JP2016192979A - 核酸を増幅するための組成物、方法およびキット - Google Patents
核酸を増幅するための組成物、方法およびキット Download PDFInfo
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Abstract
Description
本教示は、一般に、非特異的蛍光および望ましくない増幅産物を減少させながら核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および関連技術は種々の適用に非常に有用である一方で、深刻な問題として望ましくない副反応に起因する非標的核酸の増幅が生じ得る。かかる副反応は、非標的核酸の誤プライミングおよび/またはプライマーオリゴマー化(時折、プライマー二量体形成と呼ばれる)、およびその後のこれらのプライミング人工物の増幅の結果として起こり得る。これは、特に、有意なバックグラウンド核酸を有する一方で、標的核酸のコピー数が少ない核酸混合物を使用してPCRを行う適用で当てはまる(例えば、非特許文献1を参照のこと)。非特異的に増幅した産物の生成は、少なくともその一部が、非特異的にアニーリングしたプライマーを伸長する周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性に起因していた(例えば、非特許文献1、非特許文献2を参照のこと)。したがって、周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性の阻害は、二次アンプリコンの生成の調節で有益である。
本教示は、非特異的蛍光および望ましくない増幅産物(時折、当該分野で二次アンプリコンまたは偽副産物と呼ばれる)を減少させながら標的核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。
(項目1)
DNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼインヒビターを含む複合体であって、該DNAポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む、複合体。
(項目2)
ヌクレオチド三リン酸(NTP)、ヌクレオチドアナログ、またはNTPおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目1に記載の複合体。
(項目3)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に、第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目1に記載の複合体。
(項目4)
NTP、ヌクレオチドアナログ、またはNTPおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目3に記載の複合体。
(項目5)
前記ヌクレオチド配列がDNAポリメラーゼによって伸長できない、項目3に記載の複合体。
(項目6)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが副溝結合剤をさらに含む、項目3に記載の複合体。
(項目7)
前記ヌクレオチド配列が、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第1のオリゴヌクレオチドが第1の領域を含み、該第2のオリゴヌクレオチドが第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1のオリゴヌクレオチドの第1の領域が該第2のオリゴヌクレオチドの第3の領域に相補的である、項目1に記載の複合体。
(項目8)
NTP、ヌクレオチドアナログ、またはNTPおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目7に記載の複合体。
(項目9)
前記第1のオリゴヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼによって伸長できないか、前記第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できないか、該第1のオリゴヌクレオチドおよび該第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目7に記載の複合体。
(項目10)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目1に記載の複合体。
(項目11)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目1に記載の複合体。
(項目12)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がヌクレオチドアナログを含む、項目1に記載の複合体。
(項目13)
前記ヌクレオチドアナログが、7−デアザ−2’−デオキシアデノシン(デアザ−dA)、7−デアザ−2’−デオキシグアノシン(デアザ−dG)、ジデオキシヌクレオチド(ddN)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、またはこれらの組み合わせを含む、項目12に記載の複合体。
(項目14)
DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、NTP、ヌクレオチドアナログ、またはNTPおよびヌクレオチドアナログを含む複合体であって、該DNAポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的であり、該第1の領域、該第3の領域、または該第1の領域および該第3の領域が少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該第1の領域が第1のクエンチャーを含み、該第2の領域が第2のクエンチャーを含む、複合体。
(項目15)
前記第3の領域が前記DNAポリメラーゼによって伸長できないか、前記第4の領域が該DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目14に記載の複合体。
(項目16)
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ−dA、デアザ−dG、ddN、LNA、PNA、またはこれらの組み合わせを含む、項目14に記載の複合体。
(項目17)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが副溝結合剤をさらに含む、項目14に記載の複合体。
(項目18)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目19)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に、第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目18に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目20)
前記ヌクレオチド配列がDNAポリメラーゼによって伸長できない、項目19に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目21)
副溝結合剤をさらに含む、項目19に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目22)
前記ヌクレオチド配列が、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第1のオリゴヌクレオチドが第1の領域を含み、該第2のオリゴヌクレオチドが第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1のオリゴヌクレオチドの第1の領域が該第2のオリゴヌクレオチドの第3の領域に相補的である、項目18に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目23)
前記第1のオリゴヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって伸長できないか、前記第2のオリゴヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって伸長できないか、該第1のオリゴヌクレオチドおよび該第2のオリゴヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって伸長できない、項目22に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目24)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目18に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目25)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目18に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目26)
ヌクレオチドアナログをさらに含む、項目18に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目27)
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ−dA、デアザ−dG、ddN、LNA、PNA、またはこれらの組み合わせを含む、項目26に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目28)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビターであって、該ヌクレオチド配列が第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的であり、該第1の領域がヌクレオチドアナログを含むか、該第3の領域がヌクレオチドアナログを含むか、該第1の領域および該第3の領域がヌクレオチドアナログを含み、該第1の領域が第1のクエンチャーを含み、該第2の領域が第2のクエンチャーを含む、DNAポリメラーゼインヒビター。
(項目29)
前記ヌクレオチド配列がDNAポリメラーゼによって伸長できない、項目28に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目30)
副溝結合剤をさらに含む、項目28に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目31)
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ−dA、デアザ−dG、ddN、PNA、LNA、またはこれらの組み合わせを含む、項目28に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目32)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビターであって、該ヌクレオチド配列が、5’−TCTGGGATA(デアザ−dA)TT(デアザ−dA)TGGTA(デアザ−dA)ATATG(Tn)C(デアザ−dA)TATTTATT(デアザ−dA)TA(デアザ−dA)TTATC−3’を含み、TnがTT、TTT、TTTT、TTTTT、またはTTTTTTを含む、DNAポリメラーゼインヒビター。
