JP2016213149A - 試料収容セル - Google Patents

Abstract

【課題】試料を収容するセルの利便性を高めること。【解決手段】本発明の実施形態における試料収容セルは、第１開口部を有する第１層と、第１層に対向して配置される第２層と、第１層と前記第２層とに挟まれて配置された中間層であって、第１層または第２層に形成された少なくとも１つの開口部を介して外部空間に接続し、少なくとも２つの開口部の端部から所定の距離にわたって拡がり、第１開口部と第２層との間の観察空間と外部空間とを接続する流路空間を形成する中間層と、第１開口部の第２層側を開口内部から塞ぎ、少なくとも当該第１開口部の側面に支持され、電子線に対して透過性を有する第１薄膜と、を備えることを特徴とする。【選択図】図３

Description

本発明は、走査型電子顕微鏡の観察において、観察対象の試料（Ｏｂｊｅｃｔ）を収容するセルに関する。

電子顕微鏡を用いた試料の観察は、一般的には、観察対象の試料が真空等の特殊な空間に曝される。一方、近年では、メカノバイオロジー（Ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）と呼ばれる技術分野において、生体細胞、生体組織等をそのまま観察したいという要求がある。しかしながら、電子顕微鏡での観察の際に試料を真空中に曝すと、細胞等は、液体成分が揮発していくことで変質し、また測定環境の汚染につながってしまう。これを防ぐために、様々な方法が開発されている。

例えば、試料を急速凍結して薄い氷の中に閉じ込め、冷凍状態で観察する技術がある。しかしながら、冷凍状態で観察する技術は、容易に観察用の試料を作製することができず、また、試料作成用の装置が非常に特殊であり高価なものであった。

さらに、液体中に試料を保持したまま観察することで、さらに試料を直接的に観察するための技術が、特許文献１に開示されている。この技術では、観察用のセルを構成する薄膜間に試料を含む液体を配置しつつ、試料が配置される空間をセルの外部空間と遮断する。電子線は、薄膜を透過して薄膜間の試料に到達するようになっている。

特開２００７−１６５２７１号公報

また、特許文献１に開示されたセルのうち、注入口から試料を含む液体を注入する方式のセルにおいては、観察孔の大きさが小さい。そのため、観察孔に観察対象となる試料が到達しているか、電子顕微鏡による測定前に確認することが困難であった。また、試料を座体に配置した後に蓋体を被せ、座体と蓋体とを接着剤で接合する方式のセルについても特許文献１に開示されている。このようなセルでは、接合に高度な技術がユーザに求められ、座体と蓋体との接合がうまくいかずに内部の液体が漏れ出したり、座体と蓋体とのギャップ制御が困難であったりする場合があった。これらの複数の問題の少なくとも１つが生じる結果、試料を収容したセルが電子顕微鏡による観察に用いることができない状態であることも多くなり、ユーザの利便性を損ねていた。

本発明の目的の一つは、走査型電子顕微鏡による観察において、試料を収容するセルの利便性を高めることにある。

本発明の一実施形態によると、第１開口部を有する第１層と、前記第１層に対向して配置される第２層と、前記第１層と前記第２層とに挟まれて配置された中間層であって、前記第１層または前記第２層に形成された少なくとも１つの開口部を介して外部空間に接続し、前記少なくとも２つの開口部の端部から所定の距離にわたって拡がり、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間と外部空間とを接続する流路空間を形成する中間層と、前記第１開口部の前記第２層側を開口内部から塞ぎ、少なくとも当該第１開口部の側面に支持され、電子線に対して透過性を有する第１薄膜と、を備えることを特徴とする試料収容セルを提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

前記少なくとも２つの開口部のいずれかは、前記第１層に配置されてもよい。これによれば、試料収容セルへの試料含有液体の注入が容易になる。

前記少なくとも２つの開口部のいずれかは、前記第２層に配置されてもよい。これによれば、試料収容セルへの試料含有液体の注入が容易になる。

前記第１層および前記第２層は、シリコンであり、前記中間層は、酸化シリコンであってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層および前記第２層は、表面が（１００）面のシリコンであり、前記第１開口部および前記第２開口部は、開口内部の側面が（１１１）面であってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

本発明の一実施形態によると、第１層、第２層および当該第１層と当該第２層とに挟まれた中間層を有する基板において、第１開口部および少なくとも２つの開口部に対応する領域の前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させ、前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆い、前記少なくとも２つの開口部を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間、および当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成することを特徴とする試料収容セルの製造方法を提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

本発明の一実施形態によると、第１層、第２層および当該第１層と当該第２層とに挟まれた中間層を有する基板において、第１開口部に対応する領域の前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させ、少なくとも２つの開口部に対応する領域の前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させ、前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆い、前記少なくとも２つの開口部を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間、および当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成することを特徴とする試料収容セルの製造方法を提供する。これによれば、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

前記第２層をエッチングして、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを更に含み、前記第１層および前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させることは、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを含んでもよい。これによれば、工程負荷をほとんど増加させずに、試料収容セルの個片化を容易にすることができる。

前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させることと、前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させることは、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを含んでもよい。これによれば、工程負荷をほとんど増加させずに、試料収容セルの個片化を容易にすることができる。

前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆うことは、前記第１開口部および前記液体注入口に対応する領域において露出された前記中間層を前記第１薄膜で覆い、前記液体注入口に対応する領域において前記第１薄膜をエッチングして前記中間層を露出させてもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層および前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させることは、第２エッチング液を用いたエッチングであり、前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液よりも前記１エッチング液に対して耐性を有し、前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記２エッチング液に対して耐性を有してもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

