JP2016019736A - シナプス小胞サイクリングアッセイおよびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)のもとで、2008年9月4日に出願された米国仮出願番号第61/094,361号からの優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
剤:本明細書において、用語「剤」(「試験剤」または「候補剤」とも呼ぶ)とは、潜在的モジュレータとして試験することができる任意の化合物または組成物を指す。用いることのできる剤の例としては、限定することなく、小分子、抗体、抗体断片、siRNA、shRNA、核酸分子(RNA、DNA、またはDNA/RNAハイブリッド)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質、微生物、天然産物などが挙げられる。いくつかの態様において、剤は単離することができるか、または単離されない。非限定的例として、剤は剤のライブラリであることができる。複数剤の混合物がモジュレータとして見出された場合、次にプールをさらに個別の成分に精製して、どの成分が実際に標的活性のモジュレータであるかを決定することができる。
本発明は、シナプス小胞サイクリングモジュレータを同定するためのシステムおよび方法を提供する。特に本発明は、シナプス小胞サイクリングアッセイを提供する。いくつかの態様において、シナプス小胞サイクリングアッセイは、シナプス小胞サイクルの動態、効率、および/または他の特徴をモニタリングするために用いられる。いくつかの態様において、シナプス小胞サイクリングアッセイは、シナプス小胞サイクルの少なくとも1つの側面に影響を及ぼす(例えば刺激するおよび/または阻害する)物質を同定するために用いられる。
ニューロンが発火すると、活動電位の到達が引き金となって、エキソサイトーシスを介して神経伝達物質の放出が生じる。シナプス前神経終末内において、神経伝達物質を含むシナプス小胞がシナプス前膜に移動されてこれにドッキングし、カルシウムイオン・センシングについてプライミングされ、最終的にはシナプス前膜と融合する。到達した活動電位は、活動電位のダウンストロークにおける電圧依存性・カルシウム選択的イオンチャネルを通して、カルシウムイオンの流入をもたらす(テール電流)。カルシウムイオンは次に生化学的カスケードの引き金となり、これはシナプス小胞のシナプス前膜との融合と、神経伝達物質のシナプス間隙への放出をもたらす。シナプス小胞融合は、SNAREで知られているシナプス前終末での1セットのタンパク質の活動により駆動されている。この融合により付加された膜は、後にエンドサイトーシスにより回収され、エンドサイトーシスには以下のステップが関与する:クラスリン媒介性核形成、シナプス前膜の陥入、シナプス小胞のシナプス前膜からの分裂、およびエンドサイトーシスされたシナプス小胞からの、クラスリン除去。エンドサイトーシスされたシナプス小胞は、シナプス前終末内に移動されてソートされ、その内腔には神経伝達物質が再負荷される。
本発明は、シナプス小胞サイクルを調節する物質を同定するための、システムおよび方法を提供する。かかる方法は、典型的には以下を含む:機能性シナプス小胞サイクリングまたはシナプス小胞サイクリングの少なくとも1つの側面を示すシナプス前終末を含む細胞または細胞培養物、レポーター(例えば、シナプス小胞サイクリングまたはシナプス小胞サイクリングの少なくとも1つの活性を追跡するのに有用なレポーター)、刺激システム(例えば、シナプス小胞サイクリングの引き金となる、電気的、音響的、超音波、光学、または生化学的刺激システム、例えば活動電位の開始を介するもの)、および検出システム(例えば、レポーターにより生成されたシグナルを捕らえるための画像化システム)。
シナプス小胞サイクルを調節する物質を同定するためのシステムおよび方法は、典型的には神経細胞の使用を含む。いくつかの態様において、神経細胞はシナプス前終末を有し、ここでシナプス前終末は、機能性シナプス小胞サイクルを形成する。いくつかの態様において、神経細胞はシナプス前終末を有さないが、シナプス前終末を形成するよう誘導することができ、ここでシナプス前終末は、機能性シナプス小胞サイクルを有する。細胞は、細胞を特定条件下で培養および/またはインキュベートすることにより、シナプス前終末を形成するよう誘発してもよく、ここでシナプス前終末は、機能性シナプス小胞サイクルを有する。
本発明に好適なレポーター(本明細書ではレポーター分子とも呼ばれる)は、1または2以上のシナプス小胞サイクリング活性を示すシグナルを発生または生成することができる、任意のレポータータンパク質、遺伝子、化合物、またはその他の分子または物質を含む。例えば、FM染料(例えばFM1−43、FM2−10、FM4−64など)および、シナプス小胞タンパク質の内腔ドメインに対する蛍光標識抗体(例えばシナプトタグミン抗体)を、シナプス小胞サイクルを追跡するために用いることができる。FM1−43は、親水性および疎水性領域の両方を有する両親媒性分子である、スチリルピリジニウム分子(スチリル分子またはスチリル染料としても知られている)である。ピリジニウム基を含む親水性領域(一般にヘッドと呼ぶ)は、二重結合架橋がその間にある2つの芳香族環からなり、これは染料分子の蛍光体部分である。この蛍光体基は、約500nmでの励起および約625nmでの発光を有する。
ATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGGACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTTCATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGTGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACGATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAACCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCCACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(配列番号:2;シナプトフィジン−pHluorin)。
ATGGAGTTCAGACAGGAGGAGTTCCGAAAACTTGCAGGCCGAGCACTGGGTCGACTGCATCGCTTGCTGGAGAAGCGGCAGGAGGGAGCAGAAACACTGGAGCTCAGCGCTGACGGCCGGCCCGTCACAACCCACACTAGAGACCCACCTGTGGTAGACTGTACCTGCTTTGGCCTGCCTAGAAGGTATATCATTGCAATCATGTCTGGGCTTGGCTTCTGCATCAGTTTTGGAATTAGATGTAACCTGGGGGTTGCGATTGTGAGTATGGTCAATAACTCAACGACACACAGAGGAAGCACCTCCGGTGGATCCGGGGGGACTGGGGGAAGCATGTCCAAAGGCGAAGAACTGTTTACAGGCGTGGTGCCAATACTCGTGGAACTCGACGGCGATGTTAACGGACATAAGTTTTCCGTGTCCGGCGAGGGTGAGGGAGATGCTACATATGGAAAACTGACTCTGAAATTTATTTGTACCACCGGGAAACTGCCCGTGCCATGGCCTACCCTCGTCACTACACTGACGTATGGGGTTCAATGTTTCAGTAGGTATCCGGACCACATGAAAAGACACGATTTCTTCAAAAGCGCAATGCCCGAAGGCTACGTACAAGAACGCACTATATTCTTCAAGGACGACGGCAACTATAAAACCCGCGCAGAGGTTAAATTTGAGGGGGACACACTGGTAAATCGGATCGAGCTGAAGGGTATCGACTTTAAAGAAGACGGAAACATATTGGGCCATAAGCTGGAATACAACTATAATGATCATCAGGTGTATATCATGGCCGATAAGCAGAAAAATGGAATCAAGGCAAACTTCAAAATTAGGCACAATATTGAGGATGGGGGCGTCCAGCTGGCCGACCATTACCAGCAGAATACTCCAATAGGCGATGGACCGGTGTTGCTTCCTGATAATCACTACTTGTTTACCACTAGCACCCTCAGTAAGGATCCCAATGAGAAGCGGGACCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACTGCCGCTGGCATAACTCATGGGATGGATGAGCTCTACAAAGGAGGGACAGGGGGTACCGGTGGTAGTGGTGGAACCGGCGGCCATGTAGTGGTGCAGAAGGCCCAGTTCAATTGGGACCCAGAGACAGTGGGCTTGATCCACGGCTCTTTCTTTTGGGGTTATATCGTTACTCAAATCCCAGGCGGTTTCATTTGTCAGAAGTTCGCCGCCAACAGAGTGTTCGGCTTCGCAATAGTAGCCACCTCCACACTGAACATGCTGATTCCGTCTGCAGCCCGAGTGCACTATGGCTGTGTGATATTCGTGAGAATCCTGCAAGGTCTTGTCGAGGGCGTGACCTACCCAGCCTGTCACGGGATCTGGTCCAAATGGGCTCCACCACTGGAGCGATCCAGACTGGCGACCACTGCATTCTGTGGCAGTTACGCCGGCGCTGTCGTGGCTATGCCCCTGGCTGGTGTGCTGGTGCAGTACAGCGGATGGAGCAGCGTGTTCTACGTTTATGGCTCTTTCGGGATCTTTTGGTACCTCTTCTGGCTGCTCGTCAGCTACGAATCCCCCGCTCTGCACCCTTCCATCAGCGAGGAGGAGCGGAAATACATTGAAGACGCAATCGGTGAATCAGCAAAGCTGATGAACCCCGTGACGAAATTCAATACACCGTGGAGACGGTTTTTTACCTCCATGCCCGTGTACGCGATAATTGTTGCAAATTTCTGCCGGAGCTGGACATTCTATCTCCTCCTGATTAGCCAACCTGCCTACTTCGAAGAGGTCTTCGGGTTCGAGATCTCTAAAGTGGGTCTTGTGTCTGCGCTCCCTCACCTCGTTATGACCATTATTGTTCCTATCGGCGGGCAGATCGCTGATTTTCTTCGGTCAAGACATATTATGTCCACTACTAATGTGAGGAAGCTGATGAATTGCGGTGGGTTTGGCATGGAGGCGACCCTGCTTCTGGTGGTGGGTTACTCTCATTCCAAGGGAGTGGCGATCAGTTTCCTGGTCCTGGCCGTGGGATTTAGCGGCTTTGCCATAAGCGGTTTTAACGTTAATCACCTTGATATTGCTCCCCGCTACGCATCCATTCTCATGGGGATCAGCAACGGAGTCGGGACTCTGAGTGGAATGGTTTGCCCAATAATAGTCGGAGCGATGACTAAACATAAGACCCGAGAAGAATGGCAGTACGTGTTCCTGATTGCTAGTCTGGTCCATTACGGAGGCGTCATCTTCTATGGCGTCTTCGCCTCTGGGGAAAAACAACCATGGGCAGAGCCTGAAGAAATGTCCGAGGAAAAATGTGGGTTCGTCGGGCACGATCAGCTTGCCGGTTCTGATGAGTCCGAGATGGAGGACGAGGTTGAGCCCCCTGGGGCGCCTCCTGCACCGCCCCCAAGCTACGGCGCAACCCATAGCACTGTGCAGCCTCCTCGGCCACCTCCTCCAGTGCGGGATTACTAA(配列番号:3;vGlut−pHluorin)。
ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTCGTGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG(配列番号:4;ヒトシナプシンIプロモータ)。その他の適切なプロモータも用いることができる。例えば、一般の発現のために、CMVまたはチキンベータアクチンプロモータを用いることができる。代替的に、ニューロン特異的発現のために、ニューロン特異的エノラーゼまたはシナプシンIプロモータを用いてよい。グルタミン酸作動性特異的発現のために、vGlut1プロモータを用いてよい。GABA作動性特異的発現のために、GAD65、GAD67、ソマトスタチン、またはGABA小胞トランスポータープロモータを用いてよい。さらに他の適切なプロモータは、当業者には明らかである。
ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTCGTGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGGACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTTCATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGTGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACGATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAACCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCCACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(配列番号:5;hSyn−SypHyカセット配列)。
本発明による、調節物質を同定する、および/または特性を決定するためのアッセイは、典型的には電気刺激システムを含む。活動電位発火の電界刺激は、外部電界と細胞の細胞膜の比較的単純な抵抗特性との、物理的相互作用に基づく。典型的な細胞体を、高抵抗性のシェル(細胞膜)と比較的低抵抗性の内部(細胞質)を持つ物質と考えると、単純な静電気理論により、これを電界の中に置くと、電界強度Eと細胞体の大きさdの積で与えられる、細胞にわたる電圧降下を有することが示される。例えば電圧降下は、2つが細胞膜に対応し、1つが細胞質に対応する、1系列の抵抗器にわたって生じると考えることができる。細胞膜が細胞質より顕著に高い抵抗を有するとすると、これは、実質的にすべての電圧降下が、細胞膜にわたって生じることを意味する。細胞の片側において、膜は〜(Exd)/2により脱分極し、一方反対側では、同じ量だけ過分極する。ニューロンについては、一方の側が十分に脱分極すると、活動電位が開始されることが推測される。電位刺激には典型的に、その間に電圧降下(例えば〜10V/cm)を有して電界を発生させる電極対が関与する。非限定的例としては、典型的な細胞体直径50μmに対し、各細胞膜にわたる電圧降下は約25mVである。
一定の態様においては、音響または超音波刺激を用いて、神経細胞に活動電位を励起する。いくつかの態様においては、音響刺激は、マルチウェルプレートのウェル内の(1または2以上の)神経細胞に適用された、1または2以上の音波パルスまたは超音波パルスを含む。一定の態様において、音響トランスデューサーは、(1または2以上の)神経細胞を含むウェルに接触させるか、またはその近傍に配置することができる。いくつかの態様において、音響トランスデューサーのアレイを、神経細胞を含むウェルのアレイに空間的に適合させることができ、トランスデューサーのアレイは、神経細胞を含むウェルのアレイに接触させるか、またはその近傍に配置することができる。一定の態様において、トランスデューサーのアレイは、神経細胞を含むウェルのアレイに空間的に適合している必要はない。例えば、トランスデューサーのアレイ中のトランスデューサーは、神経細胞を含むウェルのアレイ内の、2つごと、3つごと、または4つごとのウェルに空間的に適合していてもよい。いくつかの態様において、音響トランスデューサーは、直線アレイ状に、例えばマルチウェルプレートの行または列に対応するアレイに配置してよい。種々の態様において、超音波パルスは、ニューロンに活動電位の発火を開始させる。音響または超音波刺激システムの例は、ウェブサイト:arraytherapeutic.com/research/indexに見出すことができる。
種々の態様において、シナプス小胞サイクリングプラットフォームは、シナプス小胞サイクリングに関連する活性をモニタリングするための検出システムを含む。いくつかの態様において、検出システムは、例えば複数ウェル内にある神経細胞の画像化を提供する。いくつかの態様において、検出システムは、神経細胞を含むウェル内の少なくとも1つの領域からの発光のモニタリングを提供する。種々の態様において、検出システムは、電気刺激システムと通信し、シナプス小胞サイクリングの刺激と検出を実質的に同期させることができる。
典型的には、空気対物レンズは、水浸または油浸レンズよりも低い開口数(NA)を有する。NAは、対物レンズが収集した放出フォトンの率を直接制御するため、空気対物レンズは一般に、水浸または油浸レンズよりも少ないフォトンを収集する。出願人らは、1または2以上の空気対物レンズの使用を含むことができる一定の用途、例えばハイスループットプラットフォームなどに対して、対物レンズに付随する低い収集効率は、種々の方法により補償可能であることを発見した。例えば、空気対物レンズに付随する低い収集効率は、視野内で画像化されるシナプス数の増加により、例えば、神経細胞数の増加により、視野面積サイズの増加により、および/またはレポータータンパク質発現の効率および特異性を増加させることにより、補償することができる。したがって、出願人らは、シナプス小胞サイクリングの側面を、ハイスループット様式かつ高い感受性で検出できることを発見し、例えば、神経細胞での5〜10という低い活動電位に応答するシナプス小胞サイクリングの側面を、1または2以上の低開口数空気対物レンズを用いて検出可能である。
種々の態様において、電気刺激システムおよび検出システムは、図10(ロースループットプラットフォームの例示の描写)および図11(ハイスループットプラットフォームの例示の描写)に示すように、シナプス小胞サイクリングシステムにインターフェースされ組み込まれている。マルチ電極アセンブリ600、それに付随する電子装置および検出システムは、通信リンク966、962、964、968、1062を介して中央コントローラ(例えば、コンピュータ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラなど)にインターフェースされ、実験手順、データ収集およびデータ処理は、実質的に自動化または半自動化することができる。種々の態様において、マルチ電極アセンブリ600の電極602、604は、マルチウェルプレートの上方向から、マルチウェルプレート915のウェル906内の神経細胞培養物に接触するよう配置され、検出システムは、ウェルの下に配置される。電気刺激システムおよび検出システムが中央コンピュータにインターフェースされている自動化実験手順の例として、コンピュータは以下のステップを実行することができる:(a)電子コマンドを位置決め装置945に発行して、第1ウェルを顕微鏡対物レンズ920の上に配置する、(b)顕微鏡操作パラメータ、例えばレンズの選択、フィルター設定などを初期化するコマンドを発行する、(c)CCDアレイを初期化する(例えば電源設定、ゲイン設定、電子シャッター速度)、(d)CCDアレイからのデータ受信を開始する、(e)電子コマンドを電気刺激システムに発行して、1または2以上の波形を第1ウェル内の電極に適用する、(f)波形の適用を終了するコマンドを発行する、(g)CCDアレイからのデータ受信を終了する、および(h)電子コマンドを発行して、装置945を他のウェルに配置し、サイクル(b〜h)を繰り返す。
いくつかの態様において、本発明によるシナプス小胞サイクリングアッセイは、ロースループットプラットフォームで実施される。典型的には、ロースループットアッセイシステムはより良好な光学素子(例えば落射蛍光顕微鏡)を用い、より良い解像度を提供する。その結果、いくつかの態様において、ロースループットプラットフォームは、個々のシナプスの特徴を示すことができる。典型的には、ロースループットプラットフォームは、個々の化合物の効果の特徴づけに特に有用である。例えば、特定の疾患を処置する既知の薬剤をロースループットプラットフォームで分析して、これがシナプス小胞サイクリングに影響するかどうかを決定することができる。例示のロースループットプラットフォームを、図10に示す。
いくつかの態様において、本発明によるシナプス小胞サイクリングアッセイは、ハイスループットプラットフォームで実施することができる。ハイスループットプラットフォームは、多数の候補剤または試験剤からシナプス小胞サイクリングモジュレータ(例えば刺激剤および/または阻害剤)を同定するブラインド・スクリーニングに特に有用である。一定の態様において、ハイスループットスクリーニングアッセイは、以下のステップを含むことができる:(a)本明細書に記載のように、複数の神経細胞を提供すること、(b)複数の試験剤を、複数試験剤のメンバーが複数神経細胞の各々と接触するように提供すること、(c)本明細書に記載のように、シナプス小胞サイクリングアッセイを実施すること、および(d)複数試験剤の任意のメンバーが、対照と比較して、シナプス小胞サイクリングに関連する1または2以上の活性を調節するかどうかを決定すること。
シグナル対ノイズ比の増加は、少なくとも10、20、30、40、または50Hzでの、より小さい活動電位(例えば40、20、10、5またはそれより少ない活動電位)に対するシナプス小胞サイクリング応答の測定を可能とし、全体のシナプス小胞サイクルに加えて、シナプス小胞サイクルの追加のプロセスの測定(例えば放出の確率)を可能とする。本明細書に記載のアッセイのかかる改変および変更は、本発明の範囲内である。
種々の候補剤を、シナプス小胞サイクリングの潜在的モジュレータ(例えば、阻害剤または刺激剤)について試験することができる。例示の試験剤としては、限定することなく、化合物、小分子、タンパク質またはペプチド、抗体、共結晶、ナノ結晶、微生物(例えばウイルス、細菌、真菌など)、核酸(例えばDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アプタマーなど)、炭水化物(例えば単糖類、二糖類、または多糖類)、脂質(例えばリン脂質、トリグリセリド、ステロイドなど)、天然産物、これらの任意の組み合わせを含む。候補剤はまた、コンピュータに基づく合理的薬物設計法を用いて設計することもできる。典型的には、複数の試験剤(例えば候補剤のライブラリ)を、潜在的モジュレータ用のスクリーニングアッセイにおいて試験する。いくつかの態様において、試験剤は、生分解性および/または生体適合性である。
いくつかの態様において、シナプス小胞サイクリングの潜在的モジュレータは、組み換えバクテリオファージにより産生されたランダムなペプチドライブラリ、例えば、Scott and Smith, Science, 249:386-390 (1990);Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990);Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)、または化学的ライブラリをスクリーニングすることにより、得ることができる。「ファージ法」を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる(106〜108の化学的実体)。第2のアプローチは本質的に化学的方法を用い、この例としては、Geysen method(Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715 (1986);Geysen et al. J. Immunologic Method 102:259-274 (1987))およびFodor et al.(Science 251:767-773 (1991))の方法がある。Furka et al. 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988);Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)、Houghton (U.S. Pat. No. 4,631,211, issued December 1986)およびRutter et al.(U.S. Pat. No. 5,010,175, issued Apr. 23, 1991)は、シナプス小胞サイクリングに関連する活性のモジュレータとして試験できるペプチドの混合物を産生する方法を記載する。