(項目33)
前記クエンチャーが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目32に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目34)
副溝結合剤をさらに含む、項目32に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目35)
前記ヌクレオチド配列が、5’−TCTGGGATA(デアザ−dA)TT(デアザ−dA)TGGTA(デアザ−dA)ATATGTTTTC(デアザ−dA)TATTTATT(デアザ−dA)TA(デアザ−dA)TTATC−3’を含み、前記クエンチャーが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目32に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目36)
副溝結合剤をさらに含む、項目35に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目37)
前記第1のクエンチャーが、少なくとも1つのDABCYL、DABSYL、TAMRA、TET、およびROXを含み、前記副溝結合剤が前記第2のクエンチャーをさらに含む、項目36に記載のDNAポリメラーゼインヒビター。
(項目38)
非特異的蛍光を減少させるための方法であって、
DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビター、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、標的核酸、プライマー、核酸色素、および、任意選択的に、ヌクレオチドアナログを含む反応組成物を第1の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも1つの二本鎖セグメントを含み、該DNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼインヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第2の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも1つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
該反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した該核酸色素の蛍光を検出する工程であって、該クエンチャーが該DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と
を含む、方法。
(項目39)
前記検出する工程が実時間検出を含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記検出する工程が終点検出を含む、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記終点検出が融解曲線分析を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記DNAポリメラーゼ、前記DNAポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、NTPおよび/またはヌクレオチドアナログを共にインキュベートして複合体を形成し、その後に前記第1の温度で前記反応組成物を形成する、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目38に記載の方法。
(項目44)
前記ヌクレオチド配列が前記DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目46)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第1のオリゴヌクレオチドが第1の領域を含み、該第2のオリゴヌクレオチドが第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1のオリゴヌクレオチドの第1の領域が該第2のオリゴヌクレオチドの第3の領域に相補的である、項目38に記載の方法。
(項目47)
前記第1のオリゴヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼによって伸長できないか、前記第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できないか、該第1のオリゴヌクレオチドおよび該第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目38に記載の方法。
(項目49)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目38に記載の方法。
(項目50)
前記DNAポリメラーゼインヒビターがヌクレオチドアナログを含む、項目38に記載の方法。
(項目51)
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ−dA、デアザ−dG、ddN、LNA、PNA、またはこれらの組み合わせを含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記標的核酸が複数の異なる標的核酸を含み、前記プライマーが複数の異なるプライマーを含み、前記複数のアンプリコンが複数の異なるアンプリコンを含む、項目38に記載の方法。
(項目53)
前記検出する工程が検出プローブをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目54)
前記標的核酸がRNAを含む、項目38に記載の方法。
(項目55)
前記RNAがメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記RNAが小RNA分子を含む、項目54に記載の方法。
(項目57)
前記小RNA分子がミクロRNA(miRNA)を含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記第1の温度が約22℃〜約40℃である、項目38に記載の方法。
(項目59)
前記第2の温度が約48℃〜約73℃である、項目38に記載の方法。
(項目60)
前記第2の温度が約53℃〜約67℃である、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記第2の温度が64℃〜67℃である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記標的核酸がDNAを含む、項目38に記載の方法。
(項目63)
前記プライマーがプライマー対を含み、前記少なくとも1つの増幅サイクルがDNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、項目38に記載の方法。
(項目64)
標的核酸を増幅するための方法であって、
DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビター、NTP、標的核酸、プライマー、核酸色素、および、任意選択的に、ヌクレオチドアナログを含む反応組成物を第1の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも1つの二本鎖セグメントを含み、該DNAポリメラーゼおよび該DNAポリメラーゼインヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに関連した蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第2の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも1つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
を含む、方法。
(項目65)
前記標的核酸がRNAを含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記RNAがmRNAを含む、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記RNAが小RNA分子を含む、項目65に記載の方法。
(項目68)
前記小RNA分子がmiRNAを含む、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記標的核酸がDNAを含む、項目64に記載の方法。
(項目70)
前記プライマーがプライマー対を含み、前記少なくとも1つの増幅サイクルがPCRを含む、項目64に記載の方法。
(項目71)
前記DNAポリメラーゼ、前記DNAポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、NTPおよび/またはヌクレオチドアナログを共にインキュベートして複合体を形成し、その後に前記第1の温度で前記反応組成物を形成する、項目64に記載の方法。
(項目72)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目64に記載の方法。
(項目73)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が前記DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目64に記載の方法。
(項目75)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第1のオリゴヌクレオチドが第1の領域を含み、該第2のオリゴヌクレオチドが第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1のオリゴヌクレオチドの第1の領域が該第2のオリゴヌクレオチドの第3の領域に相補的である、項目64に記載の方法。
(項目76)
前記第1のオリゴヌクレオチドが前記DNAポリメラーゼによって伸長できないか、前記第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できないか、該第1のオリゴヌクレオチドおよび該第2のオリゴヌクレオチドが該DNAポリメラーゼによって伸長できない、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目64に記載の方法。
(項目78)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが少なくとも2つの異なるクエンチャーを含む、項目64に記載の方法。
(項目79)
前記DNAポリメラーゼインヒビターがヌクレオチドアナログを含む、項目64に記載の方法。
