JP2016204323A - 骨形成促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】カルシウムの吸収を促進し、吸収されたカルシウムが効率よく骨の形成に反映される骨形成促進剤、組成物、及びサプリメントを提供する。【解決手段】コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分とする骨形成促進剤。特にコラーゲンとジフルクトース無水物−ＩＩＩを有効成分とする骨形成促進剤、組成物、及びサプリメント。【選択図】なし

Description

本発明は、骨粗鬆症の予防及び治療に用いることができる骨形成促進剤に関する。また本発明は、骨粗鬆症の予防及び治療に用いることができる骨形成促進作用を有する組成物に関する。さらに本発明は、骨粗鬆症の予防及び治療に用いることができる骨形成促進作用を有するサプリメントに関する。

社会の高齢化に伴い、骨粗鬆症が増加している。骨粗鬆症は骨量が減少することによって、骨が脆くなる疾患である。骨は常に作り変えられており、健常者においては吸収される骨量と形成される骨量がほぼ等しく、骨量が一定に保たれている。一方、高齢者においては、吸収される骨量よりも形成される骨量が減少するために、骨粗鬆症に罹患する傾向が高くなる。

骨粗鬆症はホルモンの分泌と関係が深く、閉経後、女性ホルモンであるエストロゲンの減少によって生じることが多い。２００６年に厚生労働省によって、骨粗鬆症の患者の統計が行われたが、この統計によれば、６０歳代の女性では２人に１人、７０歳以上になると１０人に７人が骨粗鬆症であり、男性においても、６０歳過ぎから徐々に増え、７０歳以上では１０人に４人とされている。現在、日本には女性では約８００万人、男性では約２００万人、合計１，０００万人以上の骨粗鬆症患者がいると推定されている。

骨粗鬆症における骨折などの医療費は年々増加しており、医療における問題だけではなく社会問題にもなっている。また、米国における骨粗鬆症の治療に要する直接医療費は１４兆円にも及んでいる。
骨粗鬆症における別の問題点は、骨が稀弱化することによって、運動器症候群になることである。厚生労働省は２００６年から２０１０年にかけて運動器症候群の対策を国家プロジェクトに指定して、多くの研究が行われたが、治療法が開発されなかったのが現状である。

骨組織は骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収が常に繰り返されるリモデリングが行われている。正常な場合では、骨のリモデリングは骨芽細胞と破骨細胞は細胞間の連携、骨の成長を調節するホルモン、や成長因子によって調節されており、骨の量や骨に含まれるカルシウムの恒常性が保たれている。

このために、骨粗鬆症の治療にはＣａ製剤や骨形成を促進する副甲状腺ホルモンであるカルシトニンが多く使用されて来たが、充分な効果が得られなかった経緯がある。

また、近年では骨粗鬆症治療薬として、骨芽細胞の骨吸収作用を抑制するビスフォスフォネート製剤が使用されている。骨組織は常に吸収と形成が繰り返されて、作り変えられているが、ビスフォスフォネート製剤は骨吸収作用を抑制することによって、骨の吸収を抑制する。したがって、本来吸収されるべき古い骨が吸収されることがないので、腐骨を形成するケースがみられる。また、ビスフォスフォネート製剤を服用する患者では、骨組織のリモデリングが低下するために、骨再生が長引く傾向にある。

骨組織は約６４％の無機質と残りのコラーゲンとオステオネクチンなどの有機質で構成されている。骨組織が形成される時には、コラーゲンとオステオネクチンや骨シアロプロテインなどの非コラーゲンタンパクから構成される骨組みに、カルシウムやマグネシウムを中心とする無機質が沈着する。

骨の無機質の主成分はハイドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６ＯＨ_２）という微細な結晶から形成されおり、カルシウムは骨の結晶を形成するための重要な成分なっている。そのカルシウムは腸管上部から吸収されるが、骨粗鬆症の治療や予防のためにと従来使用されるカルシウム製剤は、口腔から摂取すると、ほとんど小腸から吸収されることはなく、体外に排出されてしまう。

そのため、小腸からカルシウムを吸収するには、吸収促進剤が必要となっている。ジフルクトース無水物−ＩＩＩ（ＤＦＡ−ＩＩＩ）はカルシウム吸収促進剤であることが知られている（特許文献１、２）。

特開２００６−２４１０５７号公報 特開２００５−２４７７５８号公報

本発明は、カルシウムの吸収を促進し、吸収されたカルシウムが効率よく骨の形成に反映される骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントを提供することを目的とするものである。

すなわち本発明は、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進剤である

また本発明は、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進作用を有する組成物である。

さらに本発明は、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進作用を有するサプリメントである。

本発明により、カルシウムが効率よく吸収され、骨粗鬆症の予防及び治療に用いることができる骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントを提供することが可能となる。

