WO2023210585A1 - 標的化剤 - Google Patents

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WO2023210585A1
WO2023210585A1 PCT/JP2023/016125 JP2023016125W WO2023210585A1 WO 2023210585 A1 WO2023210585 A1 WO 2023210585A1 JP 2023016125 W JP2023016125 W JP 2023016125W WO 2023210585 A1 WO2023210585 A1 WO 2023210585A1
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WO
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antibody
seq
targeting agent
amino acid
domain
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PCT/JP2023/016125
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English (en)
French (fr)
Inventor
法弘 湯本
大二郎 猪俣
Original Assignee
株式会社Jiksak Bioengineering
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Definitions

  • the present invention relates to a targeting agent for motor neurons, an agent for visualizing motor neurons, a composition containing the same, a targeting method using the same, a method for visualizing motor neurons, a method for preventing or treating a condition or disease, etc. .
  • Nerves are composed of central nerves and peripheral nerves, and regulate various emotions, muscles, and the functions of internal organs. Such neurological functions may deteriorate due to nerve damage, disease, aging, etc. In such cases, mental and physical health may be impaired, and the ability to lead a social life may be severely affected. Therefore, maintaining and improving neurological function can be said to be an extremely important issue as it is directly linked to maintaining and improving quality of life (QOL).
  • QOL quality of life
  • the central nerve and peripheral nerve are each composed of nerve cells, and these cells exchange signals with each other via synapses.
  • a synapse is a junction that includes a gap formed between the axon terminal of a neuron (presynaptic part) and the dendrite of another neuron or a cell such as a skeletal muscle or organ (postsynaptic part). , chemicals released from the presynapse transmit signals by binding to receptors present at the postsynapse. Synapse formation is triggered by interactions between specific membrane proteins expressed pre- and post-synaptic.
  • Patent Document 1 describes that a specific peptide has a dendrite outgrowth-promoting effect and a synapse formation-promoting effect in primary cultured cortical neuron cells (PCN), and that such a peptide is used for the treatment of mild cognitive impairment or early dementia. It is described that it is used.
  • Patent Document 2 describes that C-terminal fragment ⁇ (CTF ⁇ ), which is generated when amyloid precursor protein (APP) is cleaved by ⁇ -secretase, promotes synapse formation, and that CTF ⁇ can be used to treat neurodegenerative diseases, etc. It is described that it is used for.
  • CTF ⁇ C-terminal fragment ⁇
  • Patent Document 3 describes a method for culturing motor neurons having a presynaptic region using microbeads on which an LRRTM molecule or a fusion protein containing the molecule is immobilized.
  • an object of the present invention is to provide a means for targeting a substance to motor neurons and a means for visualizing the targeted site.
  • the present inventors focused on the fact that a specific protein is expressed on the membrane of synaptic vesicles, and as a result of intensive studies to solve the above problems, the intravesicular domain (N-terminal). Furthermore, the present inventors discovered that similar effects can be obtained by using antibodies that bind to other membrane proteins of synaptic vesicles, leading to the completion of the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • a targeting agent for motor neurons comprising an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein present in synaptic vesicles of motor neurons.
  • the targeting agent according to [1] further comprising a labeling substance and/or a physiologically active substance.
  • the targeting agent according to [2] comprising a conjugate of the antibody and the labeling substance and/or the physiologically active substance.
  • the membrane protein includes any one protein selected from the group consisting of synaptotagmin 2, synaptic vesicle glycoprotein 2A, synaptogyrin 1, synaptophysin, and synaptotagmin 1, [1] to [4]
  • the targeting agent according to any one of.
  • the intravesicular domain has an amino acid sequence represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 7-12, 15, 16, 19, 20, and 23; SEQ ID NOs: 3, 7-12, An amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, and/or substituted in any one of the amino acid sequences selected from the group consisting of 15, 16, 19, 20, and 23; or SEQ ID NO: 3 , [5] or [6], consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any one of the amino acid sequences selected from the group consisting of , 7 to 12, 15, 16, 19, 20, and 23.
  • the targeting agent described in. [8] The targeting agent according to any one of [2] to [7], wherein the labeling substance is a fluorescent molecule.
  • the physiologically active substance is one or more selected from the group consisting of a synapse formation promoter, a synapse maintenance agent, a muscle enhancer, and a nerve cell function modifying agent.
  • Targeting agents as described.
  • a pharmaceutical composition comprising the targeting agent according to any one of [2] to [11].
  • a method for targeting a labeling substance and/or a physiologically active substance to a motor neuron comprising the step of delivering a composition to a synapse of the motor neuron.
  • a condition or disease comprising the step of contacting the targeting agent according to any one of [2] to [11] with a motor neuron, and the step of delivering the targeting agent to the synapse of the motor neuron. prevention or treatment methods.
  • the prevention or treatment method according to [15] wherein the condition or disease is a condition or disease exhibiting a decline in neurological function.
  • the prevention or treatment method according to [15] or [18], wherein the condition or disease is a neurological disease or a neuromuscular disease.
  • a composition for targeting motor neurons comprising an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein present in synaptic vesicles of motor neurons.
  • a desired substance can be targeted to motor neurons using an antibody.
  • desired substances can be delivered to motor neurons (eg, synaptic vesicles within the cells).
  • motor neurons eg, synaptic vesicles within the cells.
  • the substance is a physiologically active substance or a therapeutic agent, symptoms and/or diseases caused by motor neuron abnormalities can be treated.
  • motor neurons can be visualized.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the experimental procedure for presynaptic induction and antibody delivery using LRRTM2 beads.
  • nerve axons grow from the neurospheres.
  • LRRTM2 beads by seeding LRRTM2 beads there, a presynapse is induced from the elongated nerve axon to the LRRTM2 bead surface.
  • a normal rabbit IgG antibody (control) or an anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) was introduced into the plate in which presynapses were induced in this way, and the cells were stimulated with chemicals.
  • FIG. 2-1 is a diagram showing a fluorescence image when an antibody delivery experiment using spontaneous activity was performed at an antibody concentration of 1 ⁇ g/mL.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing.
  • the scale bar is common to A and B and indicates 100 ⁇ m.
  • Figure 2-2 shows a fluorescence image when a spontaneous activity delivery experiment of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) was carried out at an antibody concentration of 1 ⁇ g/mL.
  • a and B are fluorescent images showing the localization of anti-SYT2 N-terminal antibody in LRRTM2 beads (A) where nerve axons are not densely packed and LRRTM2 beads (B) where nerve axons are densely packed, respectively.
  • the dashed circle indicates the position of LRRTM2 beads.
  • FIG. 3 is a diagram showing a fluorescence image when an antibody delivery experiment using spontaneous activity was performed at an antibody concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing.
  • the scale bar is common to A and B and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 4 is a diagram showing fluorescence images obtained when an antibody delivery experiment was performed by stimulating nerve cells with 4-aminopyridine for 10 minutes.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing.
  • the scale bar is common to A and B and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence images when an antibody delivery experiment was performed by stimulating nerve cells with 4-aminopyridine for 30 minutes.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing. In the figure, the scale bar is common to A and B and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows fluorescence images at the neuromuscular junction 12 hours after administration of antibodies by tail vein injection.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • ⁇ -BgtX refers to a stained image showing an ⁇ -bungarotoxin signal
  • SYN1 refers to a stained image showing a synapsin 1 signal.
  • the arrowhead indicates the location of the neuromuscular junction where the anti-SYT2 N-terminal antibody was delivered, and the scale bar is common to each image and indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 7 shows fluorescence images at the neuromuscular junction 72 hours after administration of antibodies by tail vein injection.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing.
  • ⁇ -BgtX refers to a stained image showing an ⁇ -bungarotoxin signal
  • SYN1 refers to a stained image showing a synapsin 1 signal.
  • the arrowhead indicates the location of the neuromuscular junction where the anti-SYT2 N-terminal antibody was delivered, and the scale bar is common to each image and indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 8 shows fluorescence images at the neuromuscular junction 12 hours after administration of antibodies by intraperitoneal injection.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • This is a fluorescence image showing.
  • ⁇ -BgtX refers to a stained image showing an ⁇ -bungarotoxin signal
  • SYN1 refers to a stained image showing a synapsin 1 signal.
  • FIG. 9 shows fluorescence images at the neuromuscular junction 72 hours after administration of antibodies by intraperitoneal injection.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively. This is a fluorescence image showing.
  • ⁇ -BgtX refers to a stained image showing an ⁇ -bungarotoxin signal
  • SYN1 refers to a stained image showing a synapsin 1 signal.
  • the arrowhead indicates the location of the neuromuscular junction where the anti-SYT2 N-terminal antibody was delivered, and the scale bar is common to each image and indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 10 shows electron microscopy images of neuromuscular junctions 72 hours after administration of antibodies by tail vein injection.
  • a and B show the localization of the administered antibody when normal rabbit IgG antibody (A) and anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) (B) were used as antibodies, respectively.
  • FIG. 11 shows an electron microscopy image of the neuromuscular junction 72 hours after administration of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) by tail vein injection.
  • A is an electron microscope image of the same field of view as FIG. 10B
  • B is an electron microscope image in which the area surrounded by the solid black line in A is enlarged.
  • black dots indicate the positions of antibodies.
  • the area surrounded by white lines indicates nerve axon terminals of motor neurons
  • the area surrounded by black dashed lines indicates gastrocnemius muscle cells, which are skeletal muscles
  • the scale bar indicates 2 ⁇ m.
  • a to c represent synaptic vesicles that do not contain antibodies (a), synaptic vesicles that contain antibodies (b), and mitochondria (c), respectively.
  • the scale bar indicates 500 nm.
  • ChAT refers to a stained image showing the signal of choline acetyltransferase.
  • the dashed line indicates the boundary between the spinal ventral horn and the white matter, and the spinal ventral horn is located to the left of the dashed line.
  • Arrowheads illustrate the location of cell bodies of motor neurons to which anti-SYT2 N-terminal antibodies were delivered, scale bars are common to each image and indicate 100 ⁇ m.
  • FIG. 13 is a diagram showing an enlarged fluorescence image of the ventral horn of the spinal cord 72 hours after administration of normal rabbit IgG antibody by tail vein injection.
  • ChAT refers to a stained image showing the signal of choline acetyltransferase.
  • the scale bar is common to each image and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 14 is a diagram showing an enlarged fluorescent image of the ventral horn of the spinal cord 72 hours after administration of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) by tail vein injection.
  • ChAT refers to a stained image showing the signal of choline acetyltransferase.
  • FIG. 15 is a diagram showing fluorescence images in the ventral horn of the spinal cord 6 to 72 hours after administration of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminus) antibody (anti-SYT2 N-terminus antibody) by tail vein injection.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • the scale bar is common to each image and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 16 is a diagram showing fluorescence images of the anterior horn of the spinal cord 120 to 240 hours after administration of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminus) antibody (anti-SYT2 N-terminus antibody) by tail vein injection.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • the scale bar is common to each image and indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 17 is a diagram showing fluorescence images in a control antibody group into which a conjugate of a normal rabbit antibody and monomethyl auristatin E (MMAE) was introduced.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on ⁇ III tubulin (Tuj1).
  • FIG. 18 is a diagram showing fluorescence images of the SYT2 antibody group into which a conjugate of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody (anti-SYT2 N-terminal antibody) and monomethyl auristatin E (MMAE) was introduced.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on ⁇ III tubulin (Tuj1).
  • Figures B and C are diagrams showing enlarged images of the white frame area in Figure A.
  • FIG. 19 is a diagram showing a graph quantifying the pharmacological effects based on monomethyl auristatin E (MMAE).
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • the relative axon volume is a value normalized to the result obtained when a conjugate of a normal rabbit antibody and MMAE was used as a control ("Cont. IgG-MMAE" in the figure) as 100%.
  • the dashed line indicates the position where the relative axon amount is 100%
  • MMAE is the single introduction group in which MMAE was introduced alone
  • ⁇ -SYT2 IgG-MMAE is the anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal )
  • error bars indicate standard errors
  • "*” indicates p ⁇ 0.05
  • *** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3 is a diagram showing a fluorescence image in a firing group.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on ⁇ III tubulin (Tuj1).
  • the scale bar indicates 1 mm.
  • Figure 21 shows that a conjugate of anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminus) antibody (anti-SYT2 N-terminus antibody) and monomethyl auristatin E (MMAE) was introduced into neurons under conditions that do not induce presynaptic formation.
  • N-terminus anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • FIG. 3 is a diagram showing fluorescence images in the endocytosis inhibition group cultured.
  • the fluorescent signal shown in the figure is a signal based on ⁇ III tubulin (Tuj1).
  • the scale bar indicates 1 mm.
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • anti-synaptotagmin 2 intravesicular domain (N-terminal) antibody anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • the relative axon mass is a value normalized to 100% of the synaptic non-formation group in which neurons were cultured under conditions that do not induce the formation of presynapses.
  • FIG. 24 is a diagram showing a graph quantifying the pharmacological effects based on monomethyl auristatin E (MMAE) delivered by various antibodies.
  • the present invention provides targeting agents for motor neurons (referred to as “intravesicular domain antibodies”) that are capable of binding to intravesicular domains of membrane proteins present in synaptic vesicles of motor neurons (referred to as “intravesicular domain antibodies”). (referred to as “targeting agent of the present invention”).
  • Membrane protein refers to a protein that exists on biological membranes.
  • the “membrane protein” in the present invention particularly refers to a protein present on the membrane of synaptic vesicles.
  • Membrane proteins in the present invention include transmembrane proteins, membrane surface proteins, and lipid-modified proteins. Both superficial membrane proteins and lipid-modified proteins are proteins that do not have transmembrane domains.
  • the type of membrane protein in the targeting agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains an intravesicular domain, but is preferably a transmembrane protein.
  • the term "intravesicular domain" of a protein refers to a protein region in a membrane protein that is exposed to the lumen of a synaptic vesicle.
  • the length of the intravesicular domain of the membrane protein in the targeting agent of the present invention is not particularly limited.
  • continuous vesicles with 1 or more amino acids, 2 or more amino acids, 3 or more amino acids, 4 or more amino acids, 5 or more amino acids, 6 or more amino acids, 7 or more amino acids, 8 or more amino acids, 9 or more amino acids, 10 or more amino acids, or 11 or more amino acids.
  • Membrane proteins with internal domains can be used.
  • a transmembrane protein having a continuous intravesicular domain of 4 or more amino acids can be suitably used.
  • the lumen of a synaptic vesicle refers to the space that exists on the opposite side of the synaptic vesicle from the cytoplasm.
  • the lumen of the synaptic vesicle communicates with the extracellular space when the synaptic vesicle fuses with the cell membrane. Therefore, the intravesicular domain of the membrane protein in the targeting agent of the present invention is exposed outside the cell when the synaptic vesicle fuses with the cell membrane.
  • synaptotagmin 2 as a membrane protein as an example.
  • the present invention relates to a targeting agent for motor neurons, which includes an antibody capable of binding to the intravesicular domain (N-terminal portion) of synaptotagmin 2 (referred to as "anti-SYT2 N-terminal antibody”).
  • synaptotagmin 2 refers to one of the membrane proteins belonging to the synaptotagmin family.
  • the synaptotagmin family includes 17 proteins in mammals, among which synaptotagmin 2 is mainly expressed on the presynaptic vesicle membrane of the neuromuscular junction in peripheral nerves, and is a calcium ion Proteins that promote the fusion of synaptic vesicles and cell membranes in a dependent manner (e.g., Rickman, Colin, et al., Journal of Biological Chemistry 279.13 (2004): 12574-12579., Stephanie Bauche, et al., Neurol). Genet. 2020 Dec 3;6(6):e534. doi: 10.1212).
  • Synaptotagmin 2 is a single-transmembrane protein that contains an intravesicular domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain in order from the N-terminus.
  • the C-terminal cytoplasmic domain has a tandem C2 domain with calcium ion binding ability, and it is known that this cytoplasmic domain is primarily responsible for membrane fusion-related functions.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 2 is exposed in the lumen of synaptic vesicles.
  • the lumen of the synaptic vesicle connects with the extracellular space, and the intravesicular domain of synaptotagmin 2 is temporarily exposed to the outside of the cell. do.
  • the cell membrane portion containing synaptotagmin 2 is collected into the cell by endocytosis as a synaptic vesicle membrane and reused as a synaptic vesicle.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 2 is exposed again to the synaptic vesicle lumen.
  • an exemplary human synaptotagmin 2 is a protein consisting of 419 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the position of each domain is, for example, in SEQ ID NO: 1, the intravesicular domain is the region shown by the amino acid sequence from positions 1 to 62, the transmembrane domain is the region shown by the amino acid sequence from positions 63 to 83, and the cytoplasmic domain is the region indicated by the amino acid sequence from position 84 to position 419.
  • An exemplary mouse synaptotagmin 2 is a protein consisting of 422 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the positions of each domain are as follows: the intravesicular domain is the region shown by the amino acid sequence from positions 1 to 60, the transmembrane domain is the region shown by the amino acid sequence from positions 61 to 87, and the cytoplasmic domain. is the region indicated by the amino acid sequence from position 88 to position 422.