(項目80)
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ−dA、デアザ−dG、ddN、LNA、PNA、またはこれらの組み合わせを含む、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記標的核酸が複数の異なる標的核酸を含み、前記プライマーが複数の異なるプライマー、複数の異なるプライマー対、またはこれらの組み合わせを含み、前記複数のアンプリコンが複数の異なるアンプリコンを含む、項目64に記載の方法。
(項目82)
前記第1の温度が約22℃〜約40℃である、項目64に記載の方法。
(項目83)
前記第2の温度が約48℃〜約73℃である、項目64に記載の方法。
(項目84)
前記第2の温度が約53℃〜約67℃である、項目83に記載の方法。
(項目85)
前記第2の温度が63℃〜67℃である、項目83に記載の方法。
(項目86)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むDNAポリメラーゼインヒビターを含むキット。
(項目87)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目86に記載のキット。
(項目88)
前記ヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目86に記載のキット。
(項目89)
前記第1の領域、前記第3の領域、または該第1の領域および該第3の領域がヌクレオチドアナログを含み、ここで該第1の領域が第1のクエンチャーを含むか、前記第2の領域が第2のクエンチャーを含むか、該第1の領域が第1のクエンチャーを含み、且つ該第2の領域が第2のクエンチャーを含む、項目88に記載のキット。
(項目90)
前記ヌクレオチド配列が第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第1のオリゴヌクレオチドが第1の領域を含み、該第2のオリゴヌクレオチドが第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1のオリゴヌクレオチドの第1の領域が該第2のオリゴヌクレオチドの第3の領域に相補的である、項目86に記載のキット。
(項目91)
前記DNAポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目92)
核酸色素をさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目93)
前記核酸色素が、臭化エチジウム、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)、非対称性シアニン色素、またはこれらの組み合わせを含む、項目92に記載のキット。
(項目94)
前記非対称性シアニン色素が、[2−N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−プロピルアミノ]−4−[2,3−ジヒドロ−3−メチル−(ベンゾ−1,3−チアゾール−2−イル)−メチリデン]−1−フェニル−キノリニウム](SYBR(登録商標)Green)、[2−N−ビス−(3−ジメチルアミノプロピル)−アミノ)−アミノ]−4−[2,3−ジヒドロ−3−メチル−(ベンゾ−1,3−チアゾール−2−イル)−メチリデン]−1−フェニル−キノリニウム](PicoGreen(登録商標))、4−[(3−メチル−6−(ベンゾチアゾール−2−イル)−2,3−ジヒドロ−(ベンゾ−1,3−チアゾール)−2−メチリデン)]−1−メチル−ピリジニウムヨージド(BEBO)、BOXTO、BETO、またはこれらの組み合わせを含む、項目93に記載のキット。
(項目95)
前記DNAポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目86に記載のキット。
(項目96)
前記ヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目86に記載のキット。
(項目97)
レポータープローブをさらに含む、項目86に記載のキット。
(項目98)
酵素および酵素インヒビターを含む複合体であって、該酵素インヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む、複合体。
(項目99)
前記酵素が、RNAポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目98に記載の複合体。
(項目100)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目98に記載の複合体。
(項目101)
前記インヒビターのヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および、任意選択的に第4の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的である、項目98に記載の複合体。
(項目102)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、1つのオリゴヌクレオチド、2つのオリゴヌクレオチド、または3つのオリゴヌクレオチドを含む、項目98に記載の複合体。
(項目103)
前記酵素インヒビターが少なくとも2つのクエンチャーを含む、項目98に記載の複合体。
(項目104)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビター。
(項目105)
前記ヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目103に記載の酵素インヒビター。
(項目106)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、1つのオリゴヌクレオチド、2つのオリゴヌクレオチド、または3つのオリゴヌクレオチドを含む、項目104に記載の酵素インヒビター。
(項目107)
前記ヌクレオチド配列が、第1の領域、第2の領域、第3の領域、第4の領域、第5の領域、および第6の領域を含み、該第1の領域が該第3の領域に相補的であり、該第4の領域が該第6の領域に相補的である、項目104に記載の酵素インヒビター。
(項目108)
ライゲーション不可能なヌクレオチドをさらに含む、項目107に記載の酵素インヒビター。
(項目109)
切断不可能なフラップ配列をさらに含む、項目107に記載の酵素インヒビター。
(項目110)
前記切断不可能なフラップ配列は非切断性ヌクレオチド間結合を含む、項目109に記載の酵素インヒビター。
(項目111)
非特異的蛍光を減少させるための方法であって、
酵素、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビター、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む反応組成物を第1の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも1つの二本鎖セグメントを形成し、該酵素および酵素インヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該酵素インヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第2の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物中の標的核酸を増幅して複数のアンプリコンを生成する工程と、
該反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した該核酸色素の蛍光を検出する工程であって、該クエンチャーが該酵素インヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
を含む、方法。
(項目112)
前記酵素が、RNAポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目111に記載の方法。
(項目114)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、1つのオリゴヌクレオチド、2つのオリゴヌクレオチド、または3つのオリゴヌクレオチドを含む、項目111に記載の方法。
(項目115)
前記反応組成物が、プライマー、プライマー対、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、またはこれらの組み合わせを含む、項目111に記載の方法。
(項目116)
標的核酸を増幅するための方法であって、
酵素、酵素インヒビター、標的核酸、および核酸色素を含む反応組成物を第1の温度で形成する工程であって、該酵素インヒビターがヌクレオチド配列および少なくとも1つのクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が少なくとも1つの二本鎖セグメントを形成することができ、該酵素および該酵素インヒビターが会合して酵素−酵素インヒビター複合体を形成し、該少なくとも1つのクエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに関連した蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第2の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物中の標的核酸を増幅して複数のアンプリコンを生成する工程と、
を含む、方法。
(項目117)
前記酵素が、RNAポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目116に記載の方法。
(項目119)
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、1つのオリゴヌクレオチド、2つのオリゴヌクレオチド、または3つのオリゴヌクレオチドを含む、項目116に記載の方法。
(項目120)
前記反応組成物が、プライマー、プライマー対、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、またはこれらの組み合わせを含む、項目116に記載の方法。
(項目121)
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを含むキット。
(項目122)
前記酵素インヒビターが、RNAポリメラーゼインヒビター、リガーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、切断酵素インヒビター、またはこれらの組み合わせを含む、項目121に記載のキット。
(項目123)
プライマー、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、またはこれらの組み合わせをさらに含む、項目122に記載のキット。
当業者は、下記の図面が例示のみを目的とすると理解するであろう。これらの図面は、決して本教示の範囲を制限することを意図しない。