前記第１層および前記第２層は、シリコンであり、前記中間層は、酸化シリコンであってもよい。これによれば、試料収容セルを容易に製造することができる。

本発明によると、試料を収容するセルの利便性を高めることができる。

本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１層側から見た平面図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料注入装置の試料注入処理を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料注入装置のセル封止処理を説明する図である。 本発明の第１実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。 図８に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。 本発明の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。 本発明の第２実施形態における試料収容セルを封止する方法を説明する図である。 本発明の第３実施形態における試料収容セルの流路空間ＦＰの形状を説明する図である。 本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。 本発明の第４実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。 図１４に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。 本発明の第５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。

＜第１実施形態＞
以下、本発明の一実施形態に係る試料収容セルについて、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は本発明の実施形態の一例であって、本発明はこれらの実施形態に限定して解釈されるものではない。なお、本実施形態で参照する図面において、同一部分または同様な機能を有する部分には同一の符号または類似の符号（数字の後にＡ、Ｂ等を付しただけの符号）を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、図面の寸法比率（各構成間の比率、縦横高さ方向の比率等）は説明の都合上実際の比率とは異なったり、構成の一部が図面から省略されたりする場合がある。

［試料収容セルの構成］
図１は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの外観を示す図である。試料収容セル１は、第１層１０、第２層２０およびこれらに挟まれた中間層３０により形成されている。この例では、第１層１０、第２層２０および中間層３０は、ＳＯＩ（Silicon on Insulator）基板を構成している。第１層１０はシリコン（ＳＯＩ層）であり、１μｍ以上１００μｍ以下（この例では５μｍ）の膜厚を有する。第２層２０はシリコン（支持層、支持基板）であり、数百μｍ（この例では３００μｍ）の膜厚を有する。中間層３０は酸化シリコン（ＢＯＸ層）であり、数百ｎｍ（この例では２００ｎｍ）の膜厚を有するが、膜厚について特に制限は無い。中間層３０を部分的に除去することで、第１層１０と第２層２０との間に空間（流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳ）を形成する。

試料収容セル１は、電子顕微鏡の観察対象となる試料を液体に含ませた状態で、この内部空間に収容するセルである。以下、試料を含む液体を、試料含有液体と表現する場合がある。試料収容セル１の大きさは、１辺が０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度の正方形または長方形であり、この例では一辺が概ね１．０ｍｍである。

第２層２０に比べて薄い第１層１０には、開口部が形成されている。この例では、第１層１０に、開口部１１０、１２０、１３０が配置されている。続いて、試料収容セル１の内部構造を含めた詳細な構造について、図２、図３を用いて説明する。

図２は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを第１層側から見た平面図である。図３は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの断面構成（図１、２における断面線Ａ−Ａ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図３は、各断面線に対応する端面図を示している。以下の断面構成を示す模式図についても、それぞれ端面図として示している。

開口部１１０の中間層３０（第２層２０）側の開口は、開口内部側から第１薄膜１５０により塞がれている。すなわち、第１薄膜１５０は、開口部１１０の側面（内面）の少なくとも一部と接触した状態で、開口を塞いでいる。また、この例では、第１薄膜１５０は、第１層１０の表面（外部空間１０００側の面）に形成されたマスク層１５５上にも形成されている。マスク層１５５上に形成された部分の第１薄膜１５０と、開口部１１０を塞いでいる第１薄膜１５０とは、図３に示す例では、後述する庇部分の影響で分離されているが、接続されていてもよい。

第１薄膜１５０は、電子線に対して透過性を有する膜である。開口部１１０を塞いでいる部分の第１薄膜１５０と、第２層２０とによって挟まれた領域を観察空間ＭＳという。観察空間ＭＳは、測定対象となる試料が配置され、電子線が通過する。

第１薄膜１５０は、例えば、窒化シリコンで形成される。第１薄膜１５０の膜厚は、１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、望ましくは、１５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１５０は、１０ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、２００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１５０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。

第１薄膜１５０と第２層２０との距離は、中間層３０の膜厚に対応する。そのため、この例では、上述した通り、２００ｎｍとなるが、特に制限は無い。この距離は、試料すなわち観察対象物（例えば細胞）の大きさに依存して設定されることが望ましく、観察対象物よりも大きくする必要がある。

開口部１１０の開口（中間層３０側）の形状は、この例では、５０μｍ×５０μｍの正方形である。なお、この開口の形状は、５μｍ×５０μｍ等の長方形であってもよい。

開口部１２０、１３０の開口の形状は、開口部１１０と比べて大きく、この例では、中間層３０側の開口の大きさは、１００μｍ×１００μｍの正方形である。この開口の形状についても正方形でなく長方形であってもよい。説明に用いた各図では、構造をわかりやすくする表現するために、各構成間の比率等を調整して示している。

なお、これらの開口部１１０、１２０、１３０の開口の形状は、四角形以外の多角形であってもよいし、円形、楕円形等、曲線で囲まれた形状であってもよいし、直線と曲線とで囲まれた形状であってもよい。ただし、第１層１０および第２層２０のエッチングを結晶異方性エッチングで行う場合には、開口の形状は四角形であることが望ましい。また、開口部１２０の形状と開口部１３０の形状とが異なっていてもよい。例えば、試料含有液体が注入される側の開口部が大きくてもよい。

開口部１１０は、その内壁が、第１薄膜１５０が拡がる平面（基板表面）に対して傾き（テーパ形状）を持って形成されている。開口部１２０、１３０についても、その内壁がその基板表面に対して傾きを持って形成されている。後述するように、（１００）面が表面になっている単結晶シリコンである第１層１０および第２層２０を用い、ＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）水溶液等のエッチング液で結晶異方性エッチングを施すようにすれば、（１１１）面が開口部の側面に現れるため、テーパ形状の制御が容易になる。

なお、開口部内において傾きの程度が一定でなく変化していてもよい。すなわち、開口部１１０、１２０、１３０は中間層３０（第２層２０）側の開口面積が外部空間１０００側の開口面積よりも小さい。開口部１１０の内壁がテーパ形状であると、電子線の入射角のマージンを確保することができる。

