JP2016032483A - 核酸増幅のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、同一オリゴヌクレオチド中に標的特異的配列およびユニバーサル配列の両方を含む1つ以上の標的特異的ユニバーサル(TSU)オリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物を提供する。本発明のTSUプライマーは、5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(U1)、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(TS1)から構成される少なくとも1つのTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含む。かかる組成物は、さらに、第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)から構成される少なくとも1つのTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含み得る。
【選択図】なし
Description
universal sequence)(U1)、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(3’first target specific sequence)(TS1)を含むTSUプロモーターオリゴヌクレオチドであって、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによって伸長することができる3’末端を有するTSUプロモータープライマーであるか、ポリメラーゼによって伸長することができない遮断3’末端を有するTSUプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド(TSU promoter provider oligonucleotide)である、TSUプロモーターオリゴヌクレオチド、第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)で構成されるTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、およびTSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結し、それにより、標的特異的ユニバーサル(TSU)プライマー複合体を形成する手段を含む、組成物を開示する。1つの実施形態では、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段は共有結合である。別の実施形態では、共有結合はポリヌクレオチドリンカー配列を介して形成され、これは非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物を介して形成される共有結合であり得る。別の実施形態は、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドおよびTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを支持体に連結するための結合対のメンバーの非共有結合である、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段であって、結合対の一方のメンバーがTSUプロモーターオリゴヌクレオチド上またはTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド上に存在し、結合対の他方のメンバーが支持体に結合する、手段を使用する。別の実施形態では、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段は、TSUプロモーターオリゴヌクレオチド上の第1の配列とTSUプロモーターオリゴヌクレオチド上の第1の配列と相補的なTSU非プロモータープライマー上の第2の配列との間のハイブリッド形成複合体である。TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段は、TSUプロモーターオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第1の配列およびTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第2の配列を含むS−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体であり得る。1つの実施形態では、S−オリゴヌクレオチドはTSUプロモーターオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第1の配列を含み、S−オリゴヌクレオチドはTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第2の配列を含む。組成物はまた、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドのTS配列またはTSU非プロモータープライマーのTS配列とハイブリッド形成する標的核酸中の配列と異なる配列で、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドおよびTSU非プロモータープライマーの標的配列中の配列と特異的にハイブリッド形成する配列を含む標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドを含むことができ、これは、標的核酸を支持体に結合する手段を含む。組成物はまた、5’プロモーター配列およびTSUプロモーターオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一の3’ユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプロモータープライマーを含むことができる。別の実施形態は、TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一のユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプライマーをさらに含む組成物である。組成物はまた、標的核酸鎖中のTSUプロモーターオリゴヌクレオチドのTS配列またはTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのTS配列が結合する配列と異なる標的核酸鎖中の配列と特異的にハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド(blocker oligonucleotide)を含むことができ、ブロッカーオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長することができない3’遮断末端(3’ blocked terminus)を有する。