JP2016199514A - 自己組織化ペプチド及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】安定性が向上した自己組織化膜を形成することができる自己組織化ペプチドを提供する。また、安定性が向上した自己組織化膜及びその製造方法、パターン形状を有する自己組織化膜及びその製造方法、並びにデバイスを提供する。【解決手段】複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチド；溶媒中に溶解又は分散させた自己組織化ペプチドを基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、自己組織膜に光を照射する工程と、を備える、安定性が向上した自己組織化膜の製造方法；自己組織化膜を形成する工程と、自己組織化膜にパターン状に光を照射して、光架橋性基が架橋された領域及び架橋されていない領域を形成する工程と、架橋されていない領域の自己組織化膜を基板から剥離する工程と、を備える、パターン形状を有する自己組織化膜の製造方法；自己組織化膜；自己組織化膜を備えるデバイス。【選択図】なし

Description

本発明は、自己組織化ペプチド及びその利用に関する。より具体的には、自己組織化ペプチド、自己組織化膜、自己組織化膜の製造方法及びデバイスに関する。

微細な構造制御の手法として、半導体の微細化技術のように、大きなものを削って小さくしていく「トップダウン」とよばれる手法と、原子や分子を組み上げて大きなものにする「ボトムアップ」とよばれる手法が知られている。近年、トップダウン的な手法による微細な構造制御を補完あるいは代替する手法として、ボトムアップ的な手法が注目を集めている。

例えば、ヒトのアルツハイマー病の原因の一つとされているアミロイドβタンパク質の一部分を模倣して設計されたペプチドが、無機物である雲母の界面において規則正しく配列し自己組織化膜を形成することが報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。

Kowalewski T. and Holtzman D. M., In situ atomic force microscopy study of Alzheimer's beta-amyloid peptide on different substrates: new insights into mechanism of beta-sheet formation., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96, 3688-3693, 1999.

しかしながら、非特許文献１に記載の自己組織化膜は、溶液中で容易に剥離してしまう場合がある。そこで、本発明は、安定性が向上した自己組織化膜を形成することができる自己組織化ペプチドを提供することを目的とする。本発明はまた、安定性が向上した自己組織化膜及びその製造方法、パターン形状を有する自己組織化膜及びその製造方法、並びにデバイスを提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
［１］複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチド。
［２］下記式（１）で表される、請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （１）
［式（１）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、光架橋性基を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基、芳香族アミノ酸若しくはその誘導体の残基又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体の残基を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体の残基を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。］
［３］前記光架橋性基がクマリン基である［１］又は［２］に記載の自己組織化ペプチド。
［４］溶媒中に溶解又は分散させた［１］〜［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチドを基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、前記自己組織膜に光を照射する工程と、を備える、安定性が向上した自己組織化膜の製造方法。
［５］溶媒中に溶解又は分散させた［１］〜［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチドを基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、前記自己組織化膜にパターン状に光を照射して、前記光架橋性基が架橋された領域及び架橋されていない領域を形成する工程と、前記架橋されていない領域の自己組織化膜を基板から剥離する工程と、を備える、パターン形状を有する自己組織化膜の製造方法。
［６］［１］〜［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチドが配列してなる自己組織化膜。
［７］前記光架橋性基の少なくとも１部が架橋されている［６］に記載の自己組織化膜。
［８］前記光架橋性基がパターン状に架橋されている［７］に記載の自己組織化膜。
［９］パターン形状を有する［７］又は［８］に記載の自己組織化膜。
［１０］［６］〜［９］のいずれかに記載の自己組織化膜を備えるデバイス。
［１１］下記式（２）で表される自己組織化ペプチド。
Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （２）
［式（２）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、存在しないか、或いは芳香族アミノ酸若しくはその誘導体又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。］
［１２］［１１］に記載の自己組織化ペプチドが配列してなる自己組織化膜。
［１３］［１２］に記載の自己組織化膜を備えるデバイス。

本発明によれば、安定性が向上した自己組織化膜を形成することができる自己組織化ペプチドを提供することができる。また、安定性が向上した自己組織化膜及びその製造方法、パターン形状を有する自己組織化膜及びその製造方法、並びにデバイスを提供することができる。

実験例４の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 実験例４で作製した自己組織化膜の表面被覆率と使用したペプチド水溶液の濃度を用いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒの吸着等温式による近似曲線によるフィッティングを行った結果を示すグラフである。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例５の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例５の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例５の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 実験例６の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 実験例６の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。 （ａ）〜（ｈ）は、実験例７の結果を示す原子間力顕微鏡画像である。

［自己組織化ペプチド］
１実施形態において、本発明は、複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチドを提供する。