  • Sequence information on synaptotagmin 2 of other organisms can be easily obtained from known databases such as the NCBI database.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 2 refers to all or part of the intravesicular domain present in the N-terminal portion of synaptotagmin 2.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from positions 1 to 62 in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3), and the amino acid sequence from positions 1 to 60 in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4). Includes the area indicated by .
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • one or more amino acids Included is the N-terminal portion of synaptotagmin 2 having a mutant amino acid sequence with substitutions, insertions, deletions, and/or additions.
  • “plurality” refers to a number of 2 or more, for example, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3, preferably 2.
  • an antibody capable of binding to any membrane protein other than synaptotagmin 2 exemplified above can be used.
  • specific membrane proteins in the targeting agent of the present invention include, for example, synaptotagmin family, major facilitator superfamily, synaptic vesicle glycoprotein 2 family, synaptogyrin family, synaptophysin/synaptobrevin. family, synaptobrevin family, vesicular amine transporter family, solute carrier family 5, vesicular glutamate transporter family, amino acid/polyamine transporter family, secreted carrier-associated membrane protein family, glutamate transporter subfamily, autophagy-related Examples include proteins belonging to any one family selected from the group consisting of protein 9 family, sugar transporter family, and vacuolar ATPase subunit S1 family.
  • membrane proteins in the targeting agent of the present invention include, in addition to synaptotagmin 2, for example, synaptic vesicle glycoprotein 2A, synaptogyrin 1, synaptophysin, synaptotagmin 1, synaptogyrin 3, and synaptogyrin 3.
  • synaptotagmin 2A for example, synaptic vesicle glycoprotein 2A, synaptogyrin 1, synaptophysin, synaptotagmin 1, synaptogyrin 3, and synaptogyrin 3.
  • vesicular acetylcholine transporter high affinity choline transporter, vesicular glutamate transporter 1, vesicular glutamate transporter 3, vesicular GABA transporter, synaptic vesicle glycoprotein 2B, synaptic vesicle glycoprotein 2C, vesicle-associated membrane protein 1, synaptogyrin 4, synaptotagmin 4, synaptotagmin 7, secreted carrier-associated membrane protein 5, synaptic vesicle glycoprotein 2-associated protein (SVOP), excitatory amino acid transporter 3, autophagy-related protein 9A, glucose trans Examples include porter 4 and ATPase H+ transport accessory protein 1.
  • the membrane protein in the targeting agent of the present invention includes any one protein selected from the group consisting of synaptotagmin 2, synaptic vesicle glycoprotein 2A, synaptogyrin 1, synaptophysin, and synaptotagmin 1.
  • the present invention provides an antibody capable of binding to the intravesicular domain of any one protein selected from the group consisting of synaptotagmin 2, synaptic vesicle glycoprotein 2A, synaptogyrin 1, synaptophysin, and synaptotagmin 1.
  • a targeting agent comprising:
  • Synaptic vesicle glycoprotein 2A refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the synaptic vesicle glycoprotein 2 family of the major facilitator superfamily. This protein is thought to be involved in the control of regulatory secretion in neurons and endocrine cells, and to promote low-frequency neurotransmission in resting neurons. Synaptic vesicle glycoprotein 2A is also known by other names such as KIAA0736, SV2, and SLC22B1. Exemplary synaptic vesicle glycoprotein 2A is a human-derived protein consisting of 742 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 6.
  • the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2A refers to all or part of the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2A.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 191 to position 205 in SEQ ID NO: 6 (sequence: PSAEKDMCLSDSNKG; SEQ ID NO: 7), the amino acid sequence from position 255 to position 262 ( Sequence: YGTFLFCR; SEQ ID NO: 8), region indicated by the amino acid sequence from position 316 to position 334 (sequence: PHYGWSFQMGSAYQFHSWR; SEQ ID NO: 9), amino acid sequence from position 469 to position 598 (sequence: PDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFV
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region represented by a partial sequence of any length in SEQ ID NOs: 7 to 12.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody. More specifically, for example, in the region shown by the amino acid sequence from position 451 to position 550 of SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 13: MGVWFTMSFSYYGLTVWFPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCT) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, one or more amino acids are substituted, Included are protein regions of synaptic vesicle glycoprotein 2A that have insertions, deletions, and/or additions of mutant amino acid sequences.
  • Synaptogyrin 1 refers to one of the four transmembrane proteins belonging to the synaptogyrin family. This protein is present in presynaptic vesicles of neurons and is thought to be involved in regulated exocytosis, synaptic vesicle formation and maturation, and synaptic plasticity.
  • An exemplary synaptogyrin 1 is a human-derived protein whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 14 and consists of 233 amino acids.
  • the intravesicular domain of synaptogyrin 1 refers to all or part of the intravesicular domain of synaptogyrin 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 45 to position 71 in SEQ ID NO: 14 (sequence: NEGYLNSASEGEEFCIYNRNPNACSYG; SEQ ID NO: 15), the amino acid sequence from position 125 to position 148 ( Sequence: YLANQWQVSKPKDNPLNEGTDAAR; SEQ ID NO: 16) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody. More specifically, for example, in the region shown by the amino acid sequence from position 130 to position 146 of SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 17: WQVSKPKDNPLNEGTDA) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, one or more amino acids are substituted, Included are protein regions of synaptogyrin 1 that have insertions, deletions, and/or additions of mutant amino acid sequences.
  • Synaptophysin refers to one of the four transmembrane proteins belonging to the synaptophysin/synaptobrevin family. This protein is thought to be involved in the organization of vesicle membrane components, targeting of vesicles to the cell membrane, and control of synaptic plasticity. Synaptophysin is also known by other names such as MRX96, tumor synaptic vesicle protein P38, MRXSYP, and XLID96.
  • An exemplary synaptophysin is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 313 amino acids represented by SEQ ID NO: 18.
  • the intravesicular domain of synaptophysin refers to all or part of the intravesicular domain of synaptophysin.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 50 to position 106 in SEQ ID NO: 18 (Sequence: ELQLSVDCANKTESDLSIEVEFEYPFRLHQVYFDAPTCRGGTTKVFLVGDYSSSAEF; SEQ ID NO: 19), the amino acid sequence from position 162 to position 199 (Sequence: ELQLSVDCANKTESDLSIEVEFEYPFRLHQVYFDAPTCRGGTTKVFLVGDYSSSAEF; Sequence: KGLSDVKMATDPENIIKEMPVCRQTGNTCKELRDPVTS; SEQ ID NO: 20) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 19 and 20.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody. More specifically, for example, in the region shown by the amino acid sequence from position 178 to position 190 of SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 21: CRQTGNTCKELRD) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, one or more amino acids are substituted, Included are protein regions of synaptophysin that have insertions, deletions, and/or additions with variant amino acid sequences.
  • Synaptotagmin 1 refers to one of the single-transmembrane proteins belonging to the synaptotagmin family. This protein is thought to be one of the proteins that promotes the fusion of synaptic vesicles and cell membranes in a calcium ion-dependent manner. Synaptotagmin 1 is also known by other names such as P65, SVP65, SYT, and BAGOS. Exemplary synaptotagmin 1 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 422 amino acids represented by SEQ ID NO: 22.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 1 refers to all or part of the intravesicular domain of synaptotagmin 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 1 to position 57 in SEQ ID NO: 22 (sequence: MVSESHHEALAAPPVTTVATVLPSNATEPASPGEGKEDAFSKLKEKFMNELHKIPLP; SEQ ID NO: 23).
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NO: 23. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • SEQ ID NO: 24 MVSASRPE
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 one or more amino acids are substituted, Included are N-terminal portions of synaptotagmin 1 having insertions, deletions, and/or additions of mutant amino acid sequences.
  • Synaptogyrin 3 refers to one of the four transmembrane proteins belonging to the synaptogyrin family. This protein is thought to be involved in regulated exocytosis, dopamine recycling, etc.
  • An exemplary synaptogyrin 3 is a human-derived protein consisting of 229 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 25.
  • the intravesicular domain of synaptogyrin 3 refers to all or part of the intravesicular domain of synaptogyrin 3.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 51 to position 69 in SEQ ID NO: 25 (sequence: TDSGPELRCVFNGNAGACR; SEQ ID NO: 26), the amino acid sequence from position 126 to position 147 ( Sequence: LTNQWQRTAPGPATTQAGDAAR; SEQ ID NO: 27) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 26 and 27. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Vesicular Acetylcholine Transporter refers to one of the 12 transmembrane membrane proteins belonging to the vesicular amine transporter family. This protein is a transmembrane protein that transports acetylcholine into secretory vesicles and releases it outside the cell. Vesicular acetylcholine transporter is also known by other names such as VACHT, SLC18A3, and CMS21. Specifically, an exemplary vesicular acetylcholine transporter is a protein of human origin consisting of 532 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 29.
  • the intravesicular domain of the vesicular acetylcholine transporter refers to all or part of the intravesicular domain of the vesicular acetylcholine transporter.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 55 to position 125 in SEQ ID NO: 29 (sequence: PIVPDYIAHMRGGGEGPTRTPEVWEPTLPLPTPANASAYTANTSASPTAAWPAGSALRPRYPTESEDVKIG; SEQ ID NO: 30), the amino acid sequence from position 174 to position 182 ( Sequence: DYATLFAAR; SEQ ID NO: 31), region indicated by the amino acid sequence from position 235 to position 242 (sequence: LYEFAGKR; SEQ ID NO: 32), amino acid sequence from position 311 to position 325 (sequence: TIATWMKHTMAASEW; SEQ ID NO: 33), the region indicated by the amino acid sequence from position 378 to
  • High Affinity Choline Transporter 1 refers to one of the 13 transmembrane proteins belonging to solute carrier family 5. This protein is a sodium ion- and chloride ion-dependent transmembrane transporter for the high affinity uptake of choline from the extracellular space for acetylcholine synthesis. High affinity choline transporter is also known by other names such as SLC5A7, HCHT, and CHT.
  • An exemplary high-affinity choline transporter is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 580 amino acids represented by SEQ ID NO: 36.
  • the intravesicular domain of high affinity choline transporter 1 refers to all or part of the intravesicular domain of high affinity choline transporter 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 1 to position 6 in SEQ ID NO: 36 (sequence: MAFHVE; SEQ ID NO: 37), the amino acid sequence from position 70 to position 81 ( Sequence: GTAEAVYVPGYG; SEQ ID NO: 38), region indicated by the amino acid sequence from position 147 to position 164 (sequence: GEMFWAAAIFSALGATISVIIDVDMHIS; SEQ ID NO: 39), amino acid sequence from position 213 to position 237 (sequence: ADIGFTAVHAKYQKPWLGTVDSSEV; SEQ ID NO: 40), the region indicated by the amino acid sequence from position 296 to position 317 (sequence: ASTDWNQTAYGLPDPKTTEEAD; SEQ ID NO: 41),
  • VGLUT1 Vesicular Glutamate Transporter 1 (VGLUT1) refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the vesicular glutamate transporter family. This protein is considered to be a multifunctional symport transporter that transports multiple types of ions, including sodium and phosphate ions, as well as L-glutamate and chloride ions. Vesicular glutamate transporter 1 is also known by other names such as SLC17A7 and BNPI. Exemplary vesicular glutamate transporter 1 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 560 amino acids represented by SEQ ID NO: 44.
  • the intravesicular domain of vesicular glutamate transporter 1 refers to all or part of the intravesicular domain of vesicular glutamate transporter 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 85 to position 116 in SEQ ID NO: 44 (sequence: VAIVSMVNNSTTHRGGHVVVQKAQFSWDPETV; SEQ ID NO: 45), the amino acid sequence from position 162 to position 169 (sequence: VAIVSMVNNSTTHRGGHVVVQKAQFSWDPETV; The region shown by the amino acid sequence from position 230 to position 236 (sequence: QYSGWSS; SEQ ID NO: 47), the amino acid sequence from position 324 to position 341 (sequence: SQPAYFEEVFGFEISKVG; SEQ ID NO: 48), region indicated by the amino acid sequence from position 400 to position 401 (sequence: SK), amino acid sequence from position
  • VGLUT3 Vesicular Glutamate Transporter 3 (VGLUT3) refers to one of the 10 transmembrane proteins belonging to the vesicular glutamate transporter family. This protein is considered to be a multifunctional uniporter that transports multiple types of ions, including sodium and phosphate ions, as well as L-glutamic acid and chloride ions. Vesicular glutamate transporter 3 is also known by other names such as SLC17A8 and DFNA25. Exemplary vesicular glutamate transporter 3 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 589 amino acids represented by SEQ ID NO: 50.
  • the intravesicular domain of vesicular glutamate transporter 3 refers to all or part of the intravesicular domain of vesicular glutamate transporter 3.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 98 to position 130 in SEQ ID NO: 50 (sequence: VAIVEMVNNSTVYVDGKPEIQTAQFNWDPETVG; SEQ ID NO: 51), the amino acid sequence from position 175 to position 182 ( The region shown by the amino acid sequence from position 243 to position 249 (sequence: QYIGWSS; sequence number 53), the amino acid sequence from position 336 to position 353 (sequence: SQPAYFEEVFGFAISKVG; SEQ ID NO: 54), region indicated by the amino acid sequence from position 412 to position 413 (sequence: TK), amino acid sequence from position 469 to position 481 (sequence: GAMTRHKTREEWQ; SEQ ID NO: 55
  • Vesicular GABA Transporter refers to one of the 10 transmembrane proteins that belong to the amino acid/polyamine transporter family. This protein is an antiporter that exchanges 4-aminobutanoic acid or glycine in the cytoplasm with protons in the vesicle and transports it into the vesicle for secretion from nerve terminals. Vesicular GABA transporter is also known by other names such as VIAAT, SLC32A1, and BA122O1.1.
  • An exemplary vesicular GABA transporter is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 525 amino acids represented by SEQ ID NO: 56.
  • intravesicular domain of a vesicular GABA transporter refers to all or part of the intravesicular domain of a vesicular GABA transporter.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 154 to position 204 in SEQ ID NO: 56 (sequence: FAAVVCCYTGKILIACLYEENEDGEVVRVRDSYVAIANACCAPRFPTLGGR; SEQ ID NO: 57), the amino acid sequence from position 287 to position 305 (sequence: FAAVVCCYTGKILIACLYEENEDGEVVRVRDSYVAIANACCAPRFPTLGGR; Sequence: SRARDWAWEKVKFYIDVKK; SEQ ID NO: 58), region indicated by the amino acid sequence from position 363 to position 383 (sequence: ADETKEVITDNLPGSIRAVVN; SEQ ID NO: 59), amino acid sequence from position 460 to position 461 (sequence:
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 57 to 60.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Synaptic vesicle glycoprotein 2B refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the synaptic vesicle glycoprotein 2 family of the major facilitator superfamily. This protein is involved in the control of regulatory secretion in neurons and endocrine cells, and has been suggested to function as a protein receptor for botulinum neurotoxin E in neurons.
  • Synaptic vesicle glycoprotein 2B is also known by other names such as KIAA0735, HsT19680, and SLC22B2.
  • Exemplary synaptic vesicle glycoprotein 2B is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 683 amino acids represented by SEQ ID NO: 61.
  • the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2B refers to all or part of the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2B.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 130 to position 148 in SEQ ID NO: 61 (sequence: SFALPSAEKDMCLSSSSKKG; SEQ ID NO: 62), the amino acid sequence from position 204 to position 205 ( The region shown by the amino acid sequence from positions 259 to 277 (Sequence: PHYGWGFSMGTNYHFHSWR; SEQ ID NO: 63), the amino acid sequence from positions 412 to 535 (PDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYE) HKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDND; Sequ
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region represented by a partial sequence of any length in SEQ ID NOs: 62 to 66.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Synaptic vesicle glycoprotein 2C refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the synaptic vesicle glycoprotein 2 family of the major facilitator superfamily. This protein is thought to be involved in the control of regulatory secretion in nerve cells and endocrine cells, and to be involved in neurotransmitter transport and transmembrane transport. Synaptic vesicle glycoprotein 2C is also known by other names such as SLC22B3 and KIAA1054. Exemplary synaptic vesicle glycoprotein 2C is a protein of human origin consisting of 727 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 67.
  • the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2C refers to all or part of the intravesicular domain of synaptic vesicle glycoprotein 2C.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 176 to position 191 in SEQ ID NO: 67 (sequence: LPSAETDLCIPNSGSG; SEQ ID NO: 68), the amino acid sequence at position 248 (sequence: R) The region shown by the amino acid sequence from positions 302 to 320 (Sequence: PHYGWSFSMGSAYQFHSWR; SEQ ID NO: 69), the amino acid sequence from positions 459 to 578 (Sequence: KPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFK NCSFFHNKTGCQIT
  • VAMP1 Vehicle Associated Membrane Protein 1
  • VAMP1 refers to one of the single-transmembrane proteins belonging to the synaptobrevin family. This protein is thought to be involved in targeting and/or membrane fusion of transport vesicles to cell membranes and the like. Vesicle-associated membrane protein 1 is also known by other names such as SYB1, CMS25, SPAX1, and synaptobrevin 1. Exemplary vesicle-associated membrane protein 1 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 118 amino acids represented by SEQ ID NO: 73.
  • the intravesicular domain of vesicle-associated membrane protein 1 refers to all or part of the intravesicular domain of vesicle-associated membrane protein 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 117 to position 118 in SEQ ID NO: 73 (sequence: FT).
