JP2016086709A

JP2016086709A - 細胞剥離認識装置および細胞剥離認識方法

Info

Publication number: JP2016086709A
Application number: JP2014223571A
Authority: JP
Inventors: 渡辺　大輔; Daisuke Watanabe; 大輔渡辺
Original assignee: Shibuya Kogyo Co Ltd
Current assignee: Shibuya Corp
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-05-23
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: JP6465280B2; US9739658B2; US20160123800A1

Abstract

【課題】細胞が培養容器から剥離した状態を認識するための細胞剥離認識装置及び細胞剥離認識方法の提供。
【解決手段】移動手段（ロボット６）が培養容器５を移動させると、撮影手段１４は、慣性によって細胞が移動する間に、培養容器５の内部を複数回撮影し、認識手段１０ａは撮影された複数の撮影データを比較することで細胞の剥離状態を判定するようになっており、培養容器内における細胞の剥離状態を高精度に認識することができる細胞剥離認識方法。
【選択図】図５

Description

本発明は細胞剥離認識装置および細胞剥離認識方法に関し、詳しくは培養容器内の細胞を撮影して、上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する細胞剥離認識装置および細胞剥離認識方法に関する。

従来、培養容器で培養した細胞を回収するには、上記培養容器の底に密着した細胞をトリプシンなどの剥離剤を用いて剥離させる必要がある。その際、細胞の剥離状態を認識するため、上記剥離剤が投入された培養容器内の細胞を撮影するとともに、撮影した撮影データに基づいて上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する細胞剥離認識方法が用いられている（特許文献１、２）。
特許文献１では、撮影データにおいて細胞と背景との区別を明確にするために位相差顕微鏡を用いており、細胞の剥離によって細胞の輪郭部分の位相差が大きくなると輝度が高くなることから、輝度の高い部分が所定の閾値を上回ることにより、当該細胞が剥離したものと判定するようになっている。
また特許文献２では、細胞の輪郭部分が培養容器の底に張り付いている状態から剥離することで、培養容器への密着部分の面積が小さくなることから、撮影データにおいて細胞の投影画像から密着部分の面積を求め、当該面積が所定の閾値を下回ると、当該細胞が剥離したものと判定するようになっている。

特許第５３３２６１０号公報特許第４０９５８１１号公報

しかしながら、上記特許文献１、２の認識方法では、静止した培養容器内において静止した培養細胞を撮影しており、細胞の所定部分が剥離したことを根拠に当該細胞の剥離を推定するものとなっており、その認識は依然として不正確であるという問題があった。
このような問題に鑑み、本発明はより正確に細胞の剥離状態を認識することが可能な細胞剥離認識装置および細胞剥離認識方法を提供するものである。

すなわち請求項１にかかる細胞剥離認識装置は、培養された細胞が収容された培養容器の内部を撮影する撮影手段と、上記撮影手段が撮影した撮影データに基づいて上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する認識手段とを備えた細胞剥離認識装置において、
上記培養容器を移動させるとともに、上記撮影手段の撮影範囲内において加速または減速もしくは停止させる移動手段を備え、
上記撮影手段は、慣性によって細胞が当該培養容器内を移動する間に、当該培養容器の内部を複数回撮影し、
上記認識手段は撮影された複数の撮影データを比較することで細胞の剥離状態を認識することを特徴としている。

また請求項３にかかる細胞剥離認識方法は、培養された細胞が収容された培養容器の内部を撮影し、撮影により得られた撮影データに基づいて上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する細胞剥離認識方法において、
上記培養容器を移動させるとともに、撮影範囲内において加速または減速もしくは停止させ、上記細胞が慣性により上記培養容器内で移動する間に、当該培養容器の内部を複数回撮影し、
撮影された複数の撮影データを比較することで細胞の剥離状態を認識することを特徴としている。

上記請求項１、３の発明によれば、培養容器を撮影範囲内において加速または減速もしくは停止させると、培養容器から剥離した細胞は慣性により当該培養容器内で移動するが、培養容器から剥離しなかった細胞は培養容器内を移動することはできない。
このため、培養容器の内部を複数回撮影し、撮影された複数の撮影データを比較すれば、剥離によって移動した細胞を確実に認識することができ、細胞の剥離状態を高精度に判定することが可能となっている。