本明細書において、自己組織化ペプチドとは、溶媒中に溶解又は分散させて基板と接触させると自発的に規則正しく配列して自己組織化膜を形成する能力（自己組織化能）を有するペプチドを意味する。

また、本明細書において、ペプチドとは、アミノ酸又はアミノ酸誘導体がペプチド結合（アミド結合）により複数脱水縮合して形成された物質を意味する。アミノ酸としては、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、プロリン、グリシン等の脂肪族アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン等の芳香族アミノ酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン等の非極性アミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン等のｐＨ７で正電荷を有するアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等のｐＨ７で負電荷を有するアミノ酸等が挙げられる。

アミノ酸誘導体としては、上記アミノ酸の各種誘導体が挙げられ、例えば、非天然アミノ酸；アミノアルコール；側鎖のカルボニル基、アミノ基、チオール基等が各種置換基により置換したもの等が挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基、ハロゲン原子（フッ素等）で修飾された芳香族基、各種保護基等が挙げられる。より具体的なアミノ酸誘導体としては、例えば、Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Ｓ−ニトロシステイン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−アリルシステイン、バリンアミド、２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール等が挙げられる。

本実施形態の自己組織化ペプチドは、１分子のペプチド中に複数の光架橋性基を有することにより、自己組織化させた後、他のペプチド分子の光架橋性基と架橋させることができる。これにより、安定性が向上した自己組織化膜を形成することができる。

光架橋性基としては、紫外線、可視光、赤外線等の光を照射することにより架橋させることが可能な基が挙げられ、例えば、クマリン基、ジアジリン基、アジド基等が挙げられる。光架橋性基の分子量が大きい場合、ペプチドの自己組織化を阻害する場合がある。このため、光架橋性基は分子量が小さいものであることが好ましい。このような観点から、光架橋性基はクマリン基であってもよい。

架橋性基として光架橋性基を採用することにより、フォトリソグラフィー等を用いて所望のパターンに光を照射し、自己組織化膜に光架橋性基が架橋された領域と架橋されていない領域を形成することができる。また、実施例において後述するように、光架橋性基が架橋された領域と架橋されていない領域では、自己組織化膜の安定性が異なる。このため、光架橋性基が架橋されていない領域を選択的に剥離することができる。これにより、所望のパターン形状を有する自己組織化膜を製造することが可能になる。

光架橋性基は、例えば、光架橋性基を有するアミノ酸の残基として自己組織化ペプチドに導入してもよい。例えば、アスパラギン、グルタミン酸等の、側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸の当該カルボキシル基に光架橋性基を導入したアミノ酸を、自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸に含めることにより、光架橋性基を導入することができる。

本実施形態の自己組織化ペプチドにおいて、ペプチドを構成するアミノ酸の数は、例えば４〜１００個、例えば４〜５０個、例えば４〜２０個、例えば４〜１０個であってよい。ここで、光架橋性基を、光架橋性基を有するアミノ酸の残基として自己組織化ペプチドに導入する場合、自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸の数には、光架橋性基を有するアミノ酸の数も含めることとする。

本実施形態の自己組織化ペプチドは、下記式（１）で表されるものであってもよい。
Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （１）

式（１）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、光架橋性基を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基、芳香族アミノ酸若しくはその誘導体の残基又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体の残基を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体の残基を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。

本実施形態の自己組織化ペプチドは、少なくとも２つの光架橋性基を有する。上記のｍは２以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましい。また、上記のｎは、例えば１〜３０であってもよく、例えば１〜２０であってもよく、例えば１〜１０であってもよく、例えば１〜５であってもよい。

上記式（１）において、光架橋性基を有するアミノ酸としては、上述したものが挙げられ、より具体的には、アスパラギン、グルタミン酸等の、側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸の当該カルボキシル基に、例えばクマリン基等の光架橋性基を導入したアミノ酸等が挙げられる。

また、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン等が挙げられる。また、ｐＨ７で電荷を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジン等のｐＨ７で正電荷を有するアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等のｐＨ７で負電荷を有するアミノ酸等が挙げられる。上記のアミノ酸は、上述したアミノ酸誘導体であってもよい。

本実施形態の自己組織化ペプチドは、上記式（１）におけるＸを、適宜、芳香族アミノ酸若しくはその誘導体の残基、ｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基に改変することにより、様々な基板上で自己組織化させることができる。

基板としては、各種層状物質が挙げられ、例えば、グラフェン（グラファイト）、二硫化モリブデン、二セレン化タングステン、窒化ホウ素、二セレン化モリブデン、二硫化タングステン、雲母等が挙げられる。

１実施形態において、本発明は、下記式（２）で表される自己組織化ペプチドを提供する。
Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （２）

式（２）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、存在しないか、或いは芳香族アミノ酸若しくはその誘導体又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。