  • Synaptogyrin 4 refers to one of the four transmembrane proteins belonging to the synaptogyrin family. This protein, like other proteins in the same family, has four transmembrane domains.
  • An exemplary synaptogyrin 4 is a human-derived protein whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 74 and consists of 234 amino acids.
  • the intravesicular domain of synaptogyrin 4" refers to all or part of the intravesicular domain of synaptogyrin 4.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 46 to position 65 in SEQ ID NO: 74 (sequence: YQNKMESPQLHCILNSNSVA; SEQ ID NO: 75), the amino acid sequence from position 125 to position 144 ( Sequence: ANQWQHSPPKEFLLGSSSAQ; SEQ ID NO: 76) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 75 and 76. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Synaptotagmin 4 refers to one of the single-transmembrane proteins belonging to the synaptotagmin family. This protein is thought to be involved in the movement of dense-core vesicles in nerve cells through interaction with KIF1A. Synaptotagmin 4 is also known by other names such as KIAA1342 and HsT1192. Exemplary synaptotagmin 4 is a human-derived protein consisting of 425 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 77.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 4" refers to all or part of the intravesicular domain of synaptotagmin 4.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 1 to position 16 in SEQ ID NO: 77 (Sequence: MAPITTSREEFDEIPT; SEQ ID NO: 78).
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NO: 78. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Synaptotagmin 7 refers to one of the single-transmembrane proteins belonging to the synaptotagmin family. This protein is thought to be one of the proteins that promotes the fusion of secretory vesicles or synaptic vesicles with the cell membrane in a calcium ion-dependent manner. Synaptotagmin 7 is also known by other names such as IPCA-7, PCNAP7, and MGC150517. Exemplary synaptotagmin 7 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 403 amino acids represented by SEQ ID NO: 79.
  • the intravesicular domain of synaptotagmin 7 refers to all or part of the intravesicular domain of synaptotagmin 7.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 1 to position 16 in SEQ ID NO: 79 (sequence: MYRDPEAASPGAPSRD; SEQ ID NO: 80).
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NO: 80. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Secretory Carrier Membrane Protein 5 refers to one of the four transmembrane proteins belonging to the secretory carrier-associated membrane protein family. This protein is thought to be involved in calcium-dependent exocytosis of cytokines and the like. Secreted carrier-associated membrane protein 5 is also known by other names such as MGC24969 and HSCAMP5. Exemplary secreted carrier-related membrane protein 5 is a human-derived protein whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 81 and consists of 235 amino acids.
  • the intravesicular domain of the secreted carrier-associated membrane protein 5" refers to all or part of the intravesicular domain of the secreted carrier-associated membrane protein 5.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 61 to position 67 in SEQ ID NO: 81 (sequence: WLIGGGG; SEQ ID NO: 82), the amino acid sequence from position 126 to position 148 ( Sequence: IPGWGVCGWIATISFFGTNIGSA; SEQ ID NO: 83) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 82 and 83. The length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Synaptic Vesicle 2-Related Protein refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the synaptic vesicle glycoprotein 2 family of the major facilitator superfamily. This protein is thought to have transmembrane transporter activity. Synaptic vesicle glycoprotein 2-related protein is also known by other names such as SLC22B4, DKFZp761H039, and SCF22B4. An exemplary synaptic vesicle glycoprotein 2-related protein is a human-derived protein whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 84 and consists of 548 amino acids.
  • the intravesicular domain of the synaptic vesicle glycoprotein 2-related protein refers to all or part of the intravesicular domain of the synaptic vesicle glycoprotein 2-related protein.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 109 to position 122 in SEQ ID NO: 84 (sequence: PQLHCEWRLPSWQV; SEQ ID NO: 85), the amino acid sequence from position 178 to position 180 ( The region shown by the amino acid sequence from positions 231 to 238 (sequence: VMPSLGWR; SEQ ID NO: 86), the amino acid sequence from positions 338 to 373 (sequence: TTELFQAGDVCGISSRKKAVEAKCSLACEYLSEEDY; SEQ ID NO: 87), the region shown by the amino acid sequence from position 423 to position 424 (sequence: RN), the region shown by the amino acid sequence from position 479 to position 489 (sequence
  • EAAT3 Excitatory Amino Acid Transporter 3
  • SLC1A1, HEAAC1, and EAAC1 Excitatory Amino Acid Transporter 3
  • Exemplary excitatory amino acid transporter 3 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 524 amino acids represented by SEQ ID NO: 89.
  • the intravesicular domain of excitatory amino acid transporter 3 refers to all or part of the intravesicular domain of excitatory amino acid transporter 3.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 39 to position 61 in SEQ ID NO: 89 (Sequence: REHSNLSTLEKFYFAFPGEILMR; SEQ ID NO: 90), the amino acid sequence from position 115 to position 205 ( Sequence: SIKPGVTQKVGEIARTGSTPEVSTVDAMLDLIRNMFPENLVQACFQQYKTKREEVKPPSDPEMNMTEESFTAVMTTAISKNKTKEYKIVGM; SEQ ID NO: 91), region indicated by the amino acid sequence from position 267 to position 286 (sequence: AGKIIEVEDWEIFRKLGLYM; SEQ ID NO: 92), amino acid sequence from position 381 to position 393 (sequence: : It includes the region shown by IAQLND
  • Autophagy-Related Protein 9A refers to one of the five transmembrane proteins belonging to the autophagy-related protein 9 family. This protein is a phospholipid scramblase that participates in autophagy by modifying the phospholipid composition on the autophagosome membrane and mediating its expansion. Autophagy-related protein 9A is also known by other names such as APG9L1, FLJ22169, and MATG9. Exemplary autophagy-related protein 9A is a human-derived protein whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 95 and consists of 839 amino acids.
  • the intravesicular domain of autophagy-related protein 9A refers to all or part of the intravesicular domain of autophagy-related protein 9A.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 85 to position 128 in SEQ ID NO: 95 (sequence: SCVDYDILFANKMVNHSLHPTEPVKVTLPDAFLPAQVCSARIQE; SEQ ID NO: 96), the amino acid sequence from position 398 to position 406 (sequence: SCVDYDILFANKMVNHSLHPTEPVKVTLPDAFLPAQVCSARIQE; Sequence: DEDVLAVEH; SEQ ID NO: 97) is included.
  • a part of the intravesicular domain includes, for example, a region shown by a partial sequence of arbitrary length in SEQ ID NOs: 96 and 97.
  • the length of the partial sequence is as described for anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • Glucose Transporter Type 4 refers to one of the 12 transmembrane proteins belonging to the sugar transporter family. This protein is an insulin-controlled glucose transporter and plays an important role in the removal of glucose from the systemic circulation. Glucose transporter 4 is also known by other names such as SLC2A4. Exemplary glucose transporter 4 is a human-derived protein whose amino acid sequence consists of 509 amino acids represented by SEQ ID NO: 98.
  • the intravesicular domain of glucose transporter 4" refers to all or part of the intravesicular domain of glucose transporter 4.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the region shown by the amino acid sequence from position 46 to position 81 in SEQ ID NO: 98 (sequence: NAPQKVIEQSYNETWLGRQGPEGPSSIPPGTLTTLW; SEQ ID NO: 99), the amino acid sequence from position 133 to position 142 ( Sequence: ASYEMLILGR; SEQ ID NO: 100), region indicated by the amino acid sequence from position 193 to position 201 (sequence: ESLLGTASL; SEQ ID NO: 101), amino acid sequence from position 309 to position 323 (sequence: YSTSIFETAGVGQPA; SEQ ID NO: 102), a region indicated by the amino acid sequence from position 375 to position 384 (sequence: ERVPAMSYVS; SEQ ID NO: 103), and an amino acid sequence from position 439 to
  • ATPase H+ Transporting Accessory Protein 1 (ATPase H+ Transporting Accessory Protein 1: ATP6AP1) refers to one of the single-transmembrane proteins belonging to the vacuolar ATPase subunit S1 family. This protein is thought to be a subunit of the proton-transporting vacuole (type V)-ATPase protein complex required for acidification of the lumen of secretory vesicles. ATPase H+ transport accessory protein 1 is also known as VATPS1, XAP3, ATP6IP1, ATP6S1, etc.
  • Exemplary ATPase H+ transport accessory protein 1 is a protein of human origin consisting of 470 amino acids whose amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 105.
  • the intravesicular domain of ATPase H+ transport accessory protein 1 refers to all or part of the intravesicular domain of ATPase H+ transport accessory protein 1.
  • the entire intravesicular domain includes, for example, the amino acid sequence from position 42 to position 419 in SEQ ID NO: 105 (Sequence: EQQVPLVLWSSDRDLWAPAADTHEGHITSDLQLSTYLDPALELGPRNVLLFLQDKLSIEDFTAYGGVFGNKQDSAFSNLENALDLAPSSLVLPAVDWYAVSTLTTYLQEKLGASPLHVDLATLRELKLNASLPALLLIRLPYTASSGLMAPREVLTGNDEV IGQVLSTLKSEDVPYTAALTAVRPSRVARDVAVVAGGLGRQLLQKQPVSPVIHPPVSYNDTAPRILFWAQNFSVAYKDQWEDLTPLTFGVQELNLTGSFWNDSFARLSLTYERLFGTTVTFKFILANRLYP
  • the targeting agent of the present invention can use an antibody that can bind to a non-protein region of a membrane protein present in a vesicle that is exposed in the vesicle lumen.
  • non-protein regions include sugar chains, lipids, and the like.
  • antibodies capable of binding thereto can be used.
  • an antibody that can bind to the lipid anchor portion of a Ras-related protein such as Rab3a can be used.
  • antibodies capable of binding to hydrophobic domains present in the vesicle membrane of superficial membrane proteins can be used.
  • vesicle membranes of synapsin family proteins such as synapsin 1 (Synapsin 1: SYN1: SEQ ID NO: 107), synapsin 2 (Synapsin 2: SYN2: SEQ ID NO: 108), and synapsin 3 (Synapsin 3: SYN3: SEQ ID NO: 109).
  • Antibodies and the like that can bind to the hydrophobic domain present within the protein can be used.
  • the animal from which the membrane protein in this specification is derived is not particularly limited, but may be derived from, for example, various vertebrates and mammals as described below with respect to cells, and proteins derived from humans are preferred.
  • targeting agent refers to an agent for delivering a specific substance to a target.
  • a targeting agent by using a targeting agent, a desired substance (a labeling substance and/or a physiologically active substance) is transported to a motor neuron, particularly a motor neuron synapse.
  • a desired substance a labeling substance and/or a physiologically active substance
  • a motor neuron particularly a motor neuron synapse.
  • the targeting agent of the present invention allows the transported substance to exert physiological activity in the cytoplasm.
  • the transported desired substance (labeling substance and/or physiologically active substance) can permeate the synaptic vesicle membrane and migrate into the cytoplasm.
  • the transported desired substance labeling substance and/or physiologically active substance
  • the biological substance in the nucleus, the desired biological substance in the cytoplasm, or on the cytoplasmic membrane. can act on biological substances.
  • the biological substance on which the physiologically active substance acts is not particularly limited as long as it can exist on the cell membrane or inside the cell, and includes, for example, high molecular compounds such as proteins and nucleic acids, and low molecules such as lipids, sugars, amino acids, and nucleotides. It may be a compound, an ion such as a metal ion, or an atom.
  • biological substances in the nucleus include DNA, RNA (mRNA, siRNA, miRNA, etc.), transcription factors, nuclear receptors, etc.
  • biological substances in the cytoplasm include the above-mentioned nucleic acids.
  • Other examples include cytoskeleton, enzymes, and metal ions.
  • the biological substances on the cell membrane include lipids on the cell membrane, receptors on the cell membrane, enzymes coupled to the receptors, and cell adhesion factors.
  • motor neuron refers to a group of nerve cells that transmit central stimulation to skeletal muscles, which are effect organs.
  • Motor neurons generally include primary motor neurons, which are central nerve cells, and secondary motor neurons, which are peripheral nerve cells, and the motor neurons herein are secondary motor neurons.
  • the term "secondary motor neuron” refers to a motor neuron that has its cell body in the ventral horn of the spinal cord or brainstem and extends its axon to the junction with skeletal muscle.
  • motor neurons include, for example, ⁇ motor neurons, ⁇ motor neurons, ⁇ motor neurons, and the like.
  • spinal nerve cells having cell bodies in the anterior nucleus of the spinal cord some cranial nerves such as the oculomotor nerve, trochlear nerve, abducens nerve, facial nerve, and hypoglossal nerve are also included.
  • the motor neurons herein generally secrete acetylcholine as a neurotransmitter and are classified as cholinergic neurons. However, motor neurons that secrete neurotransmitters other than acetylcholine may also be used.
  • the muscle cells projected by the motor neurons herein are skeletal muscle cells.
  • skeletal muscle cells refer to cells that constitute striated muscles that move the skeleton or cells that have the phenotype thereof. Skeletal muscle cells as used herein broadly include muscle cells attached to bones and other muscle cells contained in skeletal muscles such as muscle spindles.
  • the types of skeletal muscles are not particularly limited, but include, for example, the diaphragm, vastus lateralis, vastus medialis, rectus femoris, vastus intermedius, biceps, tibialis anterior, tibialis posterior, gastrocnemius, soleus, and deltoid.
  • skeletal muscle cells in this specification refer to cultured cells differentiated in vitro from artificial stem cells (iPS cells, ES cells, etc.) and/or natural stem cells (mesenchymal stem cells, skeletal muscle stem cells, etc.). Also includes skeletal muscle cells.
  • the cell may be a cell derived from a vertebrate.
  • Vertebrates include fish, reptiles, amphibians, birds and mammals. Specific mammals include, for example, primates (eg, humans).
  • cells are derived from livestock (chickens, horses, cows, sheep, goats, pigs, etc.), pet animals (tropical fish, lizards, dogs, cats, rabbits, etc.), and experimental animals (frogs, mice, rats, monkeys, etc.) It can be a cell.
  • the cells do not need to be derived from one type of tissue, individual, or animal species, and may be a mixture of multiple types of cells.
  • the tissue from which the cells are derived and the health condition of the individual are not particularly limited.
  • a desired substance (labeled substance and/or physiologically active substance) is delivered to a motor neuron (e.g., an axon terminal, an axon, an axon of a motor neuron) via a motor neuron synapse. caruncle, cell body, dendrites, etc.).
  • a motor neuron e.g., an axon terminal, an axon, an axon of a motor neuron
  • syne refers to the connection between the axon terminal of a neuron and the dendrite of another neuron (in the case of the central nervous system) or cells of skeletal muscles, organs, etc. (in the case of the peripheral nervous system). refers to a joint that includes a gap formed between
  • a synapse may be a chemical synapse, such as an excitatory synapse, an inhibitory synapse, etc.
  • a synapse is a synapse formed between a neuron and another neuron (e.g., a synapse formed between an axon of a neuron and a dendrite of another neuron), Alternatively, it may be a synapse formed between a nerve cell and a cell of another type (such as a muscle cell), but preferably a synapse formed between a presynapse on a nerve cell and a postsynapse on a skeletal muscle cell ( (also called the "neuromuscular junction").
  • presynaptic area refers to the vast area formed at the axon terminal of a neuron at a synapse
  • postsynaptic area refers to the dendrites of another neuron or skeletal muscle
  • synaptic cleft refers to the space between the presynaptic region and the postsynaptic region.
  • synaptic vesicles refer to secretory vesicles present in the cytoplasm of presynaptic neurons.
  • synaptic vesicles include not only vesicles that contain neurotransmitters inside and fuse with the cell membrane in response to stimulation to release neurotransmitters into the synaptic cleft, but also Also included are vesicles retrieved into neuronal cells by cytosis (including bulk endocytosis).
  • the targeting agent of the present invention binds to the intravesicular domain of membrane proteins such as synaptotagmin 2 exposed on the cell membrane in the synaptic cleft, and is taken up into synaptic vesicles by endocytosis, thereby etc. can be delivered up to. Therefore, according to the targeting agent of the present invention, a desired substance (labeling substance and/or physiologically active substance) can be targeted to the inside of a motor neuron, particularly to the cell body of a motor neuron.
  • an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein refers to an antibody capable of specifically binding to the intravesicular domain of a membrane protein as an antigen. .
  • an antibody capable of binding to the intravesicular domain (N-terminal portion) of synaptotagmin 2 refers to an antibody that uses the intravesicular domain of synaptotagmin 2 as an antigen and is specific for it. Refers to antibodies that can bind to.
  • Intravesicular domain antibodies such as anti-SYT2 N-terminal antibodies include both monoclonal and polyclonal antibodies, but the included antibodies include IgG antibody molecules, IgM antibody molecules, or antigen-binding fragments and antigen-binding derivatives thereof. It can be.
  • antibodies include complete antibodies, Fab, Fab', F(ab') 2 fragments, and single chain antibody (scFv) fragments in which the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) are linked by a linker. , scFv-Fc, sc(Fv) 2 , Fv, diabody, etc.
  • the antibody may be a human chimeric, humanized or human antibody, and when a conjugate or targeting agent of the invention is administered to a human, the antibody portion may be a human chimeric, humanized or human antibody. Preferably, it is an antibody.