S−オリゴヌクレオチドを含むいくつかの実施形態では、S−オリゴヌクレオチドは、(1)TSUプロモータープライマーのU1配列に相補的な第1の末端領域配列および(2)TSU非プロモータープライマーのU2配列に相補的な第2の末端領域配列、および(3)第1および第2の末端領域配列を連結する連結部分から構成される。連結部分は、第1および第2の末端領域配列を共有結合する非核酸化合物であり得る。組成物はまた、5’プロモーター配列および3’U1配列から構成される少なくとも1つのユニバーサルプロモータープライマーならびにTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端の合成伸長から作製されたcDNA配列を含む二本鎖DNAから作製されたRNA転写物中に含まれる配列と相補的な配列から構成される少なくとも1つの標的特異的プライマー(TSP)を含むことができる。
vitro核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したTSU非プロモータープライマーの3’末端を合成的に伸長させる工程であって、標的核酸が第1のcDNA鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、第1のcDNA鎖中の相補配列とのTS1配列の特異的ハイブリッド形成によって、5’プロモーター配列、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する3’標的特異的配列(TS1)、およびポリメラーゼによって伸長することができない遮断3’末端を含む標的特異的TSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを第1のcDNA鎖とハイブリッド形成させる工程、テンプレートとしてのTSプロモータープロバイダー中の配列の使用によって第1のcDNAの3’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびTS1配列を含む実質的に二本鎖のDNAを作製する工程、機能的プロモーター配列からRNA転写物を酵素的に転写して、5’標的特異的配列TS1、標的特異的配列TS2’、およびU2’配列を含むRNA転写物を作製する工程、U2’配列でRNA転写物とユニバーサル配列U2を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド(UP2)をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってUP2の3’末端を合成的に伸長してcDNA鎖を作製し、RNA転写物の鎖を酵素的に除去する工程、プロモーター配列および3’遮断末端を含むTSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを前の工程で作製したcDNAとハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、テンプレートとしてのTSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの使用、および機能的プロモーターを含むdsDNAを作製するための酵素的in vitro核酸合成によって、機能的二本鎖プロモーターを作製するためにcDNAの3’末端を合成的に伸長する工程、およびdsDNAの機能的プロモーターから複数のRNA転写物を転写する工程であって、転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的in vitro核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程を含む。本方法はまた、増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程を含むことができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(internal first universal sequence)(U1)、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(3’first target specific sequence)(TS1)を含むTSUプロモーターオリゴヌクレオチドであって、前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによって伸長することができる3’末端を有するTSUプロモータープライマーであるか、ポリメラーゼによって伸長することができない遮断3’末端を有するTSUプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド(TSU promoter provider oligonucleotide)である、TSUプロモーターオリゴヌクレオチド、
第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)で構成されるTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、
TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結し、それにより、標的特異的ユニバーサル(TSU)プライマー複合体を形成する手段
を含む、組成物。
(項目2)
前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段が、共有結合である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記共有結合がポリヌクレオチドリンカー配列を介して形成される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記共有結合が非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物を介して形成される、項目2に記載の組成物。
(項目5)
