JP5700403B2

JP5700403B2 - Ｐｃｒ方法及びｐｃｒ装置

Info

Publication number: JP5700403B2
Application number: JP2010246917A
Authority: JP
Inventors: 修三平原
Original assignee: 有限会社フルイド
Priority date: 2009-11-04
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2030-11-02
Also published as: US9050597B2; JP2011115159A; EP2322647A3; US20110212492A1; EP2322647A2; EP2322647B1

Description

本発明は、ＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）方法及びＰＣＲ装置に関し、特に、温度制御に対する応答速度が速いＰＣＲ方法及びＰＣＲ装置に関する。

従来のＰＣＲ方法は、ＰＣＲサイクルのために反応液の温度を上げる手段として外部ヒータを使い、そのヒータの熱を反応容器の壁を介して反応液に伝達させて反応液を加熱している。しかし、この場合、まず壁を加熱して、その壁の熱で反応液を加熱するため、温度制御の応答速度が遅く、かつ、熱が壁伝いに拡散して、エネルギー効率が悪い。

そこで、反応液に電流を流してジュール熱によって反応液を直接加熱することが提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。

Guoqing Hu et al.,"Electrokinetically controlled real-time polymerase chain reaction inmicrochannel using Joule heating effect", Analytica Chimica Acta, vol.557,(2006) pp.146-151.

しかし、従来のジュール加熱によるＰＣＲ方法は、直流電流を反応液に流すものであるので、反応液が電気分解してしまい、電極の周辺に不要な気体の発生や、不要な酸性及びアルカリ性の溶液が発生してしまうので、その対処が必要であると共に、長いチャネルの両端に電圧を印加するものであるので、必要なジュール熱を発生させるためには高い電圧を印加しなければならならず、回路負担が大きかった。

本発明は、上記問題点に鑑み、印加する電圧が低くてもＰＣＲサイクルのために十分なジュール熱を発生させることができ、かつ、反応液に電流を流しても反応液を電気分解することがないＰＣＲ方法及びＰＣＲ装置を提供することを目的とする。

本発明のＰＣＲ方法は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて前記反応液の温度を制御することを特徴とする。

また、本発明のＰＣＲ装置は、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う容器と、該容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対と、に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて前記反応液の温度を制御する制御手段とを備えることを特徴とする。

また、前記容器は、管状のチャネルであることで、チャネル内の僅かな量の反応液と比べて大きな電極を用いることができるので、電圧印加に対する反応液温度応答速度を速くすることができる。

また、前記チャネルは、鉛直方向を向いていることで、ジュール加熱による反応液の上昇流を利用することができる。

また、前記容器は、鉛直方向に立っている平たいチャンバーであり、前記電極対は、該チャンバーの一方の側壁内面に鉛直方向のギャップを挟んで対向して配置されていることで、反応液をチャンバー内で循環させてＰＣＲサイクルを行うことができる。

また、前記容器は、鉛直方向に立っている平たいチャンバーであり、前記電極対は、該チャンバーの一方の側壁内面と他方の側壁内面に、チャンバーをギャップとして挟み、対向して配置されていることでも、反応液をチャンバー内で循環させてＰＣＲサイクルを行うことができる。

本発明によれば、印加する電圧が低くてもＰＣＲサイクルのために十分なジュール熱を発生させることができ、かつ、反応液に電流を流しても反応液を電気分解することがない。

本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す分解斜視図である。図１Ａの断面図である。本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の上面図及びその周辺の構成を示す図である。本発明の実施例２によるＰＣＲ装置の反応容器の上面図及びその周辺の構成を示す図である。本発明の実施例３によるＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。本発明の実施例４によるＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。本発明の実施例５によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す分解斜視図である。図６Ａの正面図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態について詳細に説明する。

図１Ａは、本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す分解斜視図であり、図１Ｂは、その断面図である。図１Ｂは、図１Ａを組み合わせた場合のＡＡ'面の断面図である。本実施例のＰＣＲ装置は、チャネル形成板１６、及び基板２１を備える。基板２１は、ガラス製であり上面に薄いクロム、その上に金を蒸着して作成した電極対２２がパターニングされ、電極対２２からは引出し部２３が配線接続される。電極対２２のギャップ幅は１０〜５００μｍ、例えば５０μｍ、長さは２〜８ｍｍ、例えば５.２ｍｍである。基板２１及びチャネル形成板１６とによって直線状の管状のチャネル１９を形成する。チャネル形成板１６は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）製であり、基板２１の上に接着されて配置され、下側表面にチャネル１９を形成する溝が設けられ、チャネル１９の一方端に反応液の注入ウェル１７、他方端に反応液の排出ウェル１８が設けられる。チャネル１９は例えば幅９８０μｍ、深さ６００μｍ、長さは電極対２２と同じである。チャネル１９両端の注入ウェル１７及び排出ウェル１８に接する基板２１の部分には厚み方向に貫通孔２４、２５が開けられ、貫通孔２４、２５の下表面側にはハトメ２８、２９が固定されている。このハトメ２８、２９にチューブを接続して反応液の流入流出が行われる。

