンパレータ抗体は、それより著しく低い結合を示した。
例９：抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の結合親和性
親和性成熟抗体１９．３を、さらなる特性決定に選択した。軽鎖の可変領域に対する完全ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列、それぞれ配列番号１４および１５を決定した。重鎖（配列番号１７）および軽鎖（配列番号１５）可変領域のアライメントを、最も近い生殖細胞系配列（配列番号４７）と共に図６に示す。
BIACORE（商標）（GE Healthcare, Waukesha, WI）およびKINEXA（Sapidyne, Boise, ID）分析を行い、抗ＡＤＤＬ抗体１９．３のＡＤＤＬに対する結合親和性を確認し、モノマーＡβと対比したＡＤＤＬに対する１９．３の選択性を決定した。BIACORE（商標）およびKINEXAベース技術は、抗体およびタンパク質標的等の巨大分子間の結合親和性の測定に広く使用される。
BIACORE（商標）。BIACORE（商標）が基づいている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術において、１つ以上の分子の間の結合相互作用の定量的測定は、センサチップ表面への標的分子の固定化に依存する。標的に対する結合相手は、それらがチップ上を通過する際に捕捉され得る。ＳＰＲは、屈折率の変化を測定することにより、センサチップ表面に近い水層における質量の変化を検出する。試験溶液中の分子が標的分子に結合すると、質量は増加し（ｋａ）、それらが解離すると、質量は減少する（ｋｄ）。この単純な原理が、センサグラム、すなわち、相互作用する分子の結合および解離の連続的なリアルタイムの監視の基礎を成す。センサグラムは、結合の特異性、試料中の分子の活性濃度、反応速度および親和性に関する定量的情報をリアルタイムで提供する。
KINEXA。KINEXA技術（Sapidyne Instruments, Boise, Idaho）は、液相と固相との間の結合イベントではなく、液相中の生体分子結合イベントを特徴付ける結合定数を測定する。溶液中、結合相手は、十分なインキュベーション後に平衡に達する。未結合分子は滴定により定量されるが、これは相手に結合した分子の部分を反映する。KINEXA法は、試験中の分子の修飾を必要としない。KINEXAにより、測定されている反応は、溶液中の非修飾分子間で生じる。したがって、修飾がいかにして「天然の」結合反応を改変するかの懸念が排除される。KINEXA法は、１０−１３Ｍまでの厳密な結合定数のより広い範囲を可能にする。KINEXAソフトウェアはデータ分析を実行するが、これは擬似的な１次近似ではなく、古典的な結合方程式の厳密な解（Ｋｄ計算）に基づく。KINEXAは、任意のデータ操作または範囲選択を必要としない。
表１１に示されるように、抗体１９．３は、BIACORE（商標）アッセイにおいて、モノマーＡβに対する１５０ｎＭの親和性と比較して、ＡＤＤＬに対する４．８ｎＭの親和性を有していた。Ａβモノマーを上回るＡＤＤＬに対する抗体１９．３の３０倍の選択性は、Ａβモノマーと対比してＡＤＤＬに対し１０倍の優先性しか示さなかった親抗体ｈ３Ｂ３に対して見られるものよりも著しく良好であった。
同様に、KINEXAベース平衡定数測定において抗体１９．３を評価した。表１２に示されるように、抗体１９．３は、２．７ｎＭの平衡定数を有していたが、これは、Ａβ４０モノマー結合と対比してＡＤＤＬオリゴマーに対する６倍を超える優先性を示している。
片側ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＡβオリゴマーおよびＡβ１−４０に対する１９．３のＥＣ５０。ＥＣ５０は、全Ａβオリゴマー結合の最大半量を表す。高タンパク質結合プレートを、ＰＢＳ中、４℃で一晩、１００ｐｍｏｌ／ウェルのＡβ１−４０または５０ｐｍｏｌ／ウェルのＡβオリゴマーでコーティングした。翌日、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０で５回洗浄し、カゼイン遮断緩衝液（Thermo Scientific, Waltham, MA）および０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０で一晩遮断した。１９．３抗体を、１２点の３倍希釈シリーズで、０μｇ／ｍｌから１５μｇ／ｍｌで試験した。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ複合化抗ヒトＩｇＧ（ThermoScientific, Waltham, MA）を０．０８μｇ／ｍｌで添加した。室温で４５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、TROPIX CDP-Star（Applied Biosystems, Foster City, CA）を添加した。３０分後にENVISIONプレートリーダー（PerkinElmer, Waltham, MA）上で発光を検出した。GraphPad Prism（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）ソフトウェアを使用して、曲線フィッティングを完了した。この分析では、片側ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、１９．３抗体（ＩｇＧ２アイソタイプ）が、ＡβオリゴマーおよびＡβ１−４０モノマーに対してそれぞれ約１．７ｎＭおよび４．３ｎＭのＥＣ５０を有することが示された（図７Ａ）。この形式では、１９．３抗体は、Ａβ４０モノマーと比較してＡβオリゴマーに対して約３倍大きい最大結合を示し、結合能は約３．７倍大きかった。