本実施例における自動培養操作装置１の正面図。細胞を収容した培養容器を示し、（ａ）は細胞が付着した状態を、（ｂ）は細胞が剥離した状態をそれぞれ示す。培養容器を搬送するアタッチメントを示し、（ａ）は平面図を、（ｂ）は（ａ）におけるｂ−ｂ部の断面図を示す。加温庫およびタッピング手段を示し、（ａ）は側面図を、（ｂ）はタッピング手段の平面図を示す。検査手段の側面図。認識手段による第１の認識手順を説明する図。認識手段による第２の認識手順を説明する図。

以下図示実施例について説明すると、図１は細胞の培養を行う自動培養操作装置１の正面図を示し、この自動培養操作装置１は内部に形成された作業室２ａが無菌状態に維持されるアイソレータ２と、上記作業室２ａに器具類を搬入するためのパスボックス３と、その内部で細胞を培養するとともに作業室２ａとの間で細胞を受け渡すインキュベータ４とを備えている。
そして本実施例の自動培養操作装置１では、培地交換や回収作業等の培養操作を自動的に行うほか、本発明にかかる細胞剥離認識装置として、細胞Ｃを収容した培養容器５の内部における細胞Ｃの剥離状態を認識することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ２の作業室２ａには、上記培養容器５を搬送する移動手段としてのロボット６と、細胞Ｃを収容した培養容器５を加温する加温庫７と、当該加温庫７に設けられて上記培養容器５を振動させるタッピング手段８と、培養容器５内の細胞Ｃを観察するとともに細胞Ｃの剥離状態を認識する検査手段９とを備え、これらは制御手段１０（図５参照）によって制御されるようになっている。
なお、アイソレータ２内には培養操作に必要なその他の手段も設けられているが、これらについての説明は省略し、また上記細胞Ｃの剥離状態を認識する手順以外の動作についても説明を省略するものとする。

上記アイソレータ２の内部に形成された作業室２ａは予め除染ガス（過酸化水素蒸気）よって除染処理されており、その後清浄な空気が供給されて無菌状態を維持している。
また上記アイソレータ２の側面には図示しないグローブが複数設けられており、作業者は上記作業室２ａにおいて作業を行う際に当該グローブを装着するようになっている。
上記パスボックス３はアイソレータ２の外部右側面に設けられており、アイソレータ２の作業室２ａとパスボックス３の内部空間とを図示しない開閉扉によって連通させることで、外部からパスボックス３に搬入した器具類をアイソレータ２の作業室２ａに搬入することが可能となっている。
上記インキュベータ４は内部に複数の培養容器５を収容可能となっており、内部は細胞Ｃの培養に最適な温度や湿度に維持されている。そして台車４ａによって移動可能に設けられることで、アイソレータ２より離隔した位置において細胞Ｃの培養を行うことが可能となっている。
そして培養が完了した細胞Ｃについては、上記アイソレータ２とインキュベータ４とを接続手段によって接続するとともに、当該接続手段の開閉扉を開閉することで、無菌状態を維持したままアイソレータ２とインキュベータ４との間で上記培養容器５の受け渡しを行うことが可能となっている。

図２は上記培養容器５を示し、当該培養容器５としては例えば底の浅い円形の皿形容器であるディッシュを使用することができる。またこの培養容器５で培養される細胞Ｃとしては、人間の細胞Ｃの他、組織や血液等がある。
そして図２（ａ）は細胞Ｃが培養容器５の底面に密着した状態を示し、上記インキュベータ４において細胞Ｃを培養すると、培養された細胞Ｃは培養容器５の底面に密着し、そのままでは細胞Ｃの回収等が困難な状態となっている。
図２（ｂ）は、（ａ）に示す細胞Ｃが培養容器５の底面に密着した状態から、これを剥離させた状態を示しており、（ａ）に示す培養容器５に所定量のトリプシンを注入し、その後所定時間上記加温庫７において加温し、さらに上記タッピング手段８において培養容器５を振動させることで、上記細胞Ｃを培養容器５から剥離させるようになっている。剥離された細胞Ｃは、図２（ｂ）に示すように、細かく分割されて培地内を浮遊した状態となる。
なお、上記細胞Ｃを収容した培養容器５にトリプシンを供給するには、予め作業室２ａ内にトリプシンを収容したピペットを載置しておき、上記グローブを装着した作業者や上記ロボット６によって当該ピペットを操作するようになっている。
そのほかにも、作業室２ａ内にトリプシン供給手段を設けて、上記ロボット６が当該トリプシン供給手段に上記培養容器５を移動させるような構成とすることもできる。

