JP2016144430A - 細胞培養用冶具 - Google Patents

Abstract

【課題】培養される細胞等に新鮮な培養液が供給され、当該細胞等の壊死を防止するとともに、当該細胞等により構成される管腔構造体を任意の長さで容易に作製可能な細胞培養用冶具を提供する。【解決手段】細胞を培養して管腔構造の立体構造体を作製するために用いられる細胞培養用冶具１は、平板状の基部２０と、当該基部２０から一体的に突出してなる複数の針部３０とを有する、金属製の針状物部材１０を、その厚さ方向に複数枚積層してなり、複数の針部３０の頂部３１が、細胞培養用冶具１の複数の針部３０の頂部３１から求められる、一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置している。【選択図】図１

Description

本発明は、培養対象である細胞塊等を穿刺するための針部を備え、当該針部に細胞塊等を穿刺した状態で当該細胞塊等を培養するために用いられる細胞培養用冶具に関する。

基部と、その基部から突出した複数の針部とを備え、複数の針部に細胞塊等を穿刺し、その状態で当該細胞塊等を培養するために用いられる細胞培養用冶具が知られている。かかる細胞培養用冶具の複数の針部のそれぞれに、複数の細胞塊を穿刺し、隣接する細胞塊同士を密着させた状態で培養することで、細胞塊等により構成される立体構造体を作製することができる。そのため、当該細胞培養用冶具は、再生医療の分野等での適用が期待されている。

このような細胞培養用冶具として、従来、細胞塊を任意の空間に配置するための支持体であって、基板と、細胞塊を貫通させるための複数の針状体とを備える支持体が提案されている（特許文献１参照）。この支持体においては、複数の針状体が、上面視縦方向及び横方向のそれぞれに、所定のピッチで並列しており、各針状体の先端に位置する頂部は、当該針状体の高さ方向において同一高さに位置している。

国際公開第２００８／１２３６１４号

特許文献１に開示された支持体を用いて、血管、リンパ管等の管腔構造を有する立体構造体を作製するためには、例えば、作製予定の立体構造体の軸方向が針状体の長手方向と平行になるように、複数の針状体に細胞塊を穿刺して培養する方法、作製予定の立体構造体の軸方向が針状体の長手方向と直交するように、複数の針状体に細胞塊を穿刺して培養する方法等が採用され得る。

しかしながら、前者の方法では、作製可能な立体構造体の軸方向の長さが、針状体の長さに依存してしまうため、針状体の長さを超える長さの立体構造体を作製することができないという問題がある。そのような長さの立体構造体を作製するために、針状体を長くすると、針状体の強度低下等を招きかねない。

また、両者の方法とも、針状体のピッチ、培養液の粘度等にもよるものの、針状体の下方に位置する細胞塊に新鮮な培養液が供給され難く、当該細胞塊が壊死しやすいという問題がある。

このような実情に鑑み、本発明は、培養される細胞等に新鮮な培養液が供給され、当該細胞等の壊死を防止するとともに、当該細胞等により構成される管腔構造の立体構造体を任意の長さで容易に作製可能な細胞培養用冶具を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、細胞を培養して管腔構造の立体構造体を作製するために用いられる細胞培養用冶具であって、前記細胞培養用冶具は、平板状の基部と、当該基部から一体的に突出してなる複数の針部とを有する、金属製の針状物部材を、その厚さ方向に複数積層してなり、前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部は、前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部から求められる、一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置していることを特徴とする細胞培養用冶具を提供する（発明１）。

上記発明（発明１）によれば、複数の針部の頂部が、それらの頂部から求められる一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置していることで、当該針部の頂部近傍に細胞塊等を穿刺して培養処理を施すことで、管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面を有する立体構造体を作製することができる。また、当該立体構造体を作製するにあたり、複数の針部の頂部の近傍に細胞塊等を穿刺して培養することで、培養処理中にすべての細胞塊等に新鮮な培養液が供給されるため、当該細胞塊等の壊死を防止することができる。

本発明において「複数の針部の頂部が、複数の針部の頂部から求められる、一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置している」とは、複数の針部の頂部から求められる近似曲面から各針部の頂部までの長さ（針部の長手方向における長さ）が１ｍｍ以下であることを意味するものとする。なお、上記近似曲面は、２次元測定器（ニコン社製，ＮＥＸＩＶ）等を用いて各針状物部材の各針部の頂部の座標を測定し、当該座標から最小二乗法により求められ得る。

上記発明（発明１）において、前記各針状物部材をその厚さ方向に沿って見たときに、前記各針状物部材の前記複数の針部の頂部は、前記各針状物部材の前記複数の針部の頂部から求められる近似曲線上に実質的に位置していてもよいし（発明２）、前記複数の針状物部材のそれぞれをその厚さ方向に沿って見たときに、各針状物部材の複数の針部は実質的に同一の長さを有しており、前記細胞培養用冶具は、前記針状物部材が積層される方向の両端に位置する当該針状物部材の前記針部の長手方向の長さが最も長く、前記積層方向の略中央に向かって、前記針部の長手方向の長さが漸減するように、複数の前記針状物部材が積層され、前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部は、前記複数の針部の頂部から求められる、前記針状物部材の積層方向に直交する方向の前記一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置していてもよい（発明３）。