ＡβオリゴマーおよびＡβモノマーによる競合結合アッセイ。プレート上に捕捉されたＡＤＤＬおよびＡβモノマーへの抗体１９．３の結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＡＤＤＬおよびＡβモノマーに対するＥＤ５０値は、それぞれ１．７ｎＭおよび４．３ｎＭであった。値は、ＡＤＤＬ調製物中のＡβ１−４２のモノマー濃度に基づいて計算されるため、BIACOREおよびプレートベースＥＬＩＳＡアッセイにより生成された数字は、１９．３抗体の真の親和性および選択性の過小評価を表す。ＡＤＤＬ調製物は、二量体から２４量体までの、およびおそらくはより大きな凝集体の範囲の様々なサイズの可溶性Ａβオリゴマーの混合物を含有し、したがって、ＡＤＤＬのエピトープ濃度は未知である。さらに、ＡβオリゴマーおよびＡβモノマーの両方が存在するin vivoのＣＳＦ試料をより正確に表現するために、Ａβ１−４０モノマーの存在下でのＡβオリゴマーに対する１９．３の親和性を、競合ＥＬＩＳＡ形式で試験した。
まずウェル当たり５０ｐｍｏｌのＡβオリゴマーの調製物でコーティングし、次いで各ウェルに２ｎＭの最終濃度の１９．３抗体を添加することにより、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。１９．３のこの濃度、すなわち２ｎＭは、片側ＥＬＩＳＡにおいて決定されるＡβオリゴマー結合のＥＣ５０濃度を表す（図７Ａ）。滴定曲線において、Ａβ１−４０モノマーを加えて、Ａβオリゴマーコーティング表面から１９．３を競合的に除去すると、５．５μΜのＥＣ５０が得られた。１００ｐｍｏｌ／ウェルを使用して、Ａβ１−４０モノマーコーティングプレートを同様に調製した。カゼイン遮断緩衝剤マトリックス中で１９．３抗体を４ｎＭで各ウェルに適用し、ＡβオリゴマーまたはＡβ１−４０と室温で３０分間振盪しながら相互作用させた。ＡβオリゴマーまたはＡβ１−４０に対する、１０μΜから開始する１２点の３倍濃縮曲線を、抗体含有ウェルに適用した。Ａβオリゴマーでコーティングされたプレートに対しては、Ａβ１−４０をウェルに添加し、Ａβ１−４０プレートに対しては、Ａβオリゴマーをウェルに添加した。プレートを室温で１時間半インキュベートした。残りの抗体結合およびＥＣ５０計算の両方の検出は、片側ＥＬＩＳＡアッセイの場合のように決定した。
この分析は、滴定曲線において、Ａβ１−４０モノマーを加えて、Ａβオリゴマーコーティング表面から１９．３を競合的に除去すると、５．５μΜのＥＣ５０が得られることを示していた（図７Ｂ）。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするためにウェル当たり１００ｐｍｏｌのＡβ１−４０モノマーが使用された場合、および抗体結合のために競合させるようにＡβオリゴマーが使用された場合、ＥＣ５０は８．７ｎＭであった。これは、競合結合アッセイにおいて、１９．３が、Ａβ１−４０モノマーと比較して約６３０：１のＡβ１−４２オリゴマーに対する親和性を有することを示していた。換言すれば、５０％の１９．３をＡβオリゴマーから移動させるために必要なＡβ１−４０の濃度は、Ａβ１−４０への１９．３の結合を移動させるために必要なＡβオリゴマーの濃度よりも約６００倍高い。Ａβモノマーの１５００ｐＭと比較して、Ａβオリゴマーの０．２ｐＭまでの濃度が、ＡＤ患者からのＣＳＦにおいて報告されている（Georganopoulou, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:2273-2276）。したがって、Ａβオリゴマーに対する１９．３の感度および選択性は、Ａβ１−４２の可溶性オリゴマーの作用により媒介される疾患の治療におけるこの抗体の使用を示唆している。
Ａβ１−４２の可溶性オリゴマーと対比してモノマーＡβ１−４０に対する抗体１９．３の計算された親和性を決定するために、ＡＤＤＬの平均分子量を考慮した（Hepler, et al. (2006) Biochemistry 45:15157-15167）。ＡＤＤＬに対し測定された９ｎＭのＥＣ５０により、抗体１９．３は、モノマーＡβ１−４０と比較して、ＡＤＤＬに対する約６００倍の選択性を示す。モノマーＡβ１−４２の分子量（４．５ｋＤａ）と比較して、ＡＤＤＬの分子量（１７５ｋＤａ）を含めると、ＡＤＤＬに対する抗体１９．３のＩＣ５０値は０．２８ｎＭと計算され、モノマーに対する選択性は１７，０００超であった。
ＡＬＰＨＡＬＩＳＡアッセイ。ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ技術（PerkinElmer）は、生体試料中の検体の検出用に設計されたビーズベース免疫測定法である。この化学発光アッセイは、有利にも従来のＥＬＩＳＡに匹敵する目覚しい感度、幅広いダイナミックレンジおよび確実な性能を示す。ＡＬＰＨＡＬＩＳＡにおいて、モノマーＡβ（Ａβ１−４０）と対比したＡＤＤＬに対する１９．３抗体の選択性および感度を決定した。この分析は、ＡＤＤＬの０．２ｐＭでのシグナルがＡβ１−４０の１０００ｐＭにおけるシグナルよりも大きいことを示し、このアッセイにおける約５０００のモノマーＡβと対比したＡＤＤＬの選択性を示した。
オリゴマー選択性。合成ＡＤＤＬまたはＴｇ２５７６マウス脳から抽出されたＡＤＤＬを調製し、非修飾タンパク質の光誘導架橋（ＰＩＣＵＰ）法を使用して架橋させた（Bitan & Teplow (2004) Acc. Chem. Res. 37:357-64）。抗体１９．３を添加し、抗体：ＡＤＤＬ複合体をアミン反応性架橋剤により架橋させ（ＣｏｖａｌＸ技術；Bich & Zenobi (2009) Curr. Opin. Struct. Biol. 19:632-39）、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分離した。抗体１９．３とＡＤＤＬとの架橋複合体は、二次抗Ａβ抗体、８２Ｅ１、および抗ヒトカッパ抗体を使用したＥＬＩＳＡにより検出された。１９．３：ＡＤＤＬ複合体は、可溶性Ａβオリゴマーに対応する保持時間で溶出し、モノマーＡβは、後の溶出分画中に溶出した。野生型マウス脳抽出物は、シグナルを示さなかった。これらの結果は、抗体１９．３が合成および内因性ＡＤＤＬに結合すること、ならびに合成および内因性ＡＤＤＬが同様のサイズ分布を有することを示していた。この分析では、抗体１９．３がＳＥＣによりＡβモノマーから分離された一連の可溶性Ａβオリゴマー種に対する親和性を有することが示された。