いくつかの態様において、小分子ライブラリ、その類似体を、シナプス小胞サイクリングのモジュレータについてスクリーニングする。いくつかの態様において、デノボ合成した化合物ライブラリをスクリーニングして、シナプス小胞サイクリングの調節機能を有する新規な化合物を同定することができる。いくつかの態様において、薬剤を含む公開ライブラリ(FDA公認薬剤を含む)をスクリーニングして、シナプス小胞サイクリングの調節活性が以前に未知であった既存の化合物を同定することができる。いくつかの態様において、既存の化合物の誘導体または類似体を含む改変ライブラリを、当分野に良く知られた方法を用いて合成してスクリーニングし、シナプス小胞サイクリングの新規なまたは改善されたモジュレータを同定することができる。好適な小分子化合物ライブラリを、市販の供給業者、例えばChemBridge Libraries (chembridge.com)、BIOMOL International、ASINEX、ChemDiv、ChemDB、ICCB-Longwoodから得ることができる。いくつかの態様において、好適な小分子ライブラリは、多様性および良好な「薬剤様」特性について選択された市販の化合物の大きなコレクション(例えば>100,000種の化合物)を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス分子を、シナプス小胞サイクリングの潜在的モジュレータについてスクリーニングすることができる。アンチセンス分子は、特定mRNAに相補的なヌクレオチド配列を有する、RNAまたは一本鎖DNA分子である。実験室で調製したアンチセンス分子を、試験する遺伝子により転写した正常なmRNAを含む細胞中に注入すると、アンチセンス分子はmRNAと塩基対を作り、mRNAのタンパク質への翻訳を妨害することができる。得られた二本鎖RNAまたはRNA/DNAは、かかる分子に特異的に付着する酵素により消化される。したがってmRNAの枯渇が生じて遺伝子産物の翻訳がブロックされ、これによりアンチセンス分子は、有害なタンパク質の産生をブロックする医薬において使用が見出される。アンチセンスRNAを産生および利用する方法は、当業者によく知られている(例えば以下を参照のこと:C. Lichtenstein and W. Nellen (Editors), Antisense Technology: A Practical Approach, Oxford University Press (December, 1997);S. Agrawal and S. T. Crooke, Antisense Research and Application (Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 131), Springer Verlag (April, 1998);I. Gibson, Antisense and Ribozyme Methodology: Laboratory Companion, Chapman & Hall (June, 1997);J. N. M. Mol and A. R. Van Der Krol, Antisense Nucleic Acids and Proteins, Marcel Dekker;B. Weiss, Antisense Oligonodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press (June, 1997);Stanley et al., Antisense Research and Applications, CRC Press (June, 1993);C. A. Stein and A. M. Krieg, Applied Antisense Oligonucleotide Technology (April, 1998))。
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)により媒介される転写後遺伝子サイレンシング機構であり、これは上述のアンチセンスおよびリボザイムベースのアプローチとは異なる。dsRNA分子は、最初にダイサー(DICER)と呼ばれるRNアーゼIII様酵素(Bernstein et al., Nature 409:363, 2001)による処理の後に、種々の系列の細胞のmRNAの配列特異的分解を、2つの21nt鎖からなる低分子のdsRNA分子に指向させると考えられており、この2つの21nt鎖の各々は5’リン酸基および3’ヒドロキシルを有し、かつ他の鎖に正確に相補的な19nt領域を含んでおり、このため2nt−3’オーバーハングに接した19ntの二本鎖領域が存在するものである。このようにRNAiは、低分子干渉RNA(siRNA)により媒介され、siRNAは、各鎖上に典型的には1〜2個のヌクレオチド3’オーバーハングを有する、約19ヌクレオチド長の二本鎖領域からなり、このため全長は、典型的には約21〜23ヌクレオチド長の間となる。
いくつかの態様において、抗体は、潜在的シナプス小胞サイクリングモジュレータについてスクリーニングすることができる。例えば、抗体は、シナプス小胞サイクリングに関与するタンパク質および遺伝子の配列情報に基づいて設計してよい。例えば抗体は、シナプス前タンパク質を標的とするよう設計することができ、これには限定することなく、内在性小胞タンパク質(例えば、シナプス小胞タンパク質2(SV2)、シナプトフィジン、シナプトタグミン、小胞関連膜ポリペプチド(VAMP)、神経伝達物質トランスポーター(NTトランスポーター)、シナプトギリン、プロトンポンプ)、周辺小胞タンパク質(例えばRab、シスチンストリングタンパク質(CSP)、シナプシン)、シナプス細胞膜タンパク質(例えばカルシウムチャネル、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP−25)、シンタキシン)、およびサイトゾルタンパク質(例えばSNAP、n−Sec1)、シナプシン(例えばシナプシンI、IIおよびIII)、デホスフィン(例えばジナミンI、PIP5K1γ、およびシナプトジャニンI)を含む。抗体はまた、カルシニューリン、カルシニューリンアクチベーター、阻害剤、および/または基質を標的とするよう、設計することもできる。
いくつかの態様において、天然産物ライブラリを、本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
特に本発明は、シナプス小胞サイクリングを調節する物質は、ある疾患(例えばシナプス小胞機能障害に関連する疾患)の処置に有用であり得るとの認識を包含する。いくつかの態様において、本明細書で同定されたシナプス小胞サイクリングモジュレータは、シナプス小胞サイクリング機能障害に関連する疾患、障害、および/または病態の1または2以上の症状または特徴を処置する(例えば、緩和する、改善する、軽減する、阻害する、予防する、その発症を遅延する、重篤度を低減する、および/または発生率を低下させる)ために用いることができる。例えば本発明は、シナプス小胞サイクリングのモジュレータは、以下の処置に有用であり得るとの認識を包含する:精神障害、疾患または病態であって、限定することなく統合失調症、双極性障害、てんかんを含むもの;神経疾患、障害または病態であって、限定することなくアルツハイマー病、アルコール性コルサニコフ病(KS)、多発性硬化症、およびパーキンソン病を含むもの;および/または他の疾患、障害、または病態であって、限定することなくダウン症、ウイリアムズ症候群、特異的言語障害、および注意欠陥多動性障害(ADHD)を含むもの。
本発明はさらに、1または2以上のシナプス小胞サイクリングモジュレータを、1または2以上の薬学的に許容し得る賦形剤と共に含む、医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、1または2以上の追加の治療活性物質を任意に含んでもよい。
本発明によるシナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、任意の経路により投与することができる。いくつかの態様において、シナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、以下を含む、1または2以上の種々の経路により投与される:経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下、心室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的(例えば粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および/または点滴薬による)、粘膜、経鼻、口腔、腸内、硝子体、腫瘍内、舌下;気道内注入、気管支内注入、および/または吸入による;経口スプレー、鼻腔用スプレー、および/またはエアロゾルとして、および/または門脈カテーテルを介して。いくつかの態様において、シナプス小胞サイクルモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、全身的静脈注射により投与される。特定の態様において、シナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、静脈内および/または経口的に投与される。特定の態様において、シナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、シナプス小胞サイクリングモジュレータが血液脳関門を通過することができるような様式で、投与される。血液脳関門を通過するためには多くの戦略が利用可能であり、これには限定することなく、分子の疎水性の性質を増加させること;分子を、例えばトランスフェリンなどの担体との複合体として、血液脳関門における受容体を標的として導入すること;などを含む。他の態様において、分子は頭蓋内に、またはさらに好ましくは心室内に投与することができる。他の態様においては、血液脳関門の浸透圧の破壊を用いて、活性成分の脳への送達を有効にする(Neuwelt et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA “Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption,” Oct. 10, 1995)。さらに他の態様において、剤は、血液脳関門を標的としたリポソームにおいて投与することができる。リポソーム内の医薬剤の投与は知られている(Langer, 1990, Science 249:1527-1533;Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989);Lopez-Berestein、同上、pp. 317-327を参照;一般的に上記を参照)。全てのかかる方法は本発明で考慮されている。特定の態様において、シナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物は、門脈カテーテルにより投与されてよい。しかしながら本発明は、シナプス小胞サイクリングモジュレータおよび/またはその医薬組成物の、薬剤送達の科学において期待できる進歩を考慮した任意の適切な経路による送達を包含する。
本発明は、本発明の方法を、便利におよび/または効率的に実施するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは、ユーザーに対し、1または2以上の対象の複数の処置を実施すること、および/または複数の実験を実施することを可能とする、十分な量および/または数の要素を含む。
例1:pHluorinレポーター
この例において、シナプス小胞サイクリングを、シナプス小胞タンパク質の内腔内ドメインに標識されたpHluorinと呼ばれるpH感受性GFPを用いて試験した。この様式で用いる小胞タンパク質としては、VAMP、シナプトタグミン、vGlut1、およびシナプトフィジンが含まれる。シナプスが休止している場合、これらのタンパク質ではpHluorinがシナプス小胞内腔に配置され、ここでは内部pH5.5が維持されていた。この酸性のpHにおいて、蛍光は消光していた。刺激を受けると、シナプス小胞はエキソサイトーシスされ、プロトンが排出されてpHが上昇し、pHluorinが蛍光を発した。次に小胞は再度内部化され、酸性化されて、再び蛍光を消光させた。この様式で、1つのシナプスで測定された蛍光変化を用いて、シナプス小胞サイクルを追跡した。この例においては、シナプトsynaptopHluorin(すなわち、小胞タンパク質VAMP2の融合およびvGlut1に融合したpH感受性GFP)を用いた。