後述するように、発明者らは、上記式（２）で表されるペプチドが自己組織化能を有することを見出した。本実施形態のペプチドは、現在自己組織化能を有することが知られているペプチドと比較しても格段に単純な構造を有するものである。このため、低コストで効率よく容易に製造することができる。本実施形態のペプチドは、Ｘ^１、Ｘ^２、ｍ、ｎを適宜変更することにより、基板への吸着力、自己組織化後又は光架橋後の安定性等を、自在に調整することができる。

上記式（２）において、ｍは２以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましい。また、上記のｎは、例えば１〜３０であってもよく、例えば１〜２０であってもよく、例えば１〜１０であってもよく、例えば１〜５であってもよい。

本実施形態の自己組織化ペプチドにおいても、上記式（２）におけるＸを、適宜、芳香族アミノ酸若しくはその誘導体の残基、ｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基に改変することにより、様々な基板上で自己組織化させることができる。基板としては、上述したものが挙げられる。

［自己組織化膜の製造方法］
１実施形態において、本発明は、溶媒中に溶解又は分散させた、複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチドを、基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、前記自己組織膜に光を照射する工程と、を備える、自己組織化膜の製造方法を提供する。

本実施形態の製造方法により製造された自己組織化膜は安定性が向上しており、例えば、溶媒中に浸漬した場合に、光を照射していない自己組織化膜と比較して、光を照射した自己組織化膜が剥離しにくい。溶媒としては、例えば、ペプチドに対する親和性の高い極性溶媒が挙げられ、より具体的には、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。

本実施形態の自己組織化膜の製造方法において、自己組織化膜を形成する工程と自己組織膜に光を照射する工程とを同時に実施してもよい。実施例において後述するように、自己組織化膜の形成と光の照射を同時に行っても安定性が向上した自己組織化膜を製造することができる。

（パターニング）
１実施形態において、本発明は、溶媒中に溶解又は分散させた、複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチドを、基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、前記自己組織化膜にパターン状に光を照射して、前記光架橋性基が架橋された領域及び架橋されていない領域を形成する工程と、前記架橋されていない領域の自己組織化膜を基板から剥離する工程と、を備える、パターン形状を有する自己組織化膜の製造方法を提供する。

本実施形態の自己組織化膜の製造方法によれば、所望のパターン形状を有する自己組織化膜を製造することができる。パターン形状は任意の形状であってよい。実施例において後述するように、発明者らは、複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチドで形成した自己組織化膜に光を照射して架橋すると、架橋していない自己組織化膜と比較して、溶媒中における安定性が向上することを見出した。

したがって、自己組織化膜を所望のパターンで架橋させ、例えば適切な種類、温度の溶媒中等の条件下で、架橋していない部分を剥離させることにより、所望のパターン形状の自己組織化膜を製造することができる。

［自己組織化膜］
１実施形態において、本発明は、複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチドが規則正しく配列してなる自己組織化膜を提供する。本実施形態の自己組織化膜において、光架橋性基は架橋されていなくてもよい。この場合、自己組織化膜を所望のパターン形状で光照射して架橋し、架橋されていない部分を剥離させることにより、所望のパターン形状の自己組織化膜を製造することができる。

１実施形態において、上記の自己組織化膜は、光架橋性基の少なくとも１部が架橋されていてもよい。実施例において後述するように、光架橋性基が架橋されている場合には、安定性が向上した自己組織化膜となる。

１実施形態において、上記の自己組織化膜は、光架橋性基がパターン状に架橋されていてもよい。このような自己組織化膜は、架橋されていない部分を剥離させることにより、架橋されたパターン形状の自己組織化膜を製造することができる。

１実施形態において、本発明は、パターン形状を有する自己組織化膜を提供する。本実施形態の自己組織化膜は、電子デバイス、センサー等のデバイスに利用することができる。

１実施形態において、本発明は、上記式（２）で表される自己組織化ペプチドが規則正しく配列してなる自己組織化膜を提供する。上述したように、上記式（２）で表される自己組織化ペプチドは、現在自己組織化能を有することが知られているペプチドと比較しても格段に単純な構造を有するものである。このため、本実施形態の自己組織化膜は、低コストで効率よく容易に製造することができる。また、上記式（２）で表される自己組織化ペプチドは、Ｘ^１、Ｘ^２、ｍ、ｎを適宜変更することにより、基板への吸着力、自己組織化後又は光架橋後の安定性等を、自在に調整することができる。

［デバイス］
１実施形態において、本発明は、上述した自己組織化膜を備えるデバイスを提供する。本実施形態のデバイスとしては、例えば、上述した自己組織化膜を足場として様々な生体物質を整列させたバイオセンサー；キャパシター、トランジスタ等の電子デバイス；生体材料と電子材料を併用した電子デバイス等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（側鎖にクマリン誘導体を有する光架橋性アミノ酸の合成）
側鎖にクマリン誘導体を有する光架橋性アミノ酸を合成した。合成スキームを以下に示す。

《Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−Ｏ^ｔＢｕ（２−３）の合成》
アミノ基を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）で、１位のカルボキシル基をｔｅｒｔ−Ｂｕ基でそれぞれ保護したグルタミン酸誘導体（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｏ^ｔＢｕ、２−１、渡辺化学工業社製）１６９．９ｍｇ（０．３９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、アミノ基を有するクマリン誘導体７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、２−２、東京化成工業社製）７６．８ｍｇ（０．４８３ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ、東京化成工業株式会社）１６９．４ｍｇ（０．４４６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を１０ｍＬサンプル瓶へ秤量した後、約１時間窒素バブリングを行ったＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）６ｍＬを加えて充分に溶解させた。

続いて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、渡辺化学工業株式会社）７５．６μＬ（０．４４１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、窒素雰囲気下にて３日間室温で攪拌した。反応後溶媒を留去した後、ジクロロメタン約５０ｍＬに溶解させ、飽和重曹水、０．１Ｍ ＨＣｌ_ａｑ、０．０１Ｍ ＮａＯＨ_ａｑ、飽和食塩水による洗浄を行った。最後に溶媒を減圧留去し淡黄色の粉末（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−Ｏ^ｔＢｕ、２−３）を回収した。

２２３．０ｍｇ（９６％），^１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ：１０．３６（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７６−７．６５（ｍ，５Ｈ），７．４８−７．２７（ｍ，５Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），４．３６−４．１４（ｍ，３Ｈ），３．９６（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１３−１．９９，１．９４−１．７６（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），ｍ／ｚ＝６０５．５４（Ｃ_３４Ｈ_３４Ｎ_２Ｏ_７＋Ｎａ^＋＝６０５．２２９８）

《Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−ＯＨ（２−４）の合成》
得られたＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−Ｏ^ｔＢｕ（２−３）に対してトリフルオロ酢酸を加え、ジクロロメタン中にて室温で約３時間撹拌することでカルボキシル基の脱保護を行い、目的物である光架橋性基を有するアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−ＯＨ（２−４）を合成した。

得られたＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−Ｏ^ｔＢｕ（２−３）全量（２２３．０ｍｇ）を１９ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。続いて、トリフルオロ酢酸１９ｍＬを加え、室温で約３時間撹拌した。その後、窒素をバブリングすることでトリフルオロ酢酸及びジクロロメタンを留去し、目的物である、側鎖にクマリン基を有するアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＡＭＣ）−ＯＨ、２−４）を得た。
２３１．５ｍｇ（不純物含む），^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ：１０．３７（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．７８−７．６４（ｍ，５Ｈ），７．５１−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），４．３３−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１８−１．８０（ｍ，２Ｈ），ｍ／ｚ＝５４９．４６（Ｃ_３０Ｈ_２６Ｎ_２Ｏ_７＋Ｎａ^＋＝５４９．１５９８）

［実験例２］
（光架橋性基を有する自己組織化ペプチドの合成）
合成した、側鎖にクマリン基を有するアミノ酸を使用してペプチド固相合成を行い、下記式（３）に示す、光架橋性基を有する自己組織化ペプチド（以下、「クマリン含有ペプチド」という場合がある。）を合成した。

目的物の生成及び単離は、ＨＰＬＣによる分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる絶対分子量測定により確認した。
３２．１ｍｇ（６６．０％），ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝９９６．７１（ｃａｌｃ．：Ｃ_４５Ｈ_５５Ｎ_１１Ｏ_１４＋Ｎａ^＋＝９９６．３７９８）

［実験例３］
（紫外線の照射による水溶液中におけるペプチドの架橋の可否の検討）
合成したクマリン含有ペプチドにおいて、クマリン基の光架橋性能が維持されているか否かについて検証を行った。

具体的には、クマリン含有ペプチドの水溶液に対して紫外線を照射し、クマリン基の光架橋に特有の変化である紫外線の吸光度の変化の観測を行った。また、ＨＰＬＣによる溶出時間やピーク強度及び形状の変化の測定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる絶対分子量測定も行った。

まず、クマリン含有ペプチドの０．１ｍＭ水溶液を調製した。本ペプチド水溶液について、紫外可視吸光度測定、ＨＰＬＣによる分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定を行った後に、波長３６５ｎｍ、９８０ｍＷ／ｃｍ^２の紫外線を１５分間照射した。続いて、紫外線照射後の溶液をそのまま用いて紫外可視吸光度測定、ＨＰＬＣによる分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定を行い、紫外線照射による光架橋について検討した。