脳組織における抗体１９．３のβ−アミロイドへの結合。抗体１９．３がβ−アミロイド斑堆積物に結合するかどうかを評価するために、β−アミロイド凝集体が脳内に存在する８〜９ヶ月齢の雌Ｔｇ２５７６形質転換マウスに、２、２０、または５０ｍｇ／ｋｇの抗体をＩＶ注射し、脳切片を採取して顕微鏡で評価した。アミロイドマーカーチオフラビン−Ｓによる共局在化試験では、β−アミロイドの優先的染色が示された。この分析の結果は、抗体１９．３が脳内に存在し、典型的には、５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投薬から２４時間後ではＴｇ２５７６脳において斑と共局在化しないことを示していた。しかしながら、抗体１９．３の線維斑との共局在化が時折見られた。これらの結果は、抗体１９．３が、線維Ａβ種に対して非常に低い非選択的親和性を有することを示している。さらに、これらの試験の全てにおいて、抗体１９．３媒介性斑溶解または微小出血の証拠は見られなかった。
血管β−アミロイド斑堆積物に結合する抗体１９．３の能力を、同じ試験において評価した。この分析の結果は、血管または血管に関連したβ−アミロイドの１９．３抗体染色が見られないことを示していた。したがって、ＡＤに罹患した患者の治療において本発明の抗体を使用して血管原性浮腫の可能性が低減される。
例１０：抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の生物物理学的特性決定
抗体凝集体形成の可能性を評価するための生物物理学的特性決定を行って、本明細書における抗ＡＤＤＬ抗体がストレス条件下で安定であり、治療剤としての使用に好適であることを示した。抗ＡＤＤＬ抗体１９．３を５０ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮し、５．０から８．０の範囲のｐＨでいくつかの製剤に入れた。試料の２つの組を、３７℃および４５℃で１週間インキュベートした。試料の第３の組を−７０℃とし、５回の一連の凍結／解凍サイクルを開始した。サイズ排除クロマトグラフィー分析では、抗体調製物が、主に（＞９５％）モノマー状態であり、モノクローナル抗体調製物では典型的である二量体が少量であることが示された。二量体およびより高分子量のオリゴマーの量は、全ての緩衝液にわたり温度ストレス後に増加せず、断片化は観察されなかった。表１３に要約されるように、近紫外濁度分析でもまた、凝集がないことが示された。
凍結／解凍ストレス試料は、濁度において緩衝液依存的増加を示し、これは、他のモノクローナル抗体に匹敵していた。５０ｍｇ／ｍＬにおける粘度は２センチポアズ未満であったが、２０センチポアズのレベルが一般に皮下注射の実用限界であると考えられているため、これは許容され得る注射粘度を示す。示差走査熱量測定でもまた許容され得る熱安定性が明らかとなり、Ｆａｂは約７２℃においてアンフォールディングであり、最も安定性の低いＣＨ２ドメインは６５℃超でアンフォールディングであった。総合すると、抗体１９．３は、非常に良好な構造安定性を示し、生物物理学的特性は皮下送達に匹敵していた。
例１１：ヒトＣＳＦおよび脳におけるＡβオリゴマー
いくつかの出版物（Mayeux, et al. (2003) Neurology 61:1185-1190;Mechta, et al. (2000) Arch. Neurol. 57:100-105;Fukumoto, et al. (2010) FASEB J. 24: 2716-2726;Karran, et al. (2011) Nature 10:698-712;Delacourte, et al. (2002) Neurology 59:398-407）に記載のデータを分析して、ＡＤおよび健常対象の脳およびＣＳＦに存在するＡβの様々な種のレベルを決定した。この分析（表１４）は、可溶性オリゴマーＡβが、ＡＤに罹患した対象の脳およびＣＳＦにおいて最も少ないＡβの種であることを示した。
抗体１９．３および８２Ｅ１（Immunobiological Laboratories(IBL), Inc., Minneapolis, MN）の組み合わせをＡβオリゴマー選択的サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用して、ヒトＣＳＦ試料におけるＡβオリゴマーの内因性レベルをさらに決定した（図８Ａおよび８Ｂ）。２つの別個の試料コホートにおいて、Ａβオリゴマーの存在により生成される蛍光シグナルは、若年または健常な年齢適合対照と比較して、ＡＤ（推定ＡＤとしての２５未満のＭＭＳＥスコアを使用して臨床診断された）のＣＳＦにおいて有意に上昇した。観察されたＡβオリゴマーの絶対レベルは、Precision Medicine（Solana Beach, CA）からのＣＳＦ試料において、ｔ−検定、ｐ＜０．０００４の両側マン−ホイットニースコアにより、ＡＤ（ｎ＝２０）で２．１±０．６１ｐｇ／ｍＬ、年齢適合対照（ｎ＝１０）で０．５３±０．２６ｐｇ／ｍＬであった（図８Ａ）。観察されたＡβオリゴマーの絶対レベルは、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）からのＣＳＦ試料において、ｔ−検定、ｐ＜０．００２１の両側マン−ホイットニースコアにより、ＡＤ（ｎ＝１０）で１．６６±０．５ｐｇ／ｍＬ、対照（ｎ＝１０）で０．２４±０．０５ｐｇ／ｍＬであった（図８Ｂ）。２つのコホートを組み合わせると、診断されたＡＤのＣＳＦ試料の９０％が、０．４２ｐｇ／ｍＬのＬＬｏＲＱより上であり、一方、年齢適合対照の２０％または若年対照の１０％のみが、この限度より上であった。全ての値は、０．０４ｐｇ／ｍＬのＬｏＤより上であった。Ａβ４０およびＡβ４２モノマーレベルを、Bioreclamationから入手したＣＳＦ試料において測定すると（それぞれ図９Ａおよび９Ｂ）、それらは、Ａβ１−４０に関してはＡＤおよび対照のＣＳＦの間で同等であり（図９Ａ）、一方Ａβ１−４２に関してはＡＤ試料において有意に低減した（図９Ｂ）。これは、以前に、ＡＤ ＣＳＦの特徴として報告されており（De Meyer, et al. (2010) Arch. Neurol. 67:949-956;Jack, et al. (2010) Lancet Neurol. 9:119-128）、これらの試料の正確な診断を確証した。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、ＡＤ ＣＳＦ試料におけるＡβ１−４２のより低いレベルは、ＡＤ脳のアミロイド堆積物におけるＡβ１−４２の保持に起因すると考えられる。
