JP2016168058A - 薬剤耐性菌検出用ディスク試験片 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いる多剤耐性菌の検出方法であって、ディスク試験片が、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬からなる少なくとも3種の抗菌薬を含有していることを特徴とする方法および検出用ディスク試験片。抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いるバンコマイシン耐性菌の検出法であって、ディスク試験片が、(a)ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬から選択される2種以上の系統の抗菌薬および(b)グリコペプチド系抗菌薬からなる少なくとも3種の抗菌薬を含有していることを特徴とする方法および検出用ディスク試験片。
【選択図】なし
Description
(1)抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いる薬剤耐性菌検出方法であって、前記ディスク試験片が3種以上の系統の抗菌薬を含有していることを特徴とする方法。
(2)抗菌薬が、以下の(a)、(b)および(c)からなる少なくとも3種を含むことを特徴とする(1)に記載の方法。
(a)カルバペネム系抗菌薬
(b)フルオロキノロン系抗菌薬
(c)アミノグリコシド系抗菌薬
(3)1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、カルバペネム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、フルオロキノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、アミノグリコシド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであることを特徴とする(2)に記載の方法。
(4)検出対象菌が多剤耐性菌であることを特徴とする(1)から(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地(BTB乳糖寒天培地)、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地(SCD寒天培地)、普通寒天培地、標準寒天培地、マッコンキー寒天培地、DHL寒天培地およびNAC寒天培地から選択されることを特徴とする(4)に記載の方法。
(6)抗菌薬が、以下の(a)および(b)からなる少なくとも3種を含むことを特徴とする(1)に記載の方法。
(a)ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびキノロン系抗菌薬から選択される2種以上の系統の抗菌薬
(b)グリコペプチド系抗菌薬
(7)1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、ポリペプチド系抗菌薬 0.001〜1,500μg、モノバクタム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、キノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、グリコペプチド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであることを特徴とする(6)に記載の方法。
(8)検出対象菌がバンコマイシン耐性菌であることを特徴とする(1)、(6)または(7)に記載の方法。
(9)固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地(BTB乳糖寒天培地)、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地(SCD寒天培地)、普通寒天培地、標準寒天培地、胆汁-エスクリン-アジド寒天培地、KF連鎖球菌寒天培地、マンニット食塩培地、卵黄加マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩培地、スタフィロコッカスNo.110培地およびベアード・パーカー寒天培地から選択されることを特徴とする(8)に記載の方法。
(10)3種以上の系統の抗菌薬を含有していることを特徴とする薬剤耐性菌検出用のディスク試験片。
(11)抗菌薬が、以下の(a)、(b)および(c)からなる少なくとも3種を含むことを特徴とする(10)に記載のディスク試験片。
(a)カルバペネム系抗菌薬
(b)フルオロキノロン系抗菌薬
(c)アミノグリコシド系抗菌薬
(12)1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、カルバペネム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、フルオロキノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、アミノグリコシド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであることを特徴とする(11)に記載のディスク試験片。
(13)薬剤耐性菌が多剤耐性菌であることを特徴とする(10)から(12)のいずれか1項に記載のディスク試験片。
(14)抗菌薬が、以下の(a)および(b)からなる少なくとも3種を含むことを特徴とする(10)に記載のディスク試験片。
(a)ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬およびキノロン系抗菌薬から選択される2種以上の系統の抗菌薬
(b)グリコペプチド系抗菌薬
(15)1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、ポリペプチド系抗菌薬 0.001〜1,500μg、モノバクタム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、キノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、グリコペプチド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであることを特徴とする(14)に記載のディスク試験片。
(16)薬剤耐性菌がバンコマイシン耐性菌であることを特徴とする(10)、(14)または(15)に記載のディスク試験片。