紫外可視吸光度測定の結果、紫外線照射前の溶液では、波長３２６．５ｎｍにおいて吸光度２．３３の値を示す未架橋のクマリン基に由来する大きな吸収が観測された。一方、紫外線照射後の溶液では、波長３２５．５ｎｍにおける吸光度が０．２６となり、約８９％程度の吸光度の明確な低下が確認された。これは、クマリン基の光架橋の進行を示していると考えられた。

また、紫外可視吸光度計による検出波長を３４０ｎｍと２１６ｎｍに設定したＨＰＬＣ分析の結果、検出波長３４０ｎｍ（未架橋のクマリン基の吸収波長に対応する。）において、主ピークの強度が紫外線照射に伴い０．６９から０．０１４へ約９８％の減少が確認された。これはクマリン基の光架橋による吸光度の低下を示した前述の紫外可視吸光度測定の結果と同一の傾向を示す結果であり、クマリン基の光架橋の進行を示していると考えられた。一方、検出波長２１６ｎｍ（ペプチド主鎖を構築するアミド結合の吸収波長に対応する。）において、紫外線照射前には２９．７６分に単峰性のピークが見られたのに対し、紫外線照射後は２９．７４分と２９．９８分の２つのピークが認められた。新たに生じた２９．９８分のシグナルは光架橋により生成した多量体ペプチドによるシグナルであると判断された。

また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析の結果、ペプチドに由来するシグナルは大きく分けて２つ確認された。最も大きなシグナルはｍ／ｚ＝９９７．２８１であり、未架橋もしくは単分子で環化したクマリン含有ペプチドの計算分子量Ｃ_４５Ｈ_５５Ｎ_１１Ｏ_１４＋Ｎａ^＋＝９９６．３７９８に近い値となった。また、より高分子量側にはｍ／ｚ＝１９６９．０５のシグナルが観測された。クマリン含有ペプチドの２量体の計算分子量はＣ_４５Ｈ_５５Ｎ_１１Ｏ_１４×２＋Ｎａ^＋＝１９６９．０６２８であり、実測値との良好な一致が確認された。

仮にペプチド３量体が形成されていた場合、その計算分子量はＣ_４５Ｈ_５５Ｎ_１１Ｏ_１４×３＋Ｎａ^＋＝２９４３．１５９８である。これに相当するシグナルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおいては観測されなかった。また、ＨＰＬＣにおいても対応するシグナルは観測されなかった。以上のことから、３量体以上の多量体はほとんど形成されなかったことが示された。

以上の紫外可視吸光度測定、ＨＰＬＣによる分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果から、合成したクマリン含有ペプチドは、クマリン基の光架橋性能を維持していると考えられた。

［実験例４］
（自己組織化膜の作製条件の検討）
まず、粘着テープを使用した剥離法によりグラファイトの小片を作製した。このグラファイト片を１ｃｍ四方程度に裁断したシリコン基板上に転写した。当該シリコン基板に対して、１μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０１μＭ及び０．００５μＭのクマリン含有ペプチド水溶液を６０μＬずつ滴下した。室温で１時間放置した後に液滴を除去し、充分に乾燥させた後に表面の様子を原子間力顕微鏡（型式「Ａｇｉｌｅｎｔ ＡＦＭ ５５００」、アジレント・テクノロジー社製）を用いて観測した。

図１（ａ）〜（ｄ）は、各濃度のクマリン含有ペプチドを用いて形成した自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。図１（ａ）は０．１μＭ、（ｂ）は０．０５μＭ、（ｃ）は０．０１μＭ、（ｄ）は０．００５μＭのクマリン含有ペプチド水溶液の結果である。その結果、クマリン含有ペプチドは、濃度０．０５μＭ、室温で１時間放置する条件で自己組織化を行うことにより、良好な自己組織化膜を形成することが明らかとなった。

また、作製したペプチド自己組織化膜の表面被覆率と使用したペプチド水溶液の濃度を用いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒの吸着等温式による近似曲線によるフィッティングを行った結果を図２に示す。このＬａｎｇｍｕｉｒ ｐｌｏｔからグラファイトに対する吸着定数Ｋは５０．３μＭ^−１と算出された。同様の条件における既報のグラフェン吸着ペプチドの吸着定数Ｋは４．８５±０．２１μＭ^−１と報告されていることから（「So C. R., et al., Controlling Self-Assembly of Engineered Peptides on Graphite by Rational Mutation, ACS Nano, 6, 1648-1656, 2012.」を参照。）、本実験で使用したクマリン含有ペプチドは、既報のペプチドよりも吸着しやすいペプチドであることが示された。