前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段が、前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドおよび前記TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを支持体に連結するための結合対のメンバーの非共有結合であり、前記結合対の一方のメンバーが前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチド上または前記TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド上に存在し、前記結合対の他方のメンバーが支持体に結合する、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段が、前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチド上の第1の配列と前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチド上の第1の配列と相補的なTSU非プロモータープライマー上の第2の配列との間のハイブリッド形成複合体である、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段が、前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第1の配列および前記TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第2の配列を含むS−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体である、項目1に記載の組成物。
(項目8)
前記S−オリゴヌクレオチドが前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第1の配列を含み、前記S−オリゴヌクレオチドが前記TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第2の配列を含む、項目7に記載の組成物。
(項目9)
TSUプロモーターオリゴヌクレオチドのTS配列またはTSU非プロモータープライマーのTS配列とハイブリッド形成する標的核酸中の配列と異なる配列において、TSUプロモーターオリゴヌクレオチドおよびTSU非プロモータープライマーの標的核酸中の配列と特異的にハイブリッド形成する配列を含み、かつ、標的核酸を支持体に結合する手段を含む標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目10)
5’プロモーター配列およびTSUプロモーターオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一の3’ユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプロモータープライマーをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目11)
TSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一のユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプライマーをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目12)
標的核酸鎖中のTSUプロモーターオリゴヌクレオチドのTS配列またはTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのTS配列が結合する配列と異なる標的核酸鎖中の配列と特異的にハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド(blocker oligonucleotide)をさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができない3’遮断末端(3’ blocked terminus)を有する、項目1に記載の組成物。
(項目13)
前記S−オリゴヌクレオチドが、(1)TSUプロモータープライマーのU1配列に相補的な第1の末端領域配列および(2)TSU非プロモータープライマーのU2配列に相補的な第2の末端領域配列、および(3)前記第1および第2の末端領域配列を連結する連結部分から構成される、項目7に記載の組成物。
(項目14)
前記連結部分が前記第1および第2の末端領域配列を共有結合する非核酸化合物である、項目13に記載の組成物。
(項目15)
5’プロモーター配列および3’U1配列から構成される少なくとも1つのユニバーサルプロモータープライマーならびにTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端の合成伸長から作製されたcDNA配列を含む二本鎖DNAから作製されたRNA転写物中に含まれる配列と相補的な配列から構成される少なくとも1つの標的特異的プライマー(TSP)をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目16)
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、以下:
5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(U1)、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(TS1)、およびポリメラーゼによって伸長することができる3’末端を含むTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチド、
第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)から構成されるTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および
TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段
から構成される標的特異的ユニバーサル(TSU)プライマー複合体の標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
TSUプロモータープライマー中のTS配列を介してTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを標的核酸中の標的配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第1のcDNA鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第1のcDNA鎖中に含まれる標的配列とのTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のTS配列の特異的ハイブリッド形成によって第1のcDNA鎖とTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成によって第1のcDNA鎖とハイブリッド形成したTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端を合成的に伸長して第2のDNA鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびU1配列を含む実質的に二本鎖のDNAを作製する工程、
