JP2016141678A

JP2016141678A - ヒトｈｍｇｂ１結合剤、ヒトｈｍｇｂ１除去装置および新規ポリペプチド

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Publication number: JP2016141678A
Application number: JP2015021620A
Authority: JP
Inventors: 貫治堀; Kanji Hori; 真平山; Makoto Hirayama; 黒川　洋; Hiroshi Kurokawa; 黒川　　洋
Original assignee: Hiroshima University NUC; Asahi Kasei Medical Co Ltd
Current assignee: Hiroshima University NUC; Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2016-08-08
Anticipated expiration: 2035-02-05
Also published as: JP6624542B2

Abstract

【課題】ヒトＨＭＧＢ１に対する結合性に優れた、ヒトＨＭＧＢ１結合剤を提供する。
【解決手段】本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）；および／または、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）、を含有し、上記ポリペプチド（Ａ）は、所定のレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドである。
【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトＨＭＧＢ１結合剤、ヒトＨＭＧＢ１除去装置および新規ポリペプチドに関する。

サイトカインとは、種々の細胞間情報伝達分子となる微量生理活性タンパク質を言い、特に血液中のサイトカイン類は多様な生理活性を有していることが知られている。例えば、敗血症や全身性炎症反応症候群などの様々な疾患において、上記のサイトカインが患者の血液中に見出されることが知られている。

ＨＭＧＢ１（High Mobility Group Box 1)は、マクロファージ、単球、好中球、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、平滑筋細胞などの種々の細胞で発現しているサイトカインの一種であり、主として細胞の核内に蓄積されているが、一部は細胞質にも存在している。ＨＭＧＢ１は、炎症応答や感染に際して細胞外へ放出され、炎症応答を促進することが知られており、敗血症のメディエーターであることが証明されている（非特許文献１）。

その他にも、ＨＭＧＢ１は近年種々の疾患との関連性が注目されている。例えば、ＨＭＧＢ１が局所で慢性的に作用することにより、動脈硬化、関節リウマチ、腎炎等の局所性炎症性疾患の原因となることも示唆されている。

ところで、これまでに、海藻類または藍藻類から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。上記レクチンの一部は、高マンノース型糖鎖に特異的に結合することが知られている（非特許文献２〜１２）。

また、本発明者によって、トサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）由来のレクチン（ＭＰＬ）が、高マンノース型糖鎖に特異的に結合することも明らかにされている（特許文献１）。

特開２０１２‐２１３３８２号公報（２０１２年１１月８日公開）

Wang H. et al.: Science 285, 248-251, 1999. Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530,1997. O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003. Helle, F. et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006. Barrientos, L. G. et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003. Dey, B. et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000. O’Keefe, B. R. et al., J. Virol. 84, 2511-2521, 2010. Hori, K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007. Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007. Sato, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 291-296, 2011. 佐藤雄一郎、平山真、藤原佳史、森本金治郎、堀貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表) Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 286, 19446-19458, 2011.

上述のように、ＨＭＧＢ１は種々の炎症性疾患に関与しているため、例えばヒト全血などの検体中に存在するＨＭＧＢ１を簡便に除去することができれば、上述した炎症性疾患の治療に役立つことが期待される。

これまでに、例えばＥＬＩＳＡ法を用いて検体中のＨＭＧＢ１を定量する試薬等が既に開発されている。しかしながら、検体中のＨＭＧＢ１を除去可能な薬剤については知見が存在していないのが実情である。

本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトＨＭＧＢ１に対する結合性に優れ、検体中に存在するＨＭＧＢ１を簡便に除去することが可能なヒトＨＭＧＢ１結合剤を提供することにある。

ヒトＨＭＧＢ１の糖鎖構造については十分な知見がなく、ヒトＨＭＧＢ１がいかなる糖鎖をその表面に有しているかは不明であった。また、ポリペプチドとヒトＨＭＧＢ１との結合性についてもこれまで知見が存在していなかった。

一方、上述のように、海藻類または藍藻類由来のレクチン（藻類由来レクチン）の一部は、高マンノース型糖鎖に特異的に結合することが知られている。そこで、本発明者は、もし、ヒトＨＭＧＢ１が高マンノース型糖鎖を表面に備えているならば、高マンノース型糖鎖に特異的に結合する藻類由来レクチンを用いて、例えばヒト血中のＨＭＧＢ１を効率的に除去できるのではないかと着想するに至り、鋭意検討を行った。

その結果、本発明者は、高マンノース型糖鎖に結合性を有するポリペプチドがヒトＨＭＧＢ１に対し強い結合性を示すことを初めて見出した。のみならず、コア（α１‐６）フコースに特異的に結合性を示すポリペプチドもヒトＨＭＧＢ１に対し強い結合性を示すことをも初めて見出し、本発明を完成するに至った。

上記課題を解決するために、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）；および／または、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）、を含有し、上記ポリペプチド（Ａ）は、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドであることを特徴としている。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ａ）が、ＢＰＬ-１７、ＢＣＡおよびＯＡＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることがより好ましい。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ｂ）がＨｙｐｎｉｎＡ、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎ‐Ａ、ＡＯＬ、ＡＡＬおよびＬＣＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることが好ましい。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ｂ）がＨｙｐｎｉｎＡであることが好ましい。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１除去装置は、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤が固定されてなるヒトＨＭＧＢ１結合部を備えることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）；および／またはコア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）、を含有し、上記ポリペプチド（Ａ）は、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドである。

それゆえ、例えばヒト全血等の検体中に含有されるＨＭＧＢ１を効率的に除去することができるため、敗血症や全身性炎症反応症候群などの様々な疾患に対する治療効果を奏することができる。

ＳＰＲ法で得られた、ヒトＨＭＧＢ１と、実施例１で供試した藻類由来レクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図である。ＳＰＲ法で得られた、ヒトＨＭＧＢ１と、実施例１で供試した植物または菌類に由来するレクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図である。ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列を哺乳類間で比較した結果を示す図である。ＳＰＲ法で得られた、サイトカインと、実施例２で供試したレクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図である。ＢＣＡと、実施例３で供試した３種のサイトカイン（ｈＩＬ‐２、ｈＩＬ‐６、ｈＴＮＦ‐α）との相互作用（センサーグラム）を表す図である。ＨｙｐｎｉｎＡ‐１と、ｈＩＬ‐６との相互作用（センサーグラム）を表す図である。イーストマンナンによって、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との相互作用が阻害されることを示す図である。高マンノース型糖鎖の構造の一例を示す図である。

以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更、実施することができる。

なお、本明細書において、範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下であることを表す。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献は、本明細書中において参考として援用される。

〔１．ヒトＨＭＧＢ１結合剤〕
本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）；および／または、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）、を含有し、上記ポリペプチド（Ａ）は、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドである。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。

高マンノース型糖鎖とは、Ｎ型糖鎖に共通する「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕からなる共通母核構造に加え、分岐構造部分にα‐マンノース残基のみを含んでおり、〔Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕という七糖を共通の母核として含む糖鎖である。なお、上記トリマンノシルコアにおいて、アスパラギンと結合する糖鎖の末端、すなわちGlcNAc側の末端を還元末端、その反対側、すなわちMan側の末端を非還元末端という。

ここで、高マンノース型糖鎖の「糖鎖」とは、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖を意味する。オリゴ糖とは、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。

高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）としては、例えば、分岐オリゴマンノシドの認識部位と一次構造の違いとに基づいて下記の４つのタイプに分類されるレクチン（堀貫治、バイオサイエンスとインダストリー vol.71 No.2（2013）129-133）を挙げることができる。図８は、高マンノース型糖鎖の構造の一例を示す図である。図中、Ｄ１〜Ｄ３は、それぞれＤ１アーム〜Ｄ３アームを表す。

下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに属するレクチンとしては、海藻類または藍藻類から単離可能なレクチンである藻類由来レクチンを挙げることができる。なお、「レクチン」とは、分子内に糖結合ドメインをもつタンパク質で、抗体を除くものの総称である。
（ａ）タイプＩレクチン：高マンノース型糖鎖のＤ２アームの非還元末端にα（１‐３）マンノース残基を有するものと強く結合し、当該残基にα（１‐２）マンノースが付加したものでは結合力が著しく低下する。
（ｂ）タイプＩＩレクチン：Ｄ１アーム、Ｄ２アームまたはＤ３アームの非還元末端にα（１‐２）マンノース残基をもつものとのみ結合し、当該α（１‐２）マンノース残基数が多いものに対してより強く結合する。
（ｃ）タイプＩＩＩレクチン：分岐糖鎖部分の構造の違いを認識せず、全ての高マンノース型糖鎖に結合する。
（ｄ）タイプＩＶレクチン：Ｄ３アームの非還元末端にα（１‐２）マンノース残基を持つものとのみ結合する。