［実験例５］
（紫外線照射による自己組織化膜の安定化）
濃度０．０５μＭ、室温で１時間放置する条件でクマリン含有ペプチドを自己組織化させて得られた自己組織化膜に紫外線を照射し、自己組織化膜を構成しているペプチド同士の光架橋を行った。

そして、紫外線照射の前後においてペプチドの自己組織化構造に変化が現れるか否か、またペプチド分子同士の光架橋によるペプチド分子膜の強度の向上が見られるか否かについての検討を行った。

始めに実験例４と同様にして、シリコン基板上のグラファイト界面でクマリン含有ペプチドを自己組織化させて自己組織化膜を作製した。作製した自己組織化膜を充分乾燥させた後に、原子間力顕微鏡で観察し、規則正しく自己組織化していることを確認した。

続いて、ペプチド分子の運動性を高めるために２０μＬの水を当該基板上に滴下し、直ちに紫外線照射装置（型式「ＰＯＴ−３６５」、３６５ ｎｍ ＵＶ ＬＥＤ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、朝日分光社製）を使用して、紫外線（波長３６５ｎｍ、９８０ｍＷ／ｃｍ^２）を基板から４ｃｍの距離から照射した。１５分間の照射の後、水を除去し充分に乾燥させた後に、原子間力顕微鏡で同一箇所におけるペプチド自己組織化膜の様子を観測し、ペプチドによる表面被覆率を算出した。

続いて、紫外線照射を行った自己組織化膜を有する基板を約１０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に室温で１時間浸漬し安定性の評価を行った。ＤＭＦはペプチド合成の際にも多用される、ペプチドに対する親和性の高い高極性溶媒である。したがって、光架橋により自己組織化膜の安定化が実現できれば、そのような溶媒中においてもペプチド分子膜が残留できる可能性が高い。

対照として、紫外線照射を行わなかった試料を作製し同様のＤＭＦへの浸漬実験を行い、双方の表面被覆率とその変化の度合いを算出した。

図３（ａ）〜（ｅ）は、実験結果を示す原子間力顕微鏡画像である。図３（ａ）及び（ｄ）は、紫外線照射前の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。規則正しい六方対称構造を比較的再現性良く観測することができた。図３（ｂ）は、紫外線照射後の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。図３（ｃ）は、紫外線照射後の自己組織化膜を室温で１時間ＤＭＦに浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。図３（ｄ）は、紫外線照射を行っていない自己組織化膜を室温で１時間ＤＭＦに浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。

その結果、紫外線を照射した自己組織化膜では、ＤＭＦ浸漬後も多数のペプチドが残留し表面被覆率の低下が２０．１％に留まった上、元の六方対称構造をある程度留めていた。これに対し、紫外線照射を行わなかった自己組織化膜では、ＤＭＦ浸漬後にほぼ全てのペプチドが消失し表面被覆率の低下は極めて大きく６６．３％の低下となり、約３．３倍の減少幅となった。

続いて、溶媒をＤＭＦから同じく高極性溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に変更し同様の浸漬実験を行った。ＤＭＳＯについては、室温における実験の他に９０℃においても浸漬実験を行い、自己組織化膜が不安定となる高温の溶媒中においても安定性を発揮するかについて検討した。

図４（ａ）〜（ｅ）は、室温でＤＭＳＯに浸漬した実験結果を示す原子間力顕微鏡画像である。図４（ａ）及び（ｄ）は、紫外線照射前の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。規則正しい六方対称構造を比較的再現性良く観測することができた。図４（ｂ）は、紫外線照射後の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。図４（ｃ）は、紫外線照射後の自己組織化膜を室温で１時間ＤＭＳＯに浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。図４（ｅ）は、紫外線照射を行っていない自己組織化膜を室温で１時間ＤＭＳＯに浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。

その結果、紫外線を照射した自己組織化膜では、ＤＭＳＯ浸漬後も多数のペプチドが残留し表面被覆率の低下が１４．０％に留まった上、元の六方対称構造を明確に維持していた。これに対し、紫外線照射を行わなかった自己組織化膜では、ＤＭＳＯ浸漬後に六方対称構造が完全に消失した上に表面被覆率の低下も４５．４％となり紫外線照射を行ったものと比較して約３．２倍の減少となった。

図５（ａ）〜（ｅ）は、９０℃のＤＭＳＯに浸漬した実験結果を示す原子間力顕微鏡画像である。図５（ａ）及び（ｄ）は、紫外線照射前の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。規則正しい六方対称構造を比較的再現性良く観測することができた。図５（ｂ）は、紫外線照射後の自己組織化膜の原子間力顕微鏡画像である。図５（ｃ）は、紫外線照射後の自己組織化膜を９０℃のＤＭＳＯに１時間浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。図５（ｅ）は、紫外線照射を行っていない自己組織化膜を９０℃のＤＭＳＯに１時間浸漬した後の原子間力顕微鏡画像である。