シナプス小胞サイクルを測定するための第2の例示のレポーターは、酸性の小胞内pHおよび酸性感受性染料を用いる。pHが外部のpH7.4から小胞内のpH5.5に上昇するとその蛍光を増加する、エンドサイトーシスレポーターは市販されている。これらの染料としては、CypHer5E(GE Healthecare)およびpHrodo(Invitrogen)が挙げられる。これらの染料は、ニューロンが刺激されたときにシナプス小胞に入ることにより、シナプス小胞サイクリングのレポーターとして機能する。小胞がエンドサイトーシスされ再度酸性化されると、レポーターが蛍光を発する。このような方法により、エンドサイトーシスを蛍光強度の増加により測定し、それに続くエキソサイトーシスを蛍光強度の減少により測定する。
10×、0.45NA対物レンズのZeiss Axiovert Z1を用いて、全ウェルレベルで、synaptopHluorinを発現するアデノ随伴ウイルスに感染させた初代神経細胞におけるシナプト小胞サイクルを画像化した(図13参照)。さらに、この顕微鏡を用いて、プレートのウェルへのオープンアクセスがあったため、刺激システムのアクセスが可能であった。刺激システムは、個別の化合物のシナプス小胞サイクリングに対する効果を検出するために用いた。落射蛍光顕微鏡を用いてシナプス小胞サイクリングを画像化するプロセスは、典型的には約2分間かかり、したがって、この構成において96ウェルプレートの全ウェルを画像化するには、一般に約2〜3時間が必要であった。
シナプス小胞サイクルを視覚化するために、ニューロンを刺激してシナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを誘発した。培養物の初代神経細胞を、部分的に電界電位の適用により刺激したが、これはRyanおよびSmith(1995, Neuron, 14:983;本明細書に参照により組み込まれる)およびRyan et al.(1996, Proc. Natl. Acad. Sci., 93:5567;本明細書に参照により組み込まれる)に記載の通りである。これらの例において、電界電位を96ウェルフォーマットの初代神経細胞に適用した。96ウェルの電気刺激装置をカスタム開発し、神経細胞を含むウェル内に時間変化する電界を発生させるために用いた。電極デザインのシナプス小胞サイクルを引き起こす能力を、検出装置で測定した;装置は上述のように、Zeiss Axiovert Z1倒立落射蛍光顕微鏡または、plate::visionプレートリーダーのどちらかであった。
この例において、カスタム電極対を用いてシナプス小胞サイクリングを刺激した。カスタム電極対は、96ウェルプレートのウェルに適合する、外径約6mmの外側プラチナリング電極を有していた。ウェルの中心に、1mm直径の金製のワイヤを配置した(図6C)。金製の中心ワイヤはカソードとして機能し、外側プラチナリングはアノードとして機能し、これらはプラスチックの器具により所定位置に保たれていた。電極は96ウェルプレートのウェル内に配置し、パルス発生器に接続された刺激アイソレーターに接続した。96個のウェルを平行して刺激するために、96個のこれら電極対は、8×12のアレイに接続する。
CellAxessHT(Cellectricon AB, Gothenburg, Swedenより入手可能)は、siRNAを384プレート中の細胞に送達するよう設計されたハイスループットエレクトロポレーターである。これは96ウェルエレクトロポレーションヘッドを有し、各電極対が384ウェルプレートのウェルに適合するよう設計されている。この例においてシナプス小胞サイクリングアッセイの刺激要素として機能するために、このシステムの電極を、96ウェルプレートのウェルの電界電位カバレージを最大化するよう、改変および/または最適化した。
この例において、活動電位発火の刺激を、改変された市販のエレクトロポレーションシステムにより実証した。Collectricon ABより利用可能なカスタム改変CellAxessCX3エレクトロポレーションシステムを、実験用に入手した。このシステムは、96ウェルプレートの3つのウェル内の3つの別々の神経細胞培養物を、実質的に同時に電気的に刺激することができる、3つの電極対を提供した。この装置の電極を改変して、電極の励起領域内に実質的に均一な電界および/または電流密度を提供するようにした。さらに、電極を搭載するために用いるプラスチック要素を改変して、データ収集の間に背景蛍光を最小化する、低蛍光材料を含ませた。
選択された刺激システムおよび検出システムを、1つのシナプス小胞スクリーニングシステムに統合することができる。例えば、96ウェルプレートでのシナプス小胞サイクリングを平行して測定するためのシステムを開発した。96ウェルプレートの初代神経細胞を、12日目にin vitroでシナプトフィジン−pHluorin発現アデノ随伴ウイルスに感染させた。21日目にin vitroで培養培地をアッセイバッファーに交換し、電極をウェル内に配置した。時間変化電界を10V/10Hzで30秒、神経細胞に適用した。この間、例えばsynaptopHluorinにより生成された蛍光を、検出装置で記録した。
ハイコンテントスクリーニングシステムは、代替的画像化システムであるBD経路ハイコンテント画像化システムを用いて開発した。かかるハイコンテントスクリーニングシステムは、典型的にはカスタム作製か、または市販の、例えばPathway, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ;ImageXpress MICRO1, Molecular Devices, Union City, CA;Opera, Perkin Elmer, Waltham, MAまたはArrayScan, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAから利用可能である。これらのシステムは高い光学感受性を有し、動態アッセイの間に高解像度の経時的画像スタックを生成する。その結果、データは、単一シナプスの解像度と高いシグナル対ノイズ比を有する。しかしこれらのシステムは、典型的にはマルチウェルプレートの個々のウェルを順番に記録するのみである。したがって、これはシナプス小胞サイクルを画像化するのに約2分かかり、96ウェルプレートの全てのウェルを画像化するには2〜3時間かかる。このように、ハイコンテントスクリーニングシステムは典型的には、1時間に少なくとも約20(例えば25、30、35、40、45、または50)のシナプス小胞サイクリングアッセイを測定することができる。
シナプス前HTSプラットフォームシステムを構成し(図21)、96平行シナプス前アッセイを該システムを用いて行った。
Fluoroskan Ascent FLプレートリーダーは、シナプトフィジン−pHluorinレポーターを発現する神経細胞内でのシナプス小胞サイクリング、例えばエキソサイトーシスの側面を測定可能であることが確認された。ラット胚皮質ニューロンをGreiner uClear96ウェルプレートで培養した。7DIVにおいて培養物をsypHy−AAVに感染させた。33DIVにおいて培養培地をアッセイバッファーに交換し、プレートをFluoroskan Ascent FLプレートリーダーに負荷し、GFP蛍光を5Hzで記録した。このプレートリーダーは、光電子増倍管(PMT)を用いて、1時点での1つのウェルの蛍光レベルを測定する。ベースライン蛍光レベルを決定し、イオノマイシン(10uM)を加えてシナプス小胞エキソサイトーシスを誘発し、得られた蛍光変化をプレートリーダーで測定した。イオノマイシンは、蛍光強度における〜15%の増加をもたらし、Fluoroskan Ascent FLとそのPMT光学素子が、sypHYレポーターを用いてシナプス小胞サイクルを測定可能であることを示す(図27)。
当業者は、ルーチンの実験を超えるものを用いることなく、本明細書に記載の特定の態様の多くの等価物を認識し、または確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定することを意図せず、むしろ付属のクレームに記載の通りである。
Claims (226)
- シナプス小胞サイクリングの側面を分析するためのプラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル;
b)複数の電極対、
ここで各電極対は、
(i)ウェル内に配置するために、および
(ii)ウェル内の複数神経細胞にシナプス小胞サイクリングを誘発する電界を発生させるように構成されており、また
ここで複数の電極対は、複数ウェル内の神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発し;および
c)複数の検出器を含む検出システム、
ここで各検出器は、ウェルに存在する神経細胞のシナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子からの発光シグナルを検出し、また
ここで発光シグナルの存在が、神経細胞のシナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - 複数のウェルが、複数の神経細胞を含む、請求項1に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数の神経細胞が、10〜1,000,000個の神経細胞の範囲である、請求項2に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数の神経細胞が、ウェルの底面積1mm2当たり1000〜4000個の細胞/mm2の範囲である、請求項2または3に記載のプラットフォーム。
- 複数の神経細胞が、少なくとも2種の異なる神経細胞型を含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が初代神経細胞であり、任意に、ここで初代神経細胞がラット初代神経細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が、グルタミン酸作動性、GABA作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性、およびコリン作動性神経細胞からなる群から選択される、請求項2〜6のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電極対の各電極が、実質的に曲線状の表面を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各電極対の電極が実質的に同心円筒であり、ここで同心円筒が、環状の絶縁材料で分離されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極対の各電極対を、複数ウェルの1つのウェル内に操作可能に配置する電極移送システムを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極に操作可能に接続された電源をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電源が、各電極対にわたり所定の電圧を適用する、請求項11に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、1V〜400Vの範囲である、請求項12に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、5V〜20Vの範囲である、請求項12に記載のプラットフォーム。