第１層１０と第２層２０との間には、中間層３０によって囲まれた空間が形成されている。この空間は、上記の観察空間ＭＳおよび流路空間ＦＰを含み、開口部１２０の開口端部から拡がった第１範囲、および開口部１３０の開口端部から拡がった第２範囲を含んでいる。それぞれの開口端部から空間端部までは、ほぼ等距離（この例では、約１５０μｍ）に拡がっている。第１範囲と第２範囲とは一部において重複している。この例では、重複した部分に観察空間ＭＳが配置されている。

流路空間ＦＰは、観察空間ＭＳと外部空間１０００とを接続するための空間である。この例では、流路空間ＦＰは、少なくとも２つの開口部を介して外部空間１０００と接続し、この例では開口部１２０、１３０を介して外部空間１０００に接続する。一方の開口部が試料含有液体を注入するための開口であり、他方が流路空間ＦＰの空気を外部空間１０００に押し出すための排気口として機能する。

以上が、試料収容セル１の構成についての説明である。続いて、試料収容セル１に試料含有液体を配置して、電子顕微鏡にて観察できる状態にするための処理（観察セル作製処理）について説明する。

［観察セル作製処理］
図４は、本発明の第１実施形態における試料収容セルへ試料含有液体を注入する方法を説明する図である。試料含有液体７００は、流路空間ＦＰに開口部１２０から注入されると、流路空間ＦＰを移動して観察空間ＭＳに至り、さらには、開口部１３０まで到達する。なお、開口部１２０ではなく開口部１３０に試料含有液体７００が注入されてもよいが、以下の説明では、開口部１２０に試料含有液体７００が注入される液体注入口であるものとして説明する。この場合には、開口部１３０は、試料含有液体７００が注入されるときに、流路空間ＦＰの気体を排出する排出口として機能する。

図５は、本発明の第１実施形態における試料収容セルを封止するための樹脂を形成する方法を説明する図である。試料含有液体７００が流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳに充填された後、開口部１２０、１３０を封止材３２０、３３０で塞ぐことで、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳは、外部空間１０００と分離される。封止材３２０、３３０は、例えば、エポキシ樹脂等の樹脂であり、ＵＶ硬化型の樹脂であってもよいし、２液混合型硬化樹脂（例えば、２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプ）であってもよい。ＵＶ硬化型の場合には、開口部１２０、１３０を塞ぐように硬化前の樹脂を形成し、ＵＶ照射によって硬化させて封止材３２０、３３０が形成される。なお、封止材３２０、３３０によって外部空間１０００と分離された内部空間には気泡が含まれないようにしてもよいし、硬化前の樹脂と試料含有液体７００とが混合しないように、少なくとも樹脂が硬化するまでは互いに離れた状態（試料含有液体と封止材との間に気泡が存在する状態）にしてもよい。

観察空間ＭＳに配置された試料含有液体７００は、外部空間１０００と離隔されているため、電子顕微鏡による観察が行われる際に、試料収容セル１が真空環境に曝されても、試料含有液体７００が揮発してしまうことを防ぎ、液体の状態を保持することができる。また、観察空間ＭＳは、電子線に対して透過性を有する数十ｎｍ程度の第１薄膜１５０、および第２層２０に囲まれている。

したがって、電子顕微鏡で用いられる電子線は、開口部１１０を通って、第１薄膜１５０を通過し、試料含有液体７００にて反射し、さらに第１薄膜１５０、開口部１１０を通過することができる。

図４における試料注入処理、および図５におけるセル封止処理については、手動処理であっても、自動処理であってもよい。手動処理の場合には、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスキャピラリの先端と開口部１２０、１３０との位置関係を、実体顕微鏡を用いて確認し、ガラスキャピラリに接続されたインジェクタを用いて試料含有液体７００を注入したり、封止材３２０、３３０を注入したりすればよい。

また、自動処理の場合には、試料注入処理およびセル封止処理を自動的に実行して観察セルを作成する装置を用いればよい。

［観察セル作製装置］
図６は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置の試料注入処理を説明する図である。観察セル作製装置８００は、試料注入器８１０、ＵＶ照射器８６０およびステージ８８８を備える。ステージ８８８には、チップ台８２５、カップ台８３５、８４５、試料台８５０が取り付けられている。チップ台８２５は、チップ８２０を収容する。チップ８２０は、試料含有液体７００を吸い取るためのノズルを有するピペットチップである。カップ台８３５は、試料含有液体７００を保持する試料カップ８３０を収容する。カップ台８４５は、封止材となる硬化前樹脂３００を保持する試料カップ８４０を収容する。試料台８５０は、試料収容セル１を設置する。また、ステージ８８８には、チップ８２０を廃棄するための廃棄口８７０が配置されている。

試料注入器８１０に対して、ステージ８８８は水平方向（図６における左右方向、以下、Ｘ方向という）に移動可能である。また、試料注入器８１０は、水平方向であってステージ８８８の移動方向とは垂直な方向（図６における奥行き方向、以下、Ｙ方向という）と、鉛直方向（図６における上下方向、以下、Ｚ方向という）とに移動可能である。したがって、試料注入器８１０とステージ８８８とでＸ、Ｙ、Ｚ方向で相対的に移動可能になっている。なお、ステージ８８８上の試料台８５０については、別途Ｙ方向にも移動可能であってもよい。

試料注入器８１０は、チップ取付部８１１、支持部８１３、制御部８１５およびチップ取り外し部８１７を備える。チップ取付部８１１は、先端にチップ８２０が差し込まれて取り付けられる部分である。支持部８１３は、装置天井に対してＹ方向、Ｚ方向に移動させるように試料注入器８１０を支持する。制御部８１５は、チップ取付部８１１に取り付けられたチップ８２０に試料カップ内の液体を吸い込んで保持したり、チップ８２０に保持された液体を排出したりするための制御を行う。チップ取り外し部８１７は、下方に移動することによって、チップ８２０を下方に押し出してチップ取付部８１１から取り外す。