  • the targeting agent of the present invention can contain antibodies capable of binding to multiple types of intravesicular domains.
  • these multiple types of intravesicular domains may be from the same membrane protein or from different membrane proteins.
  • Antibodies that can be used in the present invention further include derivatives that can be understood by those skilled in the art to the extent that antigen binding is not affected, such as derivatives that have been modified to facilitate antibody purification or increase stability. It will be done. As used herein, fragments and derivatives that retain binding to the intravesicular domain of synaptotagmin 2 are intended to be included in the term "antibody" unless the context indicates otherwise.
  • any molecule capable of binding to the target molecule can be used as the targeting agent or motor neuron visualization agent of the present invention.
  • molecules capable of binding to the target molecule include aptamers, cyclic peptides, receptors or ligands for the target molecule, or combinations thereof.
  • the targeting agent of the present invention includes antibodies capable of binding to the intravesicular domain of membrane proteins, including antibodies capable of binding to the intravesicular domain (N-terminal portion) of synaptotagmin 2, as well as desired substances (labeled and/or physiologically active substances).
  • labeling substance refers to a substance that emits a signal whose presence can be detected.
  • the labeling substance include luminescent labeling substances that emit light under specific conditions such as fluorescent molecules and chemiluminescent substances, acoustic labeling substances that emit sound waves such as photoacoustic effect probes, and radioactive labeling substances.
  • fluorescent molecules include, but are not limited to, fluorescent molecules such as fluorescent proteins, fluorescein and its derivatives, pyrene and its derivatives, and quantum dots.
  • chemiluminescent substances include enzymes such as peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (ALP).
  • radiolabeled substances examples include reagents containing 14 C, 3 H, 125 I, and the like.
  • the photoacoustic effect refers to a phenomenon in which thermoelastic waves are generated due to adiabatic expansion accompanying light absorption, and these thermoelastic waves can be detected as acoustic waves.
  • the photoacoustic effect probe include indocyanine green or its derivatives, curcumin derivatives, and choline derivatives. If the absorption characteristics of the antibody, labeling substance, and physiologically active substance used are known, it is not necessarily necessary to use a labeling substance for photoacoustic effects; for example, a luminescent labeling substance can be detected based on the photoacoustic effect. You may.
  • physiologically active substance refers to a substance that can directly or indirectly exert a physiological effect on living organisms or cells.
  • Examples include low-molecular compounds that can exert physiological effects on target motor neurons, functional middle molecules such as peptides and aptamers, and biopolymers such as antibodies, proteins such as enzymes, and nucleic acids such as DNA and RNA.
  • Examples include polymer compounds.
  • drugs or prodrugs such as synapse formation promoters, synapse maintainers, muscle enhancers, or nerve cell function modifying agents can be used as physiologically active substances.
  • physiological effect refers to an effect that brings about quantitative and/or qualitative changes in biomolecules such as proteins, DNA, and RNA.
  • physiological effects for example, the functions and properties of living organisms, organs, tissues, cells, etc. may change. For example, effects such as promotion or inhibition of synapse formation, improvement or prevention of decline in nerve function, improvement or prevention of nerve cell overactivity, etc. can be obtained.
  • the targeting agent of the present invention contains a desired substance (labeling substance and/or physiologically active substance), it binds to the intravesicular domain of membrane proteins, including antibodies capable of binding to the intravesicular domain of synaptotagmin 2.
  • a desired substance labeling substance and/or physiologically active substance
  • Possible antibodies and the desired substance are included, either uncovalently linked (eg, non-covalently linked) or covalently linked.
  • covalently linked an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein, including an antibody capable of binding to the intravesicular domain of synaptotagmin 2, and the desired substance may be conjugated ( conjugate of the present invention).
  • conjugate refers to a substance in which two or more molecules are linked by a covalent bond.
  • an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein is linked to a desired substance (labeling substance and/or physiologically active substance).
  • a desired substance labeling substance and/or physiologically active substance
  • an antibody capable of binding to the intravesicular domain of synaptotagmin 2 and a desired substance are linked.
  • the covalent bond and non-covalent bond between the antibody and the desired substance in the targeting agent of the present invention are such that the antibody capable of binding to the intravesicular domain of synaptotagmin 2 and the desired substance are linked to motor neurons. There is no particular limitation as long as the connection can reach the vicinity.
  • synapse formation promoting agent refers to a drug that has the effect of promoting the formation of presynaptic and/or postsynaptic sites. Promoting synapse formation includes, for example, increasing the bonding force of synapses, such as (i) increasing the surface area and/or volume of the presynaptic and/or posterior parts, (ii) expressing specifically in the presynaptic part. Increases and/or qualitative changes in the amount, density, accumulation rate, accumulation frequency, etc.
  • proteins e.g., synapsin 1 or synapsin 2, etc.
  • proteins specifically expressed in the postsynapse e.g., LRRTM family proteins
  • density e.g., density, accumulation rate, accumulation frequency, etc., and/or bringing about a qualitative change.
  • synaptic maintenance agent refers to a drug that has the effect of suppressing or assisting presynaptic and/or postsynaptic degeneration.
  • Synapse maintenance includes, for example, suppressing or assisting the weakening of synaptic junction strength, such as (i) suppressing or assisting the decrease in pre-synaptic and/or post-synaptic surface area and/or volume; ii) Decreasing the amount, density, accumulation rate, accumulation frequency, etc.
  • proteins specifically expressed in the presynaptic region e.g., synapsin 1 or synapsin 2, etc.
  • muscle-enhancing agent refers to a drug that has the effect of increasing muscle strength or suppressing muscle attenuation, or has the effect of promoting it.
  • the type of muscle enhancement is not particularly limited as long as muscle function is strengthened, but examples include increases in muscle surface area and/or volume, muscle bundles, muscle fibers, myofibrils, sarcomeres, muscle cells, etc. Actions that bring about an increase and/or qualitative change in the number, density, etc. of each element constituting the muscle, and/or a change in the expression level of a specific protein in the cells constituting the muscle, muscle mass and/or muscle strength (e.g. Examples include actions that increase the muscle mass or muscle strength of skeletal muscles, and actions that cause muscle attenuation due to these actions.
  • Specific synapse formation promoters, synapse maintainers, and muscle enhancers include, but are not limited to, the compounds disclosed in JP-A No. 2022-053535 (for example, thiamine and derivatives thereof), compounds disclosed in JP-A No. 2023-028848 (eg, atropine, busulfan, chromocarb, procainamide, udenafil, propyphenazone and derivatives thereof), and the like.
  • nerve cell function modifying agent refers to a drug that has the effect of changing or promoting the function exerted by nerve cells.
  • Functional modification of nerve cells is not particularly limited as long as the degree and/or properties of nerve cell function are changed, but examples include changes in electrophysiological properties (stimulus conduction and transmission characteristics, etc.) of nerve cells, gene expression, etc. These include changes in pattern, changes in morphological properties (elongation, retraction, and branching of neurites, formation and retraction of synapses, etc.), and the like.
  • Specific function modifiers include, but are not limited to, AP-1 inhibitors (for example, compounds disclosed in WO2020/196725 discovered by the present inventors), FUS inhibitors, and SOD1 inhibitors. agents, TDP-43 inhibitors (for example, anacardic acid compounds, etc.), KIF1A inhibitors, cytoskeleton modifying agents such as monomethyl auristatin E (MMAE), and the like.
  • AP-1 inhibitors for example, compounds disclosed in WO2020/196725 discovered by the present inventors
  • FUS inhibitors for example, FUS inhibitors
  • SOD1 inhibitors SOD1 inhibitors.
  • agents for example, anacardic acid compounds, etc.
  • KIF1A inhibitors for example, anacardic acid compounds, etc.
  • KIF1A inhibitors for example, anacardic acid compounds, etc.
  • cytoskeleton modifying agents such as monomethyl auristatin E (MMAE), and the like.
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • cytoskeleton modifying agent refers to an agent that suppresses and/or promotes one or more selected from the group consisting of formation, maintenance, decomposition, branching, migration, and localization of the cytoskeleton.
  • the cytoskeleton-altering agent in this specification also includes agents that modify the formation of the cytoskeleton by acting on molecules other than the cytoskeleton.
  • the cytoskeleton includes microtubules, intermediate filaments, and actin filaments.
  • a drug that suppresses the formation and maintenance of the cytoskeleton specifically, for example, a microtubule polymerization inhibitor, etc. can be used.
  • an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody and a labeling substance and/or a physiologically active substance may be directly covalently linked, or they may be linked via a linker or the like. They may also be indirectly connected.
  • the labeling substance and/or physiologically active substance preferably has a moiety that can bind to an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody.
  • a labeling substance and/or a physiologically active substance covalently bound to an antibody capable of binding to an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody can be used.
  • antibody capable of binding to anti-SYT2 N-terminal antibody and “antibody capable of binding to intravesicular domain antibody” are “anti-SYT2 N-terminal antibody” and “antibody capable of binding to intravesicular domain antibody”, except that the antigen is anti-SYT2 N-terminal antibody. According to the definition section of "Intravesicular domain antibody”.
  • the binding of a labeling substance and/or a physiologically active substance to a moiety that can bind to an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody is similar to the binding in the targeting agent or conjugate of the present invention. Therefore, the moiety that can bind to an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody and a labeling substance and/or a physiologically active substance may be linked non-covalently, or directly covalently. or may be indirectly linked via a linker or the like.
  • the targeting agent of the present invention contains a labeling substance and/or a physiologically active substance
  • the labeling substance and/or the physiologically active substance and the intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody are non-covalently linked.
  • a labeling substance and/or a physiologically active substance can be included in the targeting agent of the present invention in the form of a peptide complex.
  • the site where the labeling substance and/or bioactive substance binds to the intravesicular domain antibody such as the anti-SYT2 N-terminal antibody is determined by the binding site of the intravesicular domain antibody to the antigen, such as the binding of the anti-SYT2 N-terminal antibody to the SYT2 N-terminus. There is no particular limitation as long as the binding is not impaired. Specifically, for example, a labeling substance and/or a physiologically active substance can be bound to a site other than the hypervariable region (HVR) or a constant region.
  • HVR hypervariable region
  • a plurality of labeling substances and/or physiologically active substances may be included as long as they do not impair each other's functions.
  • it may contain a plurality of the same substances, or it may contain one or more different substances.
  • linkers that are suitably used in this field can be used as appropriate.
  • the structure and chain length of the linker can be appropriately selected within a range that does not impair the function of the resulting conjugate.
  • the linker may be configured to be cleavable after delivery to the synapse, for example.
  • the linker may also be configured such that it is not cleaved after transport to the synapse, for example.
  • the linker may be any linker commonly used in the art, and is not particularly limited, such as a peptide linker consisting of 5 to 25, preferably 10 to 20 amino acid residues, such as a GS linker. etc. can be suitably used.
  • Cleavable linkers may also be used, such as, for example, acid-labile linkers, photolabile linkers, peptidase-sensitive linkers, dimethyl linkers or disulfide-containing linkers.
  • Intravesicular domain antibodies bind to the intravesicular domain of membrane proteins, which are antigens, that are temporarily exposed on the cell surface due to the fusion of synaptic vesicles and cell membranes, and as a result of endocytosis of synaptic vesicles, the intravesicular domain of the membrane protein is temporarily exposed on the cell surface. Can be delivered into cells together with proteins.
  • the anti-SYT2 N-terminal antibody contained in the targeting agent of the present invention binds to the intravesicular domain of synaptotagmin 2, which is temporarily exposed on the cell surface due to the fusion of synaptic vesicles and the cell membrane, and induces endocytosis of synaptic vesicles.
  • the targeting agent or conjugate is preferably designed such that the label and/or bioactive substance is delivered to the synaptic vesicles of the targeted synapse.
  • the characteristics of compounds that can be delivered to synaptic vesicles are well known in the art. Since the diameter of endosomes in bulk endocytosis is 90 nm to 160 nm, the particle size of the targeting agent or conjugate of the present invention is determined by adjusting the average value (or median value) to, for example, 160 nm or less, 150 nm or less, 140 nm or less.
  • the diameter of synaptic vesicles is 40 nm to 60 nm
  • the average (or median) particle diameter of the conjugate of the present invention is, for example, 60 nm or less, 55 nm or less, 50 nm or less, 45 nm or less, It can be 40 nm or less, 35 nm or less, 30 nm or less, 25 nm or less, 23 nm or less, 20 nm or less, 18 nm or less, 15 nm or less, 14 nm or less, 13 nm or less, or 12 nm or less.
  • the overall particle size when the labeling substance and/or physiologically active substance is bound to the targeting agent can be within the above range.
  • the particle size may be designed to be large, for example, for the purpose of inhibiting endocytosis of synaptic vesicles or for the purpose of delivering a substance to the synaptic surface or synaptic cleft.
  • the particle size before separation may be designed to be large.
  • the conjugates or targeting agents of the invention need not be configured to cross the blood-brain barrier.
  • the conjugates or targeting agents of the invention do not cross the blood-brain barrier and therefore do not act on the central nervous system, but may act only at synapses present in the periphery.
  • the targeting effect on motor neurons via synapses can be achieved, for example, by administering the conjugate or targeting agent of the present invention containing a physiologically active substance to a subject such as a vertebrate (e.g., non-human mammal, human, or other vertebrate).
  • a subject such as a vertebrate (e.g., non-human mammal, human, or other vertebrate).
  • the determination can be made by administering the conjugate or targeting agent of the present invention to the subject's nerve cells and evaluating the physiological effects of the conjugate or targeting agent of the present invention.
  • the physiological effect can be evaluated, for example, by comparing the degree of physiological effect between a group administered with the conjugate or targeting agent of the present invention and a group not administered with the conjugate or targeting agent of the present invention, and/or This can be done by comparing the level of physiological effects between a group administered with a targeting agent and a group administered with a physiologically active substance alone.
  • LRRTM molecules such as the extracellular domain of LRRTM2
  • test substance has a targeting effect on motor neurons including synapses also depends on whether the test substance is localized in the presynaptic area induced by co-culture of neurons and microbeads. It can also be determined by checking.
  • LRRTM leucine-rich repeat transmembrane neuronal protein family protein
  • LRRTM family protein refers to a protein belonging to the LRRTM family.
  • the LRRTM family is a family of synaptic organizer proteins on the postsynaptic side and has the activity of inducing the formation of presynapses. In mammals including humans, four types of LRRTM family proteins have been reported: LRRTM1, LRRTM2, LRRTM3, and LRRTM4.
  • the LRRTM family protein used in microbeads may be any of them.
  • the present invention provides antibodies that can bind to the intravesicular domain of membrane proteins present in synaptic vesicles, such as antibodies that can bind to the intravesicular domain (N-terminal portion) of synaptotagmin 2 (referred to as "anti-SYT2 N-terminal antibody”).
  • the present invention relates to a conjugate of an antibody (referred to as an "intravesicular domain antibody”) and a labeling substance and/or a physiologically active substance.
  • the conjugate of the invention is, for example, taken up into synaptic vesicles of motor neurons and delivered to the motor neurons.
  • the present invention provides a targeting agent that is a visualization agent for motor neurons or their synapses (referred to as "visualization agent of the present invention").
  • the visualization agent of the present invention is a targeting agent containing a labeling substance for use in visualizing motor neurons or their synapses.
  • Visualizing motor neurons refers to making all or part of motor neurons detectable.
  • the portion to be visualized may be a random portion or a predetermined portion.
  • synapses can be visualized as predetermined parts.
  • the visualization agent of the present invention can be used as a synapse visualization agent.
  • “Visualizing a synapse” refers to making a presynaptic region and/or a postsynaptic region detectable. Therefore, in addition to a labeling substance that can be detected directly visually, any detectable labeling substance can be used in the visualization agent of the present invention.
  • the visualization agent of the present invention can visualize axon terminals, axons, axon hillocks, cell bodies, dendrites, etc. of motor neurons.
  • the visualization agent of the present invention can be used in vivo or in vitro. Detection of the signal of the labeling substance can be performed while the motor neurons are alive or after the motor neurons are fixed. Labeling substances suitable for detection of living motor neurons are known in the art. Examples include luminescent substances such as fluorescent substances, chemical or bioluminescent substances, acoustic substances such as photoacoustic probes, radioactive substances such as radioactive isotopes, or contrast agents known in the field of in vivo imaging.
  • the visualization agent of the present invention can be used for any purpose, e.g. to visualize the number, size or position of motor neurons or synapses (including neuromuscular junctions) or synaptic vesicles, or to visualize tissues in surgery or diagnosis. can be used to visualize the number, size or position of motor neurons or synapses (including neuromuscular junctions) or synaptic vesicles, or to visualize tissues in surgery or diagnosis. can be used to
  • the visualization agent of the present invention may be provided in the form of a kit together with other reagents, for example, reagents necessary for detecting the labeling substance contained in the visualization agent of the present invention.
  • the labeling substance is an enzyme or the like
  • its substrate can be provided together with the visualization agent of the present invention.
  • compositions of the invention
  • pharmaceutical compositions of the invention comprising conjugates or targeting agents of the invention.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention contains the targeting agent of the present invention containing a physiologically active substance.