本発明の骨形成促進剤は、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する。

本発明の組成物は、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する。

本発明のサプリメントは、コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する。

本発明で用いるコラーゲンは、ヒトが摂取可能なコラーゲンペプチドであればよく限定されないが、例えば、ブタコラーゲンペプチド、ウシコラーゲンペプチド、フィッシュコラーゲンペプチド、またはヒツジコラーゲンペプチド等を挙げることができる。中でも好ましいコラーゲンとして、フィッシュコラーゲンペプチドを挙げることができる。用いる量は例えば、１日量として約１００ｍｇ〜８０，０００ｍｇ、好ましくは約１，０００ｍｇ〜１０，０００ｍｇである。

カルシウム吸収促進剤としては、クエン酸・リンゴ酸（ＣＣＭ）、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、乳糖、フラクトオリゴ糖、またはＤＦＡ−ＩＩＩ等が挙げられる。これらのカルシウム吸収促進剤は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いても良い。用いる量は例えば、1日量として約１ｍｇ〜５０，０００ｍｇ、好ましくは約１００ｍｇ〜１，０００ｍｇである。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントはコラーゲンペプチド、カルシウム吸収促進剤の他にビタミン類やミネラル類等をさらに含有することができる。

ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ，ビタミンＫ群が挙げられる。ビタミン類の含有量は例えば、１日量として、ビタミンＡの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは１５ｍｇ、ビタミンＣの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ、ビタミンＫ_２（０．２％）の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは２５ｍｇ、ビタミンＢ１（チアミン硝酸塩）の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ、ビタミンＢ６（ピリドキシン塩酸塩）の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは１２ｍｇを加えることができる。

ミネラル類としては、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸一カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、オクタリン酸カルシウム、無定形リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、または水酸化カルシウム等が挙げられる。用いる量は例えば、１日量として、クエン酸カルシウムの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇ、炭酸カルシウムの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは６００ｍｇ、リン酸−水素カルシウムの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇ、炭酸マグネシウムの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは３００ｍｇを加えることができる。

ビタミン類及びミネラル類の他には、リンゴ酸、ポリグルタミン酸、グルコサミン塩酸塩、コンドロイチン、β−クリプトキサンチン、またはヒアルロン酸等を加えることができる。用いる量は例えば、１日量として、リンゴ酸の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは３０ｍｇ、ポリグルタミン酸の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ、グルコサミン塩酸塩の場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは８００ｍｇ、コンドロイチンの場合は、約１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは４００ｍｇを加えることができる。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントは経口投与可能な製剤とすることができる。このような製剤としては例えば、口腔内崩壊錠、チュアブル錠、分散錠等の錠剤や、カプセル剤、顆粒剤、散剤、経口液剤、シロップ剤、または経口ゼリー剤等を挙げることができる。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントでは、製剤化に際して、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、等張化剤、安定剤、保存剤、矯味剤、溶解補助剤、または乳化剤等をさらに加えることができる。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントは、従来公知の方法にて製造することができる。例えば錠剤の場合、次のような工程で製剤化できる。すなわち、秤量、一次混合（有効成分、賦形剤、結合剤、崩壊剤等を均一に混合）、造粒、篩過、二次混合（滑沢剤等を混合）、コーティング（必要に応じ）、包装等の工程を経る製造方法である。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントのコラーゲンの含量は特に限定されない。例えば、骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメント全体の、０．１〜３０％、好ましくは０．５〜２０％、さらに好ましくは、１〜１０％とすることができる。

本発明の骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメントのカルシウム吸収促進剤の含量は特に限定されない。例えば、骨形成促進剤、組成物、ならびにサプリメント全体の、０．１〜３０％、好ましくは０．５〜２０％、さらに好ましくは１〜１０％とすることができる。

実験で用いた製剤は、１日量として、表１に記載の材料を２０錠の錠剤（以下、錠剤と云う）として調製したものである。

（表１）

動物実験は、卵巣を摘出した動物（ＯＶＸ）で行った。動物は、体重約３５０ｇの雌性Ｗｉｓｔｅｒ系ラット４８匹を用い、卵巣摘出後１週間、標準飼料（日本クレア社製ＣＥ−２）で予備飼育後、各実験に用いた。すべての実験に関して、株式会社日本クレアの動物実験倫理委員会の許可を得て、その指針に従って行った。なお、標準飼料として用いる日本クレア社製ＣＥ−２は、炭酸カルシウ及びヨウ素酸カルシウムとして、飼料１００ｇ中にカルシウム１．０６ｇを含んでいる（日本クレア社ホームページ掲載２００９年度定期分析平均値より）。