ＵＶ照射器８６０は、硬化前樹脂３００を硬化させるためのＵＶ光を照射する装置である。ＵＶ光の照射範囲は、試料台８５０に設置された試料収容セル１全体を含んでいてもよいし、開口部１２０、１３０に対応する部分にスポットで照射するようにしてもよい。開口部１２０、１３０に対応する部分にスポットで照射するようにすれば、試料へのＵＶ光の影響を抑えることができる。

図６（ａ）は、試料収容セル１がセル保管庫等から運ばれて、観察セル作製装置８００の試料台８５０に設置された状態を示している。続いて、ステージ８８８と試料注入器８１０とを移動させ、以下に示す順に処理を実行する。まず、チップ取付部８１１にチップ８２０を取り付ける（図６（ｂ））。その後、試料注入器８１０は、試料カップ８３０内の試料含有液体７００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図６（ｃ））。試料含有液体７００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の試料含有液体７００を排出して開口部１２０から試料収容セル１内部に注入する（図６（ｄ））。

なお、チップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させる際には、例えば、試料注入器８１０は、カメラ等の撮像部を用いて試料収容セル１の形状を画像認識し、さらには開口部１２０の位置を認識し、開口部１２０の位置にチップ８２０を移動させる。続いて、観察セル作製装置８００の封止処理について説明する。

図７は、本発明の第１実施形態における観察セル作製装置のセル封止処理を説明する図である。試料注入器８１０は、試料カップ８４０内の硬化前樹脂３００を吸い上げてチップ８２０内に保持する（図７（ａ））。硬化前樹脂３００を保持するチップ８２０を試料収容セル１の開口部１２０上に移動させて、チップ８２０内の硬化前樹脂３００を排出して開口部１２０に滴下し（図７（ｄ））、続いて、開口部１３０に滴下する（図７（ｅ））。なお、開口部１３０への滴下前に、再度チップ８２０内に硬化前樹脂３００を吸い上げておいてもよい。硬化前樹脂３００が、ＵＶ硬化型ではなく、上述した２液常温硬化タイプまたは１液低温硬化タイプであっても同様であり、この場合には、後述するＵＶ光の照射は不要である。

続いて、試料台８５０をＵＶ照射器８６０の下方に移動させ、試料収容セル１にＵＶ照射器８６０からのＵＶ光を照射する。この照射によって、試料収容セル１の開口部１２０、１３０に滴下された硬化前樹脂３００を硬化させる。これによって、試料収容セル１の内部空間に試料含有液体７００が外部空間１０００と離隔された状態で収容される。また、試料注入器８１０は、チップ取り外し部８１７によって、チップ８２０をチップ取付部８１１から取り外して廃棄口８７０に廃棄する。ＵＶ光の照射中にチップ８２０の廃棄が実施されてもよい。

その後、試料含有液体７００を収容した試料収容セル１が回収され、新たな試料収容セル１が試料台８５０に設置される（図６（ａ））。なお、チップ８２０は、試料収容セル１毎に交換するプロセスを説明したが、開口部１２０に滴下する硬化前樹脂３００を吸い上げる前にチップ８２０を交換してもよい。

以上が、観察セル作製装置８００による試料注入処理およびセル封止処理についての説明である。続いて、試料収容セル１の製造方法について図８〜図１０を用いて説明する。

［試料収容セルの製造方法］
試料収容セル１は、上述したように、ＳＯＩ基板を用いて製造される。そして、酸化シリコンで形成された中間層３０の一部をエッチングすることによって、シリコンで形成された第１層１０および第２層２０の間に、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを形成する。以下、具体的に、試料収容セル１の製造方法を説明する。

図８は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。図９は、図８に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。いずれの図も、図３に対応する断面構造を示している。まず、図８（ａ）に示すように、ＳＯＩ基板（第１層１０、第２層２０および中間層３０）の両面に、マスク層１５５、２５５を形成する。マスク層１５５、２５５は、後述するシリコンに対するエッチング液（この例ではＴＭＡＨ水溶液）に対して耐性（エッチングレートが低い）を有する膜が望ましく、例えば、窒化シリコン膜である。マスク層１５５、２５５の膜厚は、例えば、５０ｎｍ以上２μｍ以下である。

これらの膜は、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）、ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などの蒸着処理等によって形成されればよい。また、マスク層１５５、２５５が窒化シリコン膜でなく酸化シリコン膜であれば、ＳＯＩ基板の表面を熱酸化することで第１層１０側の表面に形成された熱酸化膜を用いてもよい。以下に形成される様々な膜についても、同様である。

フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層１５５の一部をエッチングする（図８（ｂ））。エッチングされる領域は、開口部１１０、１２０、１３０に対応する領域である。マスク層１５５のエッチングには、ＲＩＥ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）が用いられる。このとき、第１層１０についても一部エッチング（オーバーエッチング）してもよい。なお、膜のエッチングのためには、ドライエッチングおよびウエットエッチングのいずれも適用可能であり、特に明示しない限り以下の説明においても同様である。

次に、マスク層１５５をエッチングマスクとして、第１層１０をエッチングして中間層３０を露出させる（図８（ｃ））。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、エッチング液としてＴＭＡＨ水溶液が用いられる。この例では、第１層１０（シリコン）の表面が（１００）面であり、開口部１１０、１２０、１３０の側面が、エッチングレートの遅い（１１１）面に沿って形成される。また、中間層３０がエッチングストッパとなる。