  • the composition or pharmaceutical composition of the present invention may optionally contain additives such as carriers (solid or liquid carriers, etc.), excipients, surfactants, binders, and disintegrants. , lubricant, solubilizing agent, suspending agent, coating agent, coloring agent, preservative, buffering agent, pH adjuster), etc.
  • the additive can be appropriately selected depending on the dosage form of the composition or pharmaceutical composition.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in any dosage form, including, but not limited to, solid preparations, liquid preparations, gel preparations, and aerosol preparations. Note that when the composition or pharmaceutical composition is used as a liquid preparation, it can also be prepared as a dry product intended to be reconstituted with, for example, physiological saline immediately before use.
  • excipients include lactose, crystalline cellulose, starch, and the like.
  • binder include starch paste, gum arabic paste, hydroxypropylcellulose, and the like.
  • disintegrant include starch, celluloses, carbonates, and the like.
  • lubricant include wax and talc.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention contains a synapse formation promoting agent, a synapse maintaining agent, or a muscle strengthening agent as a physiologically active substance, it can improve or prevent a decline in nerve function by promoting synapse formation. . Therefore, the composition or pharmaceutical composition of the present invention can be used to improve or prevent a decline in nerve function, such as a decline in nerve function due to nerve damage, a decline in nerve function due to aging, or a decline in nerve function due to disease. or can be used to improve neurological function.
  • nerve damage refers to damage to a nerve at any location, and includes damage caused physically from outside the body and damage caused by internal factors such as cancer and tumors. include.
  • aging refers to various functional declines, morphological changes, external appearance changes, etc. that occur in individual organisms over time, and the processes thereof.
  • Frailty and sarcopenia are known as conditions that occur due to aging. Frailty refers to a state in which physical and mental vitality (motor function, cognitive function, etc.) declines with age, and while living functions are impaired due to the effects of multiple coexisting chronic diseases, the body and mind become fragile. means. Examples of decreased mental and physical vitality include cognitive dysfunction, dizziness, eating disorders, dysphagia, visual impairment, depression, anemia, hearing loss, delirium, infectious susceptibility, weight loss, and muscle mass loss. Chronic diseases include hypertension, heart disease, cerebrovascular disease, diabetes, respiratory disease, malignant tumor, and the like.
  • sarcopenia refers to a state in which skeletal muscle mass and muscle strength decrease due to aging, disease, or the like. Morphological changes such as synaptic detachment and partial or complete withdrawal of axons from postsynapses are observed in the neuromuscular junctions of aged mice. Changes in skeletal muscle mass are thought to be involved in the decrease in skeletal muscle mass in sarcopenia.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention can be used to improve or prevent the decline in neurological function due to aging, particularly in subjects who have or are at high risk of having frailty or sarcopenia.
  • diseases include, for example, neurological diseases and neuromuscular diseases.
  • nerve disease refers to a disease caused by damage to nerves such as central nerves or peripheral nerves, and for example refers to one or more diseases selected from the group consisting of: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.
  • Lewy body dementia Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, Huntington's disease, dystonia, prion disease, acanthocytic chorea, adrenoleukodystrophy, multiple system atrophy disease, spinocerebellar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, primary lateral sclerosis, spinobulbar muscular atrophy, spinal muscular atrophy, spastic paraplegia, syringomyelia, Charcot-Marie-Tooth disease, Frontotemporal dementia, epilepsy, schizophrenia, autism, autism spectrum disorder, etc.
  • neurodecular disease refers to a disease caused by any disorder in motor nerves, neuromuscular junctions, or muscle cells, such as one or more diseases selected from the group consisting of: Refers to: muscular dystrophy, myopathy, congenital myasthenic syndrome, hereditary periodic quadriplegia, myasthenia gravis, Lambert-Eaton syndrome, etc.
  • Amyotrophic lateral sclerosis is a disease in which primary motor nerves and secondary motor nerves selectively and progressively degenerate and disappear.
  • the initial pathological condition is when motor nerves are removed from skeletal muscles at the neuromuscular junction. known to be detached. Therefore, the composition or pharmaceutical composition of the present invention containing a synapse formation promoting agent or a synapse maintaining agent capable of promoting the formation of synapses or suppressing their regression between skeletal muscle and motor nerves is particularly suitable for muscle atrophy. It can be used to improve or prevent decline in neurological function due to lateral sclerosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be a pharmaceutical composition for treating amyotrophic lateral sclerosis, a pharmaceutical composition for treating spinal muscular atrophy, etc., containing the conjugate or targeting agent of the present invention. .
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention containing a muscle-enhancing agent can improve or prevent a decrease in muscle strength by strengthening muscles. Therefore, the composition or pharmaceutical composition of the present invention containing a muscle-enhancing agent improves or prevents muscle weakness, such as muscle weakness after trauma or surgery, aging, or disease. It can be used for muscle function or to improve muscle function.
  • Trauma refers to damage to tissues or organs caused by external factors, and includes, for example, wounds, fractures, sprains, ruptured internal organs, burns, frostbite, and the like.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention containing a function-modifying agent can improve or prevent the decline or enhancement of nerve cells by modifying the function of motor neurons. Therefore, the composition or pharmaceutical composition of the present invention containing a function modifying agent can be used to improve or prevent overactivity of nerve cells, for example, due to a disease or condition, or to improve muscle tension, for example, due to aging. It can also be used to improve or prevent tremors caused by tremors, muscle tension caused by trauma or disease.
  • abnormal involuntary movements e.g. abnormal head movements, tremors, (painful) convulsions, muscle fasciculations, etc.
  • walking and abnormalities of locomotion e.g., ataxic gait, difficulty walking, etc.
  • other coordination disorders e.g., ataxia, etc.
  • other conditions related to the nervous system and musculoskeletal system e.g., tetany, abnormal reflexes, postural abnormalities
  • spasticity muscle hypertonia, myotonia, hypertonic deep tendon reflexes, dysphagia, etc.
  • disease refers to a pathological condition that can be classified according to identifiable symptoms or causes in a subject individual, and includes diseases and disorders.
  • condition refers to a pathological condition including identifiable symptoms in a target individual that does not correspond to a disease.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention may contain multiple targeting agents of the present invention, and may further contain other active ingredients.
  • Other active ingredients are not particularly limited as long as they do not impair the function of the targeting agent contained in the composition or pharmaceutical composition.
  • the membrane proteins to which each targeting agent can bind may be the same or different.
  • the same membrane protein can contain targeting agents including antibodies that can bind to different sites.
  • the labeling substances and/or physiologically active substances contained in these targeting agents may be different or the same.
  • the present invention relates to a method for targeting motor neurons or synapses.
  • antibodies capable of binding to the intravesicular domain of membrane proteins present in synaptic vesicles (anti-SYT2 N-terminal antibody), etc., which bind to the intravesicular domain of synaptotagmin 2 (anti-SYT2 N-terminal antibody), etc.
  • antibody By bringing the antibody (referred to as "antibody") into contact with the motor neuron, the antibody is incorporated into the motor neuron (particularly within the synaptic vesicle of the motor neuron), and the antibody is introduced into the motor neuron (e.g., the axon terminal of the motor neuron).
  • intravesicular domain antibodies including antibodies that bind to the intravesicular domain of synaptotagmin 2, are targeted to motor neurons or synapses.
  • a desired substance e.g., a labeling substance and/or a physiologically active substance
  • the conjugate is brought into contact with motor neurons. or by contacting the antibody and the desired substance capable of binding to the antibody separately with the motor neuron, the desired substance is introduced into the motor neuron (e.g., within the synaptic vesicle of the motor neuron). can be delivered to. Therefore, according to the present invention, a method for targeting motor neurons or synapses is provided, which method comprises contacting a cell such as a motor neuron with an antibody (optionally linked to a desired substance). include.
  • the present invention is a method for targeting a labeling substance and/or a physiologically active substance, which includes the steps of bringing the conjugate or targeting agent of the present invention into contact with a motor neuron, and delivering the targeting agent to a motor neuron synapse.
  • a method comprising:
  • the object of contact in the present invention is not particularly limited as long as it includes motor neurons. Contact may be performed, for example, with a single motor neuron as the target, or with a tissue containing cells other than motor neurons.
  • the targeting agent of the present invention primarily targets the anterior part of the motor neuron synapse at the neuromuscular junction, it may also target tissues that further include skeletal muscle cells to which motor neurons project.
  • the motor neurons in this method may include motor neurons of vertebrates (non-human mammals, humans, and other vertebrates).
  • the motor neurons in this method preferably include human motor neurons.
  • the present invention will be described below using human motor neurons as an example, but the method is not limited to human motor neurons.
  • Human motor neurons can be used without any restrictions regardless of their origin. Examples include, but are not limited to, primary culture of cells isolated from humans, cells isolated from humans and established as cell lines, and human motor neuron cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells. can.
  • the pluripotent stem cells from which human motor neurons are derived are preferably human-derived pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells used in the present invention refer to cells that have self-renewal ability, can be cultured in vitro, and have multipotency that can differentiate into cells constituting an individual. Specifically, examples include embryonic stem cells (ES cells), pluripotent stem cells (GS cells) derived from fetal primordial germ cells, and induced pluripotent stem cells (iPS cells) derived from somatic cells. Human-derived iPS cells or ES cells are preferably used in this method.
  • ES cells are often obtained from fertilized eggs, but they can also be obtained from sources other than fertilized eggs, such as adipose tissue, placenta, and testicular cells, and any ES cells are subject to the present invention.
  • sources other than fertilized eggs such as adipose tissue, placenta, and testicular cells, and any ES cells are subject to the present invention.
  • Methods for producing ES cells from sources other than fertilized eggs have been reported (eg, WO2003/046141), and these reports can be used with appropriate reference.
  • iPS cells are artificial stem cells derived from somatic cells that can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of nucleic acids or proteins, and are almost equivalent to ES cells. properties such as pluripotency and the ability to proliferate based on self-renewal. Examples of genes included in reprogramming factors include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-MYC, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas.
  • the iPS cells that can be used in this method are preferably human-derived iPS cells, for example, human fibroblast-derived iPS cells.
  • the method is an in vitro method. In another embodiment, the method is an ex vivo method. In another embodiment, the method is an in vivo method. If the method is an in vivo method, the subject may be a mammal other than a human.
  • the method may further include the step of inducing synapse formation.
  • inducing synapse formation refers to causing the formation of a presynapse in the axon of a neuron, and/or in the dendrite of another neuron or in a cell such as a skeletal muscle or organ. Refers to causing the formation of postsynapses. Synapse formation can also be induced by co-culturing cells that are going to form a presynapse and cells that are going to be a postsynapse.
  • synapse formation can be induced by other methods, such as co-culturing motor neurons and beads coated with the extracellular domain of LRRTM2.
  • the step of inducing synapse formation may be performed simultaneously with or before the step of contacting the motor neuron with the targeting agent of the present invention.
  • the step of contacting the targeting agent of the present invention with motor neurons is performed by contacting the targeting agent of the present invention with a sample containing motor neurons.
  • the method of contact is not particularly limited as long as the motor neurons in the sample and the targeting agent can contact each other.
  • the targeting agent can be applied by sprinkling, spraying, dropping, painting directly onto the sample, by dipping the sample in the targeting agent, or a combination thereof.
  • the targeting agent may be applied by scattering, spraying, dropping, or coating the carrier.
  • the amount to be applied is not particularly limited, and can be set appropriately taking into consideration the number of motor neurons and other conditions.
  • the concentration of IgG antibody is 0.01 ⁇ g/mL or more, 0.1 ⁇ g/mL or more, 0.2 ⁇ g/mL or more, 0.5 ⁇ g/mL or more, 0.7 ⁇ g/mL or more, 0.9 ⁇ g/mL or more, 1 ⁇ g/mL or more, 2 ⁇ g /mL or more, 5 ⁇ g/mL or more, 7 ⁇ g/mL or more, 9 ⁇ g/mL or more, or 10 ⁇ g/mL or more can be applied.
  • the step of bringing the targeting agent of the present invention into contact with the test sample is performed by administering the targeting agent of the present invention to the subject.
  • the administration method is not particularly limited, but for example, local administration, enteral administration, and parenteral administration, specifically, administration on the skin, inhalation administration, enema administration, eye drops, ear drops, nasal administration, and intravaginal administration. , tube feeding, intravenous administration, transarterial administration, intramuscular administration, intracardiac administration, subcutaneous administration, intraosseous administration, intradermal administration, intrathecal (intrathecal) administration, intraperitoneal administration, intravesical administration, transdermal administration , transmucosal administration, epidural administration, intravitreal administration, etc.
  • the dosage is not particularly limited, and can be set appropriately taking into consideration the target animal species and other conditions.
  • a dose of 0.1 mg/kg or more, 0.5 mg/kg or more, 1 mg/kg or more, 2 mg/kg or more, 4 mg/kg or more, or 5 mg/kg or more per 1 kg of body weight. can do.
  • targeting agent it is not necessary that only one type of targeting agent is used in this step.
  • multiple types of targeting agents can be used together or separately.
  • a targeting agent that includes a conjugate and a targeting agent that does not include a labeling substance and/or a physiologically active substance can be used.
  • a labeling substance and a physiologically active substance may be used in combination.
  • the step of bringing the targeting agent of the present invention into contact with motor neurons can be performed multiple times. If this step is performed multiple times, the targeting agent and cell type used each time, as well as the method of application and administration, may be the same or different each time.
  • the targeting agent of the present invention When the conjugate or targeting agent of the present invention is brought into contact with motor neurons, the targeting agent of the present invention is taken up into the motor neurons via synaptic vesicles. When the targeting agent of the present invention is brought into contact with motor nerve cells, the motor nerve cells can be activated or their activity can be promoted. By activating motor neurons or promoting their activity, the efficiency of uptake of the conjugate or targeting agent of the present invention into motor neurons can be improved. Typically, once a conjugate or targeting agent of the invention is taken up into a synaptic vesicle, it is delivered directly to the cell body through the axon by retrograde transport.
  • the method of activating motor neurons is not particularly limited, but examples include methods of activating motor neurons spontaneously for a sufficient period of time, methods of activating motor neurons by artificial stimulation, or endocytosis of synaptic vesicles. Examples include methods of promoting tosis.
  • Methods for spontaneously activating motor neurons include, for example, placing motor neurons in an environment where they can be activated for a sufficient period of time.
  • the environments in which motor neurons can operate are well known in the art.
  • the time for activating motor neurons is not particularly limited, but for example, when the present method is an in vitro method. , 1 hour or more, 3 hours or more, 6 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, or 24 hours or more.
  • this method is an in vivo method, for example, 1 hour or more, 3 hours or more, 6 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, 24 hours or more, 36 hours or more, 48 hours or more, 60 hours or more , 72 hours or more, 100 hours or more, 120 hours or more, 150 hours or more, 168 hours or more, 200 hours or more, or 240 hours or more.
  • Methods for activating motor neurons or promoting their activity by artificial stimulation include, for example, placing motor neurons in an environment where motor neurons can be actively active for a sufficient period of time.
  • the method for activating or promoting the activity of motor neurons can include applying chemical stimulation and/or physical stimulation to motor neurons.
  • Stimulation for activating motor neurons is well known in the art.
  • Compounds used for chemical stimulation include, for example, potassium ion channel inhibitors such as amiodarone, tetraethylammonium, 4-aminopyridine, barium, and dendrotoxin, sodium channel agonists such as batrachotoxin, and calcium channels such as Bay K8644. Examples include agonists, high concentrations of potassium ions or neurotransmitters, or combinations thereof.
  • Examples of physical stimuli include temperature changes and the like.
  • the amount of the compound added is not particularly limited. For example, it can be added at a concentration of 1 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, or 100 ⁇ M or more.
  • the stimulation time is not particularly limited, and can be set as appropriate in consideration of conditions such as the type and intensity of stimulation. For example, applying stimulation for 2 minutes or more, 3 minutes or more, 4 minutes or more, 5 minutes or more, 8 minutes or more, 9 minutes or more, 10 minutes or more, 20 minutes or more, 25 minutes or more, 30 minutes or more, or 1 hour or more. be able to.
  • the method of activating motor neurons or promoting their activity is a method of making a subject actively active (for example, a method of making a subject exercise or a method of activating brain activity). etc.) or by a method of promoting the activity of motor neurons using chemical substances or the like.
  • Compounds that promote motor nerve activity include compounds used for the chemical stimulation described above, and can be administered to the subject.
  • the compounds used for chemical stimulation may be administered at pharmaceutically acceptable concentrations or methods.
  • the above-mentioned compound can be administered to a subject so that the compound stimulation does not exhibit biotoxicity, but if biotoxicity occurs, it is not necessary to administer the above-mentioned compound to the subject.
  • the same level of effect is usually expected in a shorter period of time compared to a method that causes spontaneous firing.
  • the labeling substance and/or physiologically active substance and the targeting agent can be brought into contact with motor neurons together or separately.
  • the timing is not particularly limited as long as the labeling substance and/or the physiologically active substance can bind to the targeting agent.
  • the contact with the labeling substance and/or the physiologically active substance can be performed before the contact with the targeting agent or after the contact with the targeting agent.
  • Each contact method can be selected according to the above-mentioned contact methods. For example, the same method or different methods can be used for each contact.