このうち、本発明では、上記ポリペプチド（Ａ）として、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドを用いる。

これは、後述する実施例に示すように、本発明によって、タイプＩＶのレクチンがヒトＨＭＧＢ１に結合せず、ヒトＨＭＧＢ１がＤ３アームの非還元末端にα（１‐２）マンノース残基を有していないことが強く示唆されたためであり、上記ポリペプチドがヒトＨＭＧＢ１に対する優れた結合性を示すことが明らかとなったためである。

タイプＩレクチンとしては、例えば淡水産藍藻Oscillatoria agardhii由来のＯＡＡ（UniProtKB/Swiss-Prot Accession No.: P84330；アミノ酸配列を配列番号６に示す）、Kappaphycus alvarezii由来のＫＡＡ（ＫＡＡ‐１（GenBank Accession No: LC007080；アミノ酸配列を配列番号７に示す）およびＫＡＡ‐２（GenBank Accession No: LC007081；アミノ酸配列を配列番号８に示す）、ＫＡＡ‐３）、海藻Kappaphycus striatum由来のＫＳＡ（ＫＳＡ‐１、ＫＳＡ‐２）、海藻トゲキリンサイ（Eucheuma serra）由来のＥＳＡ（ＥＳＡ‐１、ＥＳＡ‐２（GenBank Accession No.: P84331；アミノ酸配列を配列番号９に示す）、海藻アマクサキリンサイ（Eucheuma amakusaensis）由来のＥＡＡ（ＥＡＡ‐１、ＥＡＡ‐２、ＥＡＡ‐３）、海藻Eucheuma denticulatum由来のＥＤＡ（ＥＤＡ‐１、ＥＤＡ‐２（GenBank Accession No.: LC007085；アミノ酸配列を配列番号１０に示す）、ＥＤＡ‐３）、海藻ミリン（Solieria pacifica）由来のＳｏｌｎｉｎ（ＳｏｌｎｉｎＡ、ＳｏｌｎｉｎＢ、ＳｏｌｎｉｎＣ）、海藻トサカノリ（Meristotheca papulosa）由来のＭＰＡ（ＭＰＡ‐１（GenBank Accession No: LC008514；アミノ酸配列を配列番号１１に示す）、ＭＰＡ‐２（GenBank Accession No: LC008515；アミノ酸配列を配列番号１２に示す））、海藻シラモ（Gracilaria bursa-pastoris）由来のＧｒａｎｉｎ‐ＢＰ、海藻Agardhiella subulata由来のＡＳＬ（ＡＳＬ‐１（GenBank Accession No: LC007083；アミノ酸配列を配列番号１３に示す）およびＡＳＬ‐２（GenBank Accession No: LC007084；アミノ酸配列を配列番号１４に示す）、細菌Pseudomonas fluorescens由来のＰＦＬ（GenBank Accession No: ABA72252；アミノ酸配列を配列番号２９に示す）、細菌Myxococcus xanthus由来のＭＢＨＡ（GenBank Accession No: M13831；アミノ酸配列を配列番号３０に示す）、細菌Burkholderia oklahomensis由来のＢＯＡ（GenBank Accession No: AIO69853；アミノ酸配列を配列番号３１に示す）等を用いることができる。

また、本発明者は、タイプＩのレクチンのアミノ酸配列と共通する配列を有するtheoretical proteinsが、他生物種（細菌、藍藻）にも存在することをデータベース（GenBank）検索から見出しているが、上記theoretical proteinsを用いることもできる。上記theoretical proteinsとしては、例えば、Lyngbya sp. PCC 8106 (Accession No. ZP_01622218)の配列番号３９に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779(Accession No. YP_001544456) の配列番号４０に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、Stigmatella aurantiaca DW4/3-1(Accession No. ZP_01464390) の配列番号４１に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、等を挙げることができる。

タイプＩＩレクチンとしては、例えば海藻アオモグサ（Boodlea coacta）由来のＢＣＡ（GenBank Accession No: BAK23238；アミノ酸配列を配列番号１５に示す）等を用いることができる。

タイプＩＩＩレクチンとしては、例えば海藻ハネモ（Bryopsis plumosa）由来のＢＰＬ‐１７（GenBank Accession No: BAI43482；アミノ酸配列を配列番号１６に示す）、ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来のＢＣＬ‐１７（GenBank Accession No: LC008516；アミノ酸配列を配列番号１に示す）、海藻オオハネモ（Bryopsis maxima）由来のＢＭＬ‐１７（GenBank Accession No: BAI94585；アミノ酸配列を配列番号１７に示す）等を用いることができる。

上記ポリペプチド（Ａ）は、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドである。２種以上用いる場合の混合比は任意であってよい。また、２種以上用いる場合、同じタイプのレクチンを２種以上用いてもよいし、異種のレクチンを２種以上用いてもよい。

本発明によって、ヒトＨＭＧＢ１が高マンノース型糖鎖を分子中に含有していることが明らかとなったため、高マンノース型糖鎖に特異的に結合する上記ポリペプチド（Ａ）を利用することによって、ヒトＨＭＧＢ１結合剤のヒトＨＭＧＢ１への結合性を高めることができる。その結果、検体中のＨＭＧＢ１を効率よく除去することが可能となる。

上記ポリペプチド（Ａ）は、ＢＰＬ‐１７、ＢＣＡおよびＯＡＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることがより好ましい。当該レクチンは、ヒトＨＭＧＢ１と強く結合することが後述する実施例に示されている。２種以上用いる場合の混合比は任意であってよい。

一方、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンの高マンノース型糖鎖への結合様式は上記（ａ）〜（ｃ）に示したとおりであり、それぞれのタイプに属するポリペプチドは共通した結合様式を持つため、タイプＩレクチンはＯＡＡに、タイプＩＩレクチンはＢＣＡに、タイプＩＩＩレクチンはＢＰＬ‐１７に、それぞれ限られるものではない。

コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）としては、例えばカギイバラノリ（Hypnea japonica）由来のＨｙｐｎｉｎＡ（ＨｙｐｎｉｎＡ‐１（Accession No: JC5773；アミノ酸配列を配列番号１８に示す）、ＨｙｐｎｉｎＡ‐２（Accession No: JC5774；アミノ酸配列を配列番号１９に示す）、ＨｙｐｎｉｎＡ‐３（Accession No: P85888；アミノ酸配列を配列番号２０に示す））、海藻Hypnea cervicornis由来のＨｃ‐ｈｙｐｎｉｎ‐Ａ（Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐１（GenBank Accession No: LC013892；アミノ酸配列を配列番号３２に示す）、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐２、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐３）、レンズマメ（Lens culinaris）由来のＬＣＡ（GenBank Accession No: P02870；アミノ酸配列を配列番号２１に示す）、ヒイロチャワンダケ（Aleuria aurantia）由来のＡＡＬ（GenBank Accession No:P18891；アミノ酸配列を配列番号２２に示す）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）由来のＡＯＬ（GenBank Accession No: BAB88318；アミノ酸配列を配列番号２３に示す）、等を用いることができる。

本発明によって、ヒトＨＭＧＢ１がコア（α１‐６）フコースを分子中に含有していることが明らかとなったため、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）を利用することによって、ヒトＨＭＧＢ１結合剤のヒトＨＭＧＢ１への結合性を高めることができる。その結果、検体中のＨＭＧＢ１を効率よく除去することが可能となる。

上記ポリペプチド（Ｂ）は、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有していればよいため、上記例示したレクチンに限られるものではないが、ＨｙｐｎｉｎＡ、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎ‐Ａ、ＡＯＬ、ＡＡＬおよびＬＣＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることが好ましい。上記レクチンは、ヒトＨＭＧＢ１と強く結合することが後述する実施例に示されている。２種以上用いる場合の混合比は任意であってよい。