実質的に二本鎖のDNAの機能的プロモーター配列からRNA転写物を酵素的に転写して、5’U1領域配列、第1の標的特異的配列(TS1)、第2の標的特異的配列(TS2’)、およびU2配列に相補的な3’ユニバーサル配列(U2’)を含むRNA転写物を作製する工程、
U2’配列でRNA転写物とユニバーサル配列U2を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド(UP2)とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってUP2の3’末端を合成的に伸長してcDNA鎖を作製し、RNA転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
U1’配列で前の工程で作製したcDNAとユニバーサル配列U1を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチド(UP1)とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってUP1の3’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むdsDNA鎖を作製する工程、および
dsDNAの機能的プロモーターから複数のRNA転写物を転写する工程であって、前記転写物がUP2プライマーの結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的in vitro核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
(項目17)
増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、以下:
5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(U1)、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(TS1)を含むTSUプロモーターオリゴヌクレオチドであって、前記TSUプロモーターオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができない遮断3’末端を有するTSUプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである、TSUプロモーターオリゴヌクレオチド、
第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)から構成されるTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および
TSUプロモーターオリゴヌクレオチドをTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段
から構成される標的特異的ユニバーサル(TSU)プライマー複合体の標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
TSU非プロモータープライマー中のTS配列を介して標的核酸中の標的配列とTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
任意に、ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない3’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを、標的核酸中のTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したTSU非プロモータープライマーの3’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第1のcDNA鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第1のcDNA鎖中に含まれる標的配列とのTSUプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド中のTS配列の特異的ハイブリッド形成によって第1のcDNA鎖とTSUプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
テンプレートとしてTSUプロモータープロバイダー中の配列を使用することによって第1のcDNAの3’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびU1配列を含む実質的に二本鎖のDNAを作製する工程、
機能的プロモーター配列からRNA転写物を酵素的に転写して、5’U1領域配列、第1の標的特異的配列(TS1)、第2の標的特異的配列(TS2’)、およびU2配列に相補的な3’ユニバーサル配列(U2’)を含むRNA転写物を作製する工程、
U2’配列でRNA転写物とユニバーサル配列U2を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド(UP2)とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってUP2の3’末端を合成的に伸長してcDNA鎖を作製し、RNA転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
U1’配列で前の工程で作製したcDNAとプロモーター配列、ユニバーサル配列U1、および3’遮断末端を含むユニバーサルプロモーターオリゴヌクレオチド(UP1)とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、テンプレートとしてのUP1オリゴヌクレオチドの使用によってcDNAの3’末端を合成的に伸長して機能的二本鎖プロモーターを作製し、酵素的in vitro核酸合成によって機能的プロモーターを含むdsDNAを作製する工程、および
dsDNAの機能的プロモーターから複数のRNA転写物を転写する工程であって、前記転写物がUP2プライマーの結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的in vitro核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
