JP2016023142A - 口臭抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本願発明者らは、鋭意研究の結果、オリーブ葉エキスが口臭を抑制する効果を有することを見出した。
【選択図】図1
Description
培養唾液から発生するVSCsの各サンプルによる抑制効果を確認するための試験を行った。
試験方法は以下のとおりであった。
3名の口腔疾患を有さない被験者(平均29.7±4.0歳)が、午後4時から6時にパラフィンを咀嚼し、刺激唾液10〜15mLをチューブに吐出した。3名分の唾液は、それぞれボルテックスし、ガーゼでろ過後、等量ずつ混合した。18mL容の密閉試験管(テフロン(登録商標)コーティング済)中、試験唾液1mLとサンプル溶液1mLを混合し、あるいは、コントロールとして、サンプル溶液を加えずに、蒸留水1mLを加え、37℃で嫌気条件下にて約20時間インキュベートした。サンプル溶液は、オレウロペイン(オリーブ葉から精製)、オリーブ葉エキスとして、オピエース(エーザイフード・ケミカル株式会社)、エピガロカテキンガレート(EGCg)、グルコン酸亜鉛を用い、オレウロペインは最終濃度が50ppmとなるよう、その他は、最終濃度が100ppmとなるように調製された。
なお、オピエースはオリーブ葉エキス70%と賦形剤であるデキストリン30%からなる。オリーブ葉エキス中の50%がオレウロペインであり、賦形剤を含むオピエース中のオレウロペイン含量は35%と換算される。本実験では、オリーブ葉エキス濃度が反応液中で100ppmとなるよう調製された、すなわち、オピエースとしての、反応液中の濃度は143ppmである。
プロテアーゼ活性阻害試験
各サンプルによる抑制効果を確認するための試験を菌の粗酵素液を用い、プロテアーゼ(コラゲナーゼ、BApNA分解酵素、ペプチダーゼ)阻害試験あるいは、VSCs産生酵素活性阻害試験を行った。
実施例2および3で使用した菌株は以下のとおりである。
次の菌株の粗酵素液を以下のとおり調製した。
P. g(菌体外成分由来の粗酵素液の調製)
P. gを3.0g/Lのイーストエクストラクトと5mg/Lのへミンおよび0.5mg/Lのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地中で培養した。はじめに、嫌気条件下で37℃にて2日間前々培養し、前培養用の培地に前々培養液を10%植菌し、嫌気条件下で37℃にて2日間前培養した。本培養用の培地に前培養液を10%植菌し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。10,000×g、4℃で20分間遠心分離して上清を回収した。上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて飽和硫酸アンモニウム溶液80%とし、4℃にて一晩静置した。12,000×g、4℃で30分間遠心分離して沈殿を回収後、5mM塩化カルシウム含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に懸濁した。5mM塩化カルシウム含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)に対して4℃にて2日間透析した。透析内液を25,000×g、4℃にて30分間遠心分離して上清を回収後-80℃保存し、使用時に溶解して使用した。粗酵素液はBCAプロテインアッセイキット(Thermo Scientific, Rockford, IL., USA.)を用い、タンパク濃度を算出した。粗酵素液のタンパク濃度は0.27mg/mLであり、反応系で0.04mg protein/mLに希釈して用いた。