また、上記ポリペプチド（Ｂ）はＨｙｐｎｉｎＡであることが特に好ましい。ＨｙｐｎｉｎＡは、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチドの中でもコア（α１‐６）フコースに対する結合特異性が厳密である。それゆえ、ヒトＨＭＧＢ１結合剤にＨｙｐｎｉｎＡを含有させることによって、ヒトＨＭＧＢ１への結合特異性をより一層高めることができる。その結果、検体中のＨＭＧＢ１をより効率的に除去することが可能となる。

ＨｙｐｎｉｎＡとしては、上述したＨｙｐｎｉｎＡ‐１、ＨｙｐｎｉｎＡ‐２、ＨｙｐｎｉｎＡ‐３の何れを用いてもよく、ＨｙｐｎｉｎＡ‐１、ＨｙｐｎｉｎＡ‐２およびＨｙｐｎｉｎＡ‐３からなる群より選ばれる２種以上のＨｙｐｎｉｎＡを用いてもよい。２種以上用いる場合の混合比は任意であってよい。

ＡＯＬ、ＡＡＬおよびＬＣＡは、コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するが、コア（α１‐６）フコースに対する結合特異性はＨｙｐｎｉｎＡほど厳密ではない。すなわち、ＡＯＬおよびＡＡＬは、コア（α１‐６）フコースを強く認識するが、α１‐２、α１‐３、もしくはα１‐４結合したフコースも認識する（Matsumura,K.et al., J. Biol. Chem., 282,15700-15708,2000 、特開２００８‐２０９２６１号公報）。また、ＬＣＡは単糖類のマンノースおよびグルコースにも結合する。

このように、ＡＯＬ、ＡＡＬおよびＬＣＡのコア（α１‐６）フコースに対する結合特異性は、ＨｙｐｎｉｎＡよりも低いが、コア（α１‐６）フコースへの結合性は十分有しているため、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤の有効成分として用いることが可能である。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上述のように、上記ポリペプチド（Ａ）および／または、ポリペプチド（Ｂ）を含有する。つまり、上記ヒトＨＭＧＢ１結合剤は、有効成分として上記ポリペプチド（Ａ）または上記ポリペプチド（Ｂ）の一方のみを含有していてもよいし、上記ポリペプチド（Ａ）および上記ポリペプチド（Ｂ）の双方を含有していてもよい。双方を含有する場合の、上記ポリペプチド（Ａ）と上記ポリペプチド（Ｂ）との混合比は任意であってよい。

以上述べたように、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ａ）と、ヒトＨＭＧＢ１が有する高マンノース型糖鎖との結合、および／または、上記ポリペプチド（Ｂ）とヒトＨＭＧＢ１が有するコア（α１‐６）フコースとの結合を利用して、検体中に含有されるヒトＨＭＧＢ１を結合するものである。

ここで、ポリペプチドが糖鎖に対する結合性を有するか否か、つまり、ポリペプチドが糖鎖と結合するか否かは、例えば標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した抗体あるいは糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるポリペプチドを通し、当該カラムにポリペプチドが結合したか否かをその通過液に含まれるポリペプチドの量、または特異的溶出剤でカラムから溶出したポリペプチドの量により評価することができる。

また、標的となる糖鎖が結合した抗体をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したポリペプチドを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、37, 155, 1994 参照）、ドットブロット法（Analytical Biochemistry, 204(1), 198, 1992 参照）を用いて評価することができる。

また、標的となる糖鎖、または糖鎖が結合した抗体あるいは糖タンパク質等を固定化したチップと、試験対象であるポリペプチドとの親和性を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて測定すればよい。上記方法によれば、その親和性の有無のみならず、その強度まで測定できるために好ましい方法であるといえる。このとき得られる親和定数（Ｋ_A）が、１０（Ｍ^-1）以上、より好ましくは１０^３（Ｍ^-1）以上、最も好ましくは１０^４（Ｍ^-1）以上であればポリペプチドと糖鎖とが結合していると判断できる。

上記ポリペプチド（Ａ）および上記ポリペプチド（Ｂ）は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。上記例示した藻類由来レクチンは、従来公知の方法によって海藻類または藍藻類から単離することができる。また、これらのレクチンは、市販品を用いてもよい。

例えば、ＯＡＡは文献（Sato, Y. et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 125, 169-177,2000）に開示の方法；ＥＳＡ‐１およびＥＳＡ‐２は文献（Kawakubo, A. et al., J. Appl. Phycol. 9, 331-338,1997）に開示の方法；ＥＡＡ‐１、ＥＡＡ‐２およびＥＡＡ‐３は文献（Kawakubo, A. et al., J. Appl. Phycol. 11, 149-156,1999）に開示の方法；ＥＤＡ‐１、ＥＤＡ‐２およびＥＤＡ‐３は文献（Hung,L.D. et al., J. Appl. Phycol. in press（DOI 10.1007/s10811-014-0441-0））に開示の方法；ＫＡＡ‐１、ＫＡＡ‐２およびＫＡＡ‐３は文献（Hung, L.D. et al., Fish. Sci. 75, 723-730,2009）に開示の方法；ＫＳＡ‐１およびＫＳＡ‐２は文献（Hung, L.D. et al., Phytochemistry 72, 855-861,2011）に開示の方法；ＳｏｌｎｉｎＡ、ＳｏｌｎｉｎＢおよびＳｏｌｎｉｎＣは文献（Hori, K. et al., Phytochemistry 27, 2063-2067,1988）に開示の方法；Ｇｒａｎｉｎ‐ＢＰは文献（Okamoto, T. et al., Experientia. 46, 975-977,1990）に開示の方法；ＭＢＨＡは文献（Cumsky, M. G., Zusman, D. R., J. Biol. Chem. 256, 12581-12588, 1981）に開示の方法、によってそれぞれ単離することができる。

また、ＢＯＡは文献（Whitley, M. J. et al., FEBS J. 280, 2056-2067, 2013）に開示の方法、ＰＦＬは文献（Sato, Y. et al., PLoS One 7, e45922, 2012）に開示の方法によって大腸菌発現系を用いてそれぞれ単離することができる。

ＭＰＡ‐１およびＭＰＡ‐２は、海藻Meristotheca papulosa生藻体を液体窒素下で粉末とした後、０．８５％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で抽出操作し、その後、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィーに順次供することで単離することができる。

ＡＳＬ‐１およびＡＳＬ‐２は、海藻Agardhiella subulata生藻体を液体窒素下で粉末とした後、０．８５％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で抽出操作し、その後、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過に順次供することによって単離することができる。

ＢＣＡは文献（Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 286, 19446-19458,2011）に開示の方法で単離することができる。ＢＭＬ‐１７は特許第４８７６２５８号公報に開示の方法、ＢＰＬ‐１７およびＢＣＬ‐１７は、それぞれ海藻Bryopsis plumosaおよびBryopsis corticulans生藻体から、上記公報に開示されるＢＭＬ‐１７の単離方法と同様の手法によって単離することができる。

また、ＨｙｐｎｉｎＡ‐１、ＨｙｐｎｉｎＡ‐２およびＨｙｐｎｉｎＡ‐３は文献（Hori,K. et al., Biochim. Biophys.Acta 1474, 226-236,2000）に開示の方法によって単離することができ、ＬＣＡ、ＡＡＬ、ＡＯＬは、それぞれ文献（Toyoshima, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 221, 514-521,1970）、文献（Kochibe, N. and Furukawa, K. Biochemistry 19, 2841-2846,1980）、文献（Ishida, H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1002-1008,2002）に開示の方法によって単離することができる。

Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐１は、Hypnea cervicornisからｃＤＮＡをクローニングしたものである。以下に実際に行ったクローニングの方法を説明する。まず、RNA later中で−２０℃保存したHypnea cervicornis藻体よりPlant RNA Reagent（Life Technologies）を用いて全ＲＮＡを抽出後、NucleoTrap mRNA（タカラバイオ）によりｍＲＮＡを精製し、さらにGeneRacer Kit（Life Technologies）により完全長ｃＤＮＡを調製した。

次に、配列既知で相同性を有するレクチン５種（カギイバラノリHypnea japonica由来ＨｙｐｎｉｎＡ‐１、ＨｙｐｎｉｎＡ‐２およびＨｙｐｎｉｎＡ‐３、Bryothamnion triquetrum由来ＢＴＬ、およびBryothamnion seaforthii由来ＢＳＬ）の相同アミノ酸領域を参考にプライマーHypnin_like_d_R1（配列番号３３）およびHypnin_like_d_R2（配列番号３４）を設計し、上記Hypnea cervicornis由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ（Rapid amplification of cDNA ends）法に供した。

