JP2016131548A - Pcr装置及びpcr方法 - Google Patents
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Abstract
Description
図6に示すように、特許文献1に記載のPCR装置は、カバー板41、排出口42、注入口43、チャネル44、電極対45、チャネル形成板46、及び基板を備え、反応容器は鉛直方向に立っている。特許文献1に記載のPCR装置は、電極対45の間のギャップにおいて反応液の中に電流を流して、そのジュール熱によって反応液を加熱してPCR増幅する。反応液は、環状のチャネル44を循環することで、温度が上昇及び下降してPCRサイクルの温度変化を受けてPCR増幅する。
また、電極対45が細く長いものとなるので、製造精度が高くなければならない。また、電流が流れる電極対45のギャップがチャネル断面内の中央だけであるので、加熱される部分が断面内の中央だけになってしまって温度むらが発生していた。
また、図2は、リングチャネル(Ring Channel)20及び電極対21を示す斜視図である。なお、本発明の実施例では、「上」は鉛直方向の上方、「下」は鉛直方向の下方、「水平」又は「水平方向」は鉛直方向と直交する方向とする。また、「前」は正面から見て手前方向、「後」は正面から見て後ろ方向、「左」は正面から見て左方向、「右」は正面から見て右方向、「垂直」は水平方向に直交する鉛直方向をいう。
まず、PCR装置の構成について説明する。
カバー板13は、ガラス製であり、チャネル形成板12の全面を覆うことよってリングチャネル20を形成する。
PCRサイクルは、例えば次のステップを順に20〜30サイクル繰返し行う。
(1) 変性(≒94℃)を2から10秒
(2) アニール(54〜66℃)を5秒
(3) 伸長(≒72℃)を5から15秒
図1(a),(c)に示すように、PCR装置1の反応容器10は、鉛直方向に立てて設置される。
注入ウェル15から反応液を注入し、排出ウェル16から排出する。反応液は、電極対21によってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対21の周辺で上昇流となって、リングチャネル20内を循環し、PCRサイクルが行われる。ここでは2ステップPCRサイクルを想定している。PCRが完了すると、反応液は排出ウェル16から排出される。なお、図示しない外部ポンプ又はシリンジによって、反応容器10へ反応液の注入・排出が行われる。
すなわち、従来例のPCR装置(図6参照)は、チャネル44に沿って電極対45間のギャップを設ける構成であったため、チャネル44に所定の長さの直線部分が必要となり、環状といっても4角形になってしまっていた。チャネル44に直線部分があるため、チャネル44の大きさを小さくすることは困難であった。
増幅特性(図3)は、下記条件により得られた。
リングチャネル20の流路体積:0.47μL
印加電圧:11.0V
チャネル形成板12(スペーサ)厚み:0.3mm
撮影間隔:20sec
マスターミックス:illustra(GEヘルスケア社)
テンプレート:λdna 1.31ng/25μL
ターゲットdna:199bp
図3の増幅特性に示すように、電圧印加時間に対して十分なPCR産物量を得ることが確認できた。
また、ここではテンプレートの濃度1.31ng/25μLにおけるPCR増幅特性を示したが、ここでは示していない異なるテンプレート濃度における特性の曲線は、高濃度ならば早い方向(図3では左方向)へ、低濃度ならば遅い方向(図3では右方向)へ移動した同じ形の曲線であることを確認した。これはテンプレート濃度の定量的測定に用いられるリアルタイムPCRと同様の性質である。本実施例によれば、リアルタイムPCRが可能である。
PCRサイクル内の各ステップには最小限必要な時間がある。
一版に、PCRでは、(1)変性ステップ(95℃〜98℃)、(2)アニーリングステップ(温度は様々である)、(3)伸長ステップ(前2温度の間で、やはり一定ではない)の3ステップを用いる。近年では、高速化の要請から上記(2)と(3)を共通化して同じ温度で扱う2ステップの方法が用いられ、特にリアルタイムPCRでは2ステップのファストPCRと呼ばれる方法が良く用いられる。
各構成要素の材質は上述のものに限られず、一般的なマイクロチャネルに用いられる材質のものを採用することができる。
特に2つの電極が基板11上に形成される実施例1では、カバー板13はガラス製、チャネル形成板12はPDMS製と異なる材質として述べたが、両者の材質は同じでも良い。例えば同じ材質のPDMSである場合にはモ−ルディングによる一体成形が容易となり、量産に向いた製造方法としてメリットがある。
また、「交差」は直角に交差するものに限られない。
10,10A 反応容器(環状容器)
11 基板
12 チャネル形成板
13 カバー板
13A 対向基板(カバー板)
15 注入ウェル
16 排出ウェル
20 リングチャネル
21,21A 電極対
22 引出し電極部
20a 円形開口部
30 制御部(制御手段)
211,212 電極
G 電極対のギャップ幅
GL 電極対のギャップ長
D リングチャネルの流路深さ
また、本発明に係るPCR装置は、ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器と、前記環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に1つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段とを備えることを特徴とする。
また、本発明に係るPCR方法は、ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)を行う、流路断面が長方形であり全体として円環状であり縦置き配置される環状容器を形成する対向基板のそれぞれの内面に1つずつ配置される電極からなり、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とする。
Claims (4)
- ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)を行う環状容器と、
前記環状容器の内面に、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対と、
前記電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御する制御手段と
を備えることを特徴とするPCR装置。 - 前記電極対は、前記環状容器を形成する対向基板の一方に配置される2つの電極からなることを特徴とする請求項1記載のPCR装置。
- 前記電極対は、前記環状容器を形成する対向基板のそれぞれに1つずつ配置される2つの電極からなることを特徴とする請求項1記載のPCR装置。
- ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)を行う環状容器の内面に、反応液の流れの全幅に亘り、該流れに交差し、かつ、水平のギャップ中心線となるギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて、該反応液を上昇させると共に該反応液の温度を制御することを特徴とするPCR方法。
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