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が例示および説明のみを目的とし、本教示の範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。本明細書中で使用される、用語「a」または「an」は、別な様に明確に示されない限り、少なくとも1つを意味する。本明細書中では、別なふうに明確に示されない限り、単数形を使用する場合、複数形が含まれる。例えば(制限されない)、「標的核酸」は、1つを超える標的核酸(例えば、特定の標的核酸種の1つまたは複数のコピーおよび標的核酸の2つまたはそれを超える異なる種)が存在することができることを意味する。また、「comprise」、「comprises」、「comprising」、「contain」、「contains」、「containing」、「include」、「includes」、および「including」は、制限することを意図しない。用語「および/または」は、この用語の前後の用語が一緒でも個別でもよいことを意味する。例示を目的として、「Xおよび/またはY」は、「X」もしくは「Y」または「XおよびY」を意味し得る。
用語「〜の少なくともいくつかを吸収する」は、核酸色素から放射された蛍光シグナルに関して使用される場合、酵素インヒビターの1つまたは複数のクエンチャーの存在によって検出可能な蛍光の減少をいう。酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素によって放射された少なくともいくつかの蛍光を吸収は、酵素インヒビターがクエンチャーを含まないこと以外は同一の成分を含む反応組成物中の検出可能な蛍光と比較して、核酸色素に特徴的な放射波長の検出可能な蛍光が測定可能に減少することを意味する。いくつかの実施形態では、検出可能な蛍光の測定可能な減少は、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または99%を超える蛍光の相対的減少を意味する。少なくとも1つのクエンチャーが蛍光クエンチャーを含む一部の実施形態では、核酸色素に特徴的な波長の検出可能な蛍光が測定可能に減少し、酵素インヒビターの少なくとも1つの蛍光クエンチャーの特徴的な放射波長の検出可能な蛍光が測定可能に増加し得る。
Davidson,Mol.Biol.31:349,1968に記載されている。一般に、かかるアニーリングが起こるかどうかは、特に、一定の酵素インヒビターの対応する第1および第3の領域および/または第4および第5の領域の相補部分、プライマーならびに標的隣接配列および/またはアンプリコン中のその対応する結合部位の相補部分、切断プローブまたはライゲーションプローブおよび標的核酸またはアンプリコンの対応する結合部分の相補部分、または対応する相補部分もしくはレポータープローブおよびその結合部位の長さ、pH、温度、1価および2価の陽イオンの存在、ハイブリッド形成領域中のGおよびCヌクレオチドの比率、培地の粘度、ならびに変性剤の存在に影響を受ける。かかる変動因子は、ハイブリッド形成に必要な時間に影響を与える。一定の酵素インヒビターの実施形態では、インヒビター、プローブ、および/またはプライマー中の一定のヌクレオチドアナログまたは副溝結合剤の存在もハイブリッド形成条件に影響を与える。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の適用に依存するであろう。しかし、当業者は、かかる条件を過度に実験することなく日常的に決定することができる。好ましくは、アニーリング条件プライマーおよび/またはプローブが対応する標的隣接配列またはアンプリコン中の相補配列と選択的にハイブリッド形成するが、第2の反応温度での反応組成物中の異なる標的核酸または非標的配列にいかなる有意な程度でもハイブリッド形成しないように選択する。
(式中、αは0〜4の整数である)を有するリン酸エステルに置換することができる。一部の実施形態では、αは2であり、リン酸エステルはペントースの3’−または5’−炭素に結合する。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基がプリン、7−デアザプリン、ピリミジン、またはこれらのアナログであるヌクレオチドである。用語「ヌクレオチド5’−三リン酸」は、5’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、時折、リボース糖の構造的特徴を特に指摘するために、「rNTP」または「dNTP」および「ddNTP」、一般に「NTP」と示す。三リン酸エステル基には、種々の酸素の硫黄置換物(例えば、α−チオ−ヌクレオチド5’三リン酸)が含まれ得る。ヌクレオチド化学の概説は、特に、Miller,Bioconjugate Chem.1:187−91(1990);Shabarova,Z.and Bogdanov,A.Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,VCH,New York(1994);およびNucleic Acids in Chemistry and Biology,2d ed.,Blackburn and Gait,eds.,Oxford University Press(1996;以後“Blackburn and Gait”)中に見出すことができる。
Report,16(2):5(2003);Koshkinら、Tetrahedron 54:3607−30(1998)を参照のこと)、ならびに2’位または3’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ(例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ)、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、またはブロモである2’または3’修飾物が含まれる。修飾ヌクレオチド間結合には、リン酸アナログ、アキラルおよび非荷電サブユニット間結合(例えば、Sterchak,E.P.ら、Organic Chem.52:4202(1987))、およびアキラルサブユニット間結合を有する非荷電モルホリノベースのポリマー(例えば、米国特許第5,034,506号を参照のこと)が含まれる。ヌクレオチド間結合アナログのいくつかの非限定的な例には、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド結合複素環が含まれる。ペプチド核(「PNA」と総称される)(偽相補ペプチド核酸が含まれるが、これらに限定されない)として公知のヌクレオチドアナログの1つのクラスでは、従来の糖およびヌクレオチド間結合が、2−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーに置換されている(例えば、Nielsen ら、Science,254:1497−1500(1991);Egholmら、J.Am.Chem.Soc,114:1895− 1897(1992);Demidovら、Proc.Natl.Acad.Sci.99:5953−58(2002);Peptide Nucleic Acids:Protocols and Applications,Nielsen,ed.,Horizon Bioscience(2004)を参照のこと)。酵素的組み込みまたは化学合成で用いる広範なヌクレオチドアナログは、他の供給元(Glen Research,Sterling,MD;Link Technologies,Lanarkshire,Scotland,UK;およびTriLink BioTechnologies,San Diego,CA)から、酸リン酸塩、ホスホルアミダート、またはCPG誘導体として利用可能である。オリゴヌクレオチド合成および一定のヌクレオチドアナログの説明は、特に、S.Verma and F.Eckstein,Ann.Rev.Biochem.67:99−134(1999);Goodchild,Bioconj.Chem.1:165−87(1990);Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,Beaucageら、eds.,John Wiley & Sons,New York,New York(2005年8月の最新版が含まれる(以後“Beaucageら”);およびBlackburn and Gaitに見出すことができる。
用語「切断酵素」は、適切な条件下で核酸切断構造(時折、重複フラップ構造または侵襲性切断反応基質と呼ばれる)と組み合わされた場合に下流切断プローブの非アニーリングフラップ部分を切断してライゲーションニックを含む構造を生成する任意のポリペプチドをいう。切断酵素の制限されない例には、構造特異的ヌクレアーゼ(例えば、細菌およびバクテリオファージ由来の一定のDNAポリメラーゼ(その単離5’エクソヌクレアーゼドメインが含まれる)、Cleavase(登録商標)酵素(Third Wave Technologies,Inc.,Madison,Wl)、真核生物フラップエンドヌクレアーゼ、および古細菌フラップエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない(例えば、Lyamichevら、Science 260:778−83(1993);Liら、J.Biol.Chem.270:22109−12(1995);Wuら、Nucl.Acids Res.24:2036−43(1996);Hosfieldら、J.Biol.Chem.273:27154−61(1998);Kaiserら、J.Biol.Chem.274:21387−94(1999);Allawiら、J.Mol.Biol.328:537−54(2003);および米国特許第5,614,402号および同第6,706,471号を参照のこと)。
Jersey(以後「Rapley」)、Schena;and Kwokら、Nucl.Acid Res.18:999−1005(1990)に見出すことができる。プライマーおよびプローブデザインのソフトウェアプログラムも市販されており、Primer Express,Applied Biosystems,Foster City,CA、Primer Premier and Beacon Designer software,PREMIER Biosoft International,Palo Alto,CA、Primer Designer 4,Sci−Ed Software,Durham,NC、Primer Detective,ClonTech,Palo Alto,CA、Lasergene,DNASTAR,Inc.,Madison,WI、Oligo software,National Biosciences,Inc.,Plymouth,MN、iOligo,Caesar Software,Portsmouth,NH、およびワールドワイドウェブ上のrealtimeprimerdatabase.ht.stまたはmedgen31.urgent.be/primerdatabase/index のRTPrimerDB(Pattynら、Nucl.Acid Res.31:122−23(2003)も参照のこと)が含まれるが、これらに限定されない。