本発明において「複数の針部の頂部が湾曲線上に実質的に位置する」とは、複数の針部の頂部から求められる近似曲線から各針部の頂部までの長さ（針部の長手方向における長さ）が、１ｍｍ以下であることを意味するものとする。なお、上記近似曲線は、２次元測定器（ニコン社製，ＮＥＸＩＶ）を用いて針状物部材の各針部の頂部の座標を測定し、当該座標から最小二乗法により求められ得る。また、本発明において「実質的に同一長さ」とは、一の針状物部材が有する複数の針部の長さの算術平均値と各針部の長さとの差が、１ｍｍ以下であることを意味するものとする。

上記発明（発明１〜３）において、前記基部を下方に位置させ、前記針部の頂部を上方に位置させたときに、前記複数の針部の頂部が、凹状の前記湾曲面上に実質的に位置していてもよいし（発明４）、前記基部を下方に位置させ、前記針部の頂部を上方に位置させたときに、前記複数の針部の頂部が、凸状の前記湾曲面上に実質的に位置していてもよい（発明５）。

上記発明（発明１〜５）において、前記複数の針部により求められる近似曲面が、前記管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の曲率半径を有するのが好ましい（発明６）。

本発明によれば、培養される細胞等に新鮮な培養液が供給され、当該細胞等の壊死を防止するとともに、当該細胞等により構成される管腔構造体を任意の長さで容易に作製可能な細胞培養用冶具を提供することができる。

図１（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養用冶具の概略構成を示す斜視図である。 図２は、本発明の第１の実施形態における針状物部材の概略構成を示す側面図である。 図３は、本発明の第１の実施形態における針状物部材の針部の頂部近傍の概略構成を示す側面図である。 図４は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養用冶具を積層方向に直交する方向から見た側面図である。 図５（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養用冶具を複数並列させた例を示す、当該細胞培養用冶具の積層方向に直交する方向から見た側面図である。 図６は、本発明の第１の実施形態における針状物部材を作製する工程を示す斜視図（その１）である。 図７は、本発明の第１の実施形態における針状物部材を作製する工程を示す斜視図（その２）である。 図８は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養用冶具の使用方法の一例を示す、当該細胞培養用冶具の積層方向から見た側面図である。 図９は、本発明の第２の実施形態に係る細胞培養用冶具の概略構成を示す斜視図である。 図１０は、本発明の第２の実施形態における針状物部材の概略構成を示す側面図である。 図１１は、本発明の第２の実施形態における針状物部材の概略構成を示す部分拡大側面図である。

本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本実施形態に係る細胞培養用冶具は、平板状の基部と、基部から一体的に突出してなる複数の針部とを有する金属製の針状物部材を、その厚さ方向に複数枚積層してなり、複数の針部の頂部が、管腔構造の壁面の一部を構成する実質的湾曲面を構成している。この複数の針部の頂部近傍に細胞塊等を穿刺し、その状態で培養することで、管腔構造の壁面の一部を構成する立体構造体を作製することができる。以下、本実施形態に係る細胞培養冶具の具体的態様について、図面を参照しつつ説明する。

〔第１の実施形態〕
図１（Ａ）及び（Ｂ）は、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具の概略構成を示す斜視図であり、図２は、第１の実施形態における針状物部材の概略構成を示す側面図であり、図３は、第１の実施形態における針状物部材の針部の頂部近傍の概略構成を示す側面図である。

図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１は、金属薄板をエッチング加工して形成された針状物部材１０とスペーサ４０とを、それらの厚さ方向に交互に複数積層した構成を有する。

図２に示すように、針状物部材１０は、略長方形状の平板状の基部２０と、基部２０の一の長辺部２１から、基部２０の平面方向に一体的に突出形成された針部３０とを有する。「一体的に突出形成された」とは、基部２０と針部３０とが同一材質により構成されており、かつ基部２０と針部３０とが一度も分離された状態で存在したことがない状態を意味する。

針状物部材１０の加工前のベースとなる金属薄板としては、圧延加工により形成された金属薄板（例えば、ステンレス製薄板等）を用いるのが好ましい。

針状物部材１０の加工前のベースとなる金属薄板として、圧延加工により形成された金属薄板が用いられる場合、基部２０の一の長辺部２１から突出する針３０の長手方向は、金属薄板の圧延金属組織の配列方向に対して、実質的に直角方向（９０°±１５°の範囲）であるのが好ましい。ここで、圧延金属組織の配列方向とは、図２に示すように、圧延加工された金属薄板の金属組織を確認して認識される圧延方向Ｅと同一方向である。なお、圧延金属組織の圧延方向Ｅは、例えば、１００倍以上の倍率（総合倍率）を有する金属顕微鏡等を用いて針状物部材１０を観察することにより容易に確認され得る。

このようにして、圧延金属組織の配列方向（圧延方向Ｅ）に対して針部３０の長手方向が実質的に直角方向であることで、針部３０の長手方向の強度を向上させることができる。したがって、針部３０の折れ、曲がり等の欠陥が生じ難くなる。

圧延加工とは、高温、常温、低温等の条件下で、金属素材を圧延機の回転ロールに通して、金属薄板等の板材を形成する手法である。圧延加工時に板材を引っ張る方向が、圧延方向Ｅに相当する。

基部２０の長手方向の長さＬ２０は、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて作製される、細胞等により構成される立体構造体の大きさ（管腔構造の直径）等により適宜設定され得るものであって、特に制限されるものではない。