次に、開口部１１０、１２０、１３０を覆うように第１薄膜１５０を形成する（図９（ａ））。第１薄膜１５０は、窒化シリコンであり、２０ｎｍの膜厚を有する。このとき、第１薄膜１５０は、引っ張り応力になるように形成されることが望ましい。なお、第１薄膜１５０は、ＴＭＡＨ水溶液およびＢＨＦ（バッファードフッ酸：フッ酸とフッ化アンモニウムの混合水溶液）に対して耐性を有することが望ましい。しかし、完全な耐性を有することは困難であるため、後述するＴＭＡＨ水溶液またはＢＨＦを用いたエッチングにおいて減少する膜厚分を考慮して、予め厚膜化しておいてもよい。

第１薄膜１５０において、開口部１１０、１２０、１３０の内部に形成された部分と、マスク層１５５上に形成された部分とは分離されているのは、開口部の端部においてマスク層１５５が庇のように突出しているためである。この庇は、第１層１０の深さ方向のエッチング量に対して５％程度の長さになる場合が多い。そのため、庇が小さければ、製造条件によっては、開口部１１０、１２０、１３０の内部に形成された部分と、マスク層１５５上に形成された部分とが接続される場合もある。

次に、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１薄膜１５０の一部をエッチングする（図９（ｂ））。第１薄膜１５０は、少なくとも、開口部１１０に形成された部分を残し、かつ、開口部１２０、１３０から中間層３０の少なくとも一部が露出するようにエッチングされる。図９（ｂ）に示す例では、第１薄膜１５０がエッチングされた部分と積層された部分のマスク層１５５についても、併せてエッチングされている。これによって、開口部１２０、１３０の端部において形成された庇をエッチングしてもよい。この工程により、第１層１０側のパターンの形成が終了する。なお、第１薄膜１５０を形成（成膜）する工程（図９（ａ））において、マスク等を用いて開口部１２０、１３０には第１薄膜１５０が形成されないようにしてもよい。すなわち、第１薄膜１５０が、開口部１１０の内部において、露出した中間層３０を覆うように形成されていればよい。

なお、上述の試料収容セル１は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル１を個片化するための処理が行われる。後に図１０を用いて説明するが、各試料収容セル１の間には、第１層１０側に分断溝ＳＬ１が形成され、第２層２０側に分断溝ＳＬ２が形成されている。分断溝ＳＬ１、ＳＬ２はいずれも、中間層３０には到達していない。

図示はしないが、分断溝ＳＬ１は図８（ｃ）に示す開口部１１０、１２０、１３０を形成する際に、一緒に形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層１５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ１が中間層３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ１の深さを３μｍ程度とする場合には、マスク層１５５のスリットを４μｍ程度の幅にしておけばよい。

図示はしないが、分断溝ＳＬ２も同様にして形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層２５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ２が中間層３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ２の深さを２００μｍ程度とする場合には、マスク層２５５のスリットを３００μｍ程度の幅にしておけばよい。

次に、開口部１２０、１３０を介して中間層３０にエッチング液を供給することによって、中間層３０をエッチングする（図９（ｃ））。エッチング液は、この例では、ＢＨＦである。このエッチングは、等方性エッチングであるため、エッチング時間の経過とともに、開口部１２０、１３０の開口端部から拡がるように中間層３０がエッチングされていく。一方、第１層１０と第２層２０とは、ＢＨＦに対して耐性を有しているため、ほとんどエッチングされない。そのため、第１層１０と第２層２０との間に空間が形成されていく。

そして、開口部１２０、１３０の双方から拡がった空間が接続され、かつ、第１薄膜１５０と第２層２０とが対向する領域（観察空間ＭＳ）が形成された後に、エッチングを終了する。これによって、第１層１０と第２層２０との間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳが形成される。なお、中間層３０のエッチングの際には、エッチング液中に気泡が発生する場合がある。このような場合には、脱気処理をしつつ、エッチング処理を実行すればよい。

上述した試料収容セル１は、各図において１つのセルとして説明したが、実際の製造工程においては、一基板上に複数の試料収容セル１が同時に形成されている。そのため、それぞれの試料収容セル１を個片化するための処理が行われる。この処理は、ダイシング等により切断するものであってもよいが、この例では、別の方法により個片化を実現する。

図１０は、本発明の第１実施形態における複数の試料収容セルを分離する方法を説明する図である。図１０（ａ）は、試料収容セル１が個片化される前の基板の一部を第１層１０側から見た平面図である。図１０（ｂ）は、分断溝部分の断面構成（図１０における断面線Ｂ−Ｂ’の断面構造）を示す模式図である。なお、図１０においては、試料収容セル１が３×３で配置された例を示しているが、これは基板全体の一部を抽出して例示したものである。

各試料収容セル１の間には、分断溝ＳＬ１及び分断溝ＳＬ２が形成されている。この例では、分断溝ＳＬ１は、第１層１０側に設けられている。第２層２０側にも分断溝ＳＬ２が分断溝ＳＬ１に対向した位置に設けられている。分断溝ＳＬ１、ＳＬ２はいずれも、中間層３０には到達していない。

この分断溝ＳＬ１は、図８（ｃ）に示す開口部１１０、１２０、１３０を形成する際に、一緒に形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層１５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ１が中間層３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ１の深さを３μｍ程度とする場合には、マスク層１５５のスリットを４μｍ程度の幅にしておけばよい。

同様にして、分断溝ＳＬ２も形成される。このエッチングは、結晶異方性エッチングであり、マスク層２５５が狭い幅のスリット状に形成されることで、分断溝ＳＬ２が中間層３０に到達しないようにすることができる。例えば、分断溝ＳＬ２の深さを２００μｍ程度とする場合には、マスク層２５５のスリットを３００μｍ程度の幅にしておけばよい。

分断溝ＳＬ１、ＳＬ２が中間層３０に到達していないため、図９（ｃ）に示す中間層３０のエッチングの際に、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２から中間層３０がエッチングされないようにすることができる。そして、試料収容セル１に軽い衝撃を与えることにより、分断溝ＳＬ１、ＳＬ２において容易に、隣接する試料収容セル１と分離することができる。