上記ロボット６には産業用多関節ロボットを使用することができ、複数の軸から構成されたアーム６ａと、当該アーム６ａの先端に設けられたグリッパ６ｂとを備え、これらは上記除染ガスに対して防護されている。
そしてこのロボット６は、図３に示すアタッチメント１１を用いて培養容器５を移動させるようになっており、図３（ａ）は培養容器５およびアタッチメント１１の平面図を、（ｂ）は（ａ）におけるｂ−ｂ部の断面図を示している。
上記アタッチメント１１はロボット６のグリッパ６ｂによって把持されるグリップ１１ａと、上記培養容器５を支持する保持部１１ｂとから構成されている。
上記保持部１１ｂは略Ｕ字形の部材となっており、当該Ｕ字形の形状の基部側に上記グリップ１１ａが設けられ、先端側には所要の隙間が形成されている。また保持部１１ｂはその周方向に沿って略Ｌ字形の断面形状を有しており、その底面部分および側面部分で培養容器５を支持するようになっている。

図４は上記加温庫７およびタッピング手段８を示し、図４（ａ）は側面図を、（ｂ）はタッピング手段８の平面図を示し、上記タッピング手段８は上記加温庫７の最上段に設けられている。
上記加温庫７の各段はそれぞれ図示しない加温手段によって加熱されており、上記培養容器５が上記アタッチメント１１ごと載置されることにより、上記培養容器５が所定温度に保温されるようになっている。
また上記タッピング手段８は、培養容器５を挟んで設けられた打撃部材をエアシリンダ等によって往復動させることで、上記打撃部材の衝突により培養容器５を振動させるようになっている。
このタッピング手段８には上記トリプシンが投入されるとともに上記加温庫７において所定時間加温された培養容器５が載置され、培養容器５を振動させることで、トリプシンおよび振動によって密着力が低下した細胞が培養容器５の底面より剥離するようになっている。

図５は上記検査手段９を示し、当該検査手段９は、保持手段によって保持された照明手段１２と、その下方に設けられるとともに昇降手段１３によって昇降可能に設けられた撮影手段１４とを備えている。
上記撮影手段１４は上記制御手段１０に接続され、当該制御手段１０には上記撮影手段１４が撮影した撮影データを画像処理して上記培養容器５内における細胞Ｃの剥離状態を認識する認識手段１０ａが設けられている。
そして上記ロボット６が上記培養容器５を略水平に移動させて照明手段１２と撮影手段１４との間に位置させると、上記照明手段１２の光が上記培養容器５を透過し、撮影手段１４は当該培養容器５の内部を撮影するようになっている。
そして撮影手段１４が撮影した画像は、上記制御手段１０の認識手段１０ａへと送信され、認識手段１０ａでは撮影された画像を従来公知の方法により複数の画素からなる撮影データへと変換するようになっている。