ＰＣＲ反応溶液は、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒを８．０μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ（２．５ｍＭｅａｃｈ）を８μｌ、GeneRacer 5’ Primer（１０μＭ、配列番号３６）を４．８μｌ、Hypnin_like_d_R1（１００μＭ）を４μｌ、Hypnea cervicornis由来ｃＤＮＡ溶液を１．６μｌ、Blend Taq（２．５Ｕ／μｌ）を０．８μｌおよび滅菌水を加えて反応液を８０μｌとし十分に混合した後、１０μｌずつ８本のチューブに分注してＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応はT Gradient 96 Thermocycler（Biometra）を用いて、９４℃で３分間の熱変性の後、熱変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２または６４℃（各チューブにつき異なる温度を設定）で３０秒間および伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３５回行った。最後に７２℃で５分間保持し、反応を終了した。

続いて、アニーリング温度５０〜６４℃で行ったＰＣＲ産物をプールし、その一部を滅菌水で１００倍希釈して鋳型とし、プライマー対としてHypnin_like_d_R2（１００μＭ）４μｌおよびGeneRacer 5’Nested_Primer（１０μＭ、配列番号３７）を１．６μｌ用いてnested PCRを行った。なお、ＰＣＲ反応はアニーリングを５０℃または５２℃とし、上記と同様に行う。得られたＰＣＲ産物はプールし、pGEM-T Easyベクターにサブクローニング後、塩基配列の決定に供した。

その結果、ＨｙｐｎｉｎＡと配列相同性を示すＤＮＡ断片が得られ、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐１と名付けた。さらに同遺伝子の３’末端側配列を確認するため、決定した塩基配列を参考にプライマーHcHypninA_F（配列番号３５）を設計し、これを用いて３’ＲＡＣＥに供した。すなわち、１０倍希釈Hypnea cervicornis由来ｃＤＮA溶液を鋳型として、HcHypninA_F及びGeneRacer 3’Primer（配列番号３８）のプライマーペアにBlend Taq DNAポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＡ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐１の３’末端塩基配列を決定した。５’ＲＡＣＥにより得られた配列を合わせて、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎＡ‐１の全長塩基配列を明らかにした。

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質としては、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５１３１‐５１３５,１９８５）。この「ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＭｕｌｔｉｐｌｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

上記ポリペプチド（Ａ）、上記ポリペプチド（Ｂ）は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、上記ポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、上記ポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

上記ポリペプチド（Ａ）、上記ポリペプチド（Ｂ）としては、例えば上述した配列番号に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができるが、上記アミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドを用いてもよい。また、上記アミノ酸配列および上記任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。

また、上述した配列番号に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体を用いることも可能である。変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または挿入を有する。好ましくは、サイレント置換、挿入、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明にかかるポリペプチド活性を変化させない。

代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。

上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「ＤｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅＭｅｓｓａｇｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７,１３０６‐１３１０, １９９０（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

上記ポリペプチド（Ａ）または上記ポリペプチド（Ｂ）の変異体としては、上述した配列番号に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであることが好ましい。

上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。

上記ポリペプチド（Ａ）および上記ポリペプチド（Ｂ）は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ａ）の高マンノース型糖鎖への結合、および／または上記ポリペプチド（Ｂ）のコア（α１‐６）フコースへの結合を妨げない限り、上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）以外の他の成分を含んでいてもよい。

例えば上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）と他の成分とを製剤化する場合の、当該他の成分としては、水、生理食塩液、デキストロースおよびグリセロールの水溶液などの担体；デンプン、グルコース、ラクトースなどの賦形剤、等を用いることができる。製剤化は従来公知の方法によって適宜行うことができる。

上記ヒトＨＭＧＢ１結合剤は、例えばヒト全血等の検体とバッチ式で混合することによっても、検体中に含有されるヒトＨＭＧＢ１を結合し、検体中から除去することが可能であるが、担体に固定化して用いる方が、より効率的にヒトＨＭＧＢ１を結合することができる。そこで次に、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤を固定化したヒトＨＭＧＢ１除去装置について説明する。

〔２．ヒトＨＭＧＢ１除去装置〕
本発明に係るヒトＨＭＧＢ１除去装置は、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤が固定されてなるヒトＨＭＧＢ１結合部を備える。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）を含有するため、上記検体中にヒトＨＭＧＢ１が含有されている場合、当該検体と接触させることによって、上記ヒトＨＭＧＢ１を結合し、検体から除去することができる。そのため、上記ヒトＨＭＧＢ１除去装置を用いることによって、検体中に含まれるヒトＨＭＧＢ１を効率的に除去することができる。その結果、ＨＭＧＢ１が関与する疾患、例えば敗血症、全身性炎症反応症候群などの治療に役立てることができると考えられる。

ヒトＨＭＧＢ１結合剤としては、既に説明したものを使用することができる。検体としては、上記ポリペプチドが凝集させるものではなく、かつ、上記ポリペプチドに接触させることができるものであれば、特に限定されない。例えば、ヒトの全血、血漿、血清、唾液、鼻粘膜、尿、その他の体液等を挙げることができる。これらはそれ自体を検体として用いてもよいし、例えばＭＥＭ培地や生理食塩水等に添加して調製した液体として用いることもできる。

ヒトＨＭＧＢ１結合部は、ヒトＨＭＧＢ１結合剤を固定する担体を備える。当該担体としては、例えば、各種のビーズ、織布、不織布、中空糸のフィルター、モノリスゲル等を用いることができる。

上記ヒトＨＭＧＢ１結合剤を上記フィルターに固定化する方法としては、例えば、基材表面を改質して官能基を導入し、当該官能基に固定化する方法、疎水結合により結合させる方法、基材表面に荷電を持たせて、静電的に固定化する方法を用いることができる。また、上記フィルターに固定化された上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）の量は、例えば、固定化を行う前の、上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）（リガンド）溶液のリガンド濃度と、固定化後の上記溶液のリガンド濃度とを測定し比較することによって求めることができる。

モノリスゲルとは、モノリス材料（モノリス型ポリマー）でできたゲルをいう。モノリス材料は、単一の連続的な構造体から構成され、その構造を貫通する連続的な流路となる孔を有する。モノリスゲルは、水溶液ゾルを作製するゾル化ステップ、得られたゾルを加温してゲルにするゲル化ステップ、得られたゲルを焼成する焼成ステップにより製造することができる（例えば特公平０８‐０２９９５２号公報、特開平０７‐０４１３７４号公報）。モノリスゲルとしては、例えば、アクリルアミド系、メタクリル酸エステル系、スチレン-ジビニルベンゼン系などの有機系モノリス、シリカモノリス等を用いることができる。

ヒトＨＭＧＢ１結合剤をモノリスゲルに固定化する方法としては、例えば、特開２０００‐１１９３００号公報に開示の方法を用いることができる。ヒトＨＭＧＢ１結合剤が含有する上記ポリペプチド（Ａ）および／または上記ポリペプチド（Ｂ）の固定化量は、上記方法によりモノリスゲルへの固定化反応を行った場合に、反応前後の反応溶液中の上記ポリペプチドの濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定結果に基づき、反応で消費された上記ポリペプチドの量を求め、この量を固定化量とすることによって確認することができる。

ヒトＨＭＧＢ１結合剤を固定化したモノリスゲルは、例えばスピンカラム、液体クロマトグラフィー用のステンレスカラム等に充填して用いることが好ましい。

ヒトＨＭＧＢ１結合部に固定化されたヒトＨＭＧＢ１結合剤は、上記フィルターやカラムに検体を通過させることによって、検体と接触し、検体中にヒトＨＭＧＢ１が含有されていればこれを選択的に結合し、除去することができる。

例えば、患者の全血を採取して、ペリスタポンプ等を用いて上記ヒトＨＭＧＢ１結合部に導入する。そして、上記全血を固定化されたヒトＨＭＧＢ１結合剤に接触させることによって、全血中のヒトＨＭＧＢ１を除去し、除去後の全血を再び患者の体内に戻すという体外循環の工程によって、患者の全血中に含まれているヒトＨＭＧＢ１を除去することができる。

検体中のヒトＨＭＧＢ１の、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤への結合は、ヒトＨＭＧＢ１結合剤と接触させる前後の検体中のヒトＨＭＧＢ１を、例えばＥＬＩＳＡ等の方法によって定量することにより、確認することができる。