- 電力供給装置および複数電極対に操作可能に接続されたパルス発生器をさらに含み、ここでパルス発生器は、各電極対にわたり所定の電圧パルスを適用する、請求項11〜14のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器が、複数の所定の電圧パルスを、所定の周波数で所定の時間適用する、請求項15に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、0.2Hz〜100Hzの範囲である、請求項16に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、10Hz〜50Hzの範囲である、請求項16または17に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、2分までである、請求項16〜18のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間は、0.1〜20秒の範囲である、請求項16〜19のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、5〜15秒の範囲である、請求項16〜20のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、10ミリ秒までの範囲である、請求項16〜21のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、0.1ミリ秒〜2ミリ秒の範囲である、請求項16〜22のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの開始の間の時間が、0.1〜5ミリ秒の範囲である、請求項16〜23のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス数が、1〜1000の範囲である、請求項16〜24のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器に操作可能に接続されたコンピュータをさらに含み、ここで該コンピュータは電圧パルスを制御する、請求項16〜25のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、光学センサーを含む、請求項16〜26のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、ウェルからの発光シグナルを収集する対物レンズを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.2mm〜5mmの範囲の視野面積からの発光シグナルを収集する、請求項28に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.4〜1.4の範囲の開口数を有する、請求項28または29に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.5の開口数を有する、請求項28〜30のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、油浸または水浸レンズではない、請求項28〜30のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、各検出器に操作可能に接続された電荷結合素子カメラを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の検出器が、複数ウェルからのシグナルを同時に検出する、請求項1〜33のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、検出器に操作可能に接続されたコンピュータを含み、ここで該コンピュータは、検出器からの発光シグナルを、神経細胞のシナプス小胞サイクリングの側面の特徴を示すデータに変換する、請求項1〜34のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数レポーター分子からの発光シグナルを検出する、請求項1〜35のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数シナプスからの発光シグナルを検出する、請求項1〜36のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数神経細胞からの発光シグナルを検出する、請求項1〜37のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞タンパク質が、VAMP2、vGlut1、シナプトフィジン、小胞GABAトランスポーター、アセチルコリントランスポーター、カテコールアミントランスポーター、またはシナプトタグミンである、請求項1〜38のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の神経細胞が、内腔部分を有するシナプス小胞タンパク質を発現し、ここで該シナプス小胞タンパク質はレポーター分子に付着している、請求項1〜39のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、シナプス小胞タンパク質の内腔部分に付着している、請求項40に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pH感受性蛍光タンパク質である、請求項1〜41のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pHluorinである、請求項1〜42のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、配列番号:1(hSyn−SypHy)で示される配列を含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH7.0〜8.0の範囲において、pH5.0〜6.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項42に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH5.0〜6.0の範囲において、pH7.0〜8.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項42に記載のプラットフォーム。
- 発光シグナルが、475nm〜525nmの範囲の蛍光シグナルである、請求項46に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞サイクリングの側面を分析するためのプラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル、ここで各ウェルは、複数の神経細胞を含み;
b)複数の電極対、ここで各電極対は、複数ウェルの1つの中に配置され、ここで各電極対は、ウェル内に存在する神経細胞がシナプス小胞サイクリングを誘発するのに十分な電界を発生し、また、ここで複数の電極対は、複数ウェル内の複数神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発し;および
c)複数の検出器を含む検出システム、ここで各検出器は、複数神経細胞の少なくとも1つのサブセットからの発光シグナルを検出し、ここで該発光シグナルは、シナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - 複数の神経細胞が、シナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子を含む、請求項48に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞サイクリングの側面を分析するためのプラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル、ここで各ウェルは複数の神経細胞を含み、およびここで複数の神経細胞は、シナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子を含み;
b)ウェル内に存在する神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発する、刺激システム;および
c)複数の検出器を含む検出システム、ここで各検出器は、ウェル内に存在する複数神経細胞の少なくとも1つのサブセットからの発光シグナルを検出し、およびここで該発光シグナルは、シナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - シナプス小胞タンパク質が、内腔部分を含む、請求項50に記載のプラットフォーム。
- 刺激システムが複数の電極対を含み、ここで各電極対は、複数ウェルの1つの中に配置され、およびここで各電極対は、ウェル内に存在する神経細胞がシナプス小胞サイクリングを誘発するのに十分な電界を発生する、請求項50または51に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数神経細胞が、10〜100,000個の神経細胞の範囲である、請求項48〜52のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数神経細胞が、ウェルの底面積1mm2当たり1000〜4000個の細胞/mm2の範囲である、請求項48〜53のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の神経細胞が、少なくとも2種の異なる神経細胞型を含む、請求項48〜54のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が初代神経細胞であり、任意に、ここで初代神経細胞は、ラット初代神経細胞である、請求項48〜55のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が、グルタミン酸作動性、GABA作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性、およびコリン作動性神経細胞からなる群から選択される、請求項48〜56のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が、内腔部分を有しレポーター分子に融合するシナプス小胞タンパク質を発現する導入遺伝子を含む、請求項48〜57のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電極対の各電極が、実質的に曲線状の表面を有する、請求項48および52〜58のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各電極対の電極が実質的に同心円筒であり、ここで同心円筒は、環状の絶縁材料で分離されている、請求項48および52〜59のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極対の各電極対を、複数ウェルの1つのウェル内に操作可能に配置する電極移送システムをさらに含む、請求項48および52〜60のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極に操作可能に接続された電源をさらに含む、請求項48および52〜61のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電源が、各電極対にわたり所定の電圧を適用する、請求項62に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、1V〜400Vの範囲である、請求項63に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、5V〜20Vの範囲である、請求項63に記載のプラットフォーム。