第１の実施形態において、各針状物部材１０の複数の針部３０は、基部２０の長手方向の一端部側及び他端部側のそれぞれに位置する２つの針部３０ａと、一端部側の２つの針部３０ａと他端部側の２つの針部３０ａとの間に位置する複数（図１及び図２に示す例においては９個）の針部３０ｂとを含む。基部２０の長手方向の一端部側に位置する２つの針部３０ａ、及び他端部側に位置する２つの針部３０ａは、互いに実質的に同一の長さを有する。

なお、第１の実施形態においては、基部２０の長手方向の一端部側及び他端部側のそれぞれに位置する、互いに実質的に同一の長さを有する針部３０ａが、一端部側及び他端部側に２個ずつ存在するが、このような態様に限定されるものではない。当該針部３０ａが、一端部側及び他端部側のそれぞれに３個以上存在していてもよいし、一端部側及び他端部側のいずれにも互いに実質的に同一の長さを有する針部３０ａが存在していなくてもよい。

針状物部材１０の基部２０を下方に、針部３０を上方に位置させた側面視において、複数の針部３０ｂは、それらの各頂部３１により求められる近似曲線から各針部３０ｂの頂部３１までの長さ（針部３０ｂの長手方向における長さ）が、１ｍｍ以下、好ましくは０．８ｍｍ以下となるように、基部２０の一の長辺部２１から突出形成されている。換言すると、複数の針部３０ｂの各頂部３１は、近似曲線ＣＬ上に実質的に位置している。したがって、複数の針状物部材１０が厚さ方向に積層されてなる、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１においては、当該細胞培養用冶具１の複数の針部３０ｂから求められる、当該積層方向に平行な一軸に沿って湾曲する近似曲面上に、各針部３０ｂの頂部３１が実質的に位置することになる。なお、針状物部材１０の基部２０の長手方向の両端部側に位置する針部３０ａは、上記近似曲線ＣＬ上に実質的に位置していてもよいし、上記近似曲線ＣＬ上に実質的に位置していなくてもよい。

第１の実施形態において、複数の針部３０ｂの各頂部３１により求められる近似曲面が、細胞培養用冶具１を用いて作製され得る立体構造体の管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の曲率半径を有するのが好ましい。すなわち、各針状物部材１０の側面視において、複数の針部３０ｂの各頂部３１により求められる近似曲線ＣＬが、管腔構造の軸方向に直交する切断端面における当該管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲線と実質的に同一の曲率半径を有するのが好ましい。

なお、第１の実施形態において、上記近似曲面及び近似曲線ＣＬは、例えば、複数の針部３０の頂部３１の座標を、２次元測定器（ニコン社製，ＮＥＸＩＶ）等を用いて測定し、当該座標から最小二乗法により求められ得る。

針部３０の長手方向の長さＮｄは、当該針部３０に穿刺して培養される細胞塊等の大きさ、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて作製される立体構造体の壁面（管腔構造の壁面）の厚さ等に応じ、例えば１〜２０ｍｍ程度の範囲で適宜設定され得る。

針状物部材１０の基部２０の長手方向の両端部側に位置する針部３０ａの長手方向の長さＮｄと、針状物部材１０の略中央に位置する針部３０ｂの長手方向の長さＮｄとの差（針部３０ａの長手方向の長さＮｄと、針部３０ｂのうち最短の針部３０ｂの長手方向の長さＮｄとの差）は、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて作製される立体構造体の大きさ（管腔構造の直径、曲率半径等）に応じて適宜設定され得るものであり、例えば、１〜２０ｍｍ程度の範囲内で適宜設定され得る。

針部３０の頂部３１の先端角度θは、例えば、１０〜２０°程度、好ましくは１０〜１５°程度である。先端角度θが上記範囲内であれば、細胞塊等に対する穿刺性を良好にすることができる。

針状物部材１０において、隣接する針部３０のピッチＰ₁₁は、当該針部３０に穿刺される細胞塊等の大きさに応じて適宜設定され得る。例えば、隣接する針部３０のピッチＰ₁₁は、針部３０に穿刺される細胞塊等の直径に対して６０〜９０％程度に設定され得る。

なお、第１の実施形態において、針部３０の表面にコーティング層が形成されていてもよい。コーティング層は、ＰＶＤ法、ＣＶＤ法等のドライプロセス、又はめっき法等のウェットプロセスによって形成され得る。ＰＶＤ法で形成されるコーティング層としては、Ｔｉ、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、ＴｉＡｌＮ又はＣｒＮ等により構成されるコーティング層等が挙げられる。ＣＶＤ法で形成されるコーティング層としては、ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）等により構成されるコーティング層等が挙げられる。めっき法で形成されるコーティング層としては、ニッケル、金、銀、パラジウム又はクロム等により構成されるコーティング層等が挙げられる。

第１の実施形態において、隣接する針状物部材１０の間には、スペーサ４０が介在している。スペーサ４０を介在させることにより、針部３０を、針状物部材１０の厚さ方向に所定のピッチで並列させることができる。なお、スペーサ４０は、針状物部材１０と同様に、金属材料により構成され得る。

針状物部材１０及びスペーサ４０の積層方向において、隣接する針部３０，３０のピッチＰ₁₂は、針部３０の積層方向における厚さ及びスペーサ４０の厚さＴ₄₀により決定される。そして、針状物部材１０の隣接する針部３０のピッチＰ₁₁と、細胞培養用冶具１の積層方向における隣接する針部３０のピッチＰ₁₂とは、同一であることが望ましい。そのため、針部３０に穿刺される細胞塊等の直径に応じ、例えば、スペーサ４０の厚さＴ₄₀は、当該細胞塊等の直径に対して４０〜７０％程度に設定され得る。