その結果、本実験の結果においては紫外線を照射の有無に関係なく元々の六方対称構造が崩れる様子が確認された。表面被覆率の低下は、紫外線照射を行ったものが１２．５％、行わなかったものが５４．９％となり一応の差異が見られたものの、共に大きくその自己組織化構造が崩れていた。

以上の結果から、クマリン含有ペプチドは、架橋させることにより室温のＤＭＦ及びＤＭＳＯ中における安定性が約３倍上昇することが明らかとなった。ペプチド１分子に対するクマリン基の数を増加させ、ペプチド分子の長さや構成するアミノ酸の種類、配列、クマリン基を配置する位置等を更に検討することにより、溶媒中における安定性を更に向上させることができると考えられた。

［実験例６］
（紫外線照射下におけるペプチド自己組織化膜の作製と安定性の評価）
紫外線の照射を行いながらペプチドの自己組織化を行い、ペプチド分子同士の光架橋反応による分子膜の安定性の向上について検討した。

まず、粘着テープを使用した剥離法によりグラファイトの小片を作製した。このグラファイト片を１ｃｍ四方程度に裁断したシリコン基板上に転写した。当該シリコン基板を光路長１ｃｍのプラスチック製セルに垂直に静置し、キセノンランプによる白色光から分光器を用いて取り出した波長３６０ｎｍの紫外光を照射した。そして、紫外線の照射を行っている状態で、０．０５μＭのクマリン含有ペプチド水溶液を加え、シリコン基板を完全に水没させ、紫外線照射下でクマリン含有ペプチドの自己組織化を行った。

約１時間後に水中より基板を取り出し充分に乾燥させた後に基板表面を原子間力顕微鏡で観察した。また、比較対照として紫外線照射を行わず実験例５と同様にしてクマリン含有ペプチドの自己組織化膜を作製した。

続いて、エタノール及び約８０℃の温水に各シリコン基板を浸漬し、ペプチドがどの程度残留するかを評価した。

まず、各基板をエタノールに約１時間浸漬し充分に乾燥させた後に、表面の様子をＡＦＭにより観測した。その結果、紫外線の照射の有無にかかわらず明確な差異が見られなかったため、同一の基板を引き続きエタノールに３時間浸漬した。この時点について再度ＡＦＭによる観測を行ったところ、なおも有意な変化をみることが出来なかった。したがって、クマリン含有ペプチドのグラファイト界面における自己組織化膜は、エタノールに対する安定性が高いことが明らかとなった。

そこで、より極性が大きくペプチド自己組織化膜を効率的に破壊する可能性が高い、温水に各基板を１時間浸漬し、安定性の評価を行った。

図６及び図７は、実験結果を示す原子間力顕微鏡画像である。図７（ａ）に示すように、紫外線照射を行わなかった場合、実験例５と同様に六方対称構造を形成し規則正しく整列した。この時、ペプチドによるグラファイト界面の被覆率は９５．１％と算出された。一方、図６（ａ）に示すように、紫外線を照射しながら自己組織化を行ったものでは不規則な点状構造が基板表面を覆う様子が観測された。これは、水中に単量体として分散していたクマリン含有ペプチドが、基板表面にて近接し架橋が起こることにより、ペプチド分子同士の分子間相互作用が増強されたことに起因する構造の変化と考えられる。また、ペプチドによるグラファイト界面の被覆率は９４．０％となった。

続いて、図６（ｂ）に示すように、紫外光を照射しながら作製した自己組織化膜をエタノールに約１時間浸漬したところ、ペプチドがグラファイト基板上に薄く広がる様子が確認された。これは、ペプチドがエタノール中に拡散することなくグラファイト界面上で分子膜の再構築が起きたものと考えている。

同様に、図７（ｂ）に示すように、紫外光を照射せずに作製した自己組織化膜をエタノールに約１時間浸漬したところ、ペプチドは元の規則正しい自己組織化構造をある程度維持したまま線状に残留した。

一方で、明瞭に確認されるペプチドによる線状の構造の間の部分には、やはりペプチドが薄く広がり残留している様子が確認された。したがって、紫外線照射の有無にかかわらず、グラファイト界面に吸着したペプチドは、エタノール中には拡散せず、自己組織化膜の再構築が起こるのみであることが示唆された。

各試料をエタノールにさらに約３時間浸漬したが、やはり有意な差を確認するには至らなかった。これらは全て、ペプチドのエタノールに対する溶解性がそれほど高くないためであることに起因していると推測し、各試料を、より溶解度の大きい８０℃の温水に浸漬する実験を行った。