可溶性オリゴマーＡβに対する本発明の抗体の特異性および選択性を考慮して、本発明の抗体は、一度本発明の抗ＡＤＤＬ抗体が脳に到達すると、より豊富なＡβの種により希釈されない（表１４）ため、比較的低い用量で治療上の利点を提供し得る。理論に束縛されることを望まないが、他の抗Ａβ免疫治療の有効性の欠如は、その特異性の欠如に起因し得ると考えられる。特に、これらの他の抗体は極めて豊富なＡβモノマーおよび／またはＡβ斑種に結合する（表１５）ことを考慮すると、有効な用量を得ることは困難となり得る。
例１２：１９．３の薬物動態分析およびＡＤのモデルにおける有効性
ヒトＦｃＲｎマウスにおける薬物動態試験。ヒトＦｃＲｎマウス（ヘテロ接合 Ｔｇ２５７６）（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）は、モノクローナル抗体薬物動態を評価するための貴重な代理システムであることが示されている。ヒトＦｃＲｎマウスにおける抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の薬物動態を特性決定するために、３匹の動物に、尾静脈を介して抗体１９．３を１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。次いで、抗体１９．３またはｈ３Ｂ３のＩＶ投与後０、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０および３５０時間の時点で１０の一連の血液試料を採取し、検証された抗ヒトＩｇＧ免疫測定法を使用して、抗体の血中レベルを決定した。図１０に示されるように、抗体１９．３の血中レベルは二段階で低下し、見掛けのｔ１／２ は７７±６時間であり、これは、親抗体ｈ３Ｂ３の約２９±９時間の半減期よりも著しく長かった。これらの半減期は、in vitro FcRn結合アッセイにより予測された差に一致していた（図５）、排除段階最終半減期は、非コンパートメントモデル（WINNONLIN（登録商標）, Pharsight, Sunnyvale, CA）、および投薬後３日目と１５日目との間のデータ点を使用して決定された。
ラットにおける抗体１９．３の薬物動態。雄のラットに、２、１０、または５０ｍｇ／ｋｇの抗体１９．３をＩＶ注射した。注射から２４時間後に、血漿、ＣＳＦ、および脳内レベルを測定した。３つ全てのコンパートメントにおいて、抗体レベルの線形の用量依存的増加が見られた。ＣＳＦおよび脳内レベルは、それぞれ血漿濃度のおよそ０．１％および０．０３％であった。
イヌにおける抗体１９．３の薬物動態。２匹の雄のビーグル犬に、１０ｍｇ／ｋｇの抗体１９．３をＩＶ注射した。注射から４８時間後に、血清、ＣＳＦ、および脳内レベルを測定した。注射によって、イヌの血清において抗体の著しい濃度が生成され、ＣＳＦおよび脳において測定可能な濃度が生成された（表１６）。
ＣＳＦおよび脳内レベルは、４８時間でそれぞれ血清濃度の０．１５％および０．０２％であった。
非ヒト霊長類における薬物動態試験。霊長類における１９．３の予測されるｔ１／２を確認するために、大槽ポートアカゲザルのコホートにおいて抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の霊長類薬物動態試験を行った。６匹の動物（雄３匹／雌３匹）に、抗体１９．３（５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内ボーラスまたは皮下注射を施し、抗体投与後に血液試料を採取した。同時に、０、２、４、８、１２、２４、３０、４８、５４および７２時間の時点で大槽ポートからＣＳＦ試料を採取し、血清およびＣＳＦ中の抗体１９．３の濃度を、抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。単回ＩＶボーラス注射により抗体１９．３を動物に投与すると、２５４±２８時間のｔ１／２が観察され、一方、皮下投与後では、２０４±４９時間のｔ１／２が見られた。さらに、抗体１９．３は、霊長類ＣＳＦ内に横断することができ、最初の４８時間の間に濃度が増加し、投与された抗体の約０．１％でピークを迎えることが観察された（図１２）。
第２の試験において、試験１日目および７日目に、２０ｍｇ／ｋｇの抗ＡＤＤＬ抗体１９．３を６匹のアカゲザルにＩＶ投与した。血漿およびＣＳＦを投薬後複数の時点で採取した。投薬により、抗体の著しい血漿濃度がもたらされた。第１および第２の投薬に対して測定された値において、有意な差は見られなかった。したがって、２つの投薬の値を、定量分析のために組み合わせた。最終血漿半減期は１０．８日日目で測定され、クリアランスは０．７５ｍＬ／ｈｒ／ｋｇであった。抗体投薬により、動物のＣＳＦにおいて、血漿中と同様の経時変化を伴って測定可能なレベルがもたらされ、抗体のＣＳＦ濃度は、対応する血漿レベルの約０．０５％であった。
追加的な反復投薬試験において、３匹の雄および３匹の雌のアカゲザルに、抗体１９．３（１００ｍｇ／ｋｇ）の週１回の投薬を３回行った。最後の投薬後に臨床的および血清学的評価項目を測定し、２８日の回復期間後には、いずれの動物においても、死亡、身体的兆候、または体重もしくは食物消費の変化は見られなかった。さらに、関連した血液所見は見られなかった。したがって、アカゲザルにおける無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、１００ｍｇ／ｋｇまでであった。意識のある動物における心臓血管呼吸機能および体温の遠隔測定では、２匹のサルにおいて、同時期の非補正ＱＴ間隔（−８％以下）の減少と共に、およびＨＲ補正ＱＴ間隔（ＱＴｃｉ間隔）に対する影響なしに、収縮期および拡張期血圧ならびに心拍数の増加が見られることが示された。さらに、体温の若干の増加が見られたが、心拍数および呼吸の深さに対する影響はなかった。