なお、上述した製造方法における各構成の材料、エッチング方法等の各種条件については一例であって、様々な条件に設定可能である。以上が試料収容セル１の製造方法についての説明である。

上述した一実施形態に係る試料収容セル１は、ＳＯＩ基板を用いて形成されているため、第１層１０と第２層２０とは予め中間層３０によって接合されている。したがって、２つの基板を接合する必要がなく、内部に形成された空間に注入された試料含有液体７００が漏れることはほとんどない。また、第１層１０と第２層２０との距離は中間層３０の厚さによって決まるため、精度のよいギャップ制御が可能である。また、このように、試料収容セル１によれば、利便性を高めることができる。

＜第２実施形態＞
第１実施形態においては、流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳを外部空間１０００と分離するために、開口部１２０、１３０を封止材３２０、３３０によって塞いでいた。第２実施形態では、これを蓋板で塞ぐ例を説明する。

図１１は、本発明の第２実施形態における試料収容セルを封止する方法を説明する図である。この例では、蓋板３７０によって開口部１２０、１３０を塞ぐようになっている。蓋板３７０は、例えば、ガラスである。蓋板３７０と第１層１０との間には、図１１に示すように接着剤３６０が形成されていてもよい。蓋板３７０は、開口部１２０、１３０を塞ぐ程度の大きさ（例えば、開口部より２００μｍ程度大きい正方形）であればよいが、封止する工程の容易性を考慮して、より大きくした形状であってもよいし、正方形以外の形状であってもよい。

＜第３実施形態＞
第３実施形態では、外部空間１０００と流路空間ＦＰとを接続する開口部が３つ以上である場合について説明する。

図１２は、本発明の第３実施形態における試料収容セルの流路空間ＦＰの形状を説明する図である。この例では、第１実施形態で説明した開口部１２０、１３０の他に、これらと同様な形状の開口部１２１が形成されている。このように、外部空間１０００と流路空間ＦＰとを接続する開口部の数は２つに限らず、さらに多くてもよい。このようにすると、例えば、開口部１２１と開口部１１０とを離すことができ、試料含有液体７００の注入が容易になる。ただし、この場合には、電子顕微鏡による観察前に、開口部１１０以外の開口部を封止しておく必要がある。

この場合、開口部１２０、１３０は、開口部１２１よりも開口部が小さくてもよい。すなわち、試料含有液体７００を注入するための開口部を大きくしておき、流路空間ＦＰを形成する際のエッチング液導入のための開口部は小さくしてもよい。

＜第４実施形態＞
図１３は、本発明の第４実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。第１層１０は、第１実施形態の第１層１０において開口部１２０、１３０を形成していない構成である。したがって、第１基板１０側の製造工程は、第１実施形態とほぼ同様であり、開口部１１０が形成される工程において開口部１２０、１３０が形成されないようになっている。

第２層２０は、開口部１２０、１３０に対応する構成として開口部２２０、２３０が形成されている。したがって、第層２０側の製造工程は、分断溝ＳＬ２を形成する工程において開口部２２０、２３０が形成される。

このように、支持層としての機能を有する第２層２０側に、試料含有液体７００を注入するための開口部が形成されるようになっていてもよい。

第１実施形態における試料収容セルでは、第１層１０に設けられた開口部１２０、１３０を封止材や蓋板等で塞ぐ際に、それらが開口部１１０を覆うことによって観察の妨げとならないように、開口部１１０、１２０、１３０の間には一定の間隔を確保する必要がある。

本実施形態における試料収容セルは、そのような制限がなく、開口部２２０、２３０の間隔を第１実施形態における試料収容セルに比べて狭くすることができ、開口部２２０、２３０を接続するために確保すべき流路空間ＦＰの平面視における面積が狭くなる。これによれば、試料収容セルの小型化に繋がる。さらに、流路空間ＦＰを形成するために必要なエッチング量が減少し、エッチング工程が短縮される。

［試料収容セルの製造方法］
以下、具体的に、本実施形態における試料収容セル１の製造方法を説明するが、第１実施形態における試料収容セルの製造方法に共通する工程の説明は省略する。

図１４は、本発明の第１実施形態における試料収容セルの製造工程を説明する図である。図１５は、図１４に続く試料収容セルの製造工程を説明する図である。いずれの図も、図１３に対応する断面構造を示している。まず、図１４（ａ）に示すように、ＳＯＩ基板（第１層１０、第２層２０および中間層３０）の両面に、マスク層１５５、２５５を形成する。この工程は、図８（ａ）に示した第１実施形態における試料収容セルの製造工程と同様である。

続いて、１４（ｂ）に示すように、フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層１５５の一部をエッチングするが、図８（ｂ）に示す第１実施形態と比較すると、本実施形態においては第１層１０に試料注入口となる開口部は設けないため、エッチングされる領域は、開口部１１０に対応する領域のみとなる点で異なる。

次に、マスク層１５５をエッチングマスクとして、第１層１０をエッチングして中間層３０を露出させる（図１４（ｃ））。

次に、開口部１１０を覆うように第１薄膜１５０を形成する（図１５（ａ））。

次に、フォトリソグラフィ技術を用いて、第１薄膜１５０の一部をエッチングする（図１５（ｂ））。第１薄膜１５０は、開口部１１０に形成された部分を残してエッチングされる。この工程により、第１層１０側のパターンの形成が終了する。

続いて、第２層２０側の開口部２２０、２３０を形成する。図１５（ｂ）に示すように、フォトリソグラフィ技術を用いて、マスク層２５５の一部をエッチングする。エッチングされる領域は、開口部２２０、２３０に対応する領域である。

次に、マスク層２５５をエッチングマスクとして、第２層２０をエッチングして中間層３０を露出させる（図１５（ｃ））。

この工程により、第２層２０側の開口部２２０、２３０の形成が終了する。なお、この開口部２２０、２３０を形成する工程と同時に、図１０に示す個片化のための分離溝ＳＬ２を形成してもよい。