実施例１
予備飼育後のＯＶＸラット６匹を３匹ずつ２群に分け、実験群はコラーゲンの含量が３％になる量の錠剤を含むＣＥ−２飼料で、対照群はコラーゲンの含量が３％である標準飼料で飼育した。飼育１ヵ月後、体重１０ｇあたり０．５ｍｇのフェノバルビタールを腹腔内に投与して麻酔を行い、ｐＨ７．４のカコジレートバッファーで希釈した４％のパラホルムアルデヒドで還流固定を行った。固定後、関節頭部を取り出し、３次元ＣＴＲを用いてＸ線像を撮影した。

３次元ＣＴＲを用いた画像では、実験群は対照群に比べて、皮質骨が厚く、海面骨の量や幅が大きかった。（図１）
また、骨の面積を測定する画像ソフトＯｓｉｒｉＸで測定した(表２)。結果から実験群は対照群に比べ、関節頭に占める骨の割合（骨密度）を１１．４％増加させていることが判明した。

（表２）

実施例２
ヒトでの効果の確認のため、４８才〜７６才の男女５名のボランティアに１日２０錠の錠剤を６か月服用させた。服用開始時及び６ヵ月後に、超音波骨密度測定装置（ＣＭ−２００管理医療機器）にて肘のとう骨の骨密度を測定した。結果を表３、図２に示す。

（表３）

表３から、骨密度は１０〜１９％増加していた。平均増加率は１５．４％であった。

実施例３
ＤＦＡ−ＩＩＩの骨芽細胞に対する効果を、ヒトの肉腫から分離された骨芽細胞系細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて調べた。
ペニシリン（ＳＩＧＭＡ社製）とストレプトマイシン（ＳＨＩＧＭＡ社製）（２００μｇ／１ｍＬ）９０μＬのα−ＭＥＭ培地を注いだ９６穴ウエルに３×１０^５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を撒き、１０ｍＭ、５０ｍＭ、及び１００ｍＭの濃度になるようＤＦＡ−ＩＩＩを培養液に加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。各濃度５ウエルずつの培養を行い、培養後１日目、４日目、７日目、１４日目に細胞数を測定した。

細胞測定時は、細胞培養と同じ条件下で、１０ｍＭのトリプシンで３０分間処理して細胞をウエルから剥離し、次いで細胞をＭＴＳ液（プロメガ社製）１００μＬに加えて、細胞培養と同じ条件で３０分間インキュベーションし、プレートリーダー（バイオラッド社製「ｉＭａｒｋプレートリーダー」）を用いて４９０ｎｍの吸収波長で定量した。測定される吸光度は相対的に細胞数を表している。

測定値は、同じ培養条件の５ウエルの内、中央値３つの平均値とし、対照群は培地にＤＦＡ−ＩＩＩを加えないものを用いた。コラーゲンは、本培養実験の条件ではアミノ酸レベルに溶解しないため、コラーゲンを混合した培養は行わなかった。
各点での測定値を表４、図３に示した。

（表４）

培養後１日目、４日目、ならびに７日目においては、対照実験群の方がＤＦＡ−ＩＩＩを添加した実験群より、高い値を示した。しかし、培養後１４日目では対照実験群よりもＤＦＡ−ＩＩＩを添加した群の方が高い値を示し、ＤＦＡ−ＩＩＩの濃度が高くなるにしたがって、高い値を示した。この実験結果はＤＦＡ−ＩＩＩが骨芽細胞の細胞分裂を刺激することを示している。

実施例４
３次元ＣＴＲによる骨組織の分析
予備飼育後のＯＶＸラット１２匹を３匹ずつ群分けし、Ａ群は標準飼料に３％のコラーゲン及び５％のＤＦＡ−ＩＩＩを加えた飼料、Ｂ群は同量のＤＦＡ−ＩＩＩのみを加えた飼料、Ｃ群は同量のコラーゲンのみを加えた飼料、Ｄ群は標準飼料のみで飼育した。
飼育開始１週間後、２週間後、３週間後、ならびに１ヶ月後に、体重１０ｇあたり０．５ｍｇのフェノバルビタールを腹腔内に投与して麻酔を行った。ｐＨ７．４のカコジレートバッファーで希釈した４％のパラホルムアルデヒド溶液をシリンジに注入し、左心室より５分間灌流して、灌流固定を行った。固定後、大腿骨関節頭と下肢の頚骨を取り出した。関節頭部は実験動物用３次元マイクロＸ線ＣＴＲ−ｍＣＴ２（株式会社リガク）を使用して、３次元ＣＴＲ写真を撮影した。
１ヵ月後のＸ線像を図４に示した。