- 電源および複数電極対に操作可能に接続されたパルス発生器をさらに含み、ここで該パルス発生器は、各電極対にわたり所定の電圧パルスを適用する、請求項62〜65のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器が、複数の所定の電圧パルスを、所定の周波数で所定の時間適用する、請求項66に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、0.2Hz〜100Hzの範囲である、請求項67に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、10Hz〜50Hzの範囲である、請求項67または68に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が2分までである、請求項67〜69のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、0.1〜20秒の範囲である、請求項67〜70のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、5〜15秒の範囲である、請求項67〜71のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、10ミリ秒までの範囲である、請求項67〜72のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、0.1ミリ秒〜2ミリ秒の範囲である、請求項67〜73のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの開始の間の時間が、0.1〜5ミリ秒の範囲である、請求項67〜74のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス数が、1〜1000の範囲である、請求項67〜75のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器に操作可能に接続されたコンピュータをさらに含み、ここで該コンピュータは、電圧パルスを制御する、請求項66〜75のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、光学センサーを含む、請求項48〜77のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、ウェルからの発光シグナルを収集する対物レンズを含む、請求項48〜78のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.2mm〜5mmの範囲の視野面積からの発光シグナルを収集する、請求項79に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.4〜1.4の範囲の開口数を有する、請求項79または80に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.5の開口数を有する、請求項79に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、油浸または水浸レンズではない、請求項79〜82のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、各検出器に操作可能に接続された電荷結合素子カメラを含む、請求項48〜83のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の検出器が、複数ウェルからのシグナルを同時に検出する、請求項48〜84のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、検出器に操作可能に接続されたコンピュータを含み、およびここで該コンピュータは、検出器からの発光シグナルを、神経細胞のシナプス小胞サイクリングの側面の特徴を示すデータに変換する、請求項48〜85のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数のレポーター分子からの発光シグナルを検出する、請求項48〜86のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数シナプスからの発光シグナルを検出する、請求項48〜87のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数神経細胞からの発光シグナルを検出する、請求項48〜88のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞タンパク質が、VAMP2、vGlut1、シナプトフィジン、小胞GABAトランスポーター、アセチルコリントランスポーター、カテコールアミントランスポーター、またはシナプトタグミンである、請求項49〜89のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、シナプス小胞タンパク質の内腔部分に付着している、請求項49〜90のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pH感受性蛍光タンパク質である、請求項49〜91のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pHluorinである、請求項49〜92のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、配列番号:1(hSyn−SypHy)で示される配列を含む、請求項50〜93のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH7.0〜8.0の範囲において、pH5.0〜6.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項92〜94のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH5.0〜6.0の範囲において、pH7.0〜8.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項92〜95のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 発光シグナルが、475nm〜525nmの範囲の蛍光シグナルである、請求項48〜96のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞サイクリングの側面を分析するためのプラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル;
b)複数の電極対、
ここで各電極対は、
(i)ウェル内に配置されるように、および
(ii)ウェル内の複数の神経細胞にシナプス小胞サイクリングを誘発する電界を発生するように、
構成されており、またここで、複数の電極対は、複数ウェル内の神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発し;および
c)ウェル内に存在する神経細胞のシナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子からの発光シグナルを収集する対物レンズを含む検出システム、ここで発光シグナルの存在は、神経細胞でのシナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - 複数のウェルが、複数の神経細胞を含む、請求項98に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞サイクリングの側面を分析するための神経細胞培養物プラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル、ここで各ウェルは複数の神経細胞を含み;
b)複数の電極対、ここで各電極対は、複数ウェルの1つの中に配置され、ここで各電極対は、ウェル内に存在する神経細胞がシナプス小胞サイクリングを誘発するのに十分な電界を発生し、またここで、複数の電極対は、複数ウェル内の神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発し;および
c)ウェル内に存在する神経細胞のシナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子からの発光シグナルを収集する対物レンズを含む検出システム、またここで発光シグナルの存在は、神経細胞でのシナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - シナプス小胞サイクリングの側面を分析するための神経細胞培養物プラットフォームであって、該プラットフォームは、
a)複数のウェル、ここで各ウェルは複数の神経細胞を含み、ここで複数の神経細胞は、小胞タンパク質に付着したレポーター分子を含み;
b)ウェル内に存在する神経細胞に実質的に同時にシナプス小胞サイクリングを誘発する、刺激システム;および
c)ウェル内に存在する神経細胞のシナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子からの発光シグナルを収集する対物レンズを含む検出システム、ここで発光シグナルの存在は、神経細胞でのシナプス小胞サイクリングの側面を示す;
を含む、前記プラットフォーム。 - 刺激システムが複数の電極対を含み、ここで各電極対は、複数のウェルの1つの中に配置され、およびここで各電極対は、ウェル内に存在する神経細胞がシナプス小胞サイクリングを誘発するのに十分な電界を発生する、請求項101に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞タンパク質が、内腔部分を含む、請求項98〜102のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、油浸または水浸対物レンズである、請求項98〜102のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、空気対物レンズである、請求項98〜102のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、光学検出器に操作可能に接続されている、請求項98〜105のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 光学検出器が、電荷結合素子カメラである、請求項104に記載のプラットフォーム。
- プラットフォームが、少なくとも5活動電位を発生するように刺激された神経細胞のシナプス小胞タンパク質に付着したレポーター分子からの発光シグナルを検出するように構成されている、請求項98〜107のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、複数の対物レンズを含む、請求項98〜108のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数神経細胞が、10〜100,000個の神経細胞の範囲である、請求項99〜109のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- ウェル内の複数神経細胞が、ウェルの底面積1mm2当たり1000〜4000個の細胞/mm2の範囲である、請求項99〜110のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の神経細胞が、少なくとも2種の異なる神経細胞型を含む、請求項99〜111のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が初代神経細胞であり、任意に、ここで初代神経細胞は、ラット初代神経細胞である、請求項99〜112のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が、グルタミン酸作動性、GABA作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性、およびコリン作動性神経細胞からなる群から選択される、請求項99〜113のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 神経細胞が、内腔部分を有しレポーター分子に融合するシナプス小胞タンパク質を発現する導入遺伝子を含む、請求項99〜114のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電極対の各電極が、実質的に曲線状の表面を有する、請求項98、100、および102〜115のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各電極対の電極が実質的に同心円筒であり、ここで同心円筒は、環状の絶縁材料で分離されている、請求項98、100、および102〜116のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極対の各電極対を、複数ウェルの1つのウェル内に操作可能に配置する電極移送システムをさらに含む、請求項98、100、および102〜117のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数電極に操作可能に接続された電源をさらに含む、請求項98、100、および102〜118のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 電源が、各電極対にわたり所定の電圧を適用する、請求項119に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、1V〜400Vの範囲である、請求項120に記載のプラットフォーム。
- 電圧が、5V〜20Vの範囲である、請求項120に記載のプラットフォーム。