次に、開口部２２０、２３０を介して中間層３０にエッチング液を供給することによって、中間層３０をエッチングする。

そして、開口部２２０、２３０の双方から拡がった空間が接続され、かつ、第１薄膜１５０と第２層２０とが対向する領域（観察空間ＭＳ）が形成された後に、エッチングを終了する。これによって、第１層１０と第２層２０との間に流路空間ＦＰおよび観察空間ＭＳが形成され、図１３に示した試料収容セルが得られる。

＜第５実施形態＞
図１６は、本発明の第５実施形態における試料収容セルの断面構成を示す模式図である。第１薄膜１５０は、単層に限らず、２層以上の膜を含んでいてもよい。この例では、第１薄膜１５０の第１層１５０ａはアモルファスシリコン膜であり、第１薄膜１５０の第２層１５０ｂは窒化シリコン膜である。

第１薄膜１５０の第１層１５０ａは、ＳＯＩ基板の第１層１０と接触する。第１薄膜１５０の第１層１５０ａは、ＳＯＩ基板の第１層１０と第１薄膜１５０の第２層１５０ｂとが接触する場合よりも、ＳＯＩ基板の第１層１０に対する密着性が高くなるため、ＳＯＩ基板の第１層１０と第１薄膜１５０（第１層１５０ａ）との接合強度を高めることもできる。

このように、第１薄膜１５０を窒化シリコン膜の単層で形成するよりも、膜厚を変化させずにその一部をアモルファスシリコン膜とした積層構造にすることで、膜の強度を向上させたり、各層の応力を調整することで薄膜に張りを与えたりすることもできる。また、積層構造にしたことにより、各層は薄膜化されてピンホール等が発生したとしても、積層構造にすることでピンホールが塞がれて、第１薄膜１５０の膜の信頼性も向上する。

第１薄膜１５０の膜厚は、積層膜の合計で１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、望ましくは、１５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、この例では、２０ｎｍである。第１薄膜１５０は、１０ｎｍより薄くなると強度がなくなり破損するおそれがある。一方、２００ｎｍよりも厚くなると、電子線が透過しなくなる。したがって、第１薄膜１５０は、破損しない程度の膜の強度を得ながらも、できるだけ薄くすることが望ましい。

第１薄膜１５０の膜厚が２０ｎｍである場合、例えば、第１薄膜１５０の第１層１５０ａ（アモルファスシリコン膜）の膜厚は７ｎｍであり、第１薄膜１５０の第２層１５０ｂ（窒化シリコン膜）の膜厚は１３ｎｍである。第１薄膜１５０の第１層１５０ａの膜厚は、第１薄膜１５０全体の膜厚の２０％以上５０％未満であることが望ましく、３０％以上４５％未満であることがさらに望ましい。このようにすると、薄膜の強度を確保しつつ、薄膜の可視光線に対する透過率の低下を抑えることもできる。

＜その他の実施形態＞
［表面処理］
試料収容セル１の外面（特に、第１層１０の外面）については、親油（疎水）処理を施してもよい。このようにすると、試料含有液体７００が水分系のものであれば、注入の際に外側にこぼれた試料含有液体７００をセル表面から取り除くことが容易になる。また、封止材がアルコール系（油系）であれば、開口部内に浸入しにくくなり、試料含有液体との接触を避けて混合しないようにすることもできる。試料含有液体７００がアルコール系（油系）であれば、試料収容セル１の外面に、逆の処理、すなわち親水処理を施してもよい。

例えば、親水処理であれば、酸化膜で覆う処理であればよく、フッ素および酸素によるプラズマ処理で形成してもよいし、酸素含有雰囲気下での熱処理で形成してもよい。また、シリコン基板表面に形成された自然酸化膜を親水表面としてもよい。一方、親油（疎水）処理であれば、フッ素および窒素によるプラズマ処理によりシリコン基板表面にフッ化物を形成してもよいし、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシロキサン）処理によってシリコン基板表面にメチル基を形成してもよい。

［第１薄膜の種類］
第１薄膜１５０は、窒化シリコン膜に限らず、窒化酸化シリコン、酸化シリコン膜またはアモルファスシリコン膜であってもよく、さらには、金属膜、金属窒化膜、金属酸化膜、金属窒化酸化膜であってもよい。第１薄膜１５０としては、上述したように、電子線に対して透過性を有する必要がある。そして、電子顕微鏡による観察時に真空中に曝されるため、第１薄膜１５０は、大気や水分に対してバリア性を有することが望ましい。そして、中間層３０のエッチングの際に一緒にエッチングされないように、ＢＨＦに対して耐性を有することが望ましい。また、第１薄膜１５０は、単層に限らず、複数種類の膜を積層した膜であってもよい。

また、製造工程において、複数種類の膜を積層する一方、最終的には単層になるようにしてもよい。例えば、第１薄膜１５０は、ＢＨＦよりもＴＭＡＨ水溶液に耐性を有する窒化シリコン膜（ＴＭＡＨ耐性膜）と、その膜よりも中間層３０側に配置され、ＴＭＡＨ水溶液よりもＢＨＦに耐性を有する窒化シリコン膜（ＢＨＦ耐性膜）とが積層された膜であってもよい。ＴＭＡＨ耐性膜は、ＢＨＦ耐性膜よりも相対的にシリコンの含有量が低い。例えば、ＳｉｘＮｙで表した場合、ＴＭＡＨ耐性膜はｘ＝３、ｙ＝４であり、ＢＨＦ耐性膜はｘ＝５、ｙ＝４である。なお、ＴＭＡＨ耐性膜は酸化シリコン膜であってもよい。また、ＢＨＦ耐性膜はアモルファスシリコン膜、多結晶シリコン膜または単結晶シリコン膜であってもよい。