第１の実施形態において、複数の針状物部材１０には、基部２０に厚さ方向に貫通する２つの貫通孔２２，２２が形成されている。また、スペーサ４０には、針状物部材１０の貫通孔２２に対応する位置に貫通孔が形成されている。これにより、複数の針状部材１０とスペーサ４０とを厚さ方向に交互に積層してなる積層体において、その積層方向に連続する貫通孔が形成される。そして、上記積層体において、その積層方向に連続する貫通孔にネジ５０が挿入される。これにより、当該積層体が固定される。

第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１において、各針状物部材１０の基部２０には、他の長辺部２４に開口する略Ｕ字状の溝２５が形成されている。また、スペーサ４０にも、複数の針状物部材１０とスペーサ４０とを、それらの厚さ方向に交互に積層したときの各針状物部材１０の溝２５と対応する位置に略Ｕ字状の溝が形成されている。これにより、細胞培養用冶具１は、その厚さ方向に沿って形成されてなる溝２５を有する。

上述したように、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１は、複数の針状物部材１０とスペーサ４０とを、それらの厚さ方向に交互に積層し、その積層方向に連続する貫通孔にネジ５０が挿入されることで固定されている。このとき、ネジ５０の頭部５１が、細胞培養用冶具１における積層方向の一端に位置する針状物部材１０の基部２０から、その外側に突出する（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）。

一方で、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて作製される管腔構造の立体構造体の軸方向の長さは、細胞培養用冶具１における針状物部材１０及びスペーサ４０の積層枚数と、それらの厚さとによって決定される。そのため、例えば、一の細胞培養用冶具１Ａ（図１（Ａ）参照）と、他の細胞培養用冶具１Ｂ（図１（Ｂ）参照）とを含む細胞培養用冶具セットを用いることで、１個の細胞培養用冶具１を用いて作製され得る立体構造体の軸方向の長さよりも長い立体構造体を作製することができる。

一の細胞培養用冶具１Ａにおいては、当該一の細胞培養用冶具１Ａと他の細胞培養用冶具１Ｂとを、それらの積層方向一端に位置する針状物部材１０とスペーサ４０とを当接させるように積層方向に並列させたときの他の細胞培養用冶具１Ｂのネジ５０の頭部５１に対応する位置に溝２５が形成され、他の細胞培養用冶具１Ｂの溝２５に対応する位置にネジ５０の頭部５１が位置する。一方、他の細胞培養用冶具１Ｂにおいては、上記と同様にしてそれらの細胞培養用冶具１Ａ，１Ｂを並列させたときの一の細胞培養用冶具１Ａのネジ５０の頭部５１に対応する位置に溝２５が形成され、一の細胞培養用冶具１Ａの溝２５に対応する位置にネジ５０の頭部５１が位置する（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）。

このような細胞培養用冶具セットは、図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、一の細胞培養用冶具１Ａの積層方向一端に位置する針状物部材１０と、他の細胞培養用冶具１Ｂの積層方向一端に位置するスペーサ４０とを当接させるようにして、それらを積層方向に並列させるようにして用いられる。これにより、一の細胞培養用冶具１Ａの積層方向の一端に位置する針状物部材１０の基部２０から突出するネジ５０の頭部５１が、並列させた他の細胞培養用冶具１Ｂの針状物部材１０の基部２０の溝２５に収納される（図５（Ｂ）参照）。

また、上記細胞培養用冶具セットは、一の細胞培養用冶具１Ａと他の細胞培養用冶具１Ｂとを少なくとも１個ずつ含むのが好ましい。このような細胞培養用冶具セットを用いることで、軸方向の長さが１個の細胞培養用冶具１の積層方向の長さの２倍を超える立体構造体であっても作製可能となる。この場合、一の細胞培養用冶具１Ａと他の細胞培養用冶具１Ｂとが積層方向に交互に並列するように、３個以上の細胞培養用冶具１を並列させる。このとき、一の細胞培養用冶具１Ａの積層方向の一端に位置する針状物部材１０の基部２０から突出するネジ５０の頭部５１が、並列させた他の細胞培養用冶具１Ｂの針状物部材１０の基部２０の溝２５に収納される。当該他の細胞培養用冶具１Ｂのネジ５０の頭部５１は、別個の一の細胞培養用冶具１Ａの溝部２５に収納される（図５（Ｃ）参照）。

このように、細胞培養用冶具セットを用い、一の細胞培養用冶具１Ａと他の細胞培養用冶具１Ｂとを積層方向に交互に並列させたときに、一の細胞培養用冶具１Ａの一端側に位置する針状物部材１０の針部３０と、他の細胞培養用冶具１Ｂの一端側に位置する針状物部材１０の針部３０とのピッチＰ₁₃が、各細胞培養用冶具１における積層方向の針部３０のピッチＰ₁₂と同一となる（図５（Ｂ）参照）。よって、複数の細胞培養用冶具１を積層方向に並列させても、全体として積層方向における針部３０のピッチを同一にすることができる。

上述した構成を有する細胞培養用冶具１は、例えば、以下のようにして製造され得る。
図６〜７は、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１の針状物部材１０を作製する工程を斜視図にて示す工程フロー図である。