(項目19)
増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(U1)、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(TS1)、およびポリメラーゼによって伸長することができる3’末端を含む標的特異的ユニバーサル(TSU)プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第1のcDNA鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
TS1と異なる第2の標的特異的配列(TS2)を含む標的特異的(TS)非プロモータープライマーを増幅反応混合物に添加する工程、
第1のcDNA鎖中に含まれる標的配列とのT2配列の特異的ハイブリッド形成によって第1のcDNA鎖とTS非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成によって第1のcDNA鎖とハイブリッド形成したTS非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの3’末端を合成的に伸長して第2のDNA鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびU1配列を含む実質的に二本鎖のDNAを作製する工程、
実質的に二本鎖のDNAの機能的プロモーター配列からRNA転写物を酵素的に転写して、5’U1領域配列、第1の標的特異的配列(TS1)、第2の標的特異的配列(TS2’)を含むRNA転写物を作製する工程、
U1配列でRNA転写物とユニバーサル配列U1’を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチドとをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってユニバーサルプロモータープライマーの3’末端を合成的に伸長してcDNA鎖を作製し、RNA転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
前の工程で作製したcDNA中の特異的配列とTS非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってTS非プロモータープライマーの3’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むdsDNAを作製する工程、および
dsDNAの機能的プロモーターから複数のRNA転写物を転写する工程であって、前記転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的in vitro核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
(項目21)
増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、5’ユニバーサル配列(U2)および3’標的特異的配列(TS2)から構成されるTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
標的核酸中の相補配列に対してTS2配列を介して標的核酸中の標的配列とTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドとをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない3’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを標的核酸中のTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼin vitro核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したTSU非プロモータープライマーの3’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第1のcDNA鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第1のcDNA鎖中の相補配列とのTS1配列の特異的ハイブリッド形成によって、5’プロモーター配列、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する3’標的特異的配列(TS1)、およびポリメラーゼによって伸長することができない遮断3’末端を含む標的特異的TSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを第1のcDNA鎖とハイブリッド形成させる工程、
テンプレートとしてのTSプロモータープロバイダー中の配列の使用によって第1のcDNAの3’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびTS1配列を含む実質的に二本鎖のDNAを作製する工程、
機能的プロモーター配列からRNA転写物を酵素的に転写して、5’標的特異的配列TS1、標的特異的配列TS2’、およびU2’配列を含むRNA転写物を作製する工程、
U2’配列でRNA転写物とユニバーサル配列U2を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド(UP2)とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的in vitro核酸合成によってUP2の3’末端を合成的に伸長してcDNA鎖を作製し、RNA転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
プロモーター配列および3’遮断末端を含むTSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを前の工程で作製したcDNAとハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、テンプレートとしてのTSプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの使用によってcDNAの3’末端を合成的に伸長して機能的二本鎖プロモーターを作製し、酵素的in vitro核酸合成によって機能的プロモーターを含むdsDNAを作製する工程、および
dsDNAの機能的プロモーターから複数のRNA転写物を転写する工程であって、前記転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的in vitro核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
