JP2016044138A - 担体、担体の製造方法、及び標的物の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この担体には、標的物への結合能を備えることの他に、不純物が非特異吸着しにくいこと等が要求される。非特異吸着は、標的物の検出感度や定量性、精製した標的物を生体内に応用する場合の安全性に大きく影響を与えるため、これを低減することは重要である。
他方、合成高分子で構成される支持体を用いた担体として、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリレートゲル、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物等から構成される粒子が開発されているが(特許文献2)、斯様な合成高分子系の担体は、非特異吸着が起こり易いという欠点がある。また、無機系支持体を用いた担体も同様に、非特異吸着が起こり易い欠点がある。このように、支持体の種類や組成等によっては、非特異吸着が起こり易くなる、すなわち担体の防汚性が不十分になるという問題がある。
(工程1)リガンドと結合可能な反応性基を表面に有する支持体の前記反応性基の一部に、リガンドを結合する工程
(工程2)残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物を反応させる工程
本発明の担体は、支持体と、酸性基を含む基と、当該酸性基を含む基を介さずに前記支持体表面上に結合したリガンドとを有し、前記酸性基を含む基が、前記支持体表面上に結合していることを特徴とする。
支持体としては、合成高分子系支持体、天然高分子系支持体等の有機系支持体;無機系支持体;これらを組み合わせた有機−有機複合系支持体や有機−無機複合系支持体等が挙げられる。
合成高分子系支持体としては、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ(メタ)アクリレート類、ポリ(メタ)アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるもの挙げられる。天然高分子系支持体としては、例えば、セルロース(結晶性セルロース等)、アガロース、デキストラン等の多糖類で構成されるものが挙げられる。無機系支持体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
これらの中でも、支持体の耐圧性の観点から、合成高分子系支持体が好ましく、ポリビニルアルコール類、ポリ(メタ)アクリレート類及びポリ(メタ)アクリルアミド類から選ばれる合成高分子で構成される支持体がより好ましい。
本発明の担体は、酸性基を含む基が、支持体表面上に結合しているものである。これによって、優れた防汚性が得られる。
酸性基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基、ホスホジエステル基、スルフィノ基等が挙げられ、これらが解離したイオン性の官能基及びその塩も含むものとする。これらの中では、酸性基の化学的安定性の観点から、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基、ホスホジエステル基、これらが解離したイオン性の官能基又はその塩が好ましい。
上記M+は、それぞれ対イオンを示す。対イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン;マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン;アンモニウムイオン;有機アンモニウムイオン等が挙げられる。
これら酸性基の中でも、上記1価の酸性基が好ましく、防汚性の観点から、−C(=O)OH、−C(=O)O-M+、−C(=O)O-、−S(=O)2OH、−S(=O)2O-M+、−S(=O)2O-がより好ましく、リガンドから標的物を解離する際に少ない解離液の使用量で解離させ、効率よく標的物を分離精製、定量又は検出する観点から、−S(=O)2OH、−S(=O)2O-M+、−S(=O)2O-が特に好ましい。
R1で示される2価の有機基としては、以下の式(2)で表される2価の基が好ましい。
酸性基を含む基の含有量は、後述する実施例と同様の方法で測定すればよい。
本発明の担体は、酸性基を含む基を介さずに支持体表面上にリガンドが結合したものである。これによって、リガンドの多点結合が抑えられ、リガンドの三次元構造が維持されるため、リガンドの活性が保たれ、標的物へのアフィニティー低下を防ぐことができる。
タンパク質としては、プロテインA、プロテインG、アビジン、レクチン等が挙げられる。核酸としては、DNA、RNAが挙げられる。ペプチドとしては、インシュリン、グルタチオン等が挙げられる。酵素としては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ等が挙げられる。キレート化合物としては、ニトリロ三酢酸等が挙げられる。レセプターとしては、ホルモンレセプター、サイトカインレセプター等が挙げられる。アプタマーとしては、DNAアプタマー、RNAアプタマー等が挙げられる。抗体としては、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等が挙げられる。ビタミンとしては、ビオチン等が挙げられる。金属イオンとしては、Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等が挙げられる。
斯様なリガンドの中でも、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物が好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましい。中でも、精製の標的物が抗体である場合は、タンパク質が好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質がより好ましく、プロテインAが特に好ましい。
リガンド結合量は、後述する実施例と同様の方法で測定すればよい。
また、本発明の担体は、ヒドロキシ基を含む基が、支持体表面上に結合していてもよい。酸性基が、−S(=O)2OH、−S(=O)2O-M+、−S(=O)2O-等のpKaが低い酸由来である場合において、更にヒドロキシ基を含む基が支持体表面上に結合していると、標的物を解離させる際のテーリングを抑えることができる。