アカゲザルにおける抗体１９．３の生体内分布。特定の試験において、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）と組み合わせたＰＥＴを使用して、アカゲザルにおける抗体３Ｄ６（バピネオズマブのマウス前駆体）と比較した抗体１９．３のin vivo生体内分布が評価された。３匹の雄の成体サルが試験に使用された。抗体１９．３および３Ｄ６を６４Ｃｕで放射性標識化した。血液および血漿カウントを測定し、４８時間にわたり様々な時間間隔で全身ＰＥＴ／ＣＴスキャンを得た。ＰＥＴ／ＣＴ画像化では、非排出器官／組織に対する抗体間の大きな標的外結合取り込みの差は示されなかった。最も高いシグナルが、血液プールを反映する心臓において観察された。肝臓および腎臓は、標識化された抗体およびより小さいタンパク質断片の排出器官とみなされた。ＰＥＴ画像の検査では、３Ｄ６と比較して、２４時間および４８時間の時点で１９．３抗体に対する仙骨部におけるより高い取り込みが明らかとなった。肝臓における両方の抗体の曲線の同様の形状は、標的外結合を示さなかったが、２つの抗体間の非特異的肝クリアランス速度の差を示した。
マウス脳におけるＩ２５Ｉ標識化抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の分布。脳に到達した抗体の濃度を決定するために、１２ヶ月齢の雄Ｔｇ２５７６マウス（Ｂ６系統；ＳＪＬ−ＴｇＮ ＡＰＰＳＷＥ）に、２００μｇの１２５Ｉ標識化１９．３抗体（約８ｍｇ／ｋｇ）、または２つのコンパレータ抗体の１つを注射（尾静脈）し、２時間後に血液およびＣＳＦを採取した。残留放射能は、脳を取り出す前に、ＰＢＳでの心かん流により、脳の血管から排出された。次いで、血液、ＣＳＦおよび全脳の試料を、ガンマカウンタ内に設置し、各試料中に存在する放射線標識化抗体の量を決定した。カウント後、脳を４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定し、次いで浮遊免疫細胞化学用に処理した。マウス脳における抗体１９．３の局在化は、非ヒト二次抗体よび標準ＡＢＣ検出法により検出された。次いで、この免疫反応性をチオフラビンＳ染色（斑を検出する染料）と組み合わせ、マウス脳における抗体の斑との共局在化を決定した。
図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、放射線標識化抗体１９．３は、マウスＣＳＦおよび脳内に向けて血液脳関門を貫通することができた。さらに、データは、抗体１９．３が、ＣＳＦ中に見られるレベル（０．０２％）と比較して、脳内で濃縮される（０．１９％）ことを示した。この脳内濃度が抗体１９．３とＡβとの結合に起因するかどうかを決定するために、脳を固定化し、免疫細胞化学用に処理された。老齢Ｔｇ２５７６マウス脳における抗体分布の分析では、抗体１９．３が脳においてチオフラビンＳ陽性アミロイド斑と結合することが示された（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。これらのデータは、抗体１９．３が形質転換マウス脳内に貫通し、関心のあるＡβ種に結合することができるという最初の証拠を提供した。
斑堆積モデル。脳におけるアミロイド斑へのＡＤＤＬ堆積を弱める抗ＡＤＤＬ抗体１９．３の能力をさらに評価するために、１２ヶ月齢の雄Ｔｇ２５７６マウス（Taconic, NY）に、週１回一方向にカニューレ挿入し、海馬内に週１回４週間ｂＡＤＤＬ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を注入した（図１４Ａ）。最後のｂＡＤＤＬ治療から１週間後、マウスの半数（ｎ＝５／治療）にＰＢＳを週１回４週間投薬し（尾静脈）、残りの動物に２００μｇの抗ＡＤＤＬ抗体（約８ｍｇ／ｋｇ）を週１回投薬した。全ての動物は、最後の治療から１週間後に安楽死させ、その脳を免疫細胞化学用に処理した。ｂＡＤＤＬおよび斑の検出のために、脳切片をストレプトアビジンALEXA FLUOR（登録商標）５９４（Invitrogen, Carlsbad, CA）でインキュベートし、スライドに載せ、斑をチオフラビンＳで染色した。次いで、斑の蛍光画像を、ULTRAVIE ERSソフトウェアを備えるPERKINELMER Rapid Confocal Imagerで捕捉し、斑成長の差を定量した。このモデルの詳細は説明されている（Gaspar, et al. (2010) Exp. Neurol. 223:394-400）。１ヶ月の処置後、ビヒクルのみで処置された動物（図１４Ｂ；表１６）と比較して、抗体１９．３で処置された動物において既存の斑への新たなＡＤＤＬの堆積の大きな低減が観察された（図１４Ｃ）。
第２の実験シリーズにおいて、動物を上述のようにｂＡＤＤＬで治療したが、最後のｂＡＤＤＬ注射から１週間後に開始して、動物に抗ＡＤＤＬ抗体（３Ｂ３、抗体１９．３のマウス前駆体）の週１回のＩＶ注射を４回行った。３Ｂ３の効果を、抗体ｍ２６６、Ａβモノマー選択的抗体（Yamada, et al. (2009) J. Neurosci. 29:11393-8）、またはビヒクルの効果と比較した。抗体の最後の注射から１週間後に動物を安楽死させ、脳組織をβ−アミロイド斑に関して上述のように分析した。この試験の結果は、抗ＡＤＤＬ抗体が脳を貫通し、斑の周りのｂＡＤＤＬ堆積を防止し、ｂＡＤＤＬハローの周囲の新たなβ−アミロイド斑成長堆積物の蓄積を抑制することができ、一方で、Ａβモノマー選択的抗体による治療は、β−アミロイド斑成長を抑制しなかったことを示している（表１７）。
抗ＡＤＤＬ抗体治療なしでｂＡＤＤＬ注入のみを受けているマウスにおいては、ビオチニル化Ａβの存在を反映する陽性３Ｂ３シグナルは、４週目において既存の斑と関連していないチオフラビンＳ陽性高密度コア斑の周囲のハローとして、または別個のｂＡＤＤＬ堆積物として出現した。８週目において、４週目のビオチニル化Ａβコーティング高密度コア斑またはｂＡＤＤＬ堆積斑の周りに、追加的なチオＳ陽性堆積が観察された。これらの結果は、１ヶ月のｂＡＤＤＬ治療期間中のβ−アミロイド斑の成長のさらなる蓄積、および内生的に生成されたＡβに起因するビオチニル化Ａβ治療の停止後の継続的なβ−アミロイド斑の成長を示していた。抗ＡＤＤＬ抗体によるマウスの治療は、ビオチニル化Ａβ陽性斑の周りのハローを有意に低減したが、これは、抗体治療がβ−アミロイド斑のさらなる成長を効果的に防止したことを示している。このデータは、抗ＡＤＤＬ抗体によるＩＶ治療が、脳内のＡＤＤＬの生物学的作用を低減する上で効果的であることを示している。
抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３による１ヶ月間の処置は、ビヒクルのみ（表１７）またはＡβモノマー選択的抗体で治療された動物と比較して、β−アミロイド斑のさらなる成長を有意に低減した。これらの結果は、抗ＡＤＤＬ抗体が、脳内に貫通し、ＡＤＤＬを隔離し、またβ−アミロイド斑のさらなる成長を弱めることができることを示している。
最小有効用量。最小有効用量を決定するために、Ｔｇ２５７６マウス（７ヶ月齢）に、抗体１９．３の単回ＩＶ投与を行い、例１１に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、２４時間後に脳内の抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体の分析に供した。雄および雌マウスにおける抗体１９．３の単回ＩＶ注射は、抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体の脳内レベルの用量依存的増加（図１５）、および標的結合の直接的証拠をもたらした。さらに、この試験は、１０ｍｇ／ｋｇを、脳内の抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体を有意に増加させる最小有効用量（ＭＥＤ）として特定した。したがって、０．８ｍｇ／ｋｇ（体重７０ｋｇの個人に対して５６ｍｇ）の用量が、相対成長率に基づくＭＥＤのヒト等価用量（ＨＥＤ）である（マウスからヒトへの換算係数０．０８；FDA Guidance Document UCM078932）。
この試験において使用された方法は、脳内のＡＤＤＬのレベルを測定する機会を提供した。脳抽出物内の抗体１９．３：ＡＤＤＬ複合体のレベルを、in vitroで形成されたそのような複合物に基づく標準曲線と比較した。７〜９ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスにおいて、約２ｎＭの濃度のＡＤＤＬが存在した。ＩＶおよびＳＣ注射により達成され得る抗体のレベルを考慮して、抗ＡＤＤＬ抗体の量は、脳内のＡＤＤＬのレベルよりも約１桁高かった。したがって、本発明の抗体は、可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる疾患の治療において使用できる。
例１３：海馬スライスにおける１９．３抗体の活性
げっ歯類海馬スライス調製物において、ＡＤＤＬのシナプス結合は、長期増強（ＬＴＰ）の急速な遮断をもたらし（Rammes, et al. (2011) Neuropharmacol. 60:982-990）、様々な可溶性Ａβオリゴマー調製物のげっ歯類脳への直接注射は、認知機能不全をもたらす（Reed, et al. (2011) Neurobiol. Aging 32:1784-1794）。したがって、このモデルにおいてマウス３Ｂ３がＬＴＰのＡＤＤＬ機能不全を逆転し得るかどうかを決定した。１９．３の親である抗体３Ｂ３は、ヒト化１９．３のマウスバージョンであるため、これをこの分析に使用した。Rammes, et al.（(2011)上記参照）により説明されるように、電気生理学的記録を行った。簡潔に説明すると、マウス海馬スライスを、オリゴマーＡβ１−４２（５０ｎＭ）、３Ｂ３抗体（５００ｐＭ）またはオリゴマーＡβ１−４２＋３Ｂ３抗体でかん流した。かん流から２０分後、高周波数刺激（１００Ｈｚ／１ｓ）を使用してＬＴＰを誘導し、興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）勾配を記録した。この分析では、マウス３Ｂ３が、マウス海馬スライスにおけるＬＴＰの急性ＡＤＤＬ機能不全を逆転させることが示された（図１６）。
例１４：ＡＤのモデルにおける行動に対する抗体１９．３の作用
動物における試験、および可溶性Ａβオリゴマーの既知の機能に基づく理論的考察は、行動的利益が最初の治療から数日および数週間以内に測定可能な影響をもって急激に現れるはずであることを示している。ＡＤのマウスモデルにおける抗体１９．３の急性作用を分析するために、自発運動行動アッセイを使用してin vivo有効性を評価した。対照動物に対するＴｇ２５７６マウスにおけるオープンフィールド自発運動の増加は、これらの動物におけるアルツハイマー病状の行動学的な読み取り情報として以前に説明されている（Gil-Bea, et al. (2007) Behavioral Neurosci. 121:340-4;King & Arendash (2002) Physiol. Behavior 75:627-42）。この試験において、Ｔｇ２５７６（８〜９ヶ月齢）および野生型マウスを、抗体１９．３（３０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照の単回用量で治療し、自発運動（ＬＭＡ）を、投薬前のベースラインで、ならびに投薬後７日目、１４日目、および２１日目に再び試験した。ビデオ追跡システムを使用して、自発運動（移動総距離）を、３０分の期間にわたる１０分の時間間隔の平均として測定した。ＩｇＧビヒクルで治療されたＴｇ２５７６マウスは、３０分の期間にわたり移動した距離により測定されるように、注射から１４日後に自発運動の有意な増加を示した。この増加は、野生型マウスには観察されなかった。抗体１９．３によるＴｇ２５７６マウスの処理は、ビヒクル対照群に比べ注射後１４日目および２１日目にＬＭＡを低減し、非形質転換対照動物において見られるレベルまで復帰させた。結果を図１７に示す。行動学的試験のデータは、抗体１９．３のＩＶ投与が、Ｔｇ２５７６形質転換動物の行動を改変することができ、したがってＡＤの治療に有用であるという証拠を提供する。
また、文脈的恐怖条件付けモデルを使用して行動を評価することができる。文脈的恐怖条件付けは、最も基本的な条件付け手順である。これは、動物（例えばＴｇ２５７６マウス）を選択して、新規環境内に設置し、嫌悪刺激を提供し、次いでそれを取り除くことを含む。動物は、同じ環境に戻された時、一般に、それを思い出してその環境を嫌悪刺激と関連付けた場合に、静止反応を示す。静止は、恐怖に対する種特異的な反応であり、これは、「呼吸以外の運動の非存在」として定義されている。これは、嫌悪刺激の強さ、提示回数、および対照により達成される学習度に依存して、数秒から数分間持続し得る。Curzon, et al. (2009) Methods of Behavior Analysis in Neuroscience, 2nd Ed., Buccafusco (Ed.), Boca Raton: CRC Pressを参照されたい。