図６（Ａ）に示すように、圧延加工により形成された金属薄板１１を準備する。金属薄板１１は、予め脱脂洗浄処理しておくことが好ましい。次工程におけるフォトレジスト膜の密着性を向上させ、品質・仕上がりを向上させるためである。なお、金属薄板１１の厚さＴ₁₁は、５０〜３００μｍ程度とされる。

次に、図６（Ｂ）に示すように、金属薄板１１の両平面１１ａ，１１ｂにフォトレジスト膜１２，１２を形成する。フォトレジスト膜１２は、金属薄板１１の両平面１１ａ，１１ｂに塗布形成されてもよいし、当該両平面１１ａ，１１ｂにフィルム状のフォトレジスト膜１２が貼り付けられてもよい。フォトレジスト膜１２は、ネガ型、ポジ型のいずれであってもよい。

フォトレジスト膜１２がネガ型の場合、露光部分が現像液に対して不溶解性となり、現像後に露光部分が残る。フォトレジスト膜１２がポジ型の場合、露光部分が現像液に対して溶解し、現像後に未露光部分が残る。図示例では、ネガ型の場合を示している。

続いて、フォトレジスト膜１２，１２の上に、露光用のパターンが形成されたパターンフィルム原版を配置し、露光処理を行い、現像処理を行うことによって、図７（Ａ）に示すように、マスクパターン１３が形成される。このとき、マスクパターン１３のうち、作製される針状物部材１０の針部３０の頂部３１に対応する部分が湾曲線ＣＬ上に実質的に位置するように、当該マスクパターン１３が形成される。

そして、図７（Ｂ）に示すように、金属薄板１１にエッチング処理を施し、基部２０及び針部３０を形成する。エッチング処理に用いられるエッチング液としては、金属薄板を構成する金属材料に応じて適宜選定され得る。

次に、エッチング処理後に残存しているマスクパターン１３を除去し、洗浄・乾燥処理を経て、基部２０と基部２０の一の長辺部２１から一体的に突出形成されてなる針部３０とを有する針状物部材１０（図２参照）を作製することができる。

上記エッチング処理としては、金属薄板の肉厚が極めて薄いものであれば、反応性気体やイオン、ラジカルを用いたドライエッチング処理を採用することもできる。

なお、上述のようにして形成された針状物部材１０に対し、所望により研磨処理が行われてもよい。この研磨処理によって、針状物部材１０の角部を丸めることができる。研磨処理としては、化学研磨処理及び／又は電解研磨処理が採用され得る。化学研磨処理及び電解研磨処理が行われる場合、それらの処理の順番は特に限定されるものではないが、電解研磨処理が行われた後に、化学研磨処理が行われることが好ましい。

化学研磨処理は、被研磨物をある特定の酸、アルカリ、塩類により構成された研磨液に浸漬し、その溶解作用により、被研磨物表面を平滑化、光沢化させる処理である。電解研磨処理は、被研磨物をプラス側にして電解液を介して直流電流を流し、金属表面を溶解させることで研磨効果を得る処理である。

化学研磨処理は、電解研磨処理に比べて、重量、厚みなどの変化量のコントロールが容易であり、減肉量（研磨量）の均一化が図りやすいというメリットがある。この一方で、電解研磨では、角部を集中的に研磨できるというメリットがある。

このような研磨処理の後に、さらに針部３０の表面にコーティング層を形成する処理が行われてもよい。コーティング層は、ＰＶＤ法、ＣＶＤ法等のドライプロセス、又はめっき法等のウェットプロセスによって形成され得る。ＰＶＤ法で形成されるコーティング層としては、Ｔｉ、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、ＴｉＡｌＮ又はＣｒＮ等により構成されるコーティング層等が挙げられる。ＣＶＤ法で形成されるコーティング層としては、ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）等により構成されるコーティング層等が挙げられる。めっき法で形成されるコーティング層としては、ニッケル、金、銀、パラジウム又はクロム等により構成されるコーティング層等が挙げられる。

上述のようにして形成された針状物部材１０と、スペーサ４０とを交互に積層して積層体を形成し、当該積層体の積層方向に連続する貫通孔にネジ５０を挿入して、当該積層体を固定することで、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を製造することができる。

上述した第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて細胞塊等を培養し、管腔構造の立体構造体を作製する方法について説明する。図８（Ａ）及び（Ｂ）は、管腔構造の立体構造体を作製する方法を概略的に示す、細胞培養用冶具１の積層方向から見た平面図である。

細胞培養用冶具１の針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０が保持されるように、針部３０に細胞塊６０を穿刺する（図８（Ａ）参照）。このとき、作製する立体構造体の壁面の厚さ、細胞塊６０の大きさ（直径）等に応じ、１つの針部３０に対し１個以上の細胞塊６０を穿刺する。

なお、図８（Ａ）においては、１つの針部３０に対し２個の細胞塊６０を穿刺する例が示されている。また、図８（Ａ）においては、針状物部材１０のすべての針部３０に細胞塊６０が穿刺されているが、一部の針部３０に細胞塊６０が穿刺されてもよい。この場合において、針部３０に穿刺された細胞塊６０同士を当接させ、一つの湾曲シート状の立体構造体が作製されるようにする必要がある。