そして本実施例では、細胞Ｃの培養容器５からの剥離状態を認識するため、以下のようにして培養容器５内の細胞Ｃを撮影するようになっている。
まず、上記ロボット６が上記タッピング手段８において振動させられた培養容器５をアタッチメント１１ごと保持し、当該培養容器５を上記照明手段１２と撮影手段１４との間の撮影位置に位置させる。
上記撮影手段１４の撮影範囲Ｆは図３（ａ）に示すように培養容器５の面積に対して小さく設定されており、例えば上記ロボット６は培養容器５を直線方向に断続的に移動させて、直線的に整列した所要の５か所を順次上記撮影範囲Ｆ内に入るようにする。
その際、ロボット６は各培養容器５の所要位置を撮影手段１４の撮影範囲Ｆに位置させると、当該培養容器５を停止させるようになっている。培養容器５を停止させた直後、当該培養容器５の内部では、培養容器５から剥離して浮遊している細胞Ｃが、慣性の法則によって移動することとなる。
そして撮影手段１４は、ロボット６が培養容器５を停止させてから、当該培養容器５内の細胞Ｃが慣性によって移動する間に、例えば０．５秒間隔で複数回撮影を行う。なお撮影は３回以上行うことも可能である。
このとき、図３（ａ）に示すように撮影対象とする位置を直線的に整列して設定し、培養容器５を直線方向に断続的に移動させる場合には、加速、減速、停止を繰り返すこととなり、細胞Ｃは静止することなく移動を続けることとなる。
このように、撮影範囲Ｆ内に位置させる箇所を直線的に整列した位置に設定することで、培養容器５の内部の細胞Ｃに作用する慣性力の方向が一定となり、画像データを用いた画像認識が容易となる。

上記認識手段１０ａは、撮影された画像を複数の画素からなる撮影データへと変換すると、撮影された複数の撮影データを比較して細胞Ｃの剥離状態を認識するようになっている。なお、以下の説明で用いる図６、図７の撮影データは、説明のため簡略化したものとなっている。
そして図６、図７の（１）、（２）は、それぞれ上記撮影手段１４が培養容器５が停止してから慣性により細胞Ｃが移動する間に撮影した、撮影時間の異なる２枚の画像に基づいて変換された撮影データとなっている。
具体的には、上記撮影データは複数の画素によって構成されるとともに、上記細胞として認識される画素と細胞以外の部分として認識される画素とが異なる明度で認識されている。
各画素を例えば２５６階調の明度を用いて表示した場合、細胞Ｃが位置する画素は明度２５６の白色の画素として、それ以外の背景となる画素は明度１２７の灰色の画素として表示される。
そして（３）は、以下に示す認識方法に基づき、上記認識手段１０ａが細胞Ｃの剥離状態を認識する際に作成する画像データとなっている。なお、実際にはこのような（３）に示す画像を作成する必要はなく、認識手段１０ａの内部において以下に示す処理が行われればよい。

まず図６に示す第１の認識方法は、異なる撮影データにおける同じ位置の画素について明度を比較し、明度の変化から細胞の移動を把握して、細胞の剥離状態を認識するものとなっている。
具体的に説明すると、まず上記認識手段１０ａは上記（１）（２）の撮影データにおける同じ位置の画素の全てに対して明度の差を算出し、（３）に示す撮影データを作成する。
つまり、（１）（２）における同じ明度の画素は（３）において「０」と認識される。具体的には図示左方の列に位置する細胞Ｃを示す明度「２５５」の画素と、その上下に隣接する背景を示す明度「１２７」の画素とは、それぞれ（３）において明度の差が「０」と認識される。
これに対し、（１）において図示中央の列の上下に位置する２つの細胞Ｃを示す明度「２５５」の画素は、（２）では当該細胞Ｃが図示右方の列に移動していることから、背景を示す明度「１２７」の画素に変化している。したがって、（３）においてこれらの画素は明度の差が「−１２８」と認識される。
そして、（１）において図示右方の列の上下に位置する２つの背景を示す明度「１２７」の画素は、（２）において細胞Ｃが当該画素に移動することによって明度「２５６」の画素に変化している。したがって、（３）においてこれらの画素は明度の差が「１２８」と認識される。

このようにして（３）の撮影データを作成すると、認識手段１０ａはこの（３）の撮影データにおける明度の差が「１２８」の画素が、培養容器５から剥離して慣性によって移動した細胞Ｃであると認識する。
そして認識手段１０ａは、（３）の撮影データにおける、上記剥離して移動した細胞Ｃを示す画素の数をカウントし、一画素あたりの面積を乗じて剥離した細胞の面積を算出する。