図６（ｃ）は、紫外線を照射しながら作製した自己組織化膜を８０℃の温水に浸漬した結果を示す原子間力顕微鏡写真である。その結果、ペプチドが比較的粒径の揃った点状の集合体を多数形成し、表面全体に一様に残留する様子が確認された。この時、当初９４．０％であったペプチドによるグラファイト界面の被覆率が８５．４％まで低下する様子が確認された。

一方、図７（ｃ）に示すように、紫外光照射を行わず作製したペプチド自己組織化膜を８０℃の温水に浸漬した結果、表面に吸着したペプチドの減少が明確に確認された。粒径が不揃いの斑状のペプチドの集合体が不均一に形成され、はじめに有していた規則的な構造が完全に破壊された。また、表面被覆率の減少幅も紫外線照射の試料と比較して大きく、当初９５．１％であったペプチドによるグラファイト界面の被覆率が７２．９％まで低下した。

［実験例７］
（ペプチドの自己組織化能の評価）
下記表１に示すアミノ酸配列を有する合成例１〜３のペプチドを合成し、自己組織化能を評価した。基板としては、グラファイト、二硫化モリブデン、窒化ホウ素を使用した。具体的には、各ペプチドを５ｎＭ、１０ｎＭ又は５０ｎＭの濃度で水に溶解したものを各基板上に滴下し、１時間静置後窒素ガスを吹きかけて液滴を除去し、原子間力顕微鏡で観察した。なお、Ｅ（グルタミン酸）はｐＨ７で負電荷を有するアミノ酸であり、Ｒ（アルギニン）はｐＨ７で正電荷を有するアミノ酸であり、Ｙ（チロシン）は芳香族アミノ酸である。

図８（ａ）〜（ｈ）は観察された原子間力顕微鏡画像である。各画像の右側に、用いたペプチド水溶液の濃度を示す。その結果、合成例１〜３のいずれのペプチドも自己組織化能を有することが明らかになった。

また、下記式（２）［式（２）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、存在しないか、或いは芳香族アミノ酸若しくはその誘導体又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。］で表されるペプチドにおいて、Ｘ^１及びＸ^２を適宜変更することにより、基板への吸着力等を調整できることが示された。
Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （２）

本発明によれば、安定性が向上した自己組織化膜を形成することができる自己組織化ペプチドを提供することができる。また、安定性が向上した自己組織化膜及びその製造方法、パターン形状を有する自己組織化膜及びその製造方法、並びにデバイスを提供することができる。

Claims (13)

1. 複数の光架橋性基を有する自己組織化ペプチド。
2. 下記式（１）で表される、請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
   Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （１）
   ［式（１）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、光架橋性基を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基、芳香族アミノ酸若しくはその誘導体の残基又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体の残基を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体の残基を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体の残基を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。］
3. 前記光架橋性基がクマリン基である、請求項１又は２に記載の自己組織化ペプチド。
4. 溶媒中に溶解又は分散させた請求項１〜３のいずれか一項に記載の自己組織化ペプチドを基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、
   前記自己組織膜に光を照射する工程と、
   を備える、自己組織化膜の製造方法。
5. 溶媒中に溶解又は分散させた請求項１〜３のいずれか一項に記載の自己組織化ペプチドを基板に接触させて自己組織化膜を形成する工程と、
   前記自己組織化膜にパターン状に光を照射して、前記光架橋性基が架橋された領域及び架橋されていない領域を形成する工程と、
   前記架橋されていない領域の自己組織化膜を基板から剥離する工程と、
   を備える、パターン形状を有する自己組織化膜の製造方法。
6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の自己組織化ペプチドが配列してなる自己組織化膜。
7. 前記光架橋性基の少なくとも１部が架橋されている、請求項６に記載の自己組織化膜。
8. 前記光架橋性基がパターン状に架橋されている、請求項７に記載の自己組織化膜。
9. パターン形状を有する、請求項７又は８に記載の自己組織化膜。
10. 請求項６〜９のいずれか一項に記載の自己組織化膜を備えるデバイス。
11. 下記式（２）で表される自己組織化ペプチド。
    Ｘ^１［（ＧＡ）_ｍＸ^２］_ｎ （２）
    ［式（２）中、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜３０の整数を表し、Ｘ^１及びＸ^２はそれぞれ独立に、存在しないか、或いは芳香族アミノ酸若しくはその誘導体又はｐＨ７で電荷を有するアミノ酸若しくはその誘導体を表し、Ｇはグリシン若しくはその誘導体を表し、Ａはアラニン若しくはその誘導体を表す。ｎが２以上である場合、複数存在するｍはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。］
12. 請求項１１に記載の自己組織化ペプチドが配列してなる自己組織化膜。
13. 請求項１２に記載の自己組織化膜を備えるデバイス。