第１の実施形態において、細胞塊６０としては、一種類の細胞（単一種の同一組織又は器官等に由来する、機能的に同等の細胞）を含むもののみが用いられてもよいし、それぞれ異なる種類の細胞を含むものが用いられてもよい。例えば、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１を用いて、立体構造体としての血管を作製しようとする場合、細胞塊６０としては、血管内皮細胞を含む細胞塊（血管内膜に相当）、平滑筋細胞を含む細胞塊（血管中膜に相当）及び結合組織を構成する細胞を含む細胞塊の３種類の細胞塊を用いることができる。

次に、細胞培養用冶具１の針部３０の先端部近傍に保持された細胞塊６０を培養する。培養方法としては、特に制限されるものではなく、例えば、培養液を還流させながら培養する循環培養方式等を採用することができる。このようにして細胞塊を培養することで、隣接する細胞塊６０同士が接着融合する。これにより、一軸方向に沿って湾曲する立体構造体６１を作製することができる。

このようにして作製された立体構造体６１を複数準備し、管腔構造を形成するように、複数の立体構造体６１の端部６２同士を接触させた状態でさらに培養する。上記のようにして作製された、一軸方向に沿って湾曲する立体構造体６１は、最終的に作製される管腔構造を有する立体構造体の壁面の一部と実質的に同一の曲率を有するものである。したがって、複数の立体構造体６１の端部６２同士を接触させた状態で培養することで、管腔構造を有する立体構造体を作製することができる。

第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１においては、複数の針部３０の頂部３１が一軸に沿って湾曲する湾曲面上に実質的に位置し、好適には当該湾曲面（各頂部３１により求められる近似曲面）が管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面の曲率半径と実質的に同一である。そのため、複数の細胞培養用冶具１を用いて作製された、一軸に沿って湾曲する立体構造体６１の端部６２同士を、細胞培養用冶具１に保持させたままの状態で接触させることができる。これにより、立体構造体６１の湾曲形状が崩れることなく、管腔構造を有する立体構造体を容易に作製することができる。

上述したように、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１においては、複数の針部３０の頂部３１が一軸に沿って湾曲する湾曲面上に実質的に位置しているため、当該針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０を穿刺して培養処理を施すことで、管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の湾曲面を有する立体構造体６１を作製することができる。また、当該湾曲面を有する立体構造体６１を複数組み合わせてさらに培養することで、管腔構造を有する立体構造体を容易に作製することができる。そして、針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０が穿刺・保持されることで、当該細胞塊６１に対して新鮮な培養液を供給し続けることができ、培養処理中に細胞塊６０が壊死してしまうのを防止することができる。

さらに、第１の実施形態に係る細胞培養用冶具１は、金属材料のみにより構成され、樹脂材料のような有機物等を含まないため、培養の前処理として、オートクレーブ等により加熱殺菌処理を行った際に、当該有機物等により汚染されることがない。

〔第２の実施形態〕
図９は、第２の実施形態に係る細胞培養用冶具の概略構成を示す斜視図であり、図１０は、第２の実施形態における針状物部材の概略構成を示す平面図であり、図１１は、第２の実施形態における針状物部材の概略構成を示す部分拡大平面図である。なお、第２の実施形態において、第１の実施形態と同様の構成を有する要素には同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。

第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’は、図９に示すように、金属薄板をエッチング加工して形成された針状物部材１０’とスペーサ４０とを、それらの厚さ方向に交互に複数積層した構成を有する。

第２の実施形態において、針状物部材１０’は、略長方形状の平板状の基部２０’と、基部２０’の一の長辺部２１から、基部２０’の平面方向に一体的に突出形成された針部３０とを有する。「一体的に突出形成された」とは、基部２０’と針部３０とが同一材質により構成されており、かつ基部２０’と針部３０とが一度も分離された状態で存在したことがない状態を意味する。

針状物部材１０’の基部２０’を下方に、針部３０を上方に位置させた側面視において、針部３０は、各頂部３１が基部２０’の長辺部２１に平行な直線ＳＬ上に実質的に位置するように、すなわち、針状物部材１０’に含まれる複数の針部３０の長手方向の長さＮｄの算術平均値から各針部３０の頂部３１までの長さ（針部３０の長手方向における長さ）が１ｍｍ以下、好ましくは０．８ｍｍ以下になるように、基部２０’の一の長辺部２１から突出形成されている。

第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’において、積層される複数の針状物部材１０’のうち、積層方向の両端に位置する針状物部材１０’の針部３０の長手方向の長さＮｄが最も長く、積層方向の略中央に向かって、針部３０の長手方向の長さＮｄが漸減する。なお、積層方向の両端に位置する針状物部材１０’と、それらに隣接する針状物部材１０’との針部３０の長手方向の長さＮｄは、実質的に同一であってもよい。そして、細胞培養用冶具１’の各針部３０の頂部３１が、当該各頂部３１により求められる、積層方向に直交する方向の一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置する。

第２の実施形態において、複数の針部３０の各頂部３１により求められる近似曲面が、細胞培養用冶具１’を用いて作製され得る立体構造体の管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の曲率半径を有するのが好ましい。すなわち、細胞培養用冶具１’の積層方向に直交する側面から見たときに、複数の針部３０（積層方向に沿って並ぶ各針状物部材１０’の針部３０）の各頂部３１により求められる近似曲線が、管腔構造の軸方向に直交する切断端面における当該管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲線と実質的に同一の曲率半径を有するのが好ましい。