次に、図７に示す第２の認識方法は、第１の認識方法と同様の異なる撮影データにおける同じ位置の画素についての明度の比較において、明度に変化のない画素から、細胞として認識される画素を抽出して、当該画素に位置する細胞Ｃは剥離しなかったものと判定するものである。
具体的に説明すると、まず上記認識手段１０ａは上記（１）（２）の撮影データにおける同じ位置の画素の全てについて明度を比較し、このうちより暗い明度の画素を選択して（３）に示す撮影データを作成する。
つまり、（１）（２）における同じ明度の画素は（３）において同じ明度となる。具体的には図示右方の列に位置する細胞Ｃを示す明度「２５５」の画素と、その上下に隣接する背景を示す明度「１２７」の画素とは、それぞれ（３）において同じ明度が使用される。
これに対し、（１）において図示中央の列の上下に位置する２つの細胞Ｃを示す明度「２５５」の画素は、（２）では当該細胞Ｃが図示左方の列に移動していることから、背景を示す明度「１２７」の画素に変化している。したがって、（３）においてこれらの画素は明度の低い明度「１２７」の画素として認識される。
そして、（１）において図示左方の列の上下に位置する２つの背景を示す明度「１２７」の画素は、（２）において細胞Ｃが当該画素に移動することによって明度「２５６」の画素に変化している。したがって、（３）においてこれらの画素も明度の低い明度「１２７」の画素として認識される。

このようにして（３）の撮影データを作成すると、認識手段１０ａはこの（３）の撮影データにおける明度「２５５」の画素が、培養容器５から剥離しなかった細胞Ｃであると認識する。
そして認識手段１０ａは、（３）の撮影データにおける、上記剥離しなかった細胞Ｃを示す画素の数をカウントし、一画素あたりの面積を乗じて剥離しなかった細胞の面積を算出する。
また、第１の認識方法で求めた剥離した細胞の面積と第２の認識方法で求めた剥離しなかった細胞の面積を合計して全細胞の面積を求め、剥離した細胞の面積の値を全細胞面積の値で除することにより、細胞の剥離率を求めることができる。

そして認識手段１０ａは、上記培養容器５の複数個所に設定した撮影範囲Ｆの全てについて、上記第１および第２の認識方法に基づいて剥離率を算出し、これら各撮影範囲Ｆでの剥離率から培養容器５全体における剥離率を算出する。例えば上記５か所の撮影位置における剥離率の平均を、培養容器５全体における剥離率とすることができる。
また各撮影位置において例えば３回画像を撮影した場合には、１回目と２回目、２回目と３回目とをそれぞれ比較し、それぞれについて上記剥離率を算出すればよい。
そして、このようにして得られた剥離率は、例えば異なる種類の細胞Ｃごとに、最適なトリプシンの注入量、保持時間、振動させる回数等を把握するための指標とすることができる。

以上のように、本実施例の細胞剥離認識方法に基づいて求めた剥離率によれば、培養容器５を停止させて慣性により内部の細胞Ｃを移動させることで、剥離して移動した細胞Ｃや、剥離せずに移動しなかった細胞Ｃを確実に認識することができ、高精度に細胞Ｃの剥離状態を認識することができる。
これに対し従来の認識方法では、培養容器５を移動させずに観測を行うことから、内部の細胞Ｃは移動せず、したがって一部が剥離しただけで完全には剥離していない細胞Ｃについては判定を誤ることとなっていた。
なお、対象となる細胞Ｃによって異なるが、実際に培養容器５内を移動する細胞Ｃが上記撮影データにおいて複数の画素をまたいで認識される場合であっても、例えば上記撮影手段１４による撮影間隔を調整して、移動する細胞Ｃの位置が１回目と２回目の撮影データで重複しないようにすれば、高精度な認識を行うことができる。