本教示によれば、標的核酸を、任意の生きている生物または生きていた生物(原核生物、古細菌、または真核生物(例えば、昆虫(ショウジョウバエが含まれるが、これに限定されない)、寄生虫(線虫が含まれるが、これに限定されない)、植物(シロイヌナズナが含まれるが、これに限定されない)、動物(ヒト、マウス、家畜、または非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない)、原核細胞、および真核生物から得た細胞、組織、および器官(例えば、臨床生検材料、口腔スワブ、培養細胞、および血球が含まれるが、これらに限定されない)これらに限定されない)が含まれる)から得ることができる。ウイルス核酸も本教示の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、標的核酸は、二本鎖形態または一本鎖形態で存在し得る。当業者は、gDNAには全長材料だけでなく、多数の手段(例えば、酵素消化、超音波処理、および剪断力などが含まれるが、これらに限定されない)によって生成されたフラグメントも含まれ、すべてのかかる材料は、全長またはフラグメントにかかわらず、本教示の増幅反応のためのテンプレートとしての機能を果たしうるgDNAの形態を表すものと認識する。
Sons,Inc.(2005年9月26日までの増補が含まれる)(以後「Ausubelら」)に見出すことができる。
Nucleic Acid PrepStationおよびABI PRISM(登録商標)6700 Nucleic Acid Automated Work Stationが含まれる。核酸サンプル調製試薬およびキットも市販されており、NucPrep(商標)Chemistry、BloodPrep(商標)Chemistry、ABI PRISM(登録商標)TransPrep System、およびPrepMan(商標)Ultra Sample Preparation Reagent(全てApplied Biosystems)、ならびにmiRvana RNA単離キット(Ambion,Austin,TX)が含まれるが、これらに限定されない。精製核酸または部分精製核酸(gDNA、総RNA、および組織特異的核酸調製物が含まれるが、これらに限定されない)は、多数の業者(Coriell Cell Repositories,Coriell Institute for Medical Research,Camden,NJ、Serologicals Corp.,Norcross,GA;Stratagene,La JoIIa CA、Ambion,Austin,TX、およびAmerican Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA)から市販されている。
Cloning,A Laboratory Manual,Sambrook and Russell,eds.,Cold Spring Harbor Press,3d ed.(2001;以後「Sambrook and Russell」);Sambrookら;Ausubelら;PCR Primer;McPherson;Rapley;Lizardiら、Nat.Genetics 19:225−32(1998);Wiedmannら、S51−64,in PCR Methods and Applications,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994);Cao,Trends in Biotechnol.22:38−44(2004);およびWenz and Schrothの米国特許公報番号US2003/0190646A1号に見出すことができる。
System 9700、9600、2700、または2400サーモサイクラー(全て、Applied Biosystems)が含まれるが、これらに限定されない)を使用したサーモサイクリングを含む。一部の実施形態では、一本鎖アンプリコンを、増幅反応(例えば、非対称PCRまたはA−PCRが含まれるが、これらに限定されない)で生成する。
PCR酵素、サーマスZ05属(TZ05)DNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない)を含む(例えば、Smithら、in PCR Primer,at pages 211−219を参照のこと)。一部の実施形態では、プライマー伸長は、逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼを含む。一定のかかる実施形態では、反応組成物は、1つのDNAポリメラーゼインヒビターまたは少なくとも2つの異なるDNAポリメラーゼインヒビター(例えば、逆転写酵素と複合体を形成することができるDNAポリメラーゼおよびDNA依存性DNAポリメラーゼと複合体を形成することができる第2のDNAポリメラーゼインヒビターが含まれるが、これらに限定されない)を含み得る。一定のプライマー伸長反応の説明を、特に、Sambrookら、Sambrook and Russell、Ausubelら、およびChenらの米国特許公報番号10/947,460号に見出すことができる。
of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay,Sixth International
Symposium on Human Identification(1995);およびRapley(特に、79章)を参照のこと)。開示の方法の一部の実施形態は、並行して行われる多重増幅反応および単回(single−plex)増幅反応(複数の単回または少数回(lower−plexy)の反応(例えば、二重、三重、四重、五重、または六重の反応が含まれるが、これらに限定されない)が含まれる)を含む。
本教示は、典型的には、少なくとも1つの酵素ならびに少なくとも1つのヌクレオチド配列および少なくとも1つのクエンチャーを含む少なくとも1つの酵素インヒビターを含む反応組成物中の標的核酸の増幅およびバックグラウンド蛍光の減少のための組成物、方法、およびキットを提供する。
本教示によれば、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを、酵素の少なくとも1つの酵素活性を阻害するようにデザインする一方で、酵素インヒビター−酵素複合体中で酵素インヒビターを酵素に会合する。少なくとも1つの二本鎖セグメントを含む構造を形成することができるように酵素インヒビターのヌクレオチド配列をデザインし、酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した場合に核酸色素から放射される蛍光のすくなくともいくつかを吸収することができるようにクエンチャーを選択する。酵素−酵素インヒビター複合体は、第1の温度(例えば、室温(典型的には、約22℃〜28℃)および望ましいテンプレート伸長温度を超えるか、この温度か、これをわずかに超える温度が含まれるが、これらに限定されない)で形成し、そして/または会合を維持することができる。酵素−酵素インヒビター複合体を含む反応組成物を第2の温度に加熱した場合、複合体が解離するにつれて酵素が放出される。開示のRNAポリメラーゼインヒビターを、インヒビターおよびRNAポリメラーゼが複合体中で会合された場合にRNAポリメラーゼの重合活性を阻害するようにデザインする。開示のリガーゼインヒビターを、リガーゼインヒビターおよびリガーゼが複合体中で会合した場合にテンプレート上の2つの隣接してハイブリッド形成したヌクレオチド鎖の間のホスホジエステル形成を阻害するようにデザインする。開示のヘリカーゼインヒビターを、複合体中でヘリカーゼインヒビターおよびヘリカーゼが会合した場合に二本鎖核酸のほぐれを触媒するヘリカーゼの能力を阻害するようにデザインする。一定の開示の切断酵素インヒビターを、複合体中で切断酵素インヒビターおよび切断酵素が会合した場合に切断酵素の5’−ヌクレアーゼ活性を阻害するようにデザインする。一部の実施形態では、リガーゼインヒビター、RNAポリメラーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、および/または切断酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、アプタマーを含む。本教示の酵素インヒビターの阻害活性は、典型的には、正確なインヒビター配列に有意に依存しない。むしろ、酵素インヒビターの全構造およびその融点が、酵素インヒビターが対応する酵素の意図する酵素活性を阻害するかどうかの主な決定因子である。一部の実施形態では、酵素インヒビターを、対応する酵素の基質を模倣し、それにより、酵素がインヒビターに結合して酵素活性が阻害された複合体を形成する第1の温度での高次構造を想定するようにデザインする。第2の温度では、ほはや基質を模倣せず、複合体から酵素が放出されるように、酵素インヒビターの高次構造を変化させることができる。したがって、開示のインヒビターは、典型的には、阻害効果がある場合、インヒビターが実質的に一本鎖であり、そして/または酵素と複合体を形成しない場合、阻害効果が有意に低い。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、非ヌクレオチドリンカー、またはこれらの組み合わせを含む。
A/S;McPherson;Finnら、Nucl.Acids Res.17:3357−63,1996に見出すことができる。
(式中、第4の領域を角括弧で示し、第3の領域を下線で示し、第2の領域を太字で示し、第1の領域を斜体で示し、第2の領域は第1のクエンチャーを含み(この例では、DABCYLとして示す)、第1の領域は、第2のクエンチャーを含む副溝結合剤を含む(この例では、MGB−NFQとして示す))を含むか、これからなるか、本質的になる。第1の領域は、2つの領域間の2つの内部G:T塩基対ミスマッチによってこの領域に実質的に相補的であるが、DNAポリメラーゼインヒビターは依然として第1の温度で自己アニーリングする。例示的DNAポリメラーゼインヒビターのいくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼインヒビターの3’末端上の末端Cヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであるジデオキシシトシン(ddC)を含む。いくつかの実施形態では、第2の領域は、TT、TTT、またはTTTTTを含むか、これからなるか、本質的になる。他の実施形態では、第2の領域は、非ヌクレオチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第2の領域は、クエンチャーを含まない。一部の実施形態では、DNAポリメラーゼインヒビターの5’末端は、クエンチャーをさらに含む。一部の実施形態では、DNAポリメラーゼインヒビターのGヌクレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチドアナログであるデアザ−dGを含む。いくつかの実施形態では、第1のクエンチャーは、TAMRA(商標)(カルボキシテトラメチルローダミン)、 Black Hole Quencher色素(例えば、BHQ−1、BHQ−2、またはBHQ−3(Biosearch Technologies,Inc.)が含まれるが、これらに限定されない)、OREGON GREEN(登録商標)色素(Molecular Probes)、ROX(商標)(カルボキシ−X−ローダミン)、DABSYL(4−ジメチルアミノアゾベンゼン−4’−スルホニルクロリド)、またはTET(テトラクロロフルオレセイン)(DABCYL部分の代わりまたはこれに加えて)を含む。いくつかの実施形態では、第2のクエンチャーは、DABSYL、DABCYL、TAMRA、Black Hole Quencher、ROX、OREGON GREEN、またはTET(MGB−NFQの代わりまたはこれに加えて)を含む。選択したクエンチャーが核酸色素に特徴的である波長の蛍光を吸収することができ、インヒビター中のクエンチャーおよび/またはクエンチャーの位置は、インヒビターが自己アニーリングし、そして/または酵素と複合体を形成する能力が実質的に低下しない場合、クエンチャーの選択は、典型的には、本教示を制限しない。