また、2価又は3価の炭化水素基は、好ましくは2価又は3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基、アルカントリイル基である。
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基等が挙げられる。
上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−1,1,1−トリイル基、エタン−1,1,2−トリイル基、プロパン−1,2,3−トリイル基、プロパン−1,2,2−トリイル基等が挙げられる。
また、R5〜R8としては、水素原子が好ましい。
本発明の担体の製造方法は、以下の工程1及び2を含むことを特徴とする。斯かる方法によれば、簡便且つ容易に、上記本発明の担体を得ることができる。
(工程1)リガンドと結合可能な反応性基(以下、単に反応性基ともいう)を表面に有する支持体(以下、原料支持体ともいう)の前記反応性基の一部に、リガンドを結合する工程
(工程2)残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物を反応させる工程
工程1は、原料支持体の反応性基の一部に、リガンドを結合する工程である。反応性基に対してリガンドを結合させる手法は特に限定されるものではなく、例えば、リガンドに存在するアミノ基やカルボキシ基、チオール基等を利用した、従来のカップリング法で行えばよい。カップリング法としては、(i)臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、過ヨウ素酸ナトリウム等を用いて原料支持体を活性化し、リガンドとカップリング反応を行い固定する方法、(ii)原料支持体とリガンドが存在する系に、カルボジイミドのような縮合試薬やグルタルアルデヒドのような分子中に複数の反応性基を持つ試薬を加えて、縮合・架橋することにより固定する方法、(iii)原料支持体に反応性基をあらかじめ導入しておき、原料支持体の活性化を経ずに、カップリング反応を行い固定する方法等が挙げられる。
リガンドの合計使用量は、原料支持体1gに対し、通常50〜300mg程度であるが、好ましくは120〜180mgである。
また、工程1の反応時間は特に限定されないが、通常0.5〜72時間程度であり、反応温度は通常1〜60℃程度である。
工程2は、残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物(以下、酸性基含有化合物ともいう)を反応させる工程である。
酸性基含有化合物の合計使用量は、残留反応性基1モルに対し、通常0.1〜40モル当量であるが、リガンドの多点結合を防ぐ観点から、2〜40モル当量の過剰量にて残留反応性基をブロッキングすることが好ましい。
なお、上記工程1と工程2は、効率やコストの面から工程1から工程2の順に行うのが好ましい。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、上記本発明の担体がカラム容器に充填されているものである。該カラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
本発明の試料中の標的物を精製する方法は、上記本発明の担体を用いることを特徴とする。具体的には、以下の工程A及びBを含む方法が挙げられる。
(工程A)本発明の担体と、前記リガンドに結合する標的物を含む試料とを接触させる工程
(工程B)前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Aで標的物を捕捉した担体とを接触させる工程
精製は、本発明の担体を用いる以外は常法に従い行えばよいが、解離液としては、標的物の解離性の観点から、酸性溶液が好ましく、25℃におけるpHが2.5を超える酸性溶液がより好ましい。上記pHは、より好ましくは3.0〜5.0である。
なお、標的物としては、タンパク質、抗体等の生体関連物質が挙げられる。
<エポキシ基含有量>
重合で使用したエポキシ基含有モノマー量より計算されるエポキシ基のモル数が1.00mmolとなるように、支持体水分散体をポリエチレンボトルに正確に測り取り、これに塩化カルシウム37.5質量%水溶液25mL及び0.2規定の塩酸10mLを加えて、75℃で1時間撹拌することによりエポキシ基を開環し、冷却後、0.2規定の水酸化ナトリウム水溶液10mLで中和し、さらにpHメーターでpHをモニターしながら0.1規定の塩酸で逆滴定することにより、リガンド結合前の支持体のエポキシ基含有量を定量した。
プロテインA固定粒子(S−4)、アフィニティクロマトグラフィー用担体7のプロテインAの結合量は、ビシンコニン酸(BCA)試薬を用いた試薬セットで定量した。具体的には、固形分換算で1mgの粒子(S−4)、アフィニティクロマトグラフィー用担体7をテストチューブに採取し、これをThermoFisher Scientific社のBCA Protein Assay Kitで定量した。反応は、37℃で30分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインAと同一のロットのものを用いて作成した。
固形分換算で0.5gのアフィニティクロマトグラフィー用担体1〜7を正確に測り取り、電気伝導度測定計(Metrohm製 794 Basic Titrino)を用いて、酸性基の結合量を算出した。
(1)360gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)0.72gを添加し、加熱撹拌しポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム(花王社製 エマール10G)0.18g、炭酸ナトリウム0.36g及び亜硝酸ナトリウム0.18gを添加し、撹拌して、水溶液(S−1)を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)6.88g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.37g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.12g及びポリエチレングリコール#400ジメタクリレート(新中村化学社製、9G)1.37gからなる単量体組成物を、2−オクタノン(東洋合成社製)20.63g及びアセトフェノン(井上香料製造所社製)5.30gの混液に溶解させ、単量体溶液(S−2)を調製した。