(17)試料を塗布した固体培地に、(11)〜(13)のいずれか1項に記載のディスク試験片を載せ、20〜40℃で15〜48時間培養後、ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内に菌が生育したとき、その試料に多剤耐性菌が含まれると判定する方法。
(18)試料を塗布した固体培地に、(14)〜(16)のいずれか1項に記載のディスク試験片を載せ、20〜40℃で15〜48時間培養後、ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内に菌が生育したとき、その試料にバンコマイシン耐性菌が含まれると判定する方法。
なお、実施例2Aおよび2Bで使用した供試菌株一覧を以下の表3に、実施例3〜9で使用した供試菌株一覧を表4に示す。
カルバペネム系抗菌薬としてメロペネム、フルオロキノロン系抗菌薬としてシプロフロキサシン、アミノグリコシド系抗菌薬としてアミカシンを含浸させたディスク試験片を作製した。
1ディスク当たりの各抗菌薬含有量は、以下に示したとおりである。
各抗菌薬を精製水に溶解し、メロペネムを500μg/mL、アミカシンを1,500μg/mL、シプロフロキサシンを500μg/mL含む溶液(溶液A)とした。更に、溶液Aを80%に希釈して溶液B、溶液Aを50%に希釈して溶液Cとした。
(2)で調製した溶液A、B、Cを直径6.35mmの濾紙ディスクに20μLずつ含浸させた。その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させた。
実施例1で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、3剤耐性緑膿菌、2剤耐性緑膿菌または感受性の緑膿菌を培養し、多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)検出の効果を調べた。
以下に示した培地成分を用い、121℃で15分間高圧滅菌し、50℃に冷却した後に羊血液を添加した。その後、培地を20mLずつシャーレに分注して固化した。
前培養した菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の10倍希釈液を作製し、(1)で準備した羊血液寒天培地に一白金耳画線した。画線した培地に実施例1で作製したディスク試験片を置いた後、37℃で18時間培養し、判定を行った。
培養後の写真を結果として図1に示す。図1(1)〜(3)はそれぞれディスク試験片A〜Cを用いて3剤耐性緑膿菌(3R)を培養したもの、図1(4)〜(6)はそれぞれディスク試験片A〜Cを用いて2剤耐性緑膿菌(2R)を培養したもの、図1(7)〜(9)はそれぞれディスク試験片A〜Cを用いて感受性の緑膿菌(S)を培養したものである。ディスク試験片A〜Cいずれにおいても、3剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、2剤耐性緑膿菌および感受性の緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。このことから、本発明のディスク試験片周囲に生成されるコロニーの有無を観察することにより、多剤耐性緑膿菌の検出が可能であることが示された。
実施例1で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、3剤耐性緑膿菌または感受性の緑膿菌をエシェリキア・コリ(Escherichia coli)(以下、大腸菌という。)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)と混合培養し、多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)検出の効果を調べた。
実施例2.Aと同様とした。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の10倍希釈液を作製した後、等量混合し、(1)で準備した羊血液寒天培地に一白金耳画線した。画線した培地に実施例1で作製したディスク試験片を置いた後、37℃で18時間培養し、判定を行った。
培養後の写真を結果として図2および3に示す。図2(1)〜(3)はそれぞれディスク試験片A〜Cを用いて3剤耐性緑膿菌(3R)、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエを混合培養したもの、図2(4)〜(6)はそれぞれディスク試験片A〜Cを用いて感受性の緑膿菌(S)、大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエを混合培養したものである。ディスク試験片A〜Cいずれにおいても、3剤耐性緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に緑膿菌のコロニーが認められたが、感受性の緑膿菌との混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にいずれの菌の発育も認められなかった。
ディスク試験片に含浸させるカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬およびアミノグリコシド系抗菌薬の種類および含有量を変化させ、多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)EKN8118株またはEKN8093株を大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエと混合培養し、検出効果を調べた。
各抗菌薬の溶液を調製した後に混合し、1ディスク当たりの含有量が表7に示したとおりになるように、直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させ、ディスク3−1〜3−16とした。
以下に示した培地成分を用い、121℃で15分間高圧滅菌し、50℃に冷却した後に羊血液を添加した。その後、培地を20mLずつシャーレに分注して固化した。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁した後に混合してMcFarland No. 0.5の100〜10,000倍希釈の混合菌液とし、(2)で準備した羊血液寒天培地に綿棒にて塗抹した。塗抹した培地に(1)で作製したディスク試験片を置いた後、37℃で18時間培養し、判定を行った。
表7に示した様に、いずれのディスク試験片においても、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。これらの結果から、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬ともに、1ディスク当たりの含有量として0.001〜1,500μgの範囲において本発明による多剤耐性緑膿菌の検出が可能であることが示された。