(式中、第4の領域を角括弧で示し、第3の領域を下線で示し、第2の領域を太字で示し、第1の領域を斜体で示し、第4の領域はクエンチャーを含む(この例では、TETとして示す))を含むか、これからなるか、本質的になる。第1の領域は、第3の領域に相補的である。DNAポリメラーゼインヒビターの第1の3’末端上の末端Cヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであるジデオキシシトシン(ddC)を含み、ddCがこの例示的DNAポリメラーゼインヒビターを非伸長性にする。いくつかの実施形態では、第2の領域は、TT、TTTT、またはTTTTTを含むか、これからなるか、本質的になる。いくつかの実施形態では、第2の領域は、非ヌクレオチドリンカーを含む。一部の実施形態では、第2の領域は、クエンチャーを含まない。一部の実施形態では、DNAポリメラーゼインヒビターの5’末端は、クエンチャーをさらに含む。一部の実施形態では、Gヌクレオチドの少なくとも1つはヌクレオチドアナログであるデアザ−dGを含み、少なくとも1つのAヌクレオチドはヌクレオチドアナログデアザ−dAを含むか、Gヌクレオチドの少なくとも1つはデアザ−dGを含み、少なくとも1つのAヌクレオチドはデアザ−dAを含む。いくつかの実施形態では、クエンチャーは、TAMRA、Black Hole Quencher色素、ROX、OREGON GREEN、DABCYLまたはDABSYL(TET部分)(TET部分の代わりまたはこれに加えて)を含む。
本教示の複合体は、少なくとも1つの酵素活性が阻害されるように酵素に会合した酵素インヒビターを含む。一部の実施形態では、複合体は、増幅酵素(例えば、増幅反応に含まれる任意の酵素)に会合した酵素インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、RNAポリメラーゼインヒビターに会合したRNAポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、リガーゼに会合したリガーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ヘリカーゼに会合したヘリカーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、複合体は、切断酵素インヒビターに会合した切断酵素を含む。いくつかの複合体は、さらなる成分(例えば、デオキシリボヌクレオチド(dNTP)、リボヌクレオチド(rNTP)、ヌクレオチドアナログ、ヘリカーゼアクセサリータンパク質、SSB、または酵素補因子(ATPおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)ならびに一定の酵素−酵素インヒビター複合体の形成および/または安定化に関与し得るその非切断アナログが含まれるが、これに限定されない))、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない)含む。
開示の酵素インヒビターは、本教示の方法で少なくとも2つの機能を果たす。第1に、開示の酵素インヒビターは、第1の温度で対応する酵素の酵素活性を阻害し、特に、誤アニーリングによる二次アンプリコンの形成または標的核酸以外の配列に対するプライマーおよび/またはプローブ、ならびにプライマー二量体形成を減少させる。当業者は、二次増幅産物形成の減少により、本教示の酵素インヒビターが反応組成物の非特異的蛍光を減少させることができると認識するであろう。第2に、少なくとも1つのクエンチャー部分が酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子によって放射された少なくともいつくかの蛍光を吸収することができるので、開示の酵素インヒビターはまた、酵素インヒビターの自己消光能力によって反応組成物中の非特異的蛍光を減少させることができる。一部の実施形態では、酵素インヒビターはまた、開示の方法におけるアンプリコンの生成を減少させる。
Kit,1−step Instruction Manual,Rev.# 75003a,Stratagene,2005;およびEssential of Real
Time PCR,Applied Biosystemsを参照のこと)。いくつかの実施形態では、パッシブリファレンス色素は、ROX(商標)またはTAMRA(商標)を含む。
本発明の技術により、一定の開示の方法の実施を捗らせるためにデザインしたキットも提供する。キットは、方法の実施に必要な2つまたはそれを超える要素の組み立てによって一定の開示の方法の能力を高めるのに役立ち得る。一部の実施形態では、キットは、最終使用者が測定する必要性を最小にするために、予め測定した単位量で成分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、1つまたは複数の開示の方法を実施するための説明書を含む。好ましくは、キットの成分を、相互に同時に操作するように至適化する。
Products,10th ed.,Molecular Probes−lnvitrogen,2005に見出すことができる。
一連の並行組成物(それぞれ、1×SYBR Green I 核酸色素(Molecular Probes)を含む1×反応緩衝液(50mM Tris緩衝液(pH9))、5mM MgCl2、250μM dATP、dCTP、およびdGTP、500μM dUTP、60nM ROXパッシブリファレンス色素、および必要に応じて5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、または100nMの濃度の表1に示す例示的DNAポリメラーゼインヒビターを含む)を、室温で形成した。表1に示すように、「DNAポリメラーゼインヒビター」A、DNAポリメラーゼインヒビターB、DNAポリメラーゼインヒビターC、およびDNAポリメラーゼインヒビターDは、DNAポリメラーゼインヒビターDの3’末端のヌクレオチドがCである一方で、「DNAポリメラーゼインヒビター」A、DNAポリメラーゼインヒビターB、およびDNAポリメラーゼインヒビターCの3’末端のヌクレオチドが全てジデオキシシトシン(ddC)を含むことを除き、同一のヌクレオチド配列を有する。「DNAポリメラーゼインヒビター」Aはクエンチャー部分を欠き(したがって、Aは、本教示の真のDNAポリメラーゼインヒビターではなく、引用符:「DNAポリメラーゼインヒビター」の使用によって示す)、DNAポリメラーゼインヒビターBはその5’末端にDABCYLクエンチャー部分を含み、DNAポリメラーゼインヒビターCはその5’末端にROXクエンチャー部分を含み、DNAポリメラーゼインヒビターDはその3’末端に非蛍光クエンチャーを含む副溝結合剤を含む(MGB−NFQ)。DNAポリメラーゼインヒビターEは、その第1および第3の領域に4つのデアザ−dAヌクレオチドアナログ(デアザAとして示す)および2つのG:T塩基対ミスマッチを含むヌクレオチド配列を含む。DNAポリメラーゼインヒビターEもまた、2つのクエンチャー部分(第2の領域ループ中にDABCYL部分および3’末端にMGB−NFQ)を含む。
gDNA中の標的核酸の増幅におけるDNAポリメラーゼインヒビターEの阻害能力を評価するために、PCR反応を行った。6つの並行した20μLの反応組成物を室温で形成した。各反応組成物は、40ngヒトgDNA(Coriell)、2.25μMの順方向プライマー:
を含むPAU標的核酸特異的プライマー対、最終濃度が5、10、25、50、75、または100nMのいずれかのDNAポリメラーゼインヒビターEを、1×PCR緩衝液(50mM Tris−HCl(pH9)、250μM dATP、dCTP、およびdGTP、500μM dUTP、5mM MgCl2、0.6U AmpliTaq DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)、60nM ROXパッシブリファレンス色素、8%グリセロール、0.01% Tween−20、0.01%NaN3、1×SYBR GreenI核酸色素)に含む。gDNAが存在せず、且つDNAポリメラーゼインヒビターEの最終濃度が50nMであることを除いて他の6つと同一の処方物を含む第7の並行反応組成物中にテンプレートコントロールは含まれなかった。
DNA Marker,InVitrogen)を含む分子サイズラダーをロードした。反応組成物を、以下のようにゲルのレーンにロードした:レーンB、5nMインヒビターE;レーンC、10nMインヒビターE;レーンD、25nMインヒビターE;レーンE、50nMインヒビターE;レーンF、75nMインヒビターE;レーンG、100nMインヒビターE;レーンH、50nMインヒビターE、テンプレートなしのコントロール。サンプルを15分間電気泳動し、臭化エチジウムによって視覚化した。図7に示すように、所望のアンプリコン(11)の量は、約75nMの濃度(レーン7)までDNAポリメラーゼインヒビターの濃度が増加するにつれて増加した。対照的に、二次アンプリコンバンドの強度は、DNAポリメラーゼインヒビター濃度が増加するにつれて減少した。
7つの並行した20μLの反応組成物を室温で形成した。各反応組成物は、10ng普遍的基準ヒトcDNA(Stratagene)、200nMの順方向プライマー:
を含むP450標的核酸特的プライマー対、最終濃度が0、5、10、25、50、75、または100nMのいずれかのDNAポリメラーゼインヒビターEを、1×PCR緩衝液(50mM Tris−HCl(pH9)、250μM dATP、dCTP、およびdGTP、500μM dUTP、5mM MgCl2、1.5U AmpliTaq DNAポリメラーゼ、60nM ROXパッシブリファレンス色素、8%グリセロール、0.01% Tween−20、0.01%NaN3、1×SYBR GreenI核酸色素)に含む。cDNAが存在せず、且つDNAポリメラーゼインヒビターEの最終濃度が50nMであることを除いて他の7つと同一の処方物を含む第8の並行反応組成物中でテンプレートコントロールは含まれなかった。実施例2に記載のように、反応組成物を、室温で約15分間インキュベートし、次いで、ABI PRISM(登録商標)7900HTリアルタイム配列検出システム装置にてサーマルサイクリングを行い、増幅産物を未変性アガロースゲルで分析した。反応組成物を、以下のようにゲルのレーンにロードした:レーンB、0nMインヒビターE;レーンC、5nMインヒビターE;レーンd、10nMインヒビターE;レーンE、25nMインヒビターE;レーンF、50nMインヒビターE;レーンG、75nMインヒビターE;レーンH、100nMインヒビターE、およびレーンI、50nMインヒビターE、テンプレートなしのコントロール。