上記ヒトＨＭＧＢ１除去装置は、上記ヒトＨＭＧＢ１結合部以外に、例えば上記ペリスタポンプのような検体を送液することが可能な装置、上記ＥＬＩＳＡを行うためのマイクロプレートリーダーなどをさらに備えることができる。

〔３．本発明に係るポリペプチド〕
（１）ポリペプチド
本発明に係るポリペプチドは、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる。

上記ポリペプチドは、上述したポリペプチド（Ａ）に該当し、タイプＩＩＩレクチンであるＢＣＬ‐１７に該当する。ＢＣＬ‐１７の配列情報はこれまで明らかにされておらず、本発明によって初めて明らかにされるものである。本発明に係る上記ポリペプチドは、上記ポリペプチド（Ａ）として、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤の有効成分として用いることができる。

配列番号１は、ＢＣＬ‐１７の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列である。配列番号３は、ＢＣＬ‐１７のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号４は、当該塩基配列中に含まれるオープンリーディングフレームの配列である。配列番号５は、配列番号４に示すポリヌクレオチドによってコードされる、ＢＣＬ‐１７の未成熟なポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

上述したように、上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。

また、本発明にかかるポリペプチドは、後述する本発明にかかるポリヌクレオチド（本発明にかかるポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。単離の方法は、上述したように、特許第４８７６２５８号公報に開示のＢＭＬ‐１７の単離方法と同様の方法を用いることができる。また、本発明にかかるポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。

他の実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明にかかるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。

本実施形態にかかるポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）がＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ‐ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６,８２１‐８２４,（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。

（２）ポリヌクレオチド
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記（１）で述べた本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）が挙げられる。

本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。

あるいは、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行ない、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、所望のポリヌクレオチドを含む生物材料であることが好ましい。特に、本発明にかかるポリペプチドの起源であるBryopsis corticulansが好ましい。ただし、これに限定されるものではない。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、実施例に従って本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されて解釈されるものではない。

〔実施例１：ポリペプチドとヒトＨＭＧＢ１との相互作用の解析〕
（１）供試リガンドおよびアナライト
本実施例では、アナライトとして、高マンノース型糖鎖特異的タイプＩレクチンであるｒＯＡＡのアミノ酸配列（配列番号２４）の３’末端にヒスチジンタグを付加したＨｉｓ‐ｒＯＡＡ（His-tagged recombinant Oscillatoria agardhii、配列番号２５）；高マンノース型糖鎖特異的タイプＩＩレクチンであるＢＣＡ（Boodlea coacta agglutinin、配列番号１５）；高マンノース型糖鎖特異的タイプＩＩＩレクチンであるｒＢＰＬ‐１７のアミノ酸配列（配列番号２６）の３’末端にヒスチジンタグを付加したＨｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７（His-tagged recombinant Bryopsis plumosa 17 kDa lectin、配列番号２７）；高マンノース型糖鎖特異的タイプＩＶレクチンであるＭＰＬ‐１（Meristotheca papulosa lectin 1、配列番号２８）；コア（α１‐６）フコース特異的レクチンであるＨｙｐｎｉｎＡ‐１（Hypnea japonica lectin A-1、配列番号１８）を用いた。なお、上記ヒスチジンタグとしては、ヒスチジン６残基からなるタグを用いた。

上記Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡは、以下の方法によって調製した。まず、Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ発現株ｐＥＴ２８ａ‐ＯＡＡ／ＢＬ２１（ＤＥ３）を２００ｍｌのＬＢ/Ｋａｎ^＋液体培地に加え、３７℃で対数増殖中期まで振とう培養した。

培養液のＯＤ_６００が０．５に達したところで、終濃度が０．５ｍＭとなるようにisopropyl-D-1-thiogalactopyranoside（ＩＰＴＧ）を添加し、３７℃で４時間振とう培養した。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、５分、４℃）して集菌し、１０ｍｌの超音波破砕用緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ‐５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁して超音波破砕した。これを再び遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分、４℃）し、上清を可溶性画分として回収した。

上記可溶性画分をニッケルキレートカラム（Ｖｔ＝１ｍｌ, His GraviTrap, ＧＥヘルスケア）を用いるアフィニティーカラムに供し、Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡを精製した。すなわち、上記可溶性画分１５ｍｌを１０ｍｌの５ｍＭイミダゾール-５００ｍＭＮａＣｌ‐２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化後したニッケルキレートカラム（１ｍｌ容）に添加した。このカラムを１０ｍｌの同緩衝液で十分に洗浄後、３ｍｌの１５０ｍＭイミダゾール‐５００ｍＭＮａＣｌ‐２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。溶出は自然落下により行い、溶出液は０．５ｍｌずつ分取し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。１５０ｍＭイミダゾール含有緩衝液で溶出した画分を合一し、１００ｍＭＮａＣｌ‐５０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対し十分に透析し、内液を得てＨｉｓ‐ｒＯＡＡ精製標品とした。

また、上記Ｈｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７は、以下の方法によって調製した。まず、Ｈｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７発現株ｐＥＴ２８ａ‐ＢＰＬ１７／ＢＬ２１（ＤＥ３）を２５０ｍｌのＬＢ／Ｋａｎ^＋液体培地に１／２０容加え、３７℃で対数増殖期中期まで振とう培養した。

ＯＤ_６００が０．５に達したところで、終濃度が１．０ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間振とう培養した。培養後、遠心分離（６，０００×ｇ、４℃、１０分）により集菌し、培養液に対して１／２０容の超音波破砕用緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ）に懸濁し、超音波処理を行った。

その後、トリトンＸ‐１００を最終濃度４％となるように加え、これを遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、１０分）し、残渣を不溶性画分として回収した。不溶性画分につき封入体洗浄液（４％トリトンＸ‐１００、１ｍＭＥＤＴＡ）を８ｍｌ加えて懸濁し、遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、１０分）して洗浄した。この洗浄操作を繰り返した後、得られた沈殿に封入体可溶化緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭＤＴＴ）を加えて、４℃で攪拌しながら一晩可溶化して封入体を可溶化させた。これを遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、３０分）し、上清を回収して封入体可溶化画分とした。

次に、調製した封入体可溶化画分を用いて、ニッケルキレートカラムHis GraviTrap（ＧＥヘルスケア）を使用して精製した。すなわち、カラムを１０ｍｌの平衡化緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）で十分平衡化した後、封入体可溶化画分を添加した。非吸着画分につき繰り返し添加し、カラム担体と可溶化画分中のＨｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７を結合させた。

カラムを１０ｍｌの平衡化緩衝液で十分に洗浄後、６ｍｌの溶出用緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール）を添加して自然落下により組換え体を溶出した。溶出時は０．５ｍｌずつ分取し、Ａ２８０ｎｍの吸光度を測定した。Ａ２８０ｎｍのピーク画分を回収し、これを４Ｍおよび２Ｍのグアニジン塩酸塩を含む透析用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭアルギニン塩酸塩）に対して段階的にそれぞれ十分透析した。

ニッケルキレートカラムを用いて調製したＨｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７画分を、終濃度１００‐２００μｇ／ｍｌとなるようにリフォールディング液（５００ｍＭＬ‐アルギニン塩酸塩、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化型グルタチオン、５００ｍＭグアニジン塩酸塩、２５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％ポリエチレングリコールＭＷ３３５０、２０ｍＭＭａｎ）に加え、４℃下で静置した。

経日的に赤血球凝集活性を確認し、３日目に５０％飽和となるように固形硫安を加え、Ｈｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７を沈殿画分に回収した。この沈殿を緩衝液（３００ｍＭアルギニン塩酸塩、５０ｍＭトリス（pH 8.0）、１００ｍＭＮａＣｌ）に懸濁し、上記緩衝液に対して十分に透析した。この透析内液を遠心分離（１１，０００×ｇ、４℃、３０分）後、得られた上清を回収し、Ｈｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７精製標品として得た。

上記ＯＡＡは藍藻Oschllatoria agardhii由来、ＢＣＡはアオモグサ由来、ＢＰＬ‐１７はハネモ由来、ＭＰＬ‐１はトサカノリ由来、ＨｙｐｎｉｎＡ-１はカギイバラノリ由来である。