図２は、本発明の実施例１によるＰＣＲ装置の反応容器の上面図及びその周辺の構成を示す図である。ポンプ２６は反応液を注入ウェル１７からチャネル１９に注入する。ポンプ２７はチャネル１９内の反応液を排出ウェル１８から排出する。制御部３１は、ＰＣＲサイクルを行うために必要な交流電圧を電極対２２に印加する。交流の周波数は、１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、例えば５ＭＨｚである。チャネル１９内の僅かな量の反応液と比べて大きな電極を用いることができ、かつ反応液を直接加熱する構成を採用しているので、電圧印加に対する反応液温度応答の時定数は１秒以内とすることができる。

ＰＣＲサイクルは例えば次のステップを順に２０〜３０サイクル繰返し行う。
(1).変性（≒９４℃）を２から１０秒
(2).アニール（５４〜６０℃）を５秒
(3).伸長（≒７２℃）を２から１０秒

実際には、反応容器を囲む環境をアニール温度に保ち、変成温度及び伸長温度となるように電極対２２にそれぞれに対応する交流電圧を印加することで反応液に交流電流を流しジュール熱によって反応液を加熱することによって反応液の温度を制御して、ＰＣＲサイクルを行う。

なお、アニールと伸長を同じ温度で行う２ステップのＰＣＲサイクルでも良い。

次の３つのタイプのいずれのＰＣＲ方法も、本実施例は行うことができる。
(1).注入ウェル１７から排出ウェル１８に反応液を連続的又は断続的に流しながら、チャネル１９内の反応液の全体をＰＣＴサイクルとなるように温度制御する。
(2).反応液をチャネル１９内に注入し、チャネル１９内に停止させた状態で、反応液の全体をＰＣＴサイクルとなるように温度制御する。
(3).電極対２２をいくつかに分割し、それぞれの電極対２２にＰＣＲサイクルの各ステップに対応する交流電圧を常に印加しておき、注入ウェル１７から排出ウェル１８に反応液を連続的又は断続的に流す。

本実施例は、反応液に交流電流を流すので、反応液を電気分解することはない。また、反応液の流れに沿う電極間ギャップに電流を流すので、電流の流れは幅が広くかつ距離が短いから、負荷抵抗が小さく、低い印加電圧であってもＰＣＲサイクルの温度制御に十分なジュール熱を発生させることができる。

さらに、本実施例のチャネルを用いる場合、オンラインプロセスとして、前段又は後段のプロセスと連結できる。前段としては、細胞のすりつぶし、遺伝子の取り出しと精製、又は遺伝子の細分化などが考えられ、また後段としてしては、電気泳動分析、マイクロアレイ分析、又は質量分析装置への接続、さらにはチューブを介さずに直接マイクロチャネルで接続する一体型のデバイスとして、様々な遺伝子分析方法をつなげることができる。

図３は、本発明の実施例２によるＰＣＲ装置の反応容器の上面図及びその周辺の構成を示す図である。本実施例は実施例１の反応容器を鉛直方向に立てて、チャネル１９の下から反応液を注入し、上から排出する。チャネル１９内の反応液はジュール加熱されることによって上昇流となるので、ポンプ２６、２７がなくても反応液は注入ウェル１７から排出ウェル１８に送流される。なお、ポンプ２６、２７を併用すれば、いろいろなタイプのＰＣＲ方法に必要な所定の速さで送流することができる。

図４は、本発明の実施例３によるＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。本実施例のＰＣＲ装置は、カバー板４１、排出口４２、注入口４３、チャネル４４、電極対４５、チャネル形成板４６、及び基板（図では見えない）を備え、反応容器は鉛直方向に立っている。ここでは、ポンプ、引出し部、及び制御部を省略している。本実施例のチャネル４４は、環状の管状になっている。反応液は注入口４３から注入される。反応液は電極対４５によってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対４５の周辺で上昇流となって、環状のチャネル４４内を循環し、ＰＣＲサイクルが行われる。ここでは２ステップＰＣＲサイクルを想定している。ＰＣＲが完了すると反応液は排出口４２から排出される。本実施例においてもジュール加熱による反応液の上昇流を利用する。