有効な遺伝子発現アッセイ(インターロイキン1,β(IL1β;アッセイID Hs00174097_m1)、TRAFファミリーメンバー関連NFKBアクチベーター(TANK;アッセイID Hs00370305_m1)、脂肪酸合成酵素(FASN;アッセイID Hs00188012_m1)、溶質キャリアファミリー2,メンバー1(SLC2A1;アッセイID Hs00197884_m1)、およびホスホリパーゼD1(ホスファチジルコリン特異的)(PLD1;アッセイID Hs00160118_m1)のためのアッセイが含まれる)のための5つの市販のプライマー対および対応するTaqManレポータープローブを得た(Applied Biosystems)。
PCR増幅および融点曲線分析を使用した例示的ポリメラーゼインヒビターの例示的クエンチャー部分の影響を評価するために、2つの反応組成物を調製した。各20μLの反応組成物は、1倍濃度のTANKアッセイ(実施例4に記載の)由来のプライマーおよびレポータープローブ、10ng普遍的基準ヒトcDNA(Stratagene);250μM dATP、dCTP、およびdGTP、500μM dUTP、5mM MgCl2、2U AmpliTaqDNAポリメラーゼ、60nM ROXパッシブリファレンス、8%グリセロール、0.01%Tween−20;0.01%NaN3、1×SYBR GreenIを含む50mM(pH9)Tris−HCl緩衝液、および50nM「ポリメラーゼインヒビターA」または50nMポリメラーゼインヒビターEのいずれかを含んでいた。実施例4に記載のように、反応組成物を室温で約15分間インキュベートし、次いで、ABI PRISM(登録商標)7900HTリアルタイム配列検出システム装置に移し、サーモサイクリングを行った。図10に示すように、デフォルト条件に設定した機器関連ソフトウェアを使用して、2つのサーモサイクリングした反応組成物の解離曲線を作成した。サーモサイクリングした反応組成物が「ポリメラーゼインヒビターA」を含んでいた場合、2つの解離ピーク(ピークA(「ポリメラーゼインヒビターA」)およびピークB(TANKアンプリコン)が含まれる)が認められた。対照的に、ポリメラーゼインヒビターBを含むサーモサイクリングした反応組成物を用いて得た解離曲線は、TANKアンプリコンのピーク(下のパネル中のCとして示す)を含んでいたが、ポリメラーゼインヒビターEの解離曲線は容易に区別できなかった。
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US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
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AU2012322674B9 (en) * | 2011-10-14 | 2015-10-01 | Becton, Dickinson And Company | Square wave thermal cycling |
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WO2014028793A1 (en) * | 2012-08-17 | 2014-02-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Cyclopentane-peptide nucleic acids for qualitative and quantitative detection of nucleic acids |
US9410173B2 (en) * | 2012-10-24 | 2016-08-09 | Clontech Laboratories, Inc. | Template switch-based methods for producing a product nucleic acid |
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EP3234186A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-10-25 | Brandeis University | Mispriming prevention reagents |
WO2016112073A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
CN113564168A (zh) * | 2015-04-23 | 2021-10-29 | 美国杰龙生物医药公司 | 使用多价阳离子盐组合物制备多核苷酸的方法 |
CN107849603B (zh) * | 2015-04-24 | 2022-01-28 | 阿提拉生物系统公司 | 利用有限核苷酸组成的引物扩增 |
WO2016183012A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | 3M Innovative Properties Company | Composition for reducing inhibition of nucleic acid amplification |
EP4063014A1 (en) * | 2016-03-29 | 2022-09-28 | William Marsh Rice University | Surface-based detection of nucleic acid in a convection flow fluidic device |
WO2018031588A1 (en) * | 2016-08-09 | 2018-02-15 | Takara Bio Usa, Inc. | Nucleic acid adaptors with molecular identification sequences and use thereof |
US11613777B2 (en) | 2016-08-26 | 2023-03-28 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
WO2018087200A1 (en) * | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Therapeutic oligonucleotides capture and detection |
US20180188204A1 (en) * | 2017-01-01 | 2018-07-05 | Sylvester Tumusiime | Use of charged quinine sulfate or other precursors or derivatives of quinine alkaloids in visualization of nucleic acids |
CN108546748A (zh) * | 2017-04-05 | 2018-09-18 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种检测核酸的方法和试剂盒 |
CA3089756A1 (en) * | 2018-01-29 | 2019-08-01 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Method for nucleic acid amplification |
CN112941155B (zh) * | 2018-05-14 | 2023-07-14 | 北京艾克伦医疗科技有限公司 | 具有茎环结构的dna引物对及其应用 |
JP2022515192A (ja) * | 2018-12-20 | 2022-02-17 | アルヴェオ テクノロジーズ インコーポレイテッド | 等温増幅反応における非特異的増幅を低減するための方法および組成物 |
US20200362400A1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | University Of Macau | Enhancing Agent and Kit for Enhancing Nucleic Acid Amplification Reaction and Method for Performing Nucleic Acid Amplification Reaction |
CN113528624A (zh) * | 2020-04-17 | 2021-10-22 | 青岛大学 | 扩增和检测核酸的方法及试剂盒 |
CN111926067B (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-08 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于荧光定量pcr的双探针组合物、试剂盒、用途及方法 |
KR102661292B1 (ko) * | 2021-09-09 | 2024-04-30 | 포항공과대학교 산학협력단 | 금속 이온 반응성 dna 중합 효소 스위치 및 이에 의해 제어되는 등온 증폭 방법 |
WO2024054867A1 (en) * | 2022-09-07 | 2024-03-14 | Becton, Dickinson And Company | Modified molecular beacons for improved detection specificity |
WO2024118922A1 (en) * | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Asymmetric hairpin probes for nucleic acid detection |
Family Cites Families (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US6004826A (en) | 1988-07-20 | 1999-12-21 | David Segev | Repair-mediated process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
US5874557A (en) | 1990-06-11 | 1999-02-23 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
US5763173A (en) | 1990-06-11 | 1998-06-09 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
US5693502A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-02 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
DE69130800T2 (de) | 1990-07-24 | 1999-09-16 | Hoffmann La Roche | Verringerung von nicht spezifischer amplifikation während einer (in vitro) nukleinsäure amplifikation unter verwendung von modifizierten nukleinsäure basen |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