なお、第２の実施形態において、上記近似曲面及び近似曲線は、例えば、複数の針部３０の頂部３１の座標を、２次元測定器（ニコン社製，ＮＥＸＩＶ）等を用いて測定し、当該座標から、最小二乗法により求められ得る。

基部２０’の長手方向の長さは、特に限定されるものではなく、第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’を用いて作製される管腔構造の立体構造体の長さ（軸方向の長さ）に応じて適宜設定され得る。基部２０’の長手方向の両端に位置する針部３０の側面３２から当該側面３２に最も近い基部２０’の長手方向端部２６’までの長さＬ１は、隣接する針部３０，３０の間隔Ｌ２の半分であるのが好ましい。

第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’を用いて作製される管腔構造の立体構造体の軸方向の長さは、細胞培養用冶具１’における針状物部材１０’の両端（基部２０’の長手方向両端）に位置する針部３０，３０間の長さによって決定される。そのため、複数の細胞培養用冶具１をその積層方向に直交する方向に並列させることで、１個の細胞培養用冶具１を用いて作製され得る立体構造体の軸方向の長さよりも長い立体構造体を作製することができる。

この場合において、基部２０’の長手方向の両端に位置する針部３０の側面３２から当該側面３２に最も近い基部２０’の長手方向端部２６’までの長さＬ１が、隣接する針部３０，３０の間隔Ｌ２の半分であれば、他の細胞培養用冶具１’を積層方向に直交する方向に並列させたときに、全体として針部３０のピッチを略同一にすることができる。

上述した第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’は、第１の実施形態と同様にして作製され得る。すなわち、まず、金属基板１１の両平面１１ａ，１１ｂにマスクパターンを形成し、金属基板１１にエッチング処理を施して、針状物部材１０’を作製する。上記マスクパターンは、第１の実施形態とは異なり、針部３０の頂部３１に対応する部分が直線ＳＬ上に実質的に位置するように形成され得る。

そして、第２の実施形態においては、針部３０の長手方向の長さＮｄの異なる針状物部材１０’を複数作製し、それらを、積層方向の両端に位置する針部３０の長手方向の長さＮｄが最も長く、積層方向の略中央に向かって、針部３０の長手方向の長さＮｄが漸減するように、スペーサ４０を針状物部材１０’間に介在させながら積層して積層体を形成し、当該積層体の積層方向に連続する貫通孔にネジ５０を挿入して、当該積層体を固定する。これにより、第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’を製造することができる。

上述した第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’を用いて細胞塊等を培養し、管腔構造の立体構造体を作製する方法としては、第１の実施形態と同様の方法を例示することができる。

すなわち、まず、細胞培養用冶具１’の針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０が保持されるように、針部３０に細胞塊６０を穿刺し、細胞培養用冶具１’の針部３０の頂部３１近傍に保持された細胞塊６０を培養する。これにより、細胞培養用冶具１’の積層方向に直交する一軸方向に沿って湾曲する立体構造体６１を作製することができる。

次に、このようにして作製された立体構造体６１を複数準備し、管腔構造を形成するように、複数の立体構造体６１の端部６２同士を接触させた状態でさらに培養する。これにより、管腔構造を有する立体構造体を作製することができる。

上述したように、第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’においては、複数の針部３０の頂部３１が、当該細胞培養用冶具１’の積層方向に直交する一軸に沿って湾曲する湾曲面上に実質的に位置しているため、当該針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０を穿刺して培養処理を施すことで、管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の湾曲面を有する立体構造体６１を作製することができる。また、当該湾曲面を有する立体構造体６１を複数組み合わせてさらに培養することで、管腔構造を有する立体構造体を容易に作製することができる。そして、針部３０の頂部３１近傍に細胞塊６０が穿刺・保持されることで、当該細胞塊６１に対して新鮮な培養液を供給し続けることができ、培養処理中に細胞塊６０が壊死してしまうのを防止することができる。

さらに、第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１’は、金属材料のみにより構成され、樹脂材料のような有機物等を含まないため、培養の前処理として、オートクレーブ等により加熱殺菌処理を行った際に、当該有機物等により汚染されることがない。

以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。

上記第１及び第２の実施形態においては、針状物部材１０，１０’とスペーサ４０とが交互に積層されているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、針状物部材１０，１０’において、針部３０の厚さを基部２０，２０’よりも薄くし、スペーサ４０を介在させることなく針状物部材１０，１０’が積層されていてもよい。この場合において、針部３０と基部２０，２０’との厚さの差により、積層方向における隣接する針部３０のピッチＰ₁₂が規定される。そのため、針部３０及び基部２０，２０’のそれぞれの厚さは、針部３０に穿刺される細胞塊等の大きさ等に応じて適宜設定され得る。

上記第１及び第２の実施形態において、細胞培養用冶具１，１’は、針部３０のピッチＰ₁₁，Ｐ₁₂と略同一のピッチで形成された開口部を有し、当該開口部に各針部３０を挿入可能な金属板をさらに備えていてもよい。この金属板の開口部に各針部３０を挿入し、基部２０，２０’側に当該金属板を配置した状態で、各針部３０に細胞塊６０を穿刺して培養し、一軸に沿って湾曲する湾曲面を有する立体構造体６１を作製すれば、当該金属板を針部３０の頂部３１方向に移動させることで、作製された立体構造体６１を細胞培養用冶具１，１’から容易に取り外すことができる。