ディスク試験片を置く培地の種類を変えて、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエとの混合培養における多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)の検出の効果を調べた。
以下に示す実施例4A、4Bおよび実施例5における菌の接種操作と培養は、実施例3と同様に行った。
各抗菌薬の溶液を調製した後、1ディスク当たりの含有量が表9に示したとおりになるように、直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させた。
以下に示した培地成分を用い、121℃で15分間高圧滅菌した。80℃まで冷却した後、ウマ脱線維素血液を5%添加し、撹拌しながらチョコレート色を呈するまで加熱した。その後、50℃に冷却し、20mLずつシャーレに分注して固化した。
表9に示した様に、検討したすべての培地において、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
NAC寒天培地を使用し、カルバペネム系、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系の薬剤すべてに感受性の緑膿菌との混合培養における多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)の検出の効果を調べた。
各抗菌薬の溶液を調製した後、1ディスク当たりの含有量が以下の表に示したとおりになるように、直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させた。
以下に示した培地成分を加温溶解した。その後、50℃に冷却し、20mLずつシャーレに分注して固化した。
以下の表20に示した様に、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、カルバペネム系、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系の薬剤すべてに感受性の緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
作製後4℃にて9ヶ月間保存した後の多剤耐性緑膿菌検出用ディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)を大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエと混合培養し、検出効果を調べた。
実施例4.Bと同様にしてディスク試験片を作製した後、4℃にて9ヶ月間保存した。なお、同時に作製したディスク試験片に対し、作製時に多剤耐性緑膿菌(3剤耐性緑膿菌)を用いて多剤耐性緑膿菌を検出可能であることを確認した。
実施例3と同様とした。
以下の表21に示した様に、多剤耐性緑膿菌はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエはディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。この結果から、本発明のディスク試験片は、4℃において少なくとも9ヶ月間保存した後も多剤耐性緑膿菌の検出効果を保っていることが示された。
ポリペプチド系抗菌薬としてコリスチン、キノロン系抗菌薬としてナリジクス酸、グリコペプチド系抗菌薬としてバンコマイシンを含浸させたディスク試験片を作製した。
1ディスク当たりの各抗菌薬含有量は、以下に示したとおりである。
各抗菌薬を精製水に溶解し、コリスチンを1,750μg/mL、ナリジクス酸を3,000μg/mL、バンコマイシンを1,500μg/mL含む溶液とした。
(2)で調製した溶液20μLを直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させた。その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させた。
実施例6で作製したディスク試験片を羊血液寒天培地上に置いて、バンコマイシン耐性の腸球菌(エンテロコッカス・フェカリス)またはバンコマイシン感受性の腸球菌(エンテロコッカス・フェカリス)を大腸菌、緑膿菌と混合培養し、バンコマイシン耐性腸球菌検出の効果を調べた。
実施例3と同様とした。
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁した後に混合してMcFarland No. 0.5の100〜10,000倍希釈の混合菌液を作製し、(1)で準備した羊血液寒天培地に綿棒にて塗抹した。塗抹した培地に実施例6で作製したディスク試験片を置いた後、37℃で18時間培養し、判定を行った。
培養後の写真を結果として図4(1)および(2)に示す。図4(1)はバンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス(VRE)、大腸菌および緑膿菌を混合培養したもの、図4(2)はバンコマイシン感受性のエンテロコッカス・フェカリス、大腸菌および緑膿菌を混合培養したものである。バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリスとの混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にエンテロコッカス・フェカリスのコロニーが認められたが、バンコマイシン感受性のエンテロコッカス・フェカリスとの混合培養ではディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内にいずれの菌の発育も認められなかった。以上の結果から、本発明のディスク試験片周囲に生成されるコロニーの有無を観察することにより、複数の菌が含まれる試料からバンコマイシン耐性腸球菌を検出することが可能であることが示された。
ディスク試験片に含浸させるポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬およびグリコペプチド系抗菌薬の種類および含有量を変化させ、大腸菌、緑膿菌との混合培養におけるバンコマイシン耐性腸球菌(エンテロコッカス・フェカリス)検出の効果を調べた。
以下に示す実施例8および実施例9における菌の接種操作と培養は、実施例7と同様に行った。