  • This method may further include the step of confirming the success or failure of targeting, if necessary.
  • the targeting agent used in this method contains a physiologically active substance
  • targeting can be determined to be successful if a physiological effect is observed, for example, as described above in the section on targeting agents. I can do it.
  • the targeting agent used in this method contains a labeling substance
  • targeting is considered successful if a signal is detected according to the step of detecting the signal of the labeling substance in the visualization method described below. can be judged.
  • the method can be used as a method for preventing or treating a condition or disease.
  • the present invention provides a step of contacting the motor neuron with a targeting agent containing an antibody and a physiologically active substance capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein present in the synaptic vesicle of the motor neuron, and the target
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a condition or disease, the method comprising the step of delivering a stimulant to the motor neuron synapse.
  • various conditions or diseases exemplified with respect to the pharmaceutical composition can be prevented or treated.
  • the contacting step of the method preferably includes administering the targeting agent and/or pharmaceutical composition to the subject.
  • the method of the present invention can be used to improve or prevent a decline in nerve function, such as a decline in nerve function due to nerve damage, a decline in nerve function due to aging, or a decline in nerve function due to disease, or This is a method for improving functionality.
  • the condition or disease is one exhibiting decreased neurological function.
  • the condition or disease is a neurological and neuromuscular disease.
  • the targeting agent comprises a conjugate of the antibody and the biologically active substance.
  • the method may further include a step of fully exerting the physiological effect in the subject.
  • the physiologically active substance used is a substance that can exert its effect alone
  • the subject should be exposed to a well-nourished environment for a sufficient period of time to exert its physiological effect. You can make it more effective by placing it there.
  • another substance is required for the physiologically active substance used to exert its effect, that substance can be additionally administered.
  • the time for this step can be determined as appropriate depending on the condition of the subject, the type of physiologically active substance, the dose, etc. For example, judgments can generally be made based on the period of time it takes for a physiological effect to be exerted when a physiologically active substance is administered, and the physiological effect can be confirmed once or multiple times to ensure that the physiological effect is fully exerted. You may continue until the
  • the present invention is a method for visualizing motor neurons or synapses, which includes a step of bringing a visualization agent of the present invention into contact with a motor neuron, a step of delivering the visualization agent to the motor neuron synapse, and a step of transmitting a signal of the labeling substance.
  • the present invention relates to a method including the step of detecting.
  • the motor neurons used for contact are as described in the above method for targeting a labeling substance and/or a physiologically active substance.
  • the method is an in vitro method. In another embodiment, the method is an ex vivo method. In another embodiment, the method is an in vivo method. If the method is an in vivo method, the subject may be a human or a non-human mammal.
  • the step of bringing the visualization agent of the present invention into contact with the motor neuron and the step of delivering the visualization agent to the motor neuron synapse include using the above-mentioned labeling substance and/or the visualization agent as a targeting agent.
  • This method may further include the step of generating a signal from the labeling substance, if necessary.
  • the method of generating the signal is not particularly limited. The method for generating a signal and whether it is necessary can be determined depending on the type of labeling substance used, etc.
  • the visualization agent should be delivered to the target motor neuron synapse for a sufficient period of time, that is, the visualization agent can reach the target motor neuron synapse and By waiting for sufficient time for endocytosis of synaptic vesicles to occur at the motor neuron synapse, a signal can be generated at the target. This time can be appropriately selected according to the time of the step of delivering the visualization agent to the motor neuron synapse.
  • the labeled substance is a chemiluminescent substance
  • the substance used to generate the signal such as its substrate. This can be done by
  • This step can be performed simultaneously with or before the step of detecting a signal described below.
  • the method further includes the step of detecting the signal of the detection substance.
  • the method used for detection is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on conditions such as the type of labeling substance used.
  • the labeling substance is a fluorescent substance
  • excitation light containing light at the excitation wavelength of the labeling substance can be irradiated onto motor neurons, and the fluorescence wavelength of the labeling substance can be detected using a detector capable of detecting the excitation light.
  • the labeling substance is a chemiluminescent substance
  • it can be detected using, for example, a detector capable of detecting the emission wavelength of the labeling substance.
  • the labeled substance is a radioactive labeled substance, it can be detected using a detector capable of detecting radiation emitted by the labeled substance.
  • Detection of the signal of the labeling substance includes detecting the presence, position, or amount of motor neurons (eg, synapses, cell bodies, etc.) in a sample containing motor neurons.
  • motor neurons eg, synapses, cell bodies, etc.
  • the method of the present invention compares the signal of the labeling substance detected in the sample with the signal in a standard sample containing the labeling substance or with a reference value prepared in advance. It may further include determining the presence, location, or amount.
  • the standard sample is not particularly limited as long as it is a biological sample that serves as a standard for determining whether or not a specific condition or disease exists. Specifically, for example, samples obtained from healthy individuals, samples obtained from the same individual at different collection times, or samples obtained from individuals known to have a specific condition or disease. Can be mentioned.
  • the standard sample may be, for example, a biological sample derived from the same biological species, individual, tissue, or cell as the sample, or a biological sample derived from another biological species, individual, tissue, or cell.
  • the reference value is not particularly limited as long as it is a value that serves as a reference for determining whether or not the target state is reached.
  • the reference value can be set based on, for example, the intensity or number of signals generally detected in a standard sample.
  • the method of comparison is not particularly limited. For example, this can be done visually, by numerical values, or by statistical methods.
  • the present invention provides a method of administering a substance to a subject.
  • the substance is in the form of a conjugate of an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody and the substance. This allows the substance to be delivered to cells of interest, such as motor neurons.
  • the substance is a physiologically active substance
  • the physiologically active substance can be delivered to cells such as motor neurons.
  • the substance is a labeling substance, it can be used to observe the delivery site of the labeling substance (for example, a motor neuron or its synapse).
  • the present invention also provides a conjugate of the antibody and the substance, or a composition comprising the conjugate, for use in this method.
  • the present invention provides a motor neuron comprising an antibody capable of binding to the intravesicular domain of a membrane protein present in synaptic vesicles of motor neurons, or a conjugate of the above antibody and a labeling substance and/or a physiologically active substance.
  • the present invention relates to a composition for targeting nerve cells or their synapses.
  • the present invention provides a method for visualizing motor neurons in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of a conjugate of an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody and a labeling substance. provide.
  • the present invention also provides a conjugate of the antibody and the labeling substance, or a composition containing the conjugate, for use in this method.
  • the present invention is a method for delivering a physiologically active substance to motor neurons of a target, in which an effective amount of a conjugate of an intravesicular domain antibody such as an anti-SYT2 N-terminal antibody and the physiologically active substance is administered to the target.
  • a method including:
  • the present invention also provides a conjugate of the antibody and the physiologically active substance, or a composition containing the conjugate, for use in this method.
  • the present invention provides a conjugate of the intravesicular domain antibody or the intravesicular domain antibody and the labeling substance and/or physiologically active substance for use in any of the above methods.
  • the invention relates to an intravesicular domain antibody as described above or a conjugate of an intravesicular domain antibody as described above and a physiologically active substance as described above for use in a method of preventing or treating a condition or disease.
  • the present invention provides the intravesicular domain antibody or the intravesicular domain antibody and the label for use in a method for targeting a labeling substance and/or a physiologically active substance to a motor neuron or its synapse.
  • the present invention relates to a conjugate with a substance and/or a physiologically active substance.
  • the present invention provides the above antibody or a conjugate of the above antibody and the above substance for use in the manufacture of a medicament for use in any of the above methods.
  • the present invention also provides the use of the intravesicular domain antibody or a conjugate of the intravesicular domain antibody and a physiologically active substance in the production of a medicament containing the antibody and the physiologically active substance.
  • Example 1 Delivery of synaptotagmin 2 antibody to human motor neuron synapse> Using microbeads coated with the extracellular domain of LRRTM2, we investigated whether synaptotagmin 2 antibodies could be delivered to human motor neuron synapses and the conditions under which they could be delivered.
  • the sorted neurospheres were seeded onto the plate. and cultured for 20 days.
  • the above-mentioned motor neuron culture medium was used as the medium, and the medium was replaced with the same medium on the second day of culture. Thereafter, the medium was replaced three times a week using a neuron medium (Neurobasal plus medium (B27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific), supplemented with 20 ng/mL BDNF, 20 ng/mL GDNF, and penicillin/streptomycin). All medium exchanges were performed at 50 ⁇ L/well.
  • streptavidin-coated microspheres streptavidin Coated Microspheres; made of polystyrene, average diameter 9.94 ⁇ m
  • washing buffer phosphate-buffered saline (PBS), 0.01% bovine serum albumin (BSA)
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • Triton Biotinylated anti-human IgG (Fc-specific) antibody was immobilized on avidin-coated microbeads. The obtained beads were washed three times with a washing buffer (anti-human IgGFc antibody beads).
  • anti-human IgGFc antibody beads were suspended in a binding buffer, and a fusion protein of the extracellular domain of human LRRTM2 and the Fc portion of human IgG (LRRTM2-Fc; R&D systems) was added thereto. It was immobilized on anti-human IgGFc antibody beads.
  • the obtained beads were washed with a washing buffer and suspended in a binding buffer (LRRTM2 bead suspension).
  • Presynaptic induction ( Figure 1) LRRTM2 beads were seeded at 0.1 ⁇ g/well on plates cultured for 20 days, and cultured at 37° C. for 48 hours to induce the formation of presynapses.
  • the antibody used was rabbit anti-SYT2 N-terminal antibody (Polyclonal rabbit purified antibody SYT2 lumenal domain; catalog number 105 223; Synaptic Systems), which can bind to the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or as a control.
  • normal rabbit IgG antibody Normal Rabbit IgG; catalog number AB-105-C; R&D Systems was used.
  • antibodies were added to the medium to a final concentration of 1 ⁇ g/mL or 10 ⁇ g/mL and mixed. This crude antibody solution was centrifuged at 200 g for 3 minutes at room temperature, and the supernatant was collected as an antibody solution.
  • Immunocytochemical staining was performed using the added antibody as the primary antibody. After the fixed cells were permeabilized and blocked with a detergent, a primary antibody reaction was performed using a mouse anti- ⁇ III tubulin (Tuj1) antibody (catalog number 801202; Biolegend) as an additional primary antibody. Ta. Thereafter, a secondary antibody reaction was performed with respect to each primary antibody, and a fluorescent image was obtained. Blocking was performed using blocking buffer (PBS + 2% normal goat serum + 1% BSA + 1% fetal bovine serum + 0.02% TritonX-100).
  • the secondary antibodies used were: Alexa 488-labeled anti-rabbit antibody (catalog number A32731; Thermo Fisher Scientific); Alexa 555-conjugated anti-mouse antibody (Cat. No. A32727; Thermo Fisher Scientific).
  • Fluorescence images were acquired using an inverted live cell (DMi8) microscope fluorescence microscope (Leica) equipped with LAS X software (Leica) using the following excitation wavelength, detection wavelength, exposure time, and detection threshold. A gamma correction value of 1 was used in all cases.
  • Excitation wavelength and detection wavelength Alexa 488 maximum excitation 490nm; maximum detection 525nm; actual detection 512nm; Alexa 555 maximum excitation 555nm; maximum detection 580nm; actual detection 595nm.
  • Exposure time and detection threshold Alexa 488 Exposure time 200ms; Detection threshold 150 ⁇ 1500; Alexa 555 exposure time 50ms; detection threshold 100-3500.
  • Figures 2-1 and 3 show immunocytochemical staining images at antibody concentrations of 1 ⁇ g/mL and 10 ⁇ g/mL, respectively.
  • Figure 2-2 shows an enlarged view of LRRTM2 beads in an experiment in which anti-SYT2 N-terminal antibody was administered at a concentration of 1 ⁇ g/mL.
  • LRRTM2 beads Figure 2-2A
  • nerve axon terminals points with strong Tuj1 signals in the figure
  • Figure 2-2B nerve axon terminals are observed on the surface of the LRRTM2 beads.
  • Example 2 Delivery of synaptotagmin 2 antibody to human motor neuron synapse by cell stimulation> We investigated whether synaptotagmin 2 antibody was delivered to human motor neuron synapses upon neuronal stimulation.
  • An antibody solution containing 4-aminopyridine was used to stimulate nerve cells.
  • the antibody solution was prepared using the following method.
  • the antibody and 4-aminopyridine were introduced by replacing the medium with 100 ⁇ L of antibody solution on the plate on which synapses had been formed.
  • motor neurons were stimulated by culturing at room temperature for 10 or 30 minutes.
  • motor neurons were stimulated by culturing at 37°C for 30 minutes after introducing the antibody and 4-aminopyridine.
  • motor neurons were stimulated by culturing at 4°C for 30 minutes after introducing the antibody and 4-aminopyridine.
  • the cells after introducing the antibody and 4-aminopyridine, the cells were cultured at 4°C for 30 minutes, and then the temperature was raised to 37°C and cultured for 30 minutes to stimulate the motor neurons.
  • Figures 4 and 5 show immunocytochemical staining images when the reaction time was 10 minutes and 30 minutes, respectively.
  • Example 3 Delivery of synaptotagmin 2 antibody to mouse motor neuron synapse by intravenous injection> We investigated whether synaptotagmin 2 antibody introduced into the body by intravenous injection was delivered to motor neuron synapses.
  • the same antibodies as in Example 1 were used for the introduction.
  • the antibody solution used was one in which the antibody was added to PBS and mixed to a final concentration of 1 mg/mL.
  • the antibody solution was administered to wild-type mice at a dose of 5 mg/kg by tail vein injection. Mice were sacrificed 12, 24, or 72 hours after administration, and gastrocnemius muscle was harvested and fixed.
  • the fixed gastrocnemius muscle was frozen with a tissue embedding agent, and 10 ⁇ m thick sections were prepared from this frozen tissue block using a cryostad.
  • Immunohistochemical staining was performed using the administered antibody as the primary antibody. After blocking the prepared tissue sections, ⁇ -bungarotoxin antibody ( ⁇ -BgtX antibody Alexa Fluor 594 conjugate; catalog number B13423; Thermo Fisher Scientific) and synapsin 1 antibody (SYN1 antibody) were added as additional primary antibodies. Primary antibody reaction was performed using Synaptic Systems (Cat. No. 106 308). Thereafter, a secondary antibody reaction was performed with respect to each primary antibody, and a fluorescent image was obtained. Blocking was performed using blocking buffer (PBS + 2% normal goat serum + 1% BSA + 1% fetal bovine serum + 0.02% TritonX-100).
  • Alexa 488-labeled anti-rabbit antibody catalog number A32731; Thermo Fisher Scientific
  • Alexa 647-conjugated anti-Guinea pig antibody Cat. No. A21450; Thermo Fisher Scientific.
  • Exposure time and detection threshold Alexa 488 Exposure time 150ms; Detection threshold 130-1500; Alexa 594 Exposure time 100ms; Detection threshold 100-2500; Alexa 647 exposure time 100ms; detection threshold 130-1000.
  • Figures 6 and 7 show immunohistochemical staining images 12 hours and 72 hours after administration, respectively.
  • ⁇ -BgtX is a marker for acetylcholine receptors on the muscle cell membrane
  • SYN1 is a presynaptic marker.
  • Synaptotagmin 2 is known to be expressed in the presynaptic region of motor neurons. This demonstrated that anti-SYT2 N-terminal antibody administered intravenously was delivered to motor neuron presynapses in vivo. Furthermore, since sufficient time had elapsed for endocytosis of synaptic vesicles, it is thought that the administered anti-SYT2 N-terminal antibody was incorporated into motor neuron synaptic vesicles.
  • the anti-SYT2 N-terminal antibody used is a complete IgG antibody, so it does not cross the blood-brain barrier. Furthermore, it is known that synaptotagmin 2 is not expressed in sensory neurons. In addition, no signal was observed in the liver, indicating that antibodies against the intravesicular domain of synaptotagmin 2 are delivered to motor neuron presynapses by intravenous injection, and administration of the antibodies causes significant side effects. The amount of antibody was found to be dependent on the time of exposure to the antibody.
  • Example 3 The experiment was conducted in the same manner as in Example 3, except that administration was performed by intraperitoneal injection at a dose of 10 mg/kg.
  • Figures 8 and 9 show immunohistochemical staining images 12 hours and 72 hours after administration, respectively.
  • ⁇ -BgtX is a marker for acetylcholine receptors on the muscle cell membrane
  • SYN1 is a presynaptic marker.
  • Example 5 Delivery of synaptotagmin 2 antibody to mouse motor neuron synaptic vesicles by intravenous injection>
  • synaptotagmin 2 antibody introduced into the body by intravenous injection was delivered to synaptic vesicles of motor neurons.
  • the same antibodies as in Example 1 were used for the introduction.
  • the antibody solution used was one in which the antibody was added to PBS and mixed to a final concentration of 1 mg/mL.
  • the antibody solution was administered to wild-type mice at a dose of 5 mg/kg by tail vein injection. Mice were sacrificed 72 hours after administration, and gastrocnemius muscles were harvested and fixed.
  • the fixed gastrocnemius muscle was frozen with a tissue embedding agent, and 10 ⁇ m thick sections were prepared from this frozen tissue block. After blocking the sections, they were reacted with nanogold-labeled anti-rabbit antibody (catalog number A-24922; Thermo Fisher Scientific).