上述したアナライトは藻類レクチンであるが、植物または菌類に由来するレクチンとして、フコース含有糖鎖結合性レクチンである、レンズマメ由来レクチン（Lens culinaris agglutinin （ＬＣＡ）（Ｊオイルミルズ社, Cat. J107））、ヒイロチャワンダケ由来レクチン（Aleuria aurantia lectin（ＡＡＬ）（Ｊオイルミルズ社, Cat. L0169））、コウジカビ由来レクチン（Aspergillus oryzae lectin（ＡＯＬ）（東京化成工業, Cat. J107））を用いた。

また、Ｏ結合型糖鎖／糖脂質糖鎖結合性レクチンである、ピーナッツ由来レクチン（Arachis hypogaea (peanut) agglutinin（ＰＮＡ）（Ｊオイルミルズ社, Cat. J114））をネガティブコントロールとして用いた。そして、ポジティブコントロールとして、高マンノース型糖鎖結合性レクチンである、タチナタマメ由来のCanavalia ensiformis lectin （ＣｏｎＡ）（Ｊオイルミルズ社, Cat. J103）を用いた。

（２）ポリペプチドとヒトＨＭＧＢ１との相互作用の解析
ヒトＨＭＧＢ１と上記レクチン（ポリペプチド）との相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（GE Healthcare社製）を用いる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）法により定量解析した。

リガンドとしてヒトＨＭＧＢ１をＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化し、アナライトとして種々の濃度（３．９１ｎＭ〜１６μＭ）のレクチン溶液を用い、マニュアルに従って測定・解析した。リガンドの固定化はアミンカップリング法を用い、マニュアルに従って行った。

なお、ヒトＨＭＧＢ１の固定化量は、おおよそ1000 resonance unit（ＲＵ）になるよう、マニュアルインジェクション法によって調整した。なお、リガンドのポジティブコントロールとして、ＰＮＡ以外の供試レクチンすべてが結合することが判明しているウシチログロブリン（ＢＴＧ）を用い、リガンドと同様にＣＭ５センサーチップ上に固定化した。

ＳＰＲ法では、生体分子を標識することなく、生体分子間の特異的な相互作用を微量かつ短時間で定量的に測定することができる。ＳＰＲ法では、リガンドをセンサーチップ表面上に固定化し、これに作用する物質（アナライト）を含む溶液を添加すると、分子の結合・解離によって生ずる微量の質量変化がＳＰＲシグナルの変化として検出される。

質量変化はresonance unit（ＲＵ）で表され、１０００ＲＵは共鳴による反射角度０．１°の変化に相当し、アナライトがセンサーチップ上のリガンドに１ｎｇ／ｍｍ^２結合したことを意味する。センサーチップ表面の金薄膜上にはデキストランがコーティングされており、主としてこのデキストラン内に導入されたカルボキシル基を介してリガンドを固定化する。

分析プログラムの作成には、マニュアルに従って“Customized Application”を用い、ＣＭ５センサーチップ内の４つのフローセルのうち、何も固定化していないフローセルをコントロールとして、リガンドを固定化したフローセルからの差し引き機能を使用した。

本分析プログラム下で、アナライト（レクチン）溶液をそれぞれＣＭ５センサーチップ上に流速３０μＬ／ｍｉｎで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。すなわち、アナライト添加開始から添加終了（３分間）までのＲＵの増加量を結合量、アナライト添加終了後のバッファー添加開始から３分間のＲＵ減少量を解離量とした。

各種濃度下で得られたセンサーグラムを基に, BIAevaluation version 4.1を用いて解析を行い、得られたセンサーグラムについて、結合相と解離相を同時にカーブフィッティングさせ、各定数（結合速度定数ｋ_ａ、解離速度定数ｋ_ｄ、親和定数Ｋ_Ａ、解離定数Ｋ_Ｄ）を算出した。

（３）実験結果
図１は、ＳＰＲ法で得られた、ヒトＨＭＧＢ１と上記藻類由来レクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図であり、図２は、ＳＰＲ法で得られた、ヒトＨＭＧＢ１と、上記植物または菌類に由来するレクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図である。横軸はアナライト添加開始からの時間（秒）を表し、縦軸はアナライトの結合量（上記ＲＵの増加量）を表す。

また、これらから得られるカイネティクス解析結果を表１にまとめた。なお、供試レクチンについては、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００に供する前に、赤血球凝集能（レクチン活性）があることを確認した。表中、「−」は"not determined" を意味する。

図１に示すように、ヒトＨＭＧＢ１と藻類レクチン５種との相互作用を調べたところ、ＭＰＬ‐１（図１の（ｄ））を除き、藻類レクチンの供試濃度に依存してヒトＨＭＧＢ１への結合量が増大したことから、ＭＰＬ‐１以外の上記レクチンとヒトＨＭＧＢ１とが結合性を有することが示された。

高マンノース型糖鎖特異的レクチンであるＨｉｓ‐ｒＯＡＡ、ＢＣＡおよびＨｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７がヒトＨＭＧＢ１と結合し、他方、コア（α１‐６）フコースに厳密な結合特異性をもつＨｙｐｎｉｎＡ-１も比較的強くヒトＨＭＧＢ１と結合することを考え合わせると、ヒトＨＭＧＢ１は高マンノース型糖鎖とコア（α1‐６）フコース含有複合型糖鎖との両タイプを有することが強く示唆される。このことは、従来知られていなかった知見である。

これについては、図２に示すように、フコース含有糖鎖結合性のＡＡＬ及びＡＯＬ、ならびにフコース含有糖鎖のうちコア（α１‐６）フコース含有糖鎖と強く結合するＬＣＡ、対照として用いた高マンノース型糖鎖結合性のＣｏｎＡがいずれもヒトＨＭＧＢ１と結合することからも支持される。

図３は、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列を哺乳類間で比較した結果を示す図である。図３において、枠で囲み、アスタリスクを付したＮＦＳはＮ結合型糖鎖付加サイトである。また、太字で示したアミノ酸残基は、ヒトＨＭＧＢ１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を示す。図３に示すヒト、ウシ、ブタ、チンパンジーのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列を配列番号４２〜４５にそれぞれ示す。

図３に示すように、ヒトＨＭＧＢ１は分子内に１カ所のＮ結合型糖鎖付加サイトを含むことから、使用したヒトＨＭＧＢ１は高マンノース型糖鎖を有する分子種とコア（α１‐６）フコース含有複合型糖鎖を有する分子種との混合物である可能性が高い。なお、コア（α１‐６）フコースは複合型糖鎖のみに付加することが知られており、高マンノース型糖鎖に付加したものの報告例はない。

ヒトＨＭＧＢ１のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ像（図示せず）には、複数（主に２本）のタンパク質性バンドが認められる。本実施例の結果から、この２つの成分は糖構造の違いに由来している可能性が強く示唆される。

また、ヒトＨＭＧＢ１に付加されている高マンノース型糖鎖構造について、Ｄ３アームの非還元末端にα１‐２マンノース残基を含む糖鎖構造を極めて厳密に認識するＭＰＬ‐１がヒトＨＭＧＢ１に結合しなかった（図１の（ｄ））。この結果から、ヒトＨＭＧＢ１は、上記糖鎖構造を有していないことが強く示唆される。

一方、Ｄ２アームの非還元末端にα１‐３マンノース残基が露出した糖鎖構造と強く結合するＯＡＡ（Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ）がヒトＨＭＧＢ１と結合性を示すことから（図１の（ａ））、Ｄ２アームのα１‐２マンノース残基も付加されていない可能性が考えられる。

他方、非還元末端にα１‐２マンノース残基を有する糖鎖構造のみを認識するＢＣＡがヒトＨＭＧＢ１と結合することから（図１の（ｂ））、Ｄ１アームの非還元末端にα１‐２マンノース残基を含むと予想される。

ヒトＨＭＧＢ１に付加する高マンノース型糖鎖種は、α１‐２マンノース残基の付加位置の異なる混合物から成る可能性も考えられるが、少なくとも、すべての高マンノース型糖鎖種においてＤ３アームにはα１‐２マンノース残基が付加されていないものと考えられる。

一方、Ｏ結合型糖鎖結合性のＰＮＡはヒトＨＭＧＢ１とほとんど結合しなかったことから（図２に示すＰＮＡのヒトＨＭＧＢ１に対するＲＵの増加は、Ｏ結合型糖鎖を持たないＢＴＧに対するものと同等であった）、ヒトＨＭＧＢ１はＮ結合型糖鎖のみを有するものと示唆された。