例１５：ＡＤの治療における抗体１９．３の使用
無作為二重盲検プラセボ対象試験を、ＣＳＦ中に検出可能なレベルのＡＤＤＬを有する、軽度から中程度のＡＤ（ＰＥＴにより確認）に罹患した対象において行うことができる。試験集団は、ＭｃＫｈａｎｎ基準（McKhann, et al. (2011) Alzheimers Dement. 7:263-9）を使用したアルツハイマー病の臨床基準を満たす４５〜９０歳の男性および女性で構成され得る。集団は、Ａβ堆積；減少したＡβ１−４２を有するＣＳＦ、および検出可能なＣＳＦ可溶性Ａβオリゴマーを示すフロルベタピルＦ１８ＰＥＴ走査の必要性により、Ａβ代謝に障害を有する人の割合を多くすることができる。試験全体にわたり、治療は、１ヶ月間隔で施される３回のＩＶ注入を含み得る。試験における対象に、０．１、０．３、１．０、３．０または１０ｍｇ／ｋｇの用量を与え、ＡＤの兆候および／または症状に関して監視した。特に、ＣＳＦ試料を採取し、ＡＤＤＬ：抗体１９．３複合体およびＣＳＦバイオマーカー（例えば、Ａβ１−４０、Ａβ１／４２、タウ、およびホスホタウ）を測定した。さらに、認知試験、例えばＣＡＮＴＡＢ（すなわち、対連合学習、パターン認識記憶、空間作業記憶、遅延見本合わせ、反応時間および迅速視覚情報処理）、Cogstateコンピュータ試験、ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ（アルツハイマー病評価尺度−認知下位尺度）、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）、神経心理学的状態の評価のための反復バッテリー（ＲＢＡＮＳ）、ならびに／またはＮＰＩ（神経精神病学インベントリ）が行われる。優れた薬物動態学的および薬力学的な血液脳関門貫通、ならびに本明細書において示された安全特性を考慮して、人への投与の結果は、対象への急性対症的利点、および慢性的疾患改質を提供することが期待される。具体的には、シナプス活性のＡＤＤＬ媒介性妨害の逆転は、臨床的に改善された記憶および認知として現れる、改善された海馬活性を可能とすることが期待される。したがって、他の抗Ａβモノクローナル抗体とは異なり、本発明の抗ＡＤＤＬ抗体は、短期間の治療の後に測定可能な症状改善をもたらすと予想され、したがって、可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる疾患の治療において有用である。

Claims (15)

  1. 可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる疾患を治療するための方法であって、可溶性オリゴマーアミロイドベータ１−４２の蓄積に関連する、またはそれからもたらされる前記疾患が治療されるように、それを必要とする対象に、
    （ａ）アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維に対する親和性よりも高い、アミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を有する、１０ｍｇ／ｋｇ体重未満の用量の抗体またはその抗体断片と、
    （ｂ）第２の治療剤であって、
    （ｉ）ベータ−セクレターゼまたはガンマ−セクレターゼ阻害剤、
    （ｉｉ）アミロイドベータ凝集阻害剤、
    （ｉｉｉ）タウ治療剤、または
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せ
    を含む、前記第２の治療剤と
    を投与することを含む、前記方法。
  2. 競合結合アッセイにおけるアミロイドベータ１−４０モノマーと比較したアミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する抗体の親和性が、少なくとも５００：１である、請求項１に記載の方法。
  3. 抗体またはその抗体断片が、アミロイドベータ１−４２オリゴマーのニューロンへの結合を遮断する、請求項１に記載の方法。
  4. 抗体またはその抗体断片が、アミロイドベータ１−４２オリゴマーのアミロイド斑への組み込みを遮断する、請求項１に記載の方法。
  5. 抗体またはその抗体断片が、急性アミロイドベータ１−４２オリゴマー媒介性長期増強機能不全を逆転させる、請求項１に記載の方法。
  6. 抗体またはその抗体断片の投与が、前記抗体または抗体断片を受けていない対象と比較して、認知試験における改善を提供する、請求項１に記載の方法。
  7. 抗体またはその抗体断片が、
    （ａ）軽鎖可変領域であって、
    （ｉ）配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐである）を有するＣＤＲ１、
    （ｉｉ）配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号２）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａである）を有するＣＤＲ２、および
    （ｉｉｉ）配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）を有するＣＤＲ３
    を含む、前記軽鎖可変領域と、
    （ｂ）重鎖可変領域であって、
    （ｉ）配列番号４のＣＤＲ１、
    （ｉｉ）配列番号５のＣＤＲ２、および
    （ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ３
    を含む、前記重鎖可変領域と
    を有する、請求項１に記載の方法。