P. iを3.0g/Lのイーストエクストラクトと5mg/Lのへミンおよび0.5mg/Lのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地で培養した。はじめに、嫌気条件下で37℃にて2日間前々培養し、前培養用の培地に前々培養液を10%植菌し、嫌気条件下で37℃にて2日間前培養した。本培養用の培地に前培養液を10%植菌し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。10,000×g、4℃で20分間遠心分離して上清を回収した。上清に飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて飽和硫酸アンモニウム溶液80%とし、4℃にて一晩静置した。12,000×g、4℃で30分間遠心分離して沈殿を回収後、5mM塩化カルシウム含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に懸濁した。5mM塩化カルシウム含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に対して4℃にて2日間透析した。透析内液を25,000×g、4℃にて30分間遠心分離して上清を回収後-80℃保存した。これを菌体外成分由来のペプチダーゼ粗酵素とした。粗酵素液はBCAプロテインアッセイキットを用い、タンパク濃度を算出したところ、0.34mg/mLであった。
P. i ATCC25611を3.0g/Lのイーストエクストラクトと5mg/Lのへミンおよび0.5mg/Lのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地中、嫌気条件下で37℃にて1日間前培養した。その後本培養用のトリプチケースソイブロス培地に前培養液を20%植菌し、嫌気性条件下で37℃にて2日間培養した。8,000×g、4℃で遠心分離して菌体を回収し、100mM リン酸バッファー (pH 7.6)に懸濁、超音波破砕機(model UR-200P, トミー精工, 東京, 日本)を用い、出力20Wにて0℃で7.5分間処理した。20,000×g、4℃にて20分間遠心分離して上清を回収後-80℃保存した。粗酵素液はBCAプロテインアッセイキットを用い、タンパク濃度を算出したところ、1.86mg/mLであった。
S. aを3.0g/Lのイーストエクストラクトと5mg/Lのへミンおよび0.5mg/Lのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地中、嫌気条件下で37℃にて1日間前培養した。その後本培養用の培地に前培養液を20%植菌し、嫌気性条件下で37℃にて2日間培養した。8,000×g、4℃で遠心分離して菌体を回収し、100mM リン酸バッファー(pH 7.6)に懸濁、超音波破砕機(model UR-200P, トミー精工, 東京, 日本)を用い、出力170Wにて0℃で20分間処理した。20,000×g、4℃にて20分間遠心分離して上清を回収後-80℃保存した。粗酵素液はBCAプロテインアッセイキットを用い、タンパク濃度を算出したところ、0.89mg/mLであった。
コラゲナーゼ活性を有する対象として上記P. g粗酵素液を用いた。実験ではP. g粗酵素液は0.04mg protein/mLに希釈して用いた。コラゲナーゼ活性測定はコラゲノキットCLN100(コラーゲン技術研修会, 東京, 日本)を用いた。黒色エッペンドルフチューブ中に基質溶液0.2mLとサンプル0.1mLを加え、35℃で5分間保温後、P. g粗酵素液0.1mLを加えて35℃で2時間反応させた。反応停止液を0.01mL加えた後、35℃で1時間静置した。抽出液を0.4mL加えて3,000×g、4℃にて10分間遠心分離し、上清を回収した。上清を5mM塩化カルシウム含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)を用いて5倍希釈してから蛍光強度(Ex. 495nm, Em. 520nm)を蛍光分光光度計(RF-5000, 島津製作所, 京都, 日本)を用いて測定した。
BApNA分解活性を有する対象として上記P. g粗酵素液を用いた。実験ではP. g粗酵素液は0.1mg protein/mLに希釈して用いた。サンプルを蒸留水に溶解し、96ウェルプレートにてサンプル液50μLを蒸留水を用いて2倍段階希釈した。Nα-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(BApNA)を100mMとなるようにDMSOに溶解後、蒸留水を用いて4mM BApNA溶液を調製した。各ウェルに4 mM BApNAを50μLずつ添加後、P.g FDC381菌体破砕液を終濃度0.1mg/mLとなるように100μLを添加し、37℃で60分間反応させた。反応後、直ちにマイクロプレートリーダー(SH-1000, コロナ電気, 茨城, 日本)を用いてOD405を測定した。サンプル無添加の吸光度に対する吸光度の減少率から各濃度における阻害率を算出した。