図５は、本発明の実施例４によるＰＣＲ装置の反応容器の正面図である。本実施例のＰＣＲ装置は、カバー板５１、排出口５２、注入口５３、チャンバー５４、電極対５５、チャンバー形成板５６、及び基板（図では見えない）を備え、反応容器は鉛直方向に立っている。カバー板５１と基板はチャンバー形成板５６を挟んで固定され、それぞれチャンバー５４の上面と下面を形成する。ここでは、ポンプ、引出し部、及び制御部を省略している。本実施例のチャンバー５４は、平たい円形の空間になっている。電極対５５はチャンバー５４の中央に設けられ、電極間ギャップは鉛直方向に向いている。反応液は注入口５３から注入される。反応液は電極対５５によってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対５５の周辺で上昇流となって、平たいチャンバー５４内を２つの環状に循環し、ＰＣＲサイクルが行われる。ここでは２ステップＰＣＲサイクルを想定している。ＰＣＲが完了すると反応液は排出口５２から排出される。本実施例においてもジュール加熱による反応液の上昇流を利用する。

図６Ａは、本発明の実施例５によるＰＣＲ装置の反応容器の構成を示す分解斜視図であり、図６Ｂは、その正面図である。本実施例のＰＣＲ装置は、上基板６１、下基板６２、チャンバー形成板６３、チャンバー６４、電極対６５、引出し部６６、及び注入排出兼用口６７を備え、反応容器は鉛直方向に立っている。上基板６１と下基板６２はチャンバー形成板６３を挟んで固定され、それぞれチャンバー６４の（正面から見て）上面と下面を形成する。ここでは、制御部を省略している。電極対６５の一方は上基板６１内面に、もう他方は下基板６２内面に配置され、反応液を挟み、チャンバー中央の断面を横切って電圧を印加する電極対を構成する。図６Ｂの正面図において、電極対６５が重ならないように配置されている。これにより電流は電極のエッジからエッジに流れることになり、電極の長手方向に亘って流れる各電流路の抵抗のばらつきを減らして各電流のばらつきを減らし、均一な温度制御ができる。本実施例のチャンバー６４は、平たいＵ字形の空間になっていて、鉛直方向に開いた注入排出兼用口６７を備えている。反応液は注入排出兼用口６７からμピペットなどを用いて注入される。チャンバー上端は大気中に開放状態となるため、ミネラルオイルで開放端を塞ぎ、反応液の蒸発を防止する。反応液は電極対６５によってジュール加熱され変成温度にされると共に、電極対６５の周辺で上昇流となって、平たいチャンバー６４内を２つの環状に循環し、ＰＣＲサイクルが行われる。ここでは２ステップＰＣＲサイクルを想定している。ＰＣＲが完了すると反応液は注入排出兼用口６７からガラスキャピラリなどを用いて排出される。本実施例においてもジュール加熱による反応液の上昇流を利用する。実施例１から４の場合には基板に沿って電流を流すので、加熱しても少なくない熱が基板から逃げてしまうが、本実施例の場合には基板から基板へとチャンバーの（厚み方向）中央に電流を流すので、逃げてしまう熱を減らして、効率よく温度制御することができる。また、本実施例の場合は、電極間ギャップの距離をチャンバー形成板であるスペーサによって規定するので、高価な電極対のパターニングの必要がなく、安価かつ均一に製造することができる。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではない。
各構成要素の材質は上述のものに限られず、一般的なマイクロチャネルに用いられる材質のものを採用することができる。
明細書、特許請求の範囲及び図面を含む２００９年１１月４日に出願の日本特許出願２００９−２５２８１１の開示は、そのまま参考として、ここにとり入れるものとする。
本明細書で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として、ここにとり入れるものとする。

４１、５１カバー板
１６、４６チャネル形成板
１７注入ウェル
１８排出ウェル
１９、４４チャネル
２１基板
２２、４５、５５、６５電極対
２３、６６引出し部
２４、２５貫通孔
２６、２７ポンプ
２８、２９ハトメ
３１制御部
４２、５２排出口
４３、５３注入口
５４、６４チャンバー
５６、６３チャンバー形成板
６１上基板
６２下基板
６７注入排出兼用口

Claims

ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対を設け、該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて前記反応液の温度を制御することを特徴とするＰＣＲ方法。
ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う容器と、
該容器の内面に、反応液の流れに沿うギャップを挟んで対向して配置される電極対と、
該電極対に交流電圧を印加して反応液に交流電流を流すことによってジュール熱を発生させて前記反応液の温度を制御する制御手段と
を備えることを特徴とするＰＣＲ装置。
前記容器は、管状のチャネルであることを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ装置。
前記チャネルは、鉛直方向を向いていることを特徴とする請求項３記載のＰＣＲ装置。
前記容器は、鉛直方向に立っている平たいチャンバーであり、前記電極対は、該チャンバーの一方の側壁内面に鉛直方向のギャップを挟んで対向して配置されていることを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ装置。
前記容器は、鉛直方向に立っている平たいチャンバーであり、前記電極対は、該チャンバーの一方の側壁内面と他方の側壁内面に、チャンバーをギャップとして挟み、対向して配置されていることを特徴とする請求項２記載のＰＣＲ装置。