また移動手段としては上記ロボット６に限らず、上記培養容器５を移動させるとともに、上記撮影手段１４の撮影範囲Ｆ内において加速または減速もしくは停止させる構成であれば、その他の移動手段を用いることが可能である。
さらに上記実施例では、上記ロボット６が培養容器５を撮影手段１４の撮影範囲Ｆに停止させることにより、細胞Ｃが慣性により移動することを説明したが、移動する培養容器５が加速や減速されることを要因として、慣性により細胞Ｃが移動することもあり得る。また、この場合、慣性によって移動する細胞Ｃが撮影できれば、必ずしも培養容器５を停止させる必要はない。
たとえば、ロボット６が所要の搬送速度で培養容器５を検査手段９の近傍まで移動させた後、撮影手段１４の撮影範囲Ｆに差し掛かったら、その搬送速度を減速させることで、培養容器５の内部で慣性により細胞Ｃを移動させることができる。
そしてロボット６がその後一定速度で培養容器５を撮影手段１４の撮影範囲Ｆ内を通過させながら撮影手段１４が複数回培養容器５の内部を撮影し、認識手段１０ａによって従来公知のパターンマッチング等の技術を用いて、複数の撮影データを重ね合わせることで、培養容器５内を慣性によって移動する細胞Ｃを認識することができる。
またその他の培養容器５内の剥離した細胞Ｃを移動させる方法としては、撮影範囲内において培養容器５を一旦停止させ、その後培養容器５を素早く移動させて加速させ、これにより細胞Ｃを慣性により移動させることや、撮影範囲内に位置させた培養容器５に振動を与えるようタッピング手段を設けて、振動すなわち打撃に伴う加速と停止に起因する慣性により細胞Ｃを移動させることが考えられる。
また複数の撮影手段を設けて、一方の撮影手段の撮影範囲で加速や振動に起因する慣性によって移動した細胞Ｃを撮影し、他方の撮影手段の撮影範囲でも減速や停止に起因する慣性によって移動した細胞Ｃを撮影するようにして、培養容器５の内部を複数回撮影するよう構成することもできる。
いずれにしても、何らかの要因により培養容器５を加速または減速もしくは停止させて、培養容器５内の細胞Ｃを慣性を利用して移動させ、培養容器５の内部を複数回撮影することにより、移動の前後における剥離した細胞Ｃを撮影することができればよい。

１自動培養操作装置２アイソレータ
５培養容器６ロボット
７加温庫８タッピング手段
９検査手段（細胞剥離認識装置）１０制御手段
１０ａ認識手段１４撮影手段
Ｃ細胞

Claims

培養された細胞が収容された培養容器の内部を撮影する撮影手段と、上記撮影手段が撮影した撮影データに基づいて上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する認識手段とを備えた細胞剥離認識装置において、
上記培養容器を移動させるとともに、上記撮影手段の撮影範囲内において加速または減速もしくは停止させる移動手段を備え、
上記撮影手段は、慣性によって細胞が当該培養容器内を移動する間に、当該培養容器の内部を複数回撮影し、
上記認識手段は撮影された複数の撮影データを比較することで細胞の剥離状態を認識することを特徴とする細胞剥離認識装置。
上記撮影データは複数の画素によって構成されるとともに、上記細胞として認識される画素と細胞以外の部分として認識される画素とが異なる明度で認識され、
上記認識手段は、異なる撮影データにおける同じ位置の画素について明度を比較し、各画素の明度の変化に基づいて細胞の剥離状態を認識することを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離認識装置。
培養された細胞が収容された培養容器の内部を撮影し、撮影により得られた撮影データに基づいて上記培養容器における細胞の剥離状態を認識する細胞剥離認識方法において、
上記培養容器を移動させるとともに、撮影範囲内において加速または減速もしくは停止させ、上記細胞が慣性により上記培養容器内で移動する間に、当該培養容器の内部を複数回撮影し、
撮影された複数の撮影データを比較することで細胞の剥離状態を認識することを特徴とする細胞剥離認識方法。
上記撮影データを複数の画素によって構成するとともに、上記細胞として認識される画素と細胞以外の部分として認識される画素とを異なる明度で認識し、
異なる撮影データにおける同じ位置の画素について明度を比較し、明度の変化から細胞の移動を把握して、細胞の剥離状態を認識することを特徴とする請求項３に記載の細胞剥離認識方法。
上記異なる撮影データにおける明度の比較において、明度に変化のない画素から、細胞として認識される画素を抽出することを特徴とする請求項４に記載の細胞剥離認識方法。