次いで、前記水溶液(S−1)を、500mLセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液(S−2)を全量投入して、温水バスにより加温し内温が85℃に到達したところで2,2’−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.53gを添加し、86℃に温度を維持した。
(2)その後、86℃に温度を維持したまま3時間撹拌を行い、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを3回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液(S−3)を得た。この多孔質粒子のエポキシ基含有量は、粒子の乾燥重量1gあたり1.57mmolであった。
(3)次に、改変プロテインA(Repligen製 rSPA)0.15gを、1.0Mクエン酸三ナトリウム/0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに分散させプロテインA分散液を得、このプロテインA分散液に、前記多孔質粒子分散液(S−3)を粒子乾燥重量換算で1g添加した。この分散液を25℃で5時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。この粒子を、プロテインA固定粒子(S−4)とする。プロテインA固定粒子(S−4)のプロテインA結合量は、粒子の乾燥重量1gあたり63.2mgであった。
(4)前記プロテインA固定粒子(S−4)を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)で洗浄した後、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を完全に開環(ブロッキング)させた。
その後、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)、0.5M水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用担体1を得た。メルカプト酢酸の結合量は、担体の表面積1m2あたり、2.48μmolであった。
実施例1のエポキシ開環工程に用いる溶液を、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)から、1.0M 3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウム(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用担体2を得た。3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウムの結合量は、担体の表面積1m2あたり、3.12μmolであった。
実施例1のエポキシ開環工程に用いる溶液を、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)から、0.80M 3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウム(和光純薬工業社製)/0.20M チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用担体3を得た。3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウムの結合量は、担体の表面積1m2あたり、2.88μmolであった。
実施例1のエポキシ開環工程に用いる溶液を、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)から、0.50M 3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウム(和光純薬工業社製)/0.50M チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用担体4を得た。3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウムの結合量は、担体の表面積1m2あたり、1.83μmolであった。
実施例1のエポキシ開環工程に用いる溶液を、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)から、1.0M チオグリセロール(旭化学工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用担体5を得た。酸性基の結合量は、担体の表面積1m2あたり、<0.05μmolであった。
実施例1のエポキシ開環工程に用いる溶液を、1.0Mメルカプト酢酸(和光純薬工業社製)/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)から、0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用担体6を得た。酸性基の結合量は、担体の表面積1m2あたり、<0.05μmolであった。
特開2010−133734号公報の実施例3を再現して多孔質粒子(S−5)分散液を得た。多孔質粒子(S−5)のエポキシ基含有量は、粒子の乾燥重量1gあたり0.25mmolであった。次いで、rProteinATMから、改変プロテインA(Repligen製 rSPA)に変更した以外は特開2010−133734号公報の実施例6と同様の操作を行うことで、上記多孔質粒子(S−5)に改変プロテインAを固定し、アフィニティクロマトグラフィー用担体7を得た。このアフィニティクロマトグラフィー用担体7のプロテインA結合量は、粒子の乾燥重量1gあたり27.7mgであった。また、酸性基の結合量は、担体の表面積1m2あたり、<0.05μmolであった。
GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、線流速60cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体、Equitech Bio社製 HGG−1000)に対する実施例1〜4及び比較例1〜3で得られた担体1〜7のDBCを測定した。カラムは容量4mL(5mmφ×200mm長)のものを、タンパク質は20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウムバッファー(pH7.5)で25mg/mLに希釈したものをそれぞれ使用し、溶出先端10%ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からDBCを求めた。結果を表1に示す。