この場合において、上記金属板は、細胞培養用冶具１，１’を構成する金属材料よりも低い反射率を有する金属材料により構成されているのが好ましい。第１及び第２の実施形態に係る細胞培養用冶具１，１’の使用時に、針部３０の長手方向上方から光学的に針部３０の位置を確認し、各針部３０に細胞塊等を穿刺する場合、上記金属板が低反射率の金属材料により構成されていることで、針部３０の位置をより容易に確認することができる。なお、上記金属板を構成する金属材料の反射率にかかわらず、当該金属板の少なくとも一方の面にポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリカーボネート、フッ素樹脂等の樹脂層が形成されてなるものであってもよい。この樹脂層が形成されることで、上記反射率を調整することができるため、金属板を構成する金属材料の選択の幅を広げることができる。

以下、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等に何ら限定されるものではない。

〔実施例１〕細胞培養用冶具１の製造
原材料となる厚さ１５０μｍのステンレス製金属薄板１１を準備し、この金属薄板１１の両平面１１ａ，１１ｂに、それぞれ、厚さ３８μｍのネガ型フォトレジストフィルム１２を貼り付けた。

次に、フォトレジストフィルム１２の上に、露光用のパターンが形成されたパターンフィルム原版を配置し、露光・現像処理を行い、マスクパターン１３を形成した。なお、マスクパターン１３は、針部３０の長手方向が金属薄板１１の圧延方向Ｅに対して直角方向を向くように、かつ、針部３０の頂部３１に対応するマスクパターン１３の部分が湾曲線ＣＬ上に実質的に位置するように形成された。また、金属薄板の圧延方向に沿って並列する２６本の針部３０（ピッチ＝０．４ｍｍ）が形成されるように、マスクパターン１３を形成した。

次いで、エッチング液としての塩化鉄（II）溶液を用いて、エッチング処理を行った後、残余のマスクパターン１３を除去し、洗浄・乾燥することによって、図２に示す態様の針状物部材１０を作製した。

上記針状物部材１０を２６個作製し、針状物部材１０とスペーサ４０とを交互に積層し、貫通孔にネジ５０を挿入して固定して、図１に示す態様の細胞培養用冶具１を作製した。

〔試験例〕立体構造体の作製
線維芽細胞及び軟骨細胞を予め大量に培養しておき、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社製，製品名：PrimeSurface（登録商標）MS-9096U）の各ウェルに、上記線維芽細胞及び軟骨細胞をそれぞれ１２，５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、３７℃、５%ＣＯ₂の培養雰囲気下で２日間培養し、約２，７００個の細胞塊を形成した。

次に、実施例１にて作製した細胞培養用冶具１を４つ用意し、各細胞培養用冶具１の針部３０に上記細胞塊を１個ずつ（各細胞培養用冶具１において合計６７６個の細胞塊）穿刺して、細胞塊を湾曲シート状に配置した。湾曲シート状に配置された細胞塊を、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）を還流させながら７日間培養した。これにより、隣接する細胞塊同士が接着融合してなり、一軸方向に沿って湾曲する立体構造体を作製することができた。

そして、２つの細胞培養治具１の針部３０の頂部３１が相互に向かい合うように対向させて、各細胞培養用冶具１の針部３０に穿刺されている立体構造体の端部同士を接触させ、その状態で引き続き１週間培養することにより、立体構造体の端部同士を接着融合させることができた。最後に、細胞培養治具１を取り外すことにより、管腔構造を有する立体構造体を作製することができた。

本発明の細胞培養用冶具は、再生医療分野等において有用である。

１，１’…細胞培養用冶具
１０，１０’…針状物部材
２０，２０’…基部
３０…針部
３１…頂部

Claims (6)

1. 細胞を培養して管腔構造の立体構造体を作製するために用いられる細胞培養用冶具であって、
   前記細胞培養用冶具は、平板状の基部と、当該基部から一体的に突出してなる複数の針部とを有する、金属製の針状物部材を、その厚さ方向に複数積層してなり、
   前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部は、前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部から求められる、一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置していることを特徴とする細胞培養用冶具。
2. 前記各針状物部材をその厚さ方向に沿って見たときに、前記各針状物部材の前記複数の針部の頂部は、前記各針状物部材の前記複数の針部の頂部から求められる近似曲線上に実質的に位置していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用冶具。
3. 前記複数の針状物部材のそれぞれをその厚さ方向に沿って見たときに、各針状物部材の複数の針部は実質的に同一の長さを有しており、
   前記細胞培養用冶具は、前記針状物部材が積層される方向の両端に位置する当該針状物部材の前記針部の長手方向の長さが最も長く、前記積層方向の略中央に向かって、前記針部の長手方向の長さが漸減するように、複数の前記針状物部材が積層され、
   前記細胞培養用冶具の前記複数の針部の頂部は、前記複数の針部の頂部から求められる、前記針状物部材の積層方向に直交する方向の前記一軸に沿って湾曲する近似曲面上に実質的に位置することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用冶具。
4. 前記基部を下方に位置させ、前記針部の頂部を上方に位置させたときに、前記複数の針部の頂部が、凹状の前記湾曲面上に実質的に位置していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養用冶具。
5. 前記基部を下方に位置させ、前記針部の頂部を上方に位置させたときに、前記複数の針部の頂部が、凸状の前記湾曲面上に実質的に位置していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養用冶具。
6. 前記複数の針部により求められる近似曲面が、前記管腔構造の壁面の一部を構成する湾曲面と実質的に同一の曲率半径を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養用冶具。

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