US5614402A (en) | 1992-12-07 | 1997-03-25 | Third Wave Technologies, Inc. | 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase |
DE69519783T2 (de) | 1994-04-29 | 2001-06-07 | Perkin Elmer Corp | Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation |
US5801155A (en) | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
US6183967B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-02-06 | Nexstar Pharmaceuticals | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
DK2080813T3 (da) * | 1995-06-07 | 2011-03-28 | Gilead Sciences Inc | Nukleinsyreligander, som binder til og inhiberer DNA-polymeraser |
US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
US6706471B1 (en) | 1996-01-24 | 2004-03-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
US6043060A (en) | 1996-11-18 | 2000-03-28 | Imanishi; Takeshi | Nucleotide analogues |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
US6143877A (en) | 1997-04-30 | 2000-11-07 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
JP4236812B2 (ja) | 1997-09-12 | 2009-03-11 | エクシコン エ/エス | オリゴヌクレオチド類似体 |
US6127121A (en) | 1998-04-03 | 2000-10-03 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
GB9812768D0 (en) * | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
DE69933770D1 (de) | 1998-07-09 | 2006-12-07 | Biocept Inc | Verfahren zur verwendung einer universellen bibliothek von peptid-nukleinsäuren zur optimierung der dns-hybridisierung |
US6830902B1 (en) | 1999-07-02 | 2004-12-14 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis |
JP2003504018A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-02-04 | インビトロゲン・コーポレーション | 核酸合成の感度および特異性の増大のための組成物および方法 |
AU783873B2 (en) | 1999-09-13 | 2005-12-15 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences |
US6692918B2 (en) | 1999-09-13 | 2004-02-17 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences |
JP3463098B2 (ja) * | 1999-10-08 | 2003-11-05 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法 |
US6660845B1 (en) | 1999-11-23 | 2003-12-09 | Epoch Biosciences, Inc. | Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof |
US6579680B2 (en) * | 2000-02-28 | 2003-06-17 | Corning Incorporated | Method for label-free detection of hybridized DNA targets |
AU2001256976A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using pna probes |
SE0001768D0 (sv) | 2000-05-12 | 2000-05-12 | Helen Andersson | Mikrofluidisk flödescell för manipulering av partiklar |
JP2004507226A (ja) | 2000-05-30 | 2004-03-11 | ピーイー コーポレイション (エヌワイ) | ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いて標的核酸を検出するための方法 |
US6605451B1 (en) | 2000-06-06 | 2003-08-12 | Xtrana, Inc. | Methods and devices for multiplexing amplification reactions |
US6887664B2 (en) | 2000-06-06 | 2005-05-03 | Applera Corporation | Asynchronous primed PCR |
JP2004507230A (ja) | 2000-07-03 | 2004-03-11 | アプレラ コーポレイション | ポリヌクレオチド配列アッセイ |
WO2002006827A1 (en) * | 2000-07-05 | 2002-01-24 | The General Hospital Corporation | Compounds and methods for fluorescently labeling nucleic acids |
US7309573B2 (en) * | 2000-11-21 | 2007-12-18 | Stratagene California | Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification |
US7267945B2 (en) | 2001-03-26 | 2007-09-11 | Applera Corporation | Methods of determining the presence of polynucleotides employing amplification |
US7582739B2 (en) | 2002-03-11 | 2009-09-01 | Epoch Biosciences, Inc. | Negatively charged minor groove binders |
AU2003288474A1 (en) * | 2002-06-24 | 2004-03-19 | Exiqon A/S | Methods and systems for detection and isolation of a nucleotide sequence |
EP1532275A4 (en) | 2002-07-26 | 2005-09-14 | Applera Corp | HOT START-UP BIOCHEMICAL REACTIONS BY MG |
EP3000899A1 (en) | 2002-12-04 | 2016-03-30 | Applied Biosystems, LLC | Multiplex amplification of polynucleotides |
US20040259116A1 (en) * | 2003-01-28 | 2004-12-23 | Gorilla Genomics, Inc. | Hairpin primer amplification |
US7820808B2 (en) | 2003-04-01 | 2010-10-26 | Eragen Biosciences, Inc. | Polymerase inhibitor and method of using same |
CN1661359B (zh) * | 2004-02-25 | 2013-06-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 一种核酸等温扩增定量检测方法 |
RU2495046C2 (ru) * | 2004-10-18 | 2013-10-10 | Брандейс Юнивесити | Реагент и способ предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции, наборы реагентов и олигонуклеотидов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции |
CN1308461C (zh) * | 2004-12-24 | 2007-04-04 | 武汉大学 | 一种检测口蹄疫病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 |
US8530194B2 (en) * | 2005-09-26 | 2013-09-10 | Allelogic Biosciences Corporation | Oligonucleotides as temperature-sensitive inhibitors for DNA polymerases |
US7917762B2 (en) | 2005-09-30 | 2011-03-29 | Phoenix Technologies Ltd. | Secure execution environment by preventing execution of unauthorized boot loaders |
JP5438320B2 (ja) * | 2005-10-03 | 2014-03-12 | アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | 核酸を増幅するための組成物、方法およびキット |
-
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