  • 10 and 11 show transmission electron microscopic images of the axon terminals of motor neurons (area surrounded by a solid white line in the figure) and gastrocnemius muscle cells (area surrounded by a black dashed line in the figure).
  • the black dots in the figure indicate the signal (signal amplified by silver) indicating the position of nanogold of the antibody.
  • the intracellular membrane structures seen at this magnification are mainly mitochondria (arrowheads) and junctional folds of gastrocnemius muscle cells, and from this image alone, it is clear that antibodies are not taken up into synaptic vesicles. I didn't know if it was there.
  • the same antibodies as in Example 1 were used for the introduction.
  • the antibody solution used was one in which the antibody was added to PBS and mixed to a final concentration of 1 mg/mL.
  • the antibody solution was administered to wild-type mice at a dose of 5 mg/kg by tail vein injection.
  • mice were sacrificed 72 hours after administration, and spinal cords were harvested and fixed.
  • the fixed spinal cord was frozen with a tissue embedding agent, and 10 ⁇ m thick sections were prepared from this frozen tissue block using a cryostad.
  • Immunohistochemical staining was performed using the administered antibody as the primary antibody. After blocking the prepared tissue sections, a primary antibody reaction was performed using an anti-choline acetyltransferase antibody ( ⁇ -ChAT antibody; catalog number #NBP1-30052; Novus BioLogicals) as an additional primary antibody. Thereafter, a secondary antibody reaction was performed with respect to each primary antibody, and a fluorescent image was obtained. Blocking was performed using blocking buffer (PBS + 2% normal donkey serum + 1% BSA + 1% fetal bovine serum + 0.02% TritonX-100).
  • Example 3 The same secondary antibody as in Example 3 was used, and fluorescence images were acquired in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 12 shows immunohistochemical staining images observed using an objective lens with a magnification of 10 times (FIG. 12) or 40 times (FIGS. 13 and 14).
  • ⁇ -ChAT is a marker for choline acetyltransferase in motor neurons.
  • intravenously administered anti-SYT2 N-terminal antibody is taken up by synaptic vesicles at the synapse at the neuromuscular junction, and then transported retrogradely through the axon and delivered to the cell body. It was done.
  • Example 7 Time course observation of synaptotagmin 2 antibody delivered by intravenous injection> The signals of the synaptotagmin 2 antibody, which was introduced into the body by intravenous injection and delivered into motor neurons, were observed over time.
  • the same antibodies as in Example 1 were used for the introduction.
  • the antibody solution used was one in which the antibody was added to PBS and mixed to a final concentration of 1 mg/mL.
  • the spinal cord was collected from wild-type mice by tail vein injection at a dose of 5 mg/kg.
  • Example 7 The same procedure as in Example 7 was performed except that the spinal cord was collected 6 hours, 24 hours, 72 hours, 120 hours, 168 hours, and 240 hours after administration.
  • FIG. 15 shows an immunohistochemical staining image taken 6 to 72 hours after administration
  • FIG. 16 shows an immunohistochemical staining image taken 120 to 240 hours after administration.
  • the anti-SYT2 N-terminal antibody is delivered to the cell body by 6 hours after its administration and continues to accumulate over time.
  • Example 8 Verification of pharmacological effects of drug delivery using synaptotagmin 2 antibody>
  • MMAE Monomethyl auristatin E
  • HY-15575 MedChemExpress
  • MedChemExpress a microtubule polymerization inhibitor
  • the anti-SYT2 N-terminal antibody and the control normal rabbit antibody used in Example 1 were used.
  • a conjugate of MMAE and antibody was produced using MagicLink TM kit (broadpharm). Preparation of the conjugate was performed according to the manufacturer's protocol.
  • conjugate solution After warming the neuron medium at 37°C for 30 minutes, 4-aminopyridine (Sigma Aldrich) was added to the medium to a final concentration of 100 ⁇ M and mixed. Furthermore, the conjugate was added to a final concentration of 1 ⁇ g/mL and mixed. This crude conjugate solution was centrifuged at 200 g for 3 minutes at room temperature, and the supernatant was collected as a conjugate solution.
  • 4-aminopyridine Sigma Aldrich
  • MMAE alone was introduced instead of the conjugate in some samples (number of samples: 13).
  • the MMAE solution was prepared as described above using the same concentration of MMAE instead of the conjugate.
  • the medium was replaced with 100 ⁇ L of conjugate solution or MMAE solution, and the conjugate was introduced by culturing at 37° C. for 30 minutes.
  • Axonal Elongation Response After introduction, the solution was collected and washed, and the medium was replaced with neuron medium containing no conjugate and MMAE. Thereafter, axons were elongated by culturing for an additional 24 hours.
  • Example 6 Cell fixation, staining, and observation Cells were fixed in the same manner as in Example 1, and subjected to a primary antibody reaction using a mouse anti- ⁇ III tubulin (Tuj1) antibody and a secondary antibody reaction using an Alexa 555-labeled anti-mouse antibody in the same manner as in Example 1. The following antibody reactions were performed. In this example, anti-SYT2 N-terminal antibody staining was not performed. Acquisition of fluorescence images was performed as in Example 1. The number of samples was as follows: MMAE alone introduction group, 13 samples; control antibody group, 17 samples; SYT2 antibody group, 27 samples.
  • the relative axon volume was calculated as a value normalized to 100% of the results obtained when a conjugate of a normal rabbit antibody and MMAE was used as a control.
  • Luminance was acquired using LAS X software (Leica).
  • FIG. 17 shows the results of Figures 17 to 19.
  • Figures 17 and 18 show the axons of the control antibody group using a conjugate of control normal rabbit antibody and MMAE ( Figure 17) and the SYT2 antibody group using a conjugate of anti-SYT2 N-terminal antibody ( Figure 18). This is an immunocytochemical staining image showing the situation.
  • FIG. 19 is a graph quantitatively showing the results.
  • MMAE inhibits the polymerization of microtubules, which are the cytoskeleton important for axon elongation and maintenance. Therefore, it is expected that the stronger the effect of MMAE, the more inhibited the elongation and maintenance of axons, and the more the amount of axons will decrease.
  • Example 9 Confirmation of the relationship between pharmacological effects and neural activity>
  • the pharmacological effect of using the anti-SYT2 N-terminal antibody observed in Example 9 was dependent on synaptic vesicle uptake by neural activity. confirmed.
  • the experiment was conducted using only the conjugate of anti-SYT2 N-terminal antibody and MMAE.
  • An experimental group in which synapse formation was inhibited (synaptic non-formation group) and an experimental group in which endocytosis was inhibited (endocytosis inhibition group) were used as groups in which synaptic vesicle uptake into neurons was inhibited.
  • the experiment was conducted in the same manner as in Example 9, except that the following treatments were performed on motor neurons in the synapse non-formation group and the endocytosis inhibition group.
  • FIG. 20 to 23 show a normal firing group (Figure 20) conducted under the same conditions as Example 9, a synaptic non-formation group (Figure 21) in which presynaptic induction was not performed, and a group in which endocytosis was inhibited by low temperature treatment.
  • FIG. 22 is an immunocytochemical staining image showing the appearance of axons in the endocytosis inhibition group (FIG. 22).
  • FIG. 23 is a graph quantitatively showing the results.
  • Example 10 Verification of pharmacological effects when targeting other membrane proteins> Similar to the anti-SYT2 N-terminal antibody, we investigated whether antibodies against other membrane proteins present in synaptic vesicles could also be used for drug delivery.
  • Anti-SYT2 N-terminal antibody Polyclonal rabbit antibody purified SYT2 lumenal domain (Cat. No. 105 223; Synaptic Systems); Number of samples: 27; Anti-SYP antibody: Anti-Synaptophysin Antibody Major synaptic vesicle protein p38, SYP (Cat. No.
  • the relative axon volume was calculated as a value standardized by setting the result when a conjugate of a normal rabbit antibody and MMAE as a control was used as 100%.
  • FIG. 24 shows the relative amount of axons when conjugates using each antibody were introduced.
  • drugs and the like can be delivered to motor neurons by using antibodies against membrane proteins present in synaptic vesicles, regardless of the type of target membrane protein. Furthermore, it has been suggested that it is possible to impart effects based on the drug or the like on target cells.

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Abstract

運動神経細胞への物質の標的化手段を提供する。　シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含む、運動神経細胞シナプスへの標的化剤を提供する。

Description

標的化剤
　本発明は、運動神経細胞への標的化剤、運動神経細胞可視化剤及びそれを含む組成物、並びにそれらを用いた標的化方法、運動神経細胞可視化方法及び状態又は疾患の予防又は治療方法等に関する。
　神経は、中枢神経及び末梢神経から構成され、種々の情動、筋肉及び内臓諸臓器の機能等を調節する。このような神経機能は、神経の損傷、疾患、及び老化等によって低下する場合があり、かかる場合、心身の健康が害され、社会生活を営む上で甚大な影響を受けることとなり得る。したがって、神経機能を維持及び改善することは、クオリティ・オブ・ライフ（QOL）の維持及び改善に直結するため、極めて重大な課題といえる。
　中枢神経及び末梢神経は、それぞれ神経細胞から構成され、これらの細胞はシナプスを介して相互にシグナルを交換する。シナプスは、神経細胞の軸索終末（シナプス前部）と、別の神経細胞の樹状突起又は骨格筋や臓器等の細胞（シナプス後部）との間に形成される間隙を含む接合部であり、シナプス前部から放出される化学物質がシナプス後部に存在する受容体に結合することでシグナルを伝達する。シナプス形成は、シナプス前部及び後部に発現する特異的な膜タンパク質の相互作用が引き金となって起こる。
　近年、シナプス形成を促進することにより神経機能を維持及び改善することが可能な化合物やペプチドが開発されている。特許文献１には、特定のペプチドが、皮質ニューロン初代培養細胞（PCN）において樹状突起伸長促進作用及びシナプス形成促進作用を有すること、そのようなペプチドを軽度認知障害又は初期認知症の治療に用いることが記載されている。そして、特許文献２には、アミロイド前駆体タンパク（APP）がβセクレターゼによって切断されることにより生成するC末端フラグメントβ（CTFβ）が、シナプス形成を促進すること、CTFβを神経変性疾患の治療等に用いることが記載されている。
　さらに、特許文献３には、LRRTM分子又はその分子を含む融合タンパク質をその表面に固定化させたマイクロビーズを用いた、シナプス前部を有する運動神経細胞の培養方法が記載されている。このように、薬剤の運動神経細胞の機能への影響をin vitroにおいて簡便にスクリーニング可能な技術が開発されていることにより、今後、運動神経細胞に作用可能な化合物や薬剤候補が数多く提供されることが予想される。
特開２０１２－０９２０４８号公報 特開２００８－１４３８６７号公報 ＷＯ２０２１／００６０７５
　上記のような化合物や薬剤を、運動神経細胞に作用させるためには、標的の運動神経細胞への薬剤の制御された輸送がなされる必要がある。さらに、その薬剤が作用し得る標的の位置を把握できることが重要となり得る。しかし、これまで、運動神経細胞等の神経細胞への物質の送達及び送達部位の可視化については検討されていなかった。
　したがって、本発明は、運動神経細胞への物質の標的化手段及び標的化部位の可視化手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、シナプス小胞の膜上に特定のタンパク質が発現していることに着目して、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、シナプトタグミン2の小胞内ドメイン（N末端部分）に結合する抗体を用いることにより運動神経細胞に所望の物質を標的化可能であることを見出した。さらに、その他のシナプス小胞の膜タンパク質に結合する抗体を用いた場合にも同様の効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含む、運動神経細胞への標的化剤。
［２］標識物質及び／又は生理活性物質をさらに含む、［１］に記載の標的化剤。
［３］前記抗体と、前記標識物質及び／又は前記生理活性物質とのコンジュゲートを含む、［２］に記載の標的化剤。
［４］前記膜タンパク質が、ヒト由来のタンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の標的化剤。
［５］前記膜タンパク質が、シナプトタグミン2、シナプス小胞糖タンパク質2A、シナプトジャイリン1、シナプトフィジン及びシナプトタグミン1からなる群から選択されるいずれか一のタンパク質を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の標的化剤。
［６］前記小胞内ドメインが、4個以上のアミノ酸を含むドメインである、［１］～［５］のいずれかに記載の標的化剤。
［７］前記小胞内ドメインが、配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列；配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列；又は配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、［５］又は［６］に記載の標的化剤。
［８］前記標識物質が蛍光分子である、［２］～［７］のいずれかに記載の標的化剤。
［９］運動神経細胞可視化剤である、前記標識物質を含む［２］～［８］のいずれかに記載の標的化剤。
［１０］前記生理活性物質が、シナプス形成促進剤、シナプス維持剤、筋肉増強剤及び神経細胞機能改変剤からなる群から選択される一以上である、［２］～［９］のいずれかに記載の標的化剤。
［１１］エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる、［１］～［１０］のいずれかに記載の標的化剤。
［１２］［２］～［１１］のいずれかに記載の標的化剤を含む医薬組成物。
［１３］［２］～［１１］のいずれかに記載の標的化剤及び／又は［１２］に記載の医薬組成物を運動神経細胞に接触させる工程、及び前記標的化剤及び／又は前記医薬組成物を前記運動神経細胞のシナプスに送達する工程を含む、運動神経細胞への前記標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法。
［１４］［９］に記載の運動神経細胞可視化剤を運動神経細胞に接触させる工程、前記運動神経細胞可視化剤を前記運動神経細胞のシナプスに送達する工程、及び前記標識物質のシグナルを検出する工程を含む、運動神経細胞可視化方法。
［１５］［２］～［１１］のいずれかに記載の標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程、及び前記標的化剤を前記運動神経細胞のシナプスに送達する工程を含む、状態又は疾患の予防又は治療方法。
［１６］前記状態又は疾患が神経機能の低下を呈する状態若しくは疾患である、［１５］に記載の予防又は治療方法。