カイネティクス解析により算出されたヒトＨＭＧＢ１と各レクチン間との結合定数について、藻類レクチンと、植物または菌類由来レクチンとを比較してみると、強い結合が見られるものから順に、ＡＯＬ（３．７７×１０^８）、Ｈｉｓ‐ｒＢＰＬ‐１７（１．０４×１０^８）、ＣｏｎＡ（６．９４×１０^７）、ＨｙｐｎｉｎＡ‐１（４．３８×１０^７）、ＢＣＡ（１．０８×１０^７）、Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ（７．５８×１０^６）、ＬＣＡ（６．１５×１０^６）、ＡＡＬ（１．３１×１０^６）であった。括弧内の数字は親和定数である。

このように、藻類レクチンは厳密な糖鎖結合特異性を示すものの、これらに比べて特異性が低い植物または菌類由来レクチンに劣らず比較的強い結合定数を示したことから、藻類レクチンは、ヒトＨＭＧＢ１結合剤として、ヒトＨＭＧＢ１を特異的に捕捉するために用いうることが明らかとなった。なお、ＡＯＬ、ＡＡＬ、ＬＣＡについても、上記結果に示されているようにヒトＨＭＧＢ１との結合性を有するため、本発明の範囲に含まれる。

〔実施例２：本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤のサイトカインへの結合〕
以上説明したように、上記ポリペプチド（Ａ）および上記ポリペプチド（Ｂ）がヒトＨＭＧＢ１に結合することが本発明によって初めて明らかとなった。一方、各種のサイトカインは糖鎖を有することが明らかにされているが、その糖鎖構造は明らかでないものが多い。

そこで、本実施例では、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤の、ヒトＨＭＧＢ１以外のサイトカインへの結合性について検討した。

（１）供試リガンドおよびアナライト
サイトカイン（リガンド）としては、tumor necrosis factor-α（ＴＮＦ‐α、HumanZyme, Chicago, USA）、インターロイキン（以下「ＩＬ」と略記）‐２（recombinant human IL-2, HumanZyme, Chicago, USA）およびＩＬ‐６（recombinant human IL-6, HumanZyme, Chicago, USA）を購入し、供試するまで凍結保存した。

アナライトとしては、実施例１で用いたＨｉｓ-ｒＯＡＡ（配列番号２５）、ＢＣＡ（配列番号１５）、ＭＰＬ‐１（GenBank Accession No: LC007082、配列番号２８、配列番号２８に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端はピログルタミン酸である）およびＨｙｐｎｉｎＡ‐１（配列番号１８）の他に、ｒＯＡＡ（recombinant Oscillatoria agardhii、配列番号２４）、ＫＡＡ‐１（配列番号７）、ＢＣＬ‐１７（配列番号１）、高マンノース型糖鎖および複合型糖鎖に結合するレクチンであるCarpopeltis prolifera 由来のＣａｒｎｉｎ（Hori, K. et al., Phytochemistry 26,1335-1338, 1987）を用い、対照として実施例１で用いたＣｏｎＡを供試した。なお、Ｃａｒｎｉｎの調製は上記文献に記載の方法で行った。

（２）ポリペプチドとサイトカインとの相互作用の定性的解析
上記サイトカインと上記レクチン（ポリペプチド）との相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（GE Healthcare社製）を用いる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）法により定量解析した。

リガンドとして上記サイトカインをＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化し、２５０ｎＭのレクチン溶液をアナライトとして用い、マニュアルに従って測定・解析した。リガンドの固定化はアミンカップリング法を用い、マニュアルに従って行った。

なお、サイトカインの固定化量は、1000〜3500 resonance unit（ＲＵ）の範囲になるよう、マニュアルインジェクション法によって調整した。すなわち、ＴＮＦ‐αは３５００ＲＵ、ＩＬ‐２は２０００ＲＵ、ＩＬ‐６は１０００ＲＵに調整した。リガンドのポジティブコントロールとして、実施例１と同様にブタチログロブリン（ＰＴＧ）を用い、リガンドと同様にＣＭ５センサーチップ上に固定化した。

上記分析プログラム下で、アナライト（レクチン）溶液をそれぞれＣＭ５センサーチップ上に流速３０μＬ／ｍｉｎで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。なお、アナライト添加開始５秒から添加終了５秒前までのＲＵの増加量を結合量、アナライト添加終了後のバッファー添加開始後１０秒から添加終了１０秒前までのＲＵ減少量を解離量とした。

（３）実験結果
図４は、ＳＰＲ法で得られた、サイトカインと、上記供試レクチンとの相互作用（センサーグラム）を表す図である。横軸はアナライト添加開始からの時間（秒）を表し、縦軸はアナライトの結合量（上記ＲＵの増加量）を表す。いくつかのセンサーグラムに認められるピークは夾雑ピークである。図４の（ａ）はＴＮＦ‐α、図４の（ｂ）はｈＩＬ‐２、図４の（ｃ）はｈＩＬ‐６、図４の（ｄ）はＰＴＧを供試した場合の結果である。

また、図４に示される結果を表２にまとめた。表２では、結合が認められたもの（アナライト添加後に１０ＲＵ以上の増大が見られ、アナライト添加終了後にＲＵの減少（解離）が見られたもの）を「＋」、結合する傾向が認められたもの（アナライト添加後に１０ＲＵ以下であるが増大が見られ、アナライト添加終了後に解離が見られたもの）を「＋／−」で示した。また、それ以外のもの（ＲＵの増大が見られなかったもの、および、アナライト添加後にＲＵの増大が見られたものの、アナライト添加終了後に解離が見られず、非特異的なＲＵの増大と判断されたもの）は、結合が認められなかったものとして「−」で示した。表中、ＨＭは高マンノース型糖鎖を表し、Complexは複合型糖鎖を表す。

ポジティブコントロールとして用いたＰＴＧは、Ｎ結合型糖鎖のうち、高マンノース型糖鎖と複合型糖鎖との両方を含む。本実施例で供試した上記レクチンは、上記糖鎖のいずれかに結合することが知られており、図４の（ｄ）に示すように、ＰＴＧは、供試した上記レクチンすべてに結合すること、または、結合する傾向が認められた。

一方、各サイトカインにおいてレクチンの結合プロファイルが異なっていたことから、各サイトカインの表面糖鎖構造が異なる可能性が示唆された。

高マンノース型糖鎖特異的なタイプＩＩレクチンであるＢＣＡは、全てのサイトカインと比較的強い結合を示した。ＢＣＡは、高マンノース型糖鎖のうち、非還元末端にα１‐２マンノース残基を有する糖鎖構造を持つものとのみ結合することが明らかになっているため、供試したサイトカインは、上記糖鎖構造を共通して有する可能性があることが分かった。

さらに、コア（α１‐６）フコースに特異的なＨｙｐｎｉｎＡ‐１との結合性に、サイトカイン間で差異が認められたため、コア（α１‐６）フコースをターゲットとしたサイトカインの分別も可能であると考えられる。

以上のように、本実施例では定性的な解析を行った結果、特にＢＣＡとＨｙｐｎｉｎＡ‐１とが供試したサイトカインと強く結合することが明らかとなった。つまり、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、ヒトＨＭＧＢ１のみならず、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６，ＴＮＦ‐αを結合させるために用いることも可能であることが分かった。

〔実施例３：ポリペプチドとサイトカインとの相互作用の定量的解析〕
本実施例では、実施例２においてサイトカインとの親和性を示すことが分かったＢＣＡおよびＨｙｐｎｉｎＡ‐１について、サイトカインとの相互作用の定量的解析を行った。

（１）供試リガンドおよびアナライト
サイトカイン（リガンド）としては、ヒト型ＩＬ‐２（hIL-2、human expressed, HumanZyme, Chicago, USA）、ヒト型ＩＬ‐６（hIL-6、human expressed, HumanZyme, Chicago, USA）、およびヒト型ＴＮＦ‐α（hTNF-α、human expressed, HumanZyme, Chicago, USA）を使用した。

アナライトとしては実施例２で用いたレクチン（ポリペプチド）であるＢＣＡおよびＨｙｐｎｉｎＡ‐１を使用した。

（２）ポリペプチドとサイトカインとの相互作用の定量的解析
上記サイトカインと上記レクチン（ポリペプチド）との相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ２０００（GE Healthcare社製）を用いる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）法により定量解析した。