ペプチダーゼ活性を有する対象として上記P. i(菌体外成分由来および菌体破砕液由来)、粗酵素液、及びS. a粗酵素液を用いた。サンプルを蒸留水に溶解し、96ウェルプレートにてサンプル液100μLを蒸留水を用いて2倍段階希釈した。H-Ala-Pro-pNAまたはH-Lys-Ala-pNAを4mMとなるように蒸留水に溶解し、基質液とした。各ウェルに基質液を50μLずつ添加後、粗酵素液を100 μL添加(終濃度がP. i菌体外成分由来は0.05mg/mL、P. i菌体破砕液は0.03mg/mL、S. a は0.02mg/mLであった)し、37℃で60分間反応させた。反応後、直ちにマイクロプレートリーダー(SH-1000, コロナ電気, 茨城, 日本)を用いてOD405を測定した。サンプル無添加の吸光度に対する吸光度の減少率から各濃度における阻害率を算出した。
VSCs産生酵素活性阻害試験
1)粗酵素液の調製
次の菌株の粗酵素液を以下のとおり調製した。
F. n、P. i、S. a、P. g(菌体破砕液由来の粗酵素液の調製)
F. n、P. i、S. aまたはP. gは以下のとおり調製された。すなわち、それぞれの菌株は、3.0g/Lのイーストエクストラクトと5 mg/Lのへミンおよび0.5mg/Lのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地中で培養された。はじめに、嫌気条件下で37℃にて1日間前培養した。その後本培養用のトリプチケースソイブロス培地に前培養液を20%植菌し、嫌気性条件下で37℃にて2日間培養した。8,000×g、4℃で遠心分離して菌体を回収し、100 mM リン酸バッファー(pH 7.6)に懸濁、超音波破砕機(model UR-200P, トミー精工, 東京, 日本)を用い、出力20Wにて0℃で7.5分間処理した。20,000×g、4℃にて20分間遠心分離して上清を回収後-80℃保存し、使用時に溶解して使用した。粗酵素液はBCAプロテインアッセイキット(Pierce, Rockford, IL, USA)を用い、タンパク濃度を算出した。粗酵素液のタンパク濃度はF. nは2.7mg/mL、P. iは0.81mg/mL、S. aは0.89mg/mL、P. gは2.2mg/mLであり、以下の測定ではそれぞれ0.3mg protein/mLに希釈して用いた。
上記で調製されたF. n、P. i、S. aの粗酵素液を対象に、メチレンブルー法により産生した硫化水素濃度を測定した。0.3mg protein/mL粗酵素、1mMシステイン、10μMピリドキサールリン酸、2.5mMジチオエリトリトール及びサンプルを1mLの10mMリン酸緩衝液(pH 7.5)中で混合し、37℃で60分間反応させた。0.1mLの20mM N’-N’-ジメチル-p-フェニレンジアミン塩酸塩/7.2 N塩酸、0.1mLの30mM塩化鉄(III)/1.2 N塩酸を添加して反応を停止後、室温で30分間静置してからOD670を測定した。上記反応でシステインだけを除いた反応液をサンプルブランクとした。
上記で調製されたF. n、P. gの粗酵素液を対象にメチルメルカプタン産生反応の副生成物である-ケト酪酸を以下の方法により検出した。0.3mg protein/mL粗酵素、30mMメチオニン、50μMピリドキサールリン酸及びサンプルを1mLの10mMリン酸緩衝液(pH 7.5)中で混合し、37℃で60分間反応させた。0.5mLの6%過塩素酸水溶液を添加して反応を停止後、3,000×gで10分間遠心分離して上清を得た。50mLの0.05% 3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン水溶液と100mLの1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)からなる検出試薬1.2mLを上清0.4mLに添加して50℃で30分間反応後、室温に戻してOD335を測定した。上記反応でメチオニンだけを除いた反応液をサンプルブランクとした。