このようにすると、図９（ａ）に示す工程においては、ＴＭＡＨ耐性膜の存在により第１薄膜１５０のエッチングがされにくい。製造工程が進み、図９（ｃ）に示す工程では、ＴＭＡＨ耐性膜がエッチングされる一方、ＢＨＦ耐性膜の存在により第１薄膜１５０が残る。このようにすると、予め第１薄膜を厚膜にして形成しておき、最終的に所望の厚さまで薄膜化することができるため、安定した膜の形成が可能となる。また、応力バランスの調整も容易になる。

［チャージアップ防止］
電子顕微鏡による観察時において、試料収容セルのチャージアップを防止するために、第１層１０のシリコンは低抵抗であるほど好ましく、０．００１〜１０Ωｃｍ程度であれば効果的にチャージアップを防止することができる。

また、数ｎｍのカーボン等の導電膜をセル外面（第１層１０、第２層２０および第１薄膜１５０の表面の少なくとも一部）に配置しておいてもよい。

［ＳＯＩ基板以外を用いた試料収容セルの製造］
上述した実施形態では、試料収容セル１は、第１層１０、第２層２０および中間層３０によって形成されるＳＯＩ基板を用いて製造されていたが、ＳＯＩ基板以外でもよい。すなわち、中間層３０をエッチングする際のエッチング液に対して、第１層１０および第２層２０が耐性を有していればよい。一方、中間層３０は、第１層１０および第２層２０に開口部を形成する際のエッチングに用いるエッチング液に対して、耐性を有していることが望ましい。このような第１層１０、第２層２０および中間層３０の材料の組み合わせで実現される基板であれば、ＳＯＩ基板でなくてもよい。

１…試料収容セル、１０…第１層、２０…第２層、３０…中間層、１１０，１２０，１３０…開口部、１５０…第１薄膜、１５０ａ…第１層、１５０ｂ…第２層、１５５，２５５…マスク層、３００…硬化前樹脂、３２０，３３０…封止材、３６０…接着剤、３７０…蓋板、７００…試料含有液体、８００…観察セル作製装置、８１０…試料注入器、８１１…チップ取付部、８１３…支持部、８１５…制御部、８１７…チップ取り外し部、８２０…チップ、８２５…チップ台、８３０，８４０…試料カップ、８３５，８４５…カップ台、８５０…試料台、８６０…ＵＶ照射器、８７０…廃棄口、８８８…ステージ、１０００…外部空間

Claims (12)

1. 第１開口部を有する第１層と、
   前記第１層に対向して配置される第２層と、
   前記第１層と前記第２層とに挟まれて配置された中間層であって、前記第１層または前記第２層に形成された少なくとも１つの開口部を介して外部空間に接続し、前記少なくとも２つの開口部の端部から所定の距離にわたって拡がり、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間と外部空間とを接続する流路空間を形成する中間層と、
   前記第１開口部の前記第２層側を開口内部から塞ぎ、少なくとも当該第１開口部の側面に支持され、電子線に対して透過性を有する第１薄膜と、
   を備えることを特徴とする試料収容セル。
2. 前記少なくとも１つの開口部のいずれかは、前記第１層に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の試料収容セル。
3. 前記少なくとも１つの開口部のいずれかは、前記第２層に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の試料収容セル。
4. 前記第１層および前記第２層は、シリコンであり、
   前記中間層は、酸化シリコンであることを特徴とする請求項１に記載の試料収容セル。
5. 前記第１層および前記第２層は、表面が（１００）面のシリコンであり、
   前記第１開口部は、開口内部の側面が（１１１）面であることを特徴とする請求項４に記載の試料収容セル。
6. 第１層、第２層および当該第１層と当該第２層とに挟まれた中間層を有する基板において、第１開口部および少なくとも２つの開口部に対応する領域の前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させ、
   前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆い、
   前記少なくとも２つの開口部を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間、および当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する
   ことを特徴とする試料収容セルの製造方法。
7. 第１層、第２層および当該第１層と当該第２層とに挟まれた中間層を有する基板において、第１開口部に対応する領域の前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させ、
   少なくとも２つの開口部に対応する領域の前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させ、
   前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆い、
   前記少なくとも２つの開口部を介して第１エッチング液を前記中間層に供給して当該中間層をエッチングし、前記第１開口部と前記第２層との間の観察空間、および当該観察空間と前記液体注入口とを接続する流路空間を形成する
   ことを特徴とする試料収容セルの製造方法。
8. 前記第２層をエッチングして、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを更に含み、
   前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させることは、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを含むことを特徴とする請求項６に記載の試料収容セルの製造方法。
9. 前記第１層をエッチングして前記中間層を露出させることと、前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させることは、個片化される前記試料収容セルの端部に沿って、前記中間層に到達しない分離溝を形成することを含むことを特徴とする請求項７に記載の試料収容セルの製造方法。
10. 前記第１開口部に対応する領域において露出された前記中間層を第１薄膜で覆うことは、
    前記第１開口部および前記液体注入口に対応する領域において露出された前記中間層を前記第１薄膜で覆い、
    前記液体注入口に対応する領域において前記第１薄膜をエッチングして前記中間層を露出させることを含むことを特徴とする請求項６または請求項７に記載の試料収容セルの製造方法。
11. 前記第１層および前記第２層をエッチングして前記中間層を露出させることは、第２エッチング液を用いたエッチングであり、
    前記第１層および前記第２層は、前記第２エッチング液よりも前記１エッチング液に対して耐性を有し、
    前記中間層は、前記第１エッチング液よりも前記２エッチング液に対して耐性を有することを特徴とする請求項６または請求項７に記載の試料収容セルの製造方法。
12. 前記第１層および前記第２層は、シリコンであり、
    前記中間層は、酸化シリコンであることを特徴とする請求項１１に記載の試料収容セルの製造方法。

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