リガンドとして上記サイトカインをＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化し、種々の濃度（３１．２５ｎＭ〜１６μＭ）のレクチン溶液をアナライトとして用い、マニュアルに従って測定・解析した。リガンドの固定化はアミンカップリング法を用い、マニュアルに従って行った。

なお、サイトカインの固定化量は、約1500〜3000 resonance unit（ＲＵ）の範囲になるよう、マニュアルインジェクション法によって調整した。すなわち、ｈＩＬ‐２は２３００ＲＵ、ｈＩＬ‐６は１５００ＲＵ、ｈＴＮＦ‐αは３２００ＲＵに調整した。なお、リガンドのポジティブコントロールとして、実施例１と同様にＢＴＧを用い、リガンドと同様にＣＭ５センサーチップ上に固定化した。

用いた分析プログラムは実施例１および２と同じである。上記分析プログラム下で、アナライト（レクチン）溶液をそれぞれＣＭ５センサーチップ上に流速３０μＬ／ｍｉｎで３分間流した後、バッファーを３分間流し、レクチンの結合・解離量を測定した。

ＢＣＡおよびＨｙｐｎｉｎＡ‐１につき、上記種々の濃度で得られたセンサーグラムを基に、BIAevaluation version 4.1を用いて解析を行い、得られたセンサーグラムについて、結合相と解離相を同時にカーブフィッティングさせ、各定数（結合速度定数ｋ_ａ、解離速度定数ｋ_ｄ、親和定数Ｋ_Ａ、解離定数Ｋ_Ｄ）を算出した。

なお、アナライト添加開始１０秒後から添加終了１０秒前までのＲＵ増加量を結合量、アナライト添加終了後のバッファー添加開始１０秒後から添加終了１０秒前までのＲＵ減少量を解離量とした。

（３）実験結果
図５は、ＢＣＡと、供試した３種のサイトカイン（ｈＩＬ‐２、ｈＩＬ‐６、ｈＴＮＦ‐α）との相互作用（センサーグラム）を表す図である。図５の（ａ）はｈＩＬ‐２との相互作用を、図５の（ｂ）はｈＩＬ‐６との相互作用を、図５の（ｃ）はｈＴＮＦ‐αとの相互作用をそれぞれ表している。また、これらから得られたカイネティクス解析結果を表３にまとめた。

図５に示すように、ＢＣＡの結合量は、何れの固定化サイトカインに対しても、ＢＣＡの濃度に依存して増大した。カイネティクス解析結果から、ＢＣＡの供試サイトカイン類との親和性は、ｈＩＬ‐２（解離定数Ｋ_Ｄ：３．０８×１０^−７）、ｈＴＮＦ‐α（Ｋ_Ｄ：４．３７×１０^−７）、ｈＩＬ‐６（Ｋ_Ｄ：２．４８×１０^−６）の順で強いことが分かった。なお、実施例１に示したように、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との親和性は、Ｋ_Ｄ＝９．２９×１０^−８であった。

ｈＩＬ‐２およびｈＴＮＦ‐αはＮ‐グリコシド型糖鎖（複合型、混成型、高マンノース型の３タイプに細分類される）を持たないこと（Conradt, H.S. et al., Eur. J. Biochem. 153, 255-261,1985）、ｈＩＬ‐６は複合型糖鎖を持つことが報告（Parekh, R. B. et al., Eur. J. Biochem., 203, 135-141,1992）されており、これらのサイトカインとＢＣＡとの親和性は、タンパク質‐タンパク質間相互作用に由来することが示唆された。ＢＣＡが糖鎖結合性の他に多様なタンパク質と相互作用することが示唆されたのは今回が初めてである。

次に、実施例２で相互作用が認められたＨｙｐｎｉｎＡ‐１とｈＩＬ‐６とについて、ＳＰＲ法により、種々の濃度のＨｙｐｎｉｎＡ‐１をアナライトとして固定化ｈＩＬ‐６（固定化量：１４８０ＲＵ）との相互作用を定量的に測定した。

図６はＨｙｐｎｉｎＡ‐１と、ｈＩＬ‐６との相互作用（センサーグラム）を表す図である。表３に示すカイネティクス解析の結果から、ＨｙｐｎｉｎＡ‐１のｈＩＬ‐６に対する親和性（解離定数Ｋ_Ｄ：１．５８×１０^−７）は比較的高いことが分かった。

ＨｙｐｎｉｎＡ‐１は、既に述べたように、コア（α１‐６）フコースを含有する複合型糖鎖のみと結合する、極めて厳密な糖鎖結合特異性を有するレクチンである。一方、ｈＩＬ‐６は分子内にコア（α１‐６）フコースを含有する複合型糖鎖を有していることが報告（Parekh, R. B. et al., Eur. J. Biochem., 203, 135-141,1992）されており、上記複合型糖鎖との結合を介した相互作用が存在することが示唆された。

以上の結果から、本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、本実施例で用いたサイトカインを結合するために利用することもできると言える。

〔実施例４：糖化合物によるＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１間の相互作用阻害〕
ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との間の相互作用が、レクチン‐糖鎖間相互作用に由来するものであることを確認するために、ＢＣＡと結合することが知られているイーストマンナンの添加による影響を調べた。

イーストマンナン（ナカライテスク製）の終濃度が０．１、０．２、０．４、０．６，０．８および１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、１μＭのＢＣＡ溶液（in HBS EP buffer（GE Healthcare））にそれぞれ添加し、４℃で１時間静置した。この種々の濃度のイーストマンナン含有ＢＣＡ溶液を用いて、ＢＣＡ（アナライト）と、センサーチップに固定したヒトＨＭＧＢ１との結合・解離量を、実施例１〜３と同様にＳＰＲ法によって測定した。

まず、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との相互作用が糖鎖を介したものであることを確認するために、イーストマンナン存在下での上記相互作用につき検討した。なお、イーストマンナンとヒトＨＭＧＢ１との相互作用は認められなかった（データ示さず）。

上述した種々の濃度のイーストマンナンとＢＣＡとの混合液をアナライトとして、ヒトＨＭＧＢ１に対する相互作用を測定したところ、ＢＣＡのヒトＨＭＧＢ１への結合性はイーストマンナンの存在下で低下し、上記相互作用の阻害活性は、添加したイーストマンナンの濃度に依存して増加した。図７は、イーストマンナンによって、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との相互作用が阻害されることを示す図である。

図７に示す結果から、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との相互作用は、ヒトＨＭＧＢ１上の高マンノース型糖鎖を介したものであることが強く示唆された。なお、上記相互作用は、イーストマンナンの濃度が十分に高い条件（１ｍｇ／ｍｌ）においても完全には阻害されなかったことから、ＢＣＡとヒトＨＭＧＢ１との間には、レクチン‐糖鎖間の相互作用だけでなく、タンパク質‐タンパク質間相互作用も一部存在することが示唆された。

本発明に係るヒトＨＭＧＢ１結合剤は、検体に含有されるヒトＨＭＧＢ１と強い結合性を示すことができる。それゆえ、ヒトＨＭＧＢ１が関与する疾患である敗血症、全身性炎症反応症候群などの治療に利用することができ、医療機器産業、製薬業等に広く利用することができる。

Claims

高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチド（Ａ）；および／または、
コア（α１‐６）フコースに対する結合性を有するポリペプチド（Ｂ）、を含有し、上記ポリペプチド（Ａ）は、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチンおよびタイプＩＩＩレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のポリペプチドであることを特徴とする、ヒトＨＭＧＢ１結合剤。
上記ポリペプチド（Ａ）が、ＢＰＬ‐１７、ＢＣＡおよびＯＡＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることを特徴とする請求項１に記載のヒトＨＭＧＢ１結合剤。
上記ポリペプチド（Ｂ）がＨｙｐｎｉｎＡ、Ｈｃ‐ｈｙｐｎｉｎ‐Ａ、ＡＯＬ、ＡＡＬおよびＬＣＡからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることを特徴とする請求項１に記載のヒトＨＭＧＢ１結合剤。
上記ポリペプチド（Ｂ）がＨｙｐｎｉｎＡであることを特徴とする請求項３に記載のヒトＨＭＧＢ１結合剤。
請求項１から４のいずれか１項に記載のヒトＨＭＧＢ１結合剤が固定されてなるヒトＨＭＧＢ１結合部を備えることを特徴とする、ヒトＨＭＧＢ１除去装置。
高マンノース型糖鎖に対する結合性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
請求項６に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。