(項目23)
増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目22に記載の方法。
本発明は、同一オリゴヌクレオチド中に標的特異的配列およびユニバーサル配列の両方を含む1つ以上の標的特異的ユニバーサル(TSU)オリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物を含む。本明細書中に記載のTSUプライマーは、5’プロモーター配列、第1の内部ユニバーサル配列(U1)、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第1の3’標的特異的配列(TS1)から構成される少なくとも1つのTSUプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含む。かかる組成物は、さらに、第2の5’ユニバーサル配列(U2)およびTS1と異なる第2の3’標的特異的配列(TS2)から構成される少なくとも1つのTSU非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含むことができる。TSUプロモータープライマーおよびTSU非プロモータープライマーを、複合体中で、TSUプライマーのユニバーサル配列を連結するS−オリゴヌクレオチドの使用によって連結することができ、この連結は、S−オリゴヌクレオチドの相補末端配列へのハイブリッド形成を介する。組成物は、さらに、5’プロモーター配列および3’U1配列から構成される少なくとも1つのユニバーサルプロモータープライマーを含むことができ、第2のユニバーサル配列(U2)と実質的に同一のユニバーサル配列から構成される少なくとも1つのユニバーサルプライマーを含むこともできる。これらの組成物は、オリゴヌクレオチドの構造的態様および機能的態様がこれらの合成のために選択される選択配列中に存在する限り、オリゴヌクレオチドの任意の特定の成分のために使用される任意の特定の配列を必要としない。
めのアッセイで使用される全てのTSUプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーで同一であるが、同一または異なるRNAポリメラーゼと共に機能する異なるプロモーター配列を使用することができる。当業者は、多数の異なる配列を、本明細書中に記載の組成物の範囲内であるTSUオリゴヌクレオチド、S−オリゴヌクレオチド、およびユニバーサルプライマーに組み込むことができ、核酸増幅の当業者が本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの構造的および機能的特徴の説明に基づいて選択することができ、日常的な試験方法の使用によって機能性を証明することができることを認識するであろう。
複数のHPV型の検出のためのユニバーサルTMA(uTMA)系
本実施例は、高リスクの子宮頸癌発症に関連する少なくとも12のヒトパピローマウイルス(HPV)型(高リスクHPV型)を検出するための系における「ハーフuTMA(half uTMA)」と呼ばれるユニバーサル等温増幅の実施形態の能力を示す。標的は、200または1,000コピー/反応(c/rxn)の指定のHPV型の1つのin
vitro転写物であった。標的捕獲、増幅、およびハイブリッド形成防御アッセイ(hybridization protection assay)(HPA)の使用によるプローブ検出の全てを、実質的に以前に記載のように行った(標的捕獲についての米国特許第6,110,678号および同第6,534,273号、TMAについての米国特許第5,399,491号および同第5,554,516号、ならびにHPVについての米国特許第5,283,174号および同第5,639,604号)。標的捕獲混合物は、TC試薬中に、2pmolの配列番号28〜32の各標的捕獲オリゴヌクレオチドを含んでいた。標的捕獲混合物は、5pmolの配列番号1〜9の各HPV TSU T7
プロモータープライマーをさらに含んでいた。これらの各プライマーは、標的特異的領域、ユニバーサルT7プライマー配列、およびT7プロモーター領域を含んでいた。増幅緩衝液は、TMA実施のための試薬+各15pmolの配列番号33のユニバーサルT7プライマーおよび配列番号10〜13のTS(標的特異的)非T7プロモーターを含んでいた。
高リスクHPV型の検出のためのユニバーサルTMA系の感度
本実施例は、12の高リスクHPVウイルス型を検出するための2つのユニバーサル配列を含む系における「全uTMA(full uTMA)」と呼ばれるユニバーサル等温増幅の実施形態の能力を示す。標的は、200または2,000コピー/反応の指定のHPV型の1つのin vitro転写物であった。標的捕獲、増幅、およびHPA検出工程の全てを、異なるTSUプライマーの組み合わせを使用すること以外は実施例1に実質的に記載のように行った。標的捕獲混合物は、2pmolの配列番号28、29、30、31、および32の各TCオリゴヌクレオチドを含んでいた。標的捕獲混合物は、12の高リスクHPV型を検出するためにデザインされたS−オリゴヌクレオチドTSUプライマー複合体をさらに含んでいた。TSUプライマー複合体を、5pmolのTSU T7プロモータープライマーと10pmolの配列番号35のS−オリゴヌクレオチドおよび15pmolの対応するTSU非T7プライマーとのハイブリッド形成によって形成した。S−オリゴヌクレオチドプライマー複合体は、以下のTSU T7プロモータープライマーおよびTSU非T7プライマーの組み合わせを有するハイブリッド形成複合体中の配列番号35のS−オリゴヌクレオチドからなる:配列番号1および14、配列番号2および14、配列番号3および14(HPV型の関連群に指向する3つのTSU T7プライマーのために同一のTSU非T7プライマーを使用した)、配列番号4および15、配列番号5および16、配列番号6および17、配列番号7および18、配列番号8および15、および配列番号9および15(HPV型の関連群に指向する両方のTSU T7プライマーのために同一のTSU非T7プライマーを使用した)。各TSU T7プロモータープライマーは、標的特異的領域、ユニバーサルT7プライマー配列、およびT7プロモーター領域を含んでいた。各TSU非T7プライマーは、標的特異的領域およびユニバーサル非T7プライマー配列を含んでいた。各S−オリゴヌクレオチドプライマー複合体を個別に形成した後、これらを標的捕獲混合物中で組み合わせた。増幅緩衝液は、15pmolの配列番号33のユニバーサルT7プロモータープライマーおよび配列番号34のユニバーサル非T7プライマーを含んでいた。
uTMA系を使用した臨床サンプル由来のHPV RNAの検出
本実施例は、実施例2に記載の「全uTMA」系がアルコールベースの液体媒体(CYTYC(商標))中に保存された頸部スワブまたは擦過サンプル由来のHPV RNAを検出することができることを示す。標的捕獲反応中で100μlの液体媒体サンプルを500μlの標的捕獲混合物に添加すること以外は、実施例2に記載のように手順を行った。