  8. ベータ−セクレターゼまたはガンマ−セクレターゼ阻害剤が、ＣＴＳ−２１１６６、Ｐｏｓｉｐｈｅｎ、ＡＣＩ−９１、ＭＫ−８９３１、ＴＡＫ−０７０、ＭＫ−０７５２、ＧＳＫ１８８９０９、ＯＭ９９−２、ＫＭＩ−４２９、ＧＲＬ−８２３４、スタチン阻害剤、フェニルノルスタチン阻害剤、ヒドロキシエチルアミン阻害剤、カルビナミン阻害剤、アシルグアニジン阻害剤、アミノイミダゾール阻害剤、アミノヒダントイン阻害剤、アミノキナゾリン阻害剤、セマガセスタット、アバガセスタット、またはＥＶＰ−０９６２を含む、請求項１に記載の方法。
  9. アミロイドベータ凝集阻害剤が、ＰＢＴ２、ＥＬＮＤ０００５、Ｎ−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−２−｛Ｎ’−［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジノ｝−アセトアミド、２−｛［１−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシフェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−（５−ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミドまたは（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（１−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチレン）ベンゾヒドラジドを含む、請求項１に記載の方法。
  10. タウ治療剤が、ＥＣ−１０２、ダブネチド、メチルチオニニウムクロリドまたはチデグルシブを含む、請求項１に記載の方法。
  11. キットであって、
    （ａ）アミロイドベータ１−４２モノマー、アミロイドベータ１−４０モノマー、斑およびアミロイドベータ線維の親和性よりも高い、アミロイドベータ１−４２オリゴマーに対する親和性を有する、抗体またはその抗体断片と、
    （ｂ）第２の治療剤であって、
    （ｉ）ベータ−セクレターゼまたはガンマ−セクレターゼ阻害剤、
    （ｉｉ）アミロイドベータ凝集阻害剤、
    （ｉｉｉ）タウ治療剤、または
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せを含む、前記第２の治療剤と
    を含む、前記キット。
  12. 抗体またはその抗体断片は、
    （ａ）軽鎖可変領域であって、
    （ｉ）配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｇｌｙ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ｔｈｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号１）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐである）を有するＣＤＲ１、
    （ｉｉ）配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号２）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａである）を有するＣＤＲ２、および
    （ｉｉｉ）配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５（配列番号３）（ここで、Ｘａａ１は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｙｒであり、Ｘａａ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり、Ｘａａ３は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｙであり、Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘａａ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＰｈｅである）を有するＣＤＲ３
    を含む、前記軽鎖可変領域と、
    （ｂ）重鎖可変領域であって、
    （ｉ）配列番号４のＣＤＲ１、
    （ｉｉ）配列番号５のＣＤＲ２、および
    （ｉｉｉ）配列番号６のＣＤＲ３
    を含む、前記重鎖可変領域と
    を有する、請求項１１に記載のキット。
  13. ベータ−セクレターゼまたはガンマ−セクレターゼ阻害剤が、ＣＴＳ−２１１６６、Ｐｏｓｉｐｈｅｎ、ＡＣＩ−９１、ＭＫ−８９３１、ＴＡＫ−０７０、ＭＫ−０７５２、ＧＳＫ１８８９０９、ＯＭ９９−２、ＫＭＩ−４２９、ＧＲＬ−８２３４、スタチン阻害剤、フェニルノルスタチン阻害剤、ヒドロキシエチルアミン阻害剤、カルビナミン阻害剤、アシルグアニジン阻害剤、アミノイミダゾール阻害剤、アミノヒダントイン阻害剤、アミノキナゾリン阻害剤、セマガセスタット、アバガセスタット、またはＥＶＰ−０９６２を含む、請求項１１に記載のキット。
  14. アミロイドベータ凝集阻害剤は、ＰＢＴ２、ＥＬＮＤ０００５、Ｎ−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−２−｛Ｎ’−［３−オキソ−３−チオフェン−２−イル−１−トリフルオロメチル−プロパ−（Ｚ）−イリデン］−ヒドラジノ｝−アセトアミド、２−｛［１−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−｛［１−（２−ヒドロキシフェニル）−メタ−（Ｅ）−イリデン−ヒドラジノオキサリル］−アミノ｝−６−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル、２−（５−ヒドロキシ−３−イソブチル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−２−オキソアセトアミドまたは（Ｅ）−２−ヒドロキシ−Ｎ’−（（１−ヒドロキシナフタレン−２−イル）メチレン）ベンゾヒドラジドを含む、請求項１１に記載のキット。
  15. タウ治療剤が、ＥＣ−１０２、ダブネチド、メチルチオニニウムクロリドまたはチデグルシブを含む、請求項１１に記載のキット。
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