- 電源および複数電極対に操作可能に接続されたパルス発生器をさらに含み、ここで該パルス発生器は、各電極対にわたり所定の電圧パルスを適用する、請求項119〜122のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器が、複数の所定の電圧パルスを、所定の周波数で所定の時間適用する、請求項123に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、0.2Hz〜100Hzの範囲である、請求項124に記載のプラットフォーム。
- 所定の周波数が、10Hz〜50Hzの範囲である、請求項124または125に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、2分までである、請求項124〜126のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、0.1〜20秒の範囲である、請求項124〜127のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 所定の時間が、5〜15秒の範囲である、請求項124〜128のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、10ミリ秒までの範囲である、請求項124〜129のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの持続時間が、0.1ミリ秒〜2ミリ秒の範囲である、請求項124〜130のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各パルスの開始の間の時間が、0.1〜5ミリ秒の範囲である、請求項124〜131のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス数が、1〜1000の範囲である、請求項124〜132のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- パルス発生器に操作可能に接続されたコンピュータをさらに含み、ここで該コンピュータは、電圧パルスを制御する、請求項124〜133のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、光学センサーを含む、請求項124〜134のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、ウェルからの発光シグナルを収集する対物レンズを含む、請求項124〜135のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.2mm〜5mmの範囲の視野面積からの発光シグナルを収集する、請求項136に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.4〜1.4の範囲の開口数を有する、請求項135または136に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、0.5の開口数を有する、請求項138に記載のプラットフォーム。
- 対物レンズが、油浸または水浸レンズではない、請求項136〜139のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、複数ウェルからのシグナルを同時に検出する複数の検出器を含む、請求項98〜140のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 検出システムが、検出器に操作可能に接続されたコンピュータを含み、ここで該コンピュータは、検出器からの発光シグナルを、神経細胞のシナプス小胞サイクリングの側面の特徴を示すデータに変換する、請求項141に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数のレポーター分子からの発光シグナルを検出する、請求項141または142に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数シナプスからの発光シグナルを検出する、請求項141〜143のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 各検出器が、複数神経細胞からの発光シグナルを検出する、請求項141〜144のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- シナプス小胞タンパク質が、VAMP2、vGlut1、シナプトフィジン、小胞GABAトランスポーター、アセチルコリントランスポーター、カテコールアミントランスポーター、またはシナプトタグミンである、請求項98〜145のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、シナプス小胞タンパク質の内腔部分に付着している、請求項98〜146のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pH感受性蛍光タンパク質である、請求項98〜147のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、pHluorinである、請求項98〜148のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- レポーター分子が、配列番号:1(hSyn−SypHy)で示される配列を含む、請求項98〜149のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH7.0〜8.0の範囲において、pH5.0〜6.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項148〜150のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- pH感受性レポーターがpH5.0〜6.0の範囲において、pH7.0〜8.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項148〜150のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 発光シグナルが、475nm〜525nmの範囲の蛍光シグナルである、請求項98〜152のいずれか一項に記載のプラットフォーム。
- 複数の細胞におけるシナプス小胞サイクリングの側面を測定する方法であって、該方法は、
a)複数のウェルの各々に、電極対および、シナプス小胞タンパク質に関連する蛍光レポーター分子を発現する複数細胞を提供すること;
b)前記複数の細胞において、電極対により、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の系列を実質的に同時に誘発すること;および
c)複数ウェル内のレポーター分子の発光シグナルを検出すること、ここでレポーター分子の発光シグナルは、シナプス小胞サイクリングの側面の測度である;
を含む、前記方法。 - 複数の細胞が、神経細胞である、請求項154に記載の方法。
- ウェル内の複数の神経細胞が、10〜100000個の神経細胞の範囲である、請求項154または155に記載の方法。
- ウェル内の複数の神経細胞が、ウェルの底面積1mm2当たり1000〜2000個の細胞/mm2の範囲である、請求項154または155に記載の方法。
- 複数の細胞が、少なくとも2種の異なる神経細胞型を含む、請求項154〜156のいずれか一項に記載の方法。
- 神経細胞が初代神経細胞であり、任意に、ここで初代神経細胞は、ラット初代神経細胞である、請求項155〜158のいずれか一項に記載の方法。
- 神経細胞が、グルタミン酸作動性、GABA作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性、およびコリン作動性神経細胞からなる群から選択される、請求項155〜159のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の神経細胞が、レポーター分子に融合したシナプス小胞タンパク質を発現する、請求項154〜160のいずれか一項に記載の方法。
- 電極対の各電極が、実質的に曲線状の表面を有する、請求項154〜161のいずれか一項に記載の方法。
- 各電極対の電極が実質的に同心円筒であり、ここで同心円筒は、環状の絶縁材料で分離されている、請求項154〜162のいずれか一項に記載の方法。
- 複数電極対の各電極対を、複数ウェルの1つのウェル内に、電極移送システムを用いて配置することをさらに含む、請求項154〜163のいずれか一項に記載の方法。
- 活動電位が、複数の電極に操作可能に接続された電源により誘発される、請求項154〜164のいずれか一項に記載の方法。
- 活動電位が、各電極対にわたり所定の電圧を適用することにより誘発される、請求項154〜165のいずれか一項に記載の方法。
- 電圧が、1V〜400Vの範囲である、請求項166に記載の方法。
- 電圧が、5V〜20Vの範囲である、請求項166に記載の方法。
- パルス発生器が、電源および複数電極対に操作可能に接続され、ここで該パルス発生器は、各電極対にわたり所定の電圧パルスを適用する、請求項165〜168のいずれか一項に記載の方法。
- パルス発生器が、複数の所定の電圧パルスを、所定の周波数で所定の時間適用する、請求項169に記載の方法。
- 所定の周波数が、0.2Hz〜100Hzの範囲である、請求項170に記載の方法。
- 所定の周波数が、10Hz〜50Hzの範囲である、請求項170または171に記載の方法。
- 所定の時間が、2分以下である、請求項170〜172のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の時間が、0.1〜20秒の範囲である、請求項170〜173のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の時間が、5〜15秒の範囲である、請求項170〜174のいずれか一項に記載の方法。
- 各パルスの持続時間が、10ミリ秒までの範囲である、請求項170〜175のいずれか一項に記載の方法。
- 各パルスの持続時間が、0.1ミリ秒〜2ミリ秒の範囲である、請求項170〜176のいずれか一項に記載の方法。
- 各パルスの開始の間の時間が、0.1〜5ミリ秒の範囲である、請求項170〜175のいずれか一項に記載の方法。
- パルス数が、1〜1000の範囲である、請求項170〜175のいずれか一項に記載の方法。
- 電圧パルスが、電圧発生器に操作可能に接続されたコンピュータにより制御される、請求項169〜179のいずれか一項に記載の方法。
- 発光シグナルが、検出器により検出される、請求項155〜180のいずれか一項に記載の方法。
- 検出器が光学センサーを含む、請求項181に記載の方法。
- レポーター分子の発光シグナルが、複数の検出器を用いて検出され、ここで各検出器には、電荷結合素子カメラが操作可能に接続されている、請求項181または182に記載の方法。
- 各検出器が、ウェルからの発光シグナルを収集する対物レンズを含む、請求項181に記載の方法。
- 対物レンズが、0.2mm〜5mmの範囲の視野面積からの発光シグナルを収集する、請求項184に記載の方法。
- 対物レンズが、0.4〜1.4の範囲の開口数を有する、請求項184または185に記載の方法。
- 対物レンズが、0.5の開口数を有する、請求項186に記載の方法。
- 複数の検出器が、複数ウェルからのシグナルを同時に検出する、請求項183に記載の方法。
- コンピュータが、複数の検出器に操作可能に接続され、検出器からの発光シグナルを、神経細胞のシナプス小胞サイクリングの側面の特徴を示すデータに変換する、請求項183〜188のいずれか一項に記載の方法。
- 各検出器が、複数のレポーター分子からの発光シグナルを検出する、請求項183〜189のいずれか一項に記載の方法。
- 各検出器が、複数シナプスからの発光シグナルを検出する、請求項183〜190のいずれか一項に記載の方法。
- 各検出器が、複数神経細胞からの発光シグナルを検出する、請求項183〜191のいずれか一項に記載の方法。
- シナプス小胞タンパク質が、VAMP2、vGlut1、シナプトフィジン、小胞GABAトランスポーター、アセチルコリントランスポーター、カテコールアミントランスポーター、またはシナプトタグミンである、請求項154〜192のいずれか一項に記載の方法。
- シナプス小胞タンパク質が、内腔部分を有する、請求項154〜192のいずれか一項に記載の方法。
- 発光レポーター分子が、内腔部分に付着している、請求項194に記載の方法。
- 発光レポーター分子が、pH感受性レポーターである、請求項154〜195のいずれか一項に記載の方法。