逆標準TMAを使用した単一または多重様式でのPCA3 RNAの検出
本実施例では、標準的な(すなわち、非ユニバーサルの)形式で逆TMA(RS−TMA)を行った。アッセイを、PCA3の標的捕獲、増幅および検出に必要なオリゴヌクレオチドのみを含む単一様式、またはPCA3およびPSAの両方の標的捕獲、増幅および検出に必要なオリゴヌクレオチドを含む多重様式のいずれかで行った。アッセイを、上記の一般的なプロトコールと実質的に同等に行った。具体的には、PCA3 in vitro転写物(IVT;配列番号62)を、反応あたり106、104、または102コピーで水/STM(1:1)に加えた。単一様式で実施したサンプルについて、5pmol
PCA3 TCプローブ(配列番号53)、2pmol PCA3ブロッカー(配列番号51)、および5pmolのPCA3非T7(NT7)プライマー(配列番号49)をTCRに添加し、15pmolのPCA3非T7(NT7)プライマー(配列番号49)、10pmolのPCA3 T7プロモータープロバイダー(配列番号50)、および12pmol PCA3分子トーチ(配列番号52)を増幅試薬に添加した(本実施例および他の実施例においてここでおよび後に示す量は、別途示さない限り、反応あたりの量である)。多重様式で実施したサンプルについて、上記列挙のPCA3オリゴマーに加えて、5pmol PSA TCプローブ(配列番号60)、2pmol PSAブロッカー(配列番号58)、および5pmolのPSA NT7プライマー(配列番号56)もTCRに添加し、15pmolのPSA NT7プライマー(配列番号56)、10pmolのPSA T7プロモータープロバイダー(配列番号57)、および12pmol PSA分子トーチ(配列番号59)を増幅試薬に添加した。各サンプルについて、3または4回繰り返した。
(実施例5)
逆ユニバーサル(ハーフ)TMAを使用した単一様式および多重様式でのPCA3 RNAの検出
本実施例では、ユニバーサル(ハーフ)TMA形式で逆TMAを行った(RUh−TMA)。本形式では、特異的標的結合領域およびオリゴヌクレオチドの5’末端のユニバーサル領域を含む標的特異的ユニバーサルNT7プライマー(TSU NT7)を、標的捕獲工程で標的に結合する。過剰なTSU−NT7を、洗い流す。TSU−NT7は、多重アッセイで検出すべき各分析物のための標的捕獲工程に含まれる。増幅反応では、ユニバーサルNT7プライマー(全TSU−NT7プライマーのユニバーサル配列と同一の配列)を添加し、これを、多重反応で検出すべき全分析物の増幅におけるNT7プライマーとして使用する。増幅反応でも、標的特異的T7プロモータープロバイダー(TS−T7)を、多重アッセイで検出すべき各標的のために添加する。この形式の略図を図15に示す。
(実施例6)
S−オリゴ形式で逆ユニバーサル(全)TMA(RUf−TMA)を使用した単一様式および多重様式でのPCA3 RNAの検出
本実施形態では、ユニバーサル(全)TMA形式で逆TMAを行った(RUh−TMA)。ユニバーサル(全)TMAでは、TSU−NT7およびTSU−T7プロバイダーから増幅を開始し、その後の増幅ラウンドを、ユニバーサルNT7プライマーおよびユニバーサルT7プロバイダーによって駆動する。開始に必要なプライマーおよびプロバイダーを有する各標的を準備し、依然として増幅反応ではユニバーサルプライマーおよびプロバイダーのみを含むように、TSU NT7プライマーおよびTSU T7プロバイダーを合わせ、この複合体を標的捕獲工程で(TSU−NT7の標的特異的領域の標的とのハイブリッド形成を介して)標的に結合し、過剰な複合体を洗い流す。増幅では、TSU−NT7プライマーを伸長し、RNアーゼHを介した標的の消化後、TSU−NT7プライマーに連結したTSU−T7プロバイダーの標的特異的領域はcDNAに結合し、増幅を開始する。増幅試薬中に存在するユニバーサルNT7プライマーおよびT7プロバイダーを使用して、増幅を継続する。
(実施例7)
単一様式および多重様式でのPCA3 RNAの検出
本実施形態では、実施例6と非常に類似したユニバーサル(全)TMA形式で逆TMA(RUh−TMA)を行った。しかし、S−オリゴ複合体を介する代わりに、直接ハイブリッド形成オリゴ(DH−オリゴ)複合体を使用してTSU NT7プライマーおよびTSU T7プロバイダーを相互に連結した。この様式では、TSU NT7プライマーおよびTSU T7プロバイダーを、S−オリゴ複合体のような介在配列を使用せずに相互に直接ハイブリッド形成する。図17は、DH−オリゴ複合体の例を示し、この場合、T7プロバイダーのT7プロモーター領域を介して生じる結合を有する。
(実施例8)
CL−オリゴ形式で逆ユニバーサル(全)TMA(RUf−TMA)を使用した単一様式および多重様式でのPCA3 RNAの検出
本実施形態では、実施例6の記載と非常に類似したユニバーサル(全)TMA形式で逆TMA(RUf−TMA)を行った。しかし、S−オリゴ複合体を介する代わりに、共有結合オリゴ(CL−オリゴ)複合体を使用してTSU NT7プライマーおよびTSU T7プロバイダーを相互に連結した。この様式では、TSU NT7プライマーおよびTSU T7プロバイダーを、各オリゴマーの5’末端で相互に共有結合する。種々の方法を使用して、かかる結合を行うことができる。1つの可能なスキームの例を、図18に概略的に示す。この場合、NT7プライマーおよびT7プロバイダーを、2オリゴマー間の2つのC9リンカーを使用して、5’−5’で連結する。
DNA合成機(Applied Biosystems,Foster City,California)を使用して合成した。T7プロバイダーを、5’−アルデヒド(特に、SoluLink,San Diego,Californiaのホスホルアミダイト)および逆極性dC(特に、Biosearch TechnologiesのControl Pore Glass(CPG)試薬)を使用して合成した。NT7プライマーを、5’C6 アミノリンカー(Glen−Research)を使用して合成した。両オリゴに、標準的条件を使用して、切断および脱保護を行った。次いで、150mM NaClを含む100mMリン酸緩衝液(pH7.40)中での室温で2時間のヒドラジン−NHSエステル(SoluLink)とのインキュベーションによって、二官能性スペーサーをNT7プライマーに結合した。次いで、反応混合物を、酢酸ナトリウム(pH
5.1)を使用して沈殿させ、ペレットを、10%過剰の5’アルデヒド修飾T7プロバイダーを含む100mM MOPS緩衝液(pH 4.8)中に溶解した。この混合物を、室温で一晩静置し、その後に脱塩し、PAGEによって精製した。
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