様々なメーカーが市販するオリーブ葉エキス及び精製されたオレウロペインを用い、それぞれのVSCsの抑制率を測定した。それぞれのオリーブ葉エキスは、含有するオレウロペインの量も様々であった。本実施例では、実施例1と同様の試験を行い、サンプル溶液として、各製剤中の賦形剤(デキストリン、シリカ、アラビアガム、微粒二酸化ケイ素)を除いたオリーブ葉エキスおよび果実エキスの量として、最終濃度が100ppmとなるように、あるいは、オレウロペインを用い最終濃度が50ppmとなるようにした。結果を表11に示す。
結果より、オレウロペイン含有量が18%以上であれば、VSCsに対して抑制効果を示すことがわかった。なお、オレウロペイン含有量が18%とは、最終濃度でオレウロペインが18ppmである。また、オレウロペイン単独で50ppmでも、VSCsに対して高い抑制効果を示すことが分かった。
オピエースまたはオレウロペインを用いて、以下の処方により、練り歯磨、含嗽剤、消臭スプレー、口臭用スプレー、錠剤、粉末剤等の組成物、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット等の菓子、アイスクリーム、シャーベット、氷菓等の冷菓、飲料、スープ及びジャム等の飲食品を製造した。なお、これらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
練り歯磨の処方
炭酸カルシウム 50.0重量%
グリセリン 20.0
カルボオキシメチルセルロース 2.0
ラウリル硫酸ナトリウム 2.0
香料 1.0
サッカリン 0.1
オリーブ葉エキス 0.5
クロルヘキシジン 0.01
水 残
100.0
含嗽剤の処方
エタノール 2.0重量%
香料 1.0
サッカリン 0.05
塩酸クロルヘキシジン 0.01
オリーブ葉エキス 0.5
水 残
100.0
含嗽剤の処方
エタノール 2.0重量%
香料 1.0
サッカリン 0.05
塩酸クロルヘキシジン 0.01
オレウロペイン 0.25
水 残
100.0
消臭スプレーの処方
エタノール 49.5重量%
オリーブ葉エキス 0.5
水 50.0
100.0
これを噴射ガス(窒素ガス)とともにエアゾール容器に充填し、消臭スプレーを調製した。
口臭用スプレーの処方
エタノール 10.0重量%
グリセリン 5.0
オリーブ葉エキス 0.5
香料 0.05
着色料 0.001
水 残
100.0
口臭用スプレーの処方
エタノール 10.0重量%
グリセリン 5.0
オレウロペイン 0.25
香料 0.05
着色料 0.001
水 残
100.0
トローチ剤の処方
ブドウ糖 72.3重量%
乳糖 19.0
アラビアゴム 6.0
香料 1.0
モノフルオロリン酸ナトリウム 0.7
オリーブ葉エキス 0.5
100.0
チューインガムの処方
ガムベース 20.0重量%
砂糖 55.0
グルコース 15.0
水飴 9.0
香料 0.5
オリーブ葉エキス 0.5
100.0
チューインガムの処方
ガムベース 22.5重量%
砂糖 55.0
グルコース 15.0
水飴 9.0
香料 0.5
オレウロペイン 0.25
100.0
キャンディの処方
砂糖 50.0重量%
水飴 34.0
香料 0.5
オリーブ葉エキス 0.5
水 残
100.0
キャンディの処方
砂糖 52.5重量%
水飴 34.0
香料 0.5
オレウロペイン 0.25
水 残
100.0
錠菓の処方
砂糖 76.4重量%
グルコース 19.0
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
香料 0.2
オリーブ葉エキス 0.1
水 残
100.0
錠菓の処方
砂糖 76.4重量%
グルコース 19.0
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
香料 0.2
オレウロペイン 0.05
水 残
100.0
グミゼリーの処方
ゼラチン 60.0重量%
水飴 23.0
砂糖 8.5
植物油脂 4.5
マンニトール 2.8
レモン果汁 1.0