図1に示すように、3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸ナトリウム(3−メルカプト−1−プロパンスルホン酸のpKa=−2.5〜−2.0)で表面修飾した実施例2の担体2は、メルカプト酢酸(pKa=3.5〜4.0)で表面修飾した実施例1の担体1より少ない量の解離液でタンパク質の解離が始まった。
また、実施例3〜4で得られた担体3〜4から、捕捉したタンパク質を50mMクエン酸緩衝液(pH3.2)で解離させ、その際の解離応答性をGEヘルスケア社製AKTAprime plusで3CV(3Column Volume)まで測定したところ、テーリングがほとんどみられなかった。
実施例1で得られた担体1を70μL(湿潤状態)秤取り、1.0mg/mLモノクローナル抗体溶液(モノクローナル抗体Trastuzumabのバイオシミラーを含有するCHO細胞培養上清)2.45mLを加えて、室温で1.5時間撹拌振とうして、抗体を担体に捕捉した。
次いで、前記抗体を捕捉させた担体の全量をスピンカラム(Thermo製)に移し、遠心分離(1000rpm)によって抗体溶液を除いた。
次に、20mMリン酸ナトリウム/150mM NaClバッファー(pH7.5)をスピンカラムに加え、合計840μLを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
次いで、20mMリン酸ナトリウム/1.0M NaClバッファー(pH7.5)をスピンカラムに加え、合計840μLを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
次に、20mMリン酸ナトリウム/150mM NaClバッファー(pH7.5)をスピンカラムに加え、合計840μLを遠心分離によって通液し、担体を洗浄した。
その後、50mMクエン酸緩衝液(pH3.2)をスピンカラムに加え、合計700μLを遠心分離によって通液し、担体に捕捉されていたモノクローナル抗体を解離した。解離液中の抗体濃度を、BioRAD製Smartspec Plusを使用して吸光度から算出した。
そして、Cygnus Technologies社製 CHO HCP ELISA kit,3Gを用い、Host Cell Protein(HCP)濃度を測定し、抗体濃度でスタンダード化した。
また、実施例2〜4及び比較例1〜3で得られた担体2〜7についても、上記と同様にしてHCP測定試験を行った。
結果を表1に示す。
このように、実施例1〜4の担体1〜4は、標的物の動的結合容量が高く、且つ優れた防汚性を有するものであった。
Claims (17)
- 支持体と、
酸性基を含む基と、
当該酸性基を含む基を介さずに前記支持体表面上に結合したリガンドと、を有し、
前記酸性基を含む基が、前記支持体表面上に結合していることを特徴とする、
担体。 - 前記酸性基が、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基、ホスホジエステル基、又はこれらが解離したイオン性の官能基若しくはその塩である、請求項1に記載の担体。
- 前記酸性基を含む基のpKaが、−3.0〜5.0である、請求項1又は2に記載の担体。
- Xが、−C(=O)OH、−C(=O)O-M+、−C(=O)O-、−S(=O)2OH、−S(=O)2O-M+、又は−S(=O)2O-である(M+は、対イオンを示す)、請求項4に記載の担体。
- 前記酸性基を含む基の含有量が、担体の表面積1m2あたり、0.05μmol以上である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の担体。
- 前記リガンドが、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、又はキレート化合物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の担体。
- 前記リガンドが、プロテインAである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の担体。
- 前記リガンドが、環状エーテル基が開環してなる基を介して前記支持体表面上に結合している、請求項1〜8のいずれか1項に記載の担体。
- 前記支持体が、有機系支持体、無機系支持体、有機−有機複合系支持体又は有機−無機複合系支持体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の担体。
- 前記支持体が、多孔質である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の担体。
- 前記支持体が、粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の担体。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の担体がカラム容器に充填されているクロマトグラフィーカラム。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物を精製する方法。
- 以下の工程A及びBを含むことを特徴とする、標的物の精製方法。
(工程A)請求項1〜12のいずれか1項に記載の担体と、前記リガンドに結合する標的物を含む試料とを接触させる工程
(工程B)前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Aで標的物を捕捉した担体とを接触させる工程 - 以下の工程1及び2を含むことを特徴とする、担体の製造方法。
(工程1)リガンドと結合可能な反応性基を表面に有する支持体の前記反応性基の一部に、リガンドを結合する工程
(工程2)残りの反応性基に、当該反応性基と反応可能な官能基及び酸性基を有する化合物を反応させる工程 - 前記リガンドと結合可能な反応性基が、環状エーテル基である、請求項16に記載の製造方法。
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