ＣＴＲ写真で、各群を比較すると、Ａ群が最も緻密骨が厚く、海面骨も密に配列している。Ｂ群とＣ群では顕著な差はみられない。Ｄ群では緻密骨と海面骨の両方とも最も薄い。

さらに、撮影した３次元ＣＴＲ写真から、同じ方向の断面の５枚の写真を選択して、各個体の骨と骨髄の面積を測定して平均値とした（表５及び図５）。
各実験群と対照のＤ群と比較すると、Ａ群では３２．９％、Ｂ群では１０．２％、Ｃ群では８．８％関節頭に占める骨の割合が増加していた。

（表５）

上記結果より、ＯＶＸラットにおいて、ＤＦＡ−ＩＩＩあるいはコラーゲンを単独で摂取させた群は、標準飼料のみで飼育した群と比べ、骨組織を１０％前後増加しており、さらに、ＤＦＡ−ＩＩＩとコラーゲンを摂取させた群は３０％以上の増加が見られ、ＤＦＡ−ＩＩＩとコラーゲンの混合には相乗効果が認められた。

実施例５
骨欠損時の治癒促進効果の確認
予備飼育後のＯＶＸラット１２匹を用い、体重１０ｇあたり０．５ｍｇのフェノバルビタールを腹腔内に投与して麻酔を行った。膝関節上部の皮膚を切開した後、膝関節を露出して、脛骨の骨端部に歯科用のランドバーで、直径約０．５ｍｍの穴を開け、切開部を縫合した。

術後、３匹ずつ４群に分け、Ａ群は標準飼料に３％のコラーゲン及び５％のＤＦＡ−ＩＩＩを加えた飼料、Ｂ群は同量のＤＦＡ−ＩＩＩのみを加えた飼料、Ｃ群は同量のコラーゲンのみを加えた飼料、Ｄ群は標準飼料のみで飼育した。
飼育１ヶ月後に、同じ麻酔を行い、大腿骨の実験と同様に左心室から４％パラフォルムで灌流固定を行った。固定後に手術を行った部位を取り出し、ｐＨ７．４に調整した０．８Ｍカコジレート緩衝液で洗浄後、前記のＣＴＲ装置で３次元−ＣＴＲ写真を撮影した（図６）。

さらに実施例４と同様に骨欠損部の５枚の写真を使用して骨と骨髄の面積を測定した（表６）。

（表６）

新生骨が形成された割合は、対照であるＤ群の６．８％と比べると、Ａ群で２２．２％、Ｂ群で４．６％、Ｃ群で４．３％多くなっていた。

この結果も、ＤＦＡ−ＩＩＩあるいはコラーゲン単独よりも、ＤＦＡ−ＩＩＩとコラーゲン混合の相乗効果を示すものである。

コラーゲンとカルシウム吸収促進剤、特にコラーゲンとジフルクトース無水物−ＩＩＩとを含有する骨形成促進剤、組成物、サプリメントは骨粗鬆症の予防や治療に利用可能である。

脛骨中央部の二次元ＣＴＲ画像である。 超音波によるとう骨の骨密度（ｇ／ｃｍ^２）のグラフである。 ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養結果(細胞数)のグラフである。 飼育開始1ヵ月後の大腿骨関節頭部のＸ線像である。 食餌開始後1ヶ月目の骨全体の中で骨の占める割合のグラフである。 骨欠損作成、飼育１ヵ月後のＸ線像である。

Claims (14)

1. コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進剤。
2. カルシウム吸収促進剤がジフルクトース無水物−ＩＩＩである請求項１に記載の骨形成促進剤。
3. コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進作用を有する組成物。
4. カルシウム吸収促進剤がジフルクトース無水物−ＩＩＩである請求項３に記載の組成物。
5. 組成物中のジフルクトース無水物−ＩＩＩの含量が０．１〜３０％である請求項４に記載の組成物。
6. 組成物中のコラーゲンの含量が０．１〜３０％である請求項４または５に記載の組成物。
7. 組成物中のコラーゲンの含量が０．５〜２０％であり、かつジフルクトース無水物−ＩＩＩの含量が０．５〜２０％である請求項４〜６の何れか一項に記載の組成物。
8. 経口剤である請求項３〜７の何れか一項に記載の組成物。
9. 錠剤である請求項３〜８の何れか一項に記載の組成物。
10. コラーゲンとカルシウム吸収促進剤を有効成分として含有する骨形成促進作用を有するサプリメント。
11. カルシウム吸収促進剤がジフルクトース無水物−ＩＩＩである請求項１０に記載のサプリメント。
12. サプリメント中のジフルクトース無水物−ＩＩＩの含量が０．１〜３０％である請求項１１に記載のサプリメント。
13. サプリメント中のコラーゲンの含量が０．１〜３０％である請求項１１または１２に記載のサプリメント。
14. サプリメント中のコラーゲンの含量が０．５〜２０％であり、かつジフルクトース無水物−ＩＩＩの含量が０．５〜２０％である請求項１１〜１３の何れか一項に記載のサプリメント。