- 発光レポーター分子が、pHluorinである、請求項154〜196のいずれか一項に記載の方法。
- 発光レポーター分子が、配列番号:1(hSyn−SypHy)で示される配列を含む、請求項154〜196のいずれか一項に記載の方法。
- pH感受性レポーターがpH7.0〜8.0の範囲において、pH5.0〜6.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項196に記載の方法。
- pH感受性レポーターがpH5.0〜6.0の範囲において、pH7.0〜8.0の範囲におけるよりも顕著に強い強度で蛍光を発する、請求項197に記載の方法。
- 発光シグナルが、475nm〜525nmの範囲である、請求項154〜200のいずれか一項に記載の方法。
- 方法がさらに、
d)複数ウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
e)該細胞において、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の第2系列を、実質的に同時に誘発すること;
f)複数ウェル内のレポーター分子の第2発光シグナルを検出すること;
を含み、
ここでステップ(c)で検出された発光シグナルとステップ(f)で検出された発光シグナルの間の顕著な差が、前記試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、請求項154〜201のいずれか一項に記載の方法。 - 方法がさらに、
ステップ(b)の前に、複数ウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
を含み、
ここでステップ(c)で検出された発光シグナルと対照発光シグナルの間の顕著な差が、前記試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、請求項154〜201のいずれか一項に記載の方法。 - 方法がさらに、
d)複数ウェルの少なくとも1つのウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
e)複数ウェルの少なくとも1つのウェル内の複数細胞を、少なくとも1つの対照剤と接触させること;
を含み、
ここで、試験剤を有するウェル内で検出された発光シグナルと、対照剤を有するウェル内で検出された発光シグナルの間の顕著な差が、前記試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、請求項154〜201のいずれか一項に記載の方法。 - 方法がさらに、
d)複数ウェルの少なくとも1つのウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
を含み、
ここで、試験剤を有するウェル内で検出された発光シグナルと、陰性対照ウェルにおいて検出された発光シグナルの間の顕著な差が、前記試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、請求項154〜201のいずれか一項に記載の方法。 - 方法がさらに、陰性対照ウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節しない対照剤と接触させることを含む、請求項205に記載の方法。
- 方法がさらに、
d)複数ウェルの少なくとも1つのウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
を含み、
ここで、試験剤を有するウェル内で検出された発光シグナルと、陽性対照ウェル内で検出された発光シグナルの間の顕著な差の不在は、前記試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、請求項154〜201のいずれか一項に記載の方法。 - 方法がさらに、陽性対照ウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節する対照剤と接触させることを含む、請求項207に記載の方法。
- 試験剤が小分子である、請求項202〜208のいずれか一項に記載の方法。
- 試験剤がポリペプチドである、請求項202〜208のいずれか一項に記載の方法。
- 試験剤が抗体である、請求項202〜208のいずれか一項に記載の方法。
- 試験剤が核酸である、請求項202〜208のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸が、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、低分子干渉RNA、低分子ヘアピン型RNA、マイクロRNA、リボザイム、またはアプタマーから選択される、請求項212に記載の方法。
- 試験剤が炭水化物である、請求項202または203に記載の方法。
- 試験剤が脂質である、請求項202または203に記載の方法。
- 脂質が、リン脂質、トリグリセリド、またはステロイドである、請求項215に記載の方法。
- 方法がさらに、シナプス小胞サイクリングの側面のモジュレータとして同定された試験剤の毒性を、in vivoモデルでモニタリングすることを含む、請求項202〜216のいずれか一項に記載の方法。
- 方法がさらに、シナプス小胞サイクリングの側面のモジュレータとして同定された試験剤の有効性を、in vivoモデルでモニタリングすることを含む、請求項202〜216のいずれか一項に記載の方法。
- 方法が、ハイスループットのスクリーニング法である、請求項154〜218のいずれか一項に記載の方法。
- 発光シグナルが、蛍光のレベルである、請求項154〜219のいずれか一項に記載の方法。
- 発光シグナルが、所定時間の間に得られた複数の蛍光レベルである、請求項154〜219のいずれか一項に記載の方法。
- 発光シグナルが、蛍光の上昇率である、請求項154〜219のいずれか一項に記載の方法。
- 発光シグナルが、蛍光の減衰率である、請求項154〜219のいずれか一項に記載の方法。
- 試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面のモジュレータとして同定する方法であって、該方法は、
a)複数のウェルにおいて、各ウェルに、電極対および、シナプス小胞タンパク質に関連する蛍光レポーター分子を発現する複数細胞を提供すること;
b)前記複数の細胞において、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の第1系列を、実質的に同時に誘発すること;
c)複数のウェル内のレポーター分子の第1発光シグナルを検出すること;
d)複数ウェル内の前記複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
e)前記細胞において、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の第2系列を、実質的に同時に誘発すること;
f)複数のウェル内のレポーター分子の第2発光シグナルを検出すること;
を含み、
ここでレポーター分子の蛍光の第1レベルと第2レベルの間の顕著な差は、試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面のモジュレータとして同定する、前記方法。 - 複数細胞のシナプス小胞サイクリングの側面を測定する方法であって、該方法は、
a)複数のウェルの各ウェルに、電極対および、シナプス小胞タンパク質に関連する蛍光レポーター分子を発現する複数細胞を提供すること;
b)電極対を用いて、前記複数の細胞において、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の系列を、実質的に同時に誘発すること;
c)複数ウェル内のレポーター分子の発光シグナルを検出すること;
ここでレポーター分子の発光シグナルは、シナプス小胞サイクリングの側面の測度であり;および
d)複数ウェルの少なくとも1つのウェル内の複数細胞を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するその能力について試験する少なくとも1つの試験剤と接触させること;
を含み、
ここで試験剤を有するウェルで検出された発光シグナルと、対照ウェルで検出された発光シグナルの間の比較は、試験剤を、シナプス小胞サイクリングの側面を調節するとして同定する、前記方法。 - 複数細胞のシナプス小胞サイクリングの側面を測定する方法であって、該方法は、
a)複数のウェルの各々に、刺激装置およびシナプス小胞タンパク質に関連する蛍光レポーター分子を発現する複数細胞を提供すること;
b)刺激装置を用いて、前記複数の細胞において、細胞がシナプス小胞サイクリングを引き起こすのに十分な活動電位の系列を、実質的に同時に誘発すること;および
c)複数ウェル内のレポーター分子の発光シグナルを検出すること;
を含む、前記方法。
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EP3622073A4 (en) | 2017-05-09 | 2021-01-06 | University of Massachusetts | METHOD FOR TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
CA3075643A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | University Of Massachusetts | Sod1 dual expression vectors and uses thereof |
JP7065433B2 (ja) * | 2018-08-14 | 2022-05-12 | 日本電信電話株式会社 | 電極及びその製造方法、並びに積層体 |
JP2024501847A (ja) * | 2020-12-31 | 2024-01-16 | キュー-ステート バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | プレートイメージャ |
JP2024501849A (ja) * | 2020-12-31 | 2024-01-16 | キュー-ステート バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 光学プレートコントローラおよびリーダ |
EP4334723A1 (en) * | 2021-05-04 | 2024-03-13 | Q-State Biosciences, Inc. | Drug fingerprinting |
WO2023210585A1 (ja) * | 2022-04-25 | 2023-11-02 | 株式会社Jiksak Bioengineering | 標的化剤 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005514909A (ja) * | 2001-07-12 | 2005-05-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 真核生物細胞の電場による刺激 |
JP2007534927A (ja) * | 2003-07-14 | 2007-11-29 | ヴァーテックス ファーマシューティカルズ、 インコーポレイテッド | イオンチャネルアッセイ方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE255727T1 (de) | 1998-07-17 | 2003-12-15 | Vertex Pharma San Diego Llc | Detektor und siebvorrichtung für ionenkanäle |
US6969449B2 (en) | 2000-07-10 | 2005-11-29 | Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc | Multi-well plate and electrode assemblies for ion channel assays |
US7221981B2 (en) * | 2002-03-28 | 2007-05-22 | Northstar Neuroscience, Inc. | Electrode geometries for efficient neural stimulation |
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