オリーブ葉エキス 0.2
100.0
チョコレートの処方
粉糖 39.8重量%
カカオビター 20.0
全脂粉乳 20.9
カカオバター 17.0
マンニトール 2.0
オリーブ葉エキス 0.1
香料 0.2
100.0
ビスケットの処方
薄力粉1級 25.59重量%
中力粉1級 22.22
精白糖 4.8
食塩 0.73
ブドウ糖 0.78
パームショートニング 11.78
炭酸水素ナトリウム 0.17
重亜硫酸ナトリウム 0.16
米粉 1.45
全脂粉乳 1.16
代用粉乳 0.29
オリーブ葉エキス 0.1
水 残
100.0
アイスクリームの処方
脱脂粉乳 50.0重量%
生クリーム 25.0
砂糖 10.0
卵黄 10.0
オリーブ葉エキス 0.1
香料 0.1
水 残
100.0
シャーベットの処方
オレンジ果汁 25.0重量%
砂糖 25.0
卵白 10.0
オリーブ葉エキス 0.2
水 残
100.0
飲料の処方
オレンジ果汁 30.0重量%
異性化糖 15.24
クエン酸 0.1
ビタミンC 0.04
香料 0.1
オリーブ葉エキス 0.1
水 残
100.0
スープの処方
牛乳 60.00重量%
たまねぎ 20.00
にんじん 10.00
野菜ブイヨン 1.00
バター 0.10
コショウ 0.05
塩 0.05
オリーブ葉エキス 0.1
水 残
100.0
ジャムの処方
果肉 4.0重量%
砂糖 65.0
清澄果汁 25.0
クエン酸 0.5
オリーブ葉エキス 0.1
水 残
ガム咀嚼唾液を用いた、唾液から発生するVSCsの抑制効果
オリーブ葉エキスを7.86mg/粒(オピエース11.2mg/粒)配合したガムを作成した。EGCgを3mg/粒配合したガム、グルコン酸亜鉛を7.86mg/粒配合したガム、効能素材を含まないブランクガムを同様に作成し、試験に用いた。
ブランクガムと有望素材配合ガム2種類を同時に試験する場合、ガム咀嚼と唾液の吐出を繰り返すとVSCsの発生源となる剥離上皮細胞と口臭原因菌の量は減っていくと考えられる。そのため、まずパラフィン(モリタ, 東京, 日本)を咀嚼した唾液を回収して十分な剥離上皮細胞と口臭原因菌を確保した後、ガム咀嚼唾液を回収した。その際ガムから溶出した成分が口腔内に残らないように、ガム咀嚼前後に水を用いて洗口した。口腔疾患を有さない被験者3名(平均 29.74.0歳)よりパラフィン咀嚼唾液10〜15mLを50mLチューブに回収し、ボルテックスおよびガーゼろ過後、等量混合した。ガム咀嚼唾液については被験者の1名(26歳)がガム2粒を5分間咀嚼し、咀嚼開始0分から5分までの唾液を全量回収し、同様にボルテックスおよびガーゼろ過した。各種ガムの咀嚼についてはブランクガム、EGCg配合ガム、オリーブ葉エキス配合ガム、グルコン酸亜鉛配合ガムの順で行った。18mL容のテフロン(登録商標)コーティングねじ栓試験管中試験唾液1mLとサンプル唾液1mLを混合して嫌気条件下37℃にて約20時間インキュベートし、実施例1と同様に評価した。
Claims (9)
- オリーブ葉エキスを含むことを特徴とする口臭抑制剤。
- 口腔内細菌の酵素活性を阻害することを特徴とする請求項1の口臭抑制剤。
- 酵素活性がプロテアーゼ活性またはVSCs産生酵素活性であることを特徴とする請求項2の口臭抑制剤。
- プロテアーゼが、コラゲナーゼ、BApNA分解酵素またはペプチダーゼであることを特徴とする請求項3に記載の口臭抑制剤。
- VSCs産生酵素が硫化水素産生酵素またはメチルメルカプタン産生酵素であることを特徴とする請求項3に記載の口臭抑制剤。
- 前記オリーブ葉エキスがオレウロペインを18%(重量)以上含むことを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の口臭抑制剤。
- 前記オリーブ葉エキスがオレウロペインを50%(重量)以上含むことを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の口臭抑制剤。
- オレウロペインを含むことを特徴とする口臭抑制剤
- 請求項1から8のいずれか1項に記載の口臭抑制剤を含む飲食品。
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