各抗菌薬の溶液を調製した後に混合し、1ディスク当たりの含有量が表23に示したとおりになるように、直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させ、ディスク8−1〜8−20とした。
実施例3と同様とした。
表23に示した様に、いずれのディスク試験片においても、VRE(バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス)はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。これらの結果から、ポリペプチド系抗菌薬、モノバクタム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬、グリコペプチド系抗菌薬ともに、1ディスク当たりの含有量として0.001〜1,500μgの範囲において本発明によるバンコマイシン耐性腸球菌の検出が可能であることが示された。
ディスク試験片を置く培地の種類を変えて、大腸菌、緑膿菌との混合培養におけるバンコマイシン耐性腸球菌(エンテロコッカス・フェカリス)の検出の効果を調べた。
各抗菌薬の溶液を調製した後、1ディスク当たりの含有量が表24に示したとおりになるように、直径6.35mmの濾紙ディスクに含浸させ、その後、ディスクを50℃で60分間乾燥させた。
実施例4と同様にして、チョコレート寒天培地、ドリガルスキー改良培地(BTB乳糖寒天培地)、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地(SCD寒天培地)を準備した。
表24に示した様に、検討したすべての培地において、VRE(バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス)はディスク試験片周囲の薬剤拡散領域内に生育し、コロニーを生成したが、大腸菌、緑膿菌はディスク試験片の周囲に発育阻止が認められた。
Claims (12)
- 抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いる多剤耐性菌の検出方法であって、
前記ディスク試験片が前記抗菌薬を含み、前記抗菌薬は、以下の(a)、(b)および(c)からなる3種であり、
(a)カルバペネム系抗菌薬
(b)フルオロキノロン系抗菌薬
(c)アミノグリコシド系抗菌薬
前記固体培地が血液寒天培地、チョコレート寒天培地、ハートインフュジョン寒天培地、ブレインハートインフュジョン寒天培地、トリプトソイ寒天培地(SCD寒天培地)、普通寒天培地、および標準寒天培地から選択されることを特徴とする方法。 - 前記ディスク試験片が、前記抗菌薬のみ、または前記抗菌薬およびpH緩衝剤のみを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、
カルバペネム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、
フルオロキノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、
アミノグリコシド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであり、
(a)カルバペネム系抗菌薬が、メロペネムまたはイミペネムであり、
(b)フルオロキノロン系抗菌薬が、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、またはオフロキサシンであり、
(c)アミノグリコシド系抗菌薬が、アミカシンまたはゲンタマイシンであることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - 前記抗菌薬が、以下の薬剤の組み合わせ(1)ないし(4)のいずれかであることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
(1)メロペネム、シプロフロキサシン、アミカシン
(2)メロペネム、ノルフロキサシン、アミカシン
(3)イミペネム、ノルフロキサシン、ゲンタマイシン
(4)イミペネム、オフロキサシン、ゲンタマイシン - 抗菌薬を含有しているディスク試験片と検出対象菌が増殖可能な固体培地を組み合わせて用いる多剤耐性菌の検出方法であって、
前記ディスク試験片が前記抗菌薬を含み、前記抗菌薬は、以下の(a)、(b)および(c)からなる3種であり、
(a)カルバペネム系抗菌薬
(b)フルオロキノロン系抗菌薬
(c)アミノグリコシド系抗菌薬
前記固体培地が検出対象菌以外の菌を抑制する選択剤を含まない培地であることを特徴とする方法。 - 前記検出対象菌がカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬の3系統に耐性を示す菌であることを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出対象菌が多剤耐性緑膿菌および/または多剤耐性アシネトバクターであることを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- ディスク試験片が抗菌薬のみ、または前記抗菌薬およびpH緩衝剤のみを含み、前記抗菌薬は、以下の薬剤の組み合わせ(1)ないし(4)のいずれかからなる3種であることを特徴とする多剤耐性菌検出用ディスク試験片。
(1)メロペネム、シプロフロキサシン、アミカシン
(2)メロペネム、ノルフロキサシン、アミカシン
(3)イミペネム、ノルフロキサシン、ゲンタマイシン
(4)イミペネム、オフロキサシン、ゲンタマイシン - 1ディスク当たりの含有量がそれぞれ、
カルバペネム系抗菌薬 0.001〜1,500μg、
フルオロキノロン系抗菌薬 0.001〜1,500μg、
アミノグリコシド系抗菌薬 0.001〜1,500μgであることを特徴とする請求項8に記載のディスク試験片。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法を実施するために用いられる、以下の(a)、(b)および(c)からなる3種である抗菌薬を含むことを特徴とする多剤耐性菌検出用ディスク試験片。
(a)カルバペネム系抗菌薬
(b)フルオロキノロン系抗菌薬
(c)アミノグリコシド系抗菌薬 - 試料を塗布した固体培地に、請求項8又は9のいずれか1項に記載のディスク試験片を載せ、20〜40℃で15〜48時間培養後、前記ディスク試験片の周囲の薬剤拡散領域内に菌が生育したとき、その試料に多剤耐性菌が含まれると判定する方法。
- 前記多剤耐性菌が多剤耐性緑膿菌および/または多剤耐性アシネトバクターであることを特徴とする請求項8から10のいずれか1項に記載のディスク試験片。
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