［１７］前記状態又は疾患が神経疾患及び神経筋疾患である、［１５］又は［１８］に記載の予防又は治療方法。
［１８］前記標的化剤が、前記抗体と前記生理活性物質とのコンジュゲートを含む、［１５］～［１７］のいずれかに記載の予防又は治療方法。
［１９］運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体の、前記抗体及び生理活性物質を含む医薬の製造における使用。
［２０］運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含む、運動神経細胞への標的化用組成物。
［２１］状態又は疾患の予防又は治療方法において使用するための、運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体。
［２２］運動神経細胞への標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法において使用するための、運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-071453号の開示内容を包含する。
　本発明の標的化剤及び標的化方法によれば、所望の物質を抗体を用いて運動神経細胞へと標的化することができる。抗体を用いることにより、所望の物質を運動神経細胞（例えば、その細胞内のシナプス小胞）に送達することができる。物質が生理活性物質又は治療剤である場合、運動神経細胞の異常による症状及び／又は疾患を処置することができる。また、物質が標識物質である場合、運動神経細胞を可視化することができる。
図１は、LRRTM2ビーズを用いたシナプス前部の誘導及び抗体の送達の実験手順を模式的に示す図である。ニューロスフィアをプレートに播種すると、ニューロスフィアから神経軸索が伸長する。続いて、そこにLRRTM2ビーズを播種することにより、伸長した神経軸索からLRRTM2ビーズ表面にシナプス前部が誘導される。このようにシナプス前部が誘導されたプレートに、正常ウサギIgG抗体（対照）又は抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）を導入し、化学物質による刺激によって、又は自発的に神経細胞を活動させることにより、抗SYT2 N末端抗体がシナプス前部に標的化されるか否かを調べた。 図２－１は、1μg/mLの抗体濃度で自発的活動による抗体の送達実験を行った場合の蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、100μmを示す。 図２－２は、1μg/mLの抗体濃度で自発的活動による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の送達実験を行った場合の蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ神経軸索が密集していないLRRTM2ビーズ（Ａ）及び神経軸索が密集しているLRRTM2ビーズ（Ｂ）における、抗SYT2 N末端抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、破線円はLRRTM2ビーズの位置を示す。TUJ1はβIIIチューブリンのシグナルを示す染色画像を指し、スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、10μmを示す。 図３は、10μg/mLの抗体濃度で自発的活動による抗体の送達実験を行った場合の蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、100μmを示す。 図４は10分間の4-アミノピリジンでの神経細胞の刺激による抗体の送達実験を行った場合の蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、100μmを示す。 図５は、30分間の4-アミノピリジンでの神経細胞の刺激による抗体の送達実験を行った場合の蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、100μmを示す。 図６は、尾静脈注射による抗体の投与12時間後の神経筋接合部における蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、α-BgtXはα-ブンガロトキシンのシグナルを示す染色画像を指し、SYN1はシナプシン1のシグナルを示す染色画像を指す。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された神経筋接合部の位置を示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、50μmを示す。 図７は、尾静脈注射による抗体の投与72時間後の神経筋接合部における蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、α-BgtXはα-ブンガロトキシンのシグナルを示す染色画像を指し、SYN1はシナプシン1のシグナルを示す染色画像を指す。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された神経筋接合部の位置を示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、50μmを示す。 図８は、腹腔内注射による抗体の投与12時間後の神経筋接合部における蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、α-BgtXはα-ブンガロトキシンのシグナルを示す染色画像を指し、SYN1はシナプシン1のシグナルを示す染色画像を指す。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された神経筋接合部の位置を示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、50μmを示す。 図９は、腹腔内注射による抗体の投与72時間後の神経筋接合部における蛍光画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す蛍光画像である。図中、α-BgtXはα-ブンガロトキシンのシグナルを示す染色画像を指し、SYN1はシナプシン1のシグナルを示す染色画像を指す。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された神経筋接合部の位置を示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、50μmを示す。 図１０は、尾静脈注射による抗体の投与72時間後の神経筋接合部における電子顕微鏡画像を示す図である。Ａ及びＢは、それぞれ抗体として正常ウサギIgG抗体（Ａ）及び抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）（Ｂ）を使用した場合の、投与した抗体の局在を示す電子顕微鏡画像である。図中、白色線で囲まれた領域は運動神経細胞の神経軸索末端を示し、黒色破線で囲まれた領域は骨格筋細胞を示す。黒色点は抗体の位置を示し、矢尻はミトコンドリアの位置を示す。スケールバーはＡ及びＢに共通のものであり、2μmを示す。 図１１は、尾静脈注射による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の投与72時間後の神経筋接合部における電子顕微鏡画像を示す図である。Ａは図１０Ｂと同じ視野の電子顕微鏡画像であり、Ｂは、Ａの黒色実線で囲まれた領域を拡大した電子顕微鏡画像である。図中、黒色点は抗体の位置を示す。図Ａ中、白色線で囲まれた領域は運動神経細胞の神経軸索末端を示し、黒色破線で囲まれた領域は骨格筋である腓腹筋細胞を示し、スケールバーは2μmを示す。図Ｂ中、ａ～ｃはそれぞれ、抗体を含まないシナプス小胞（ａ）、抗体を含むシナプス小胞（ｂ）及びミトコンドリア（ｃ）を示す。図Ｂ中、スケールバーは500nmを示す。 図１２は、尾静脈注射による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の投与72時間後の脊髄における蛍光画像を示す図である。図中、ChATはコリンアセチルトランスフェラーゼのシグナルを示す染色画像を指す。破線は脊髄前角と白質の境界を示し、脊髄前角は破線の左側に位置する。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された運動神経細胞の細胞体の位置を例示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、100μmを示す。 図１３は、尾静脈注射による正常ウサギIgG抗体の投与72時間後の脊髄における、脊髄前角を拡大した蛍光画像を示す図である。図中、ChATはコリンアセチルトランスフェラーゼのシグナルを示す染色画像を指す。スケールバーは各画像に共通のものであり、100μmを示す。 図１４は、尾静脈注射による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の投与72時間後の脊髄において脊髄前角を拡大した蛍光画像を示す図である。図中、ChATはコリンアセチルトランスフェラーゼのシグナルを示す染色画像を指す。矢尻は抗SYT2 N末端抗体が送達された運動神経細胞の細胞体の位置を例示し、スケールバーは各画像に共通のものであり、100μmを示す。 図１５は、尾静脈注射による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の投与の6時間～72時間後の脊髄前角における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルは抗SYT2 N末端抗体に基づくシグナルである。図中、スケールバーは各画像に共通のものであり、100μmを示す。 図１６は、尾静脈注射による抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）の投与の120時間～240時間後の脊髄前角における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルは抗SYT2 N末端抗体に基づくシグナルである。図中、スケールバーは各画像に共通のものであり、100μmを示す。 図１７は、正常ウサギ抗体とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入した対照抗体群における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルはβIIIチューブリン（Tuj1）に基づくシグナルである。図Ａ中、黒破線円はニューロスフィアの位置を示す。図Ｂ及びＣは図Ａ中の白色枠の領域の拡大画像を示す図である。図Ａ中、スケールバーは1mmを示し、図Ｂ及びＣ中、スケールバーは100μmを示す。 図１８は、抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入したSYT2抗体群における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルはβIIIチューブリン（Tuj1）に基づくシグナルである。図Ｂ及びＣは図Ａ中の白色枠の領域の拡大画像を示す図である。図中、スケールバーは1mmを示し、図Ｂ及びＣ中、スケールバーは100μmを示す。 図１９は、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）に基づく薬理効果を定量したグラフを示す図である。図中、相対軸索量は、対照の正常ウサギ抗体とMMAEのコンジュゲートを使用した場合の結果（図中、「Cont. IgG-MMAE」）を100%として標準化した値である。図中、破線は相対軸索量が100%の位置を示し、「MMAE」はMMAEを単独で導入した単独導入群、「α-SYT2 IgG-MMAE」は抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入したSYT2抗体群の結果を示す。図中、エラーバーは標準誤差を示し、「＊」はp<0.05を示し、「＊＊＊」はp<0.001を示す。 図２０は、抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入し、図１８と同じ条件で神経細胞を培養した正常発火群における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルはβIIIチューブリン（Tuj1）に基づくシグナルである。図中、スケールバーは1mmを示す。 図２１は、抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入し、シナプス前部の形成が誘導されない条件で神経細胞を培養したシナプス不形成群における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルはβIIIチューブリン（Tuj1）に基づくシグナルである。図中、スケールバーは1mmを示す。 図２２は、抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とモノメチルアウリスタチンE（MMAE）のコンジュゲートを導入し、エンドサイトーシスが阻害される低温条件で神経細胞を培養したエンドサイトーシス阻害群における蛍光画像を示す図である。図中で示される蛍光シグナルはβIIIチューブリン（Tuj1）に基づくシグナルである。図中、スケールバーは1mmを示す。 図２３は、抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）によって送達されたモノメチルアウリスタチンE（MMAE）に基づく薬理効果を定量したグラフを示す図である。図中、相対軸索量は、シナプス前部の形成が誘導されない条件で神経細胞を培養したシナプス不形成群を100%として標準化した値である。図中、破線は相対軸索量が100%の位置を示し、「α-SYT2 IgG-MMAE」は抗SYT2 N末端抗体とMMAEのコンジュゲートの導入の有無を示し、「synapse」はシナプス形成の誘導の有無を示し、「endocytosis」はエンドサイトーシスの有無を示す。図中、エラーバーは標準誤差を示し、「＊＊」はp<0.01を示す。 図２４は、各種抗体によって送達されたモノメチルアウリスタチンE（MMAE）に基づく薬理効果を定量したグラフを示す図である。対照の正常ウサギ抗体とMMAEのコンジュゲートを使用した場合の結果（図中、「Cont.」）を100%として標準化した値である。図中、破線は相対軸索量が100%の位置を示し、「α-SYT2」は抗シナプトタグミン2 小胞内ドメイン（N末端）抗体（抗SYT2 N末端抗体）とMMAEのコンジュゲートを示し、「α-SYP」は抗シナプトフィジン小胞内ドメイン抗体とMMAEのコンジュゲートを示し、「α-SYNGR1」は抗シナプトジャイリン1 小胞内ドメイン抗体とMMAEのコンジュゲートを示し、「α-SYT1」は抗シナプトタグミン1 小胞内ドメイン抗体とMMAEのコンジュゲートを示し、「α-SV2A」は抗シナプス小胞タンパク質2 小胞内ドメイン抗体とMMAEのコンジュゲートを示す。図中、エラーバーは標準誤差を示し、「＊」はp<0.05を示し、「＊＊」はp<0.01を示し、「＊＊＊」はp<0.001を示し、「＊＊＊＊」はp<0.0001を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜標的化剤＞
　本発明は、運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体（「小胞内ドメイン抗体」と称する）を含む、運動神経細胞への標的化剤（「本発明の標的化剤」と称する）に関する。
　「膜タンパク質」とは、生体膜上に存在するタンパク質をいう。本発明における「膜タンパク質」は、特にシナプス小胞の膜上に存在するタンパク質を指す。本発明における膜タンパク質としては、膜貫通タンパク質、膜表在性タンパク質及び脂質修飾タンパク質のいずれも含む。膜表在性タンパク質及び脂質修飾タンパク質はいずれも膜貫通ドメインを有さないタンパク質である。
　本発明の標的化剤における膜タンパク質の種類は、小胞内ドメインを含むタンパク質であれば特に限定しないが、好ましくは膜貫通タンパク質である。
　本明細書においてタンパク質の「小胞内ドメイン」とは、膜タンパク質中の、シナプス小胞の内腔に露出するタンパク質領域を指す。本発明の標的化剤における膜タンパク質の小胞内ドメインの長さは特に限定しない。例えば、1アミノ酸以上、2アミノ酸以上、3アミノ酸以上、4アミノ酸以上、5アミノ酸以上、6アミノ酸以上、7アミノ酸以上、8アミノ酸以上、9アミノ酸以上、10アミノ酸以上、11アミノ酸以上の連続した小胞内ドメインを有する膜タンパク質を用いることができる。例えば、4アミノ酸以上の連続した小胞内ドメインを有する膜貫通型タンパク質を好適に用いることができる。
　本明細書において「シナプス小胞の内腔」とは、シナプス小胞において細胞質とは反対側に存在する空間を指す。
　シナプス小胞の内腔は、シナプス小胞が細胞膜と融合した際には細胞外の空間と連通する。そのため、本発明の標的化剤における膜タンパク質中の小胞内ドメインは、シナプス小胞が細胞膜と融合した際には細胞外に露出する。
　まず、膜タンパク質としてシナプトタグミン2を用いた場合を例に説明する。
　本発明は、シナプトタグミン2の小胞内ドメイン（N末端部分）に結合可能な抗体（「抗SYT2 N末端抗体」と称する）を含む、運動神経細胞への標的化剤に関する。
　本明細書において、「シナプトタグミン2」とは、シナプトタグミンファミリーに属する膜タンパク質の1つを指す。シナプトタグミンファミリーには、哺乳動物では17種類のタンパク質が属するが、そのうち、シナプトタグミン2は、末梢神経において、神経筋接合部のシナプス前部のシナプス小胞膜上に主に発現しており、カルシウムイオン依存的にシナプス小胞と細胞膜との融合を促進するタンパク質である（例えば、Rickman, Colin, et al., Journal of Biological Chemistry 279.13 (2004): 12574-12579.、 Stephanie Bauche, et al., Neurol Genet. 2020 Dec 3;6(6):e534. doi: 10.1212を参照）。シナプトタグミン2は一回膜貫通型タンパク質であり、小胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをN末端から順に含む。C末端側の細胞質ドメインはカルシウムイオン結合能を有するタンデムC2ドメインを有し、この細胞質ドメインが膜の融合に関する機能を主に担っていることが知られている。
　シナプトタグミン2の小胞内ドメインは、シナプス小胞の内腔に露出している。細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇に伴ってシナプス小胞と細胞膜とが融合すると、シナプス小胞の内腔が細胞外空間とつながる結果、シナプトタグミン2の小胞内ドメインが細胞外に一時的に露出する。その後、シナプトタグミン2を含む細胞膜部分はシナプス小胞膜としてエンドサイトーシスにより細胞内に回収され、シナプス小胞として再利用される。この際にシナプトタグミン2の小胞内ドメインは、再びシナプス小胞内腔に露出する。
　具体的には、例示的なヒトシナプトタグミン2は、アミノ酸配列が配列番号１で表される419アミノ酸からなるタンパク質である。各ドメインの位置は、例えば、配列番号１においては、小胞内ドメインは1位～62位のアミノ酸配列で示される領域、膜貫通ドメインは63位～83位のアミノ酸配列で示される領域、及び細胞質ドメインは84位～419位のアミノ酸配列で示される領域である。
　例示的なマウスシナプトタグミン2は、アミノ酸配列が配列番号２で表される422アミノ酸からなるタンパク質である。各ドメインの位置は、配列番号２においては、小胞内ドメインは1位～60位のアミノ酸配列で示される領域、膜貫通ドメインは61位～87位のアミノ酸配列で示される領域、及び細胞質ドメインは88位～422位のアミノ酸配列で示される領域である。
　他の生物のシナプトタグミン2の配列情報は、NCBIデータベース等の公知のデータベースより容易に取得することができる。
　本明細書において、「シナプトタグミン2の小胞内ドメイン」とは、シナプトタグミン2のN末端部分に存在する小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号１における1位～62位のアミノ酸配列（配列番号３）で示される領域、配列番号２における1位～60位のアミノ酸配列（配列番号４）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号３及び４における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。より具体的には、例えば、配列番号３及び４の1位～11位のアミノ酸配列（いずれも配列番号５と同一）で示される領域及び配列番号５のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加された変異型アミノ酸配列を有するシナプトタグミン2のN末端部分が含まれる。ここで「複数個」とは、2以上の個数、例えば、2～6個、2～5個、2～4個、又は2～3個を指し、好ましくは2個を指す。
　本発明の標的化剤には、上に例示したシナプトタグミン2以外の任意の膜タンパク質に結合可能な抗体を用いることができる。
　本発明の標的化剤における具体的な膜タンパク質としては、シナプトタグミン2の他に、例えば、シナプトタグミンファミリー、主要ファシリテータースーパーファミリー、シナプス小胞糖タンパク質2ファミリー、シナプトジャイリンファミリー、シナプトフィジン/シナプトブレビンファミリー、シナプトブレビンファミリー、小胞アミントランスポーターファミリー、溶質キャリアファミリー5、小胞グルタミン酸トランスポーターファミリー、アミノ酸/ポリアミントランスポーターファミリー、分泌型キャリア関連膜タンパク質ファミリー、グルタミン酸トランスポーターサブファミリー、オートファジー関連タンパク質9ファミリー、糖トランスポーターファミリー、液胞型ATPアーゼサブユニットS1ファミリーからなる群から選択されるいずれか一のファミリーに属するタンパク質が挙げられる。
　より具体的には、本発明の標的化剤における膜タンパク質は、シナプトタグミン2の他に、例えば、シナプス小胞糖タンパク質2A、シナプトジャイリン1、シナプトフィジン、シナプトタグミン1、シナプトジャイリン3、小胞アセチルコリントランスポーター、高親和性コリントランスポーター、小胞グルタミン酸トランスポーター1、小胞グルタミン酸トランスポーター3、小胞GABAトランスポーター、シナプス小胞糖タンパク質2B、シナプス小胞糖タンパク質2C、小胞関連膜タンパク質1、シナプトジャイリン4、シナプトタグミン4、シナプトタグミン7、分泌型キャリア関連膜タンパク質5、シナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質（SVOP）、興奮性アミノ酸トランスポーター3、オートファジー関連タンパク質9A、グルコーストランスポーター4及びATPアーゼ H+輸送アクセサリータンパク質1等が挙げられる。好ましくは、本発明の標的化剤における膜タンパク質は、シナプトタグミン2、シナプス小胞糖タンパク質2A、シナプトジャイリン1、シナプトフィジン及びシナプトタグミン1からなる群から選択されるいずれか一のタンパク質を含む。この場合、本発明は、シナプトタグミン2、シナプス小胞糖タンパク質2A、シナプトジャイリン1、シナプトフィジン及びシナプトタグミン1からなる群から選択されるいずれか一のタンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含む標的化剤を提供する。
　「シナプス小胞糖タンパク質2A（Synaptic vesicle glycoprotein 2A：SV2A）」とは、主要ファシリテータースーパーファミリー（major facilitator superfamily）のシナプス小胞糖タンパク質2ファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、神経細胞や内分泌細胞における、調節性分泌の制御に関与し、休止期のニューロンにおける低頻度の神経伝達を促進すると考えられている。シナプス小胞糖タンパク質2Aは、KIAA0736、SV2、SLC22B1等の別名でも知られる。例示的なシナプス小胞糖タンパク質2Aは、アミノ酸配列が配列番号６で表される742アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプス小胞糖タンパク質2Aの小胞内ドメイン」とは、シナプス小胞糖タンパク質2Aの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号６における第191位～第205位のアミノ酸配列（配列：PSAEKDMCLSDSNKG；配列番号７）で示される領域、第255位～第262位のアミノ酸配列（配列：YGTFLFCR；配列番号８）で示される領域、第316位～第334位のアミノ酸配列（配列：PHYGWSFQMGSAYQFHSWR；配列番号９）で示される領域、第469位～第598位のアミノ酸配列（配列：PDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAYMVY；配列番号１０）で示される領域、第648位～第651位のアミノ酸配列（配列：ESAM；配列番号１１）で示される領域、第709位～第712位のアミノ酸配列（配列：GITK；配列番号１２）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号７～１２における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。より具体的には、例えば、配列番号６の第451位～第550位のアミノ酸配列（配列番号１３：MGVWFTMSFSYYGLTVWFPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCT）で示される領域及び配列番号１３のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加された変異型アミノ酸配列を有するシナプス小胞糖タンパク質2Aのタンパク質領域が含まれる。
　「シナプトジャイリン1（Synaptogyrin 1：SYNGR1）」とは、シナプトジャイリンファミリーに属する4回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、神経細胞のシナプス前小胞に存在し、制御性エキソサイトーシス、シナプス小胞の形成やその成熟、及びシナプス可塑性に関与していると考えられている。例示的なシナプトジャイリン1は、アミノ酸配列が配列番号１４で表される233アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトジャイリン1の小胞内ドメイン」とは、シナプトジャイリン1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号１４における第45位～第71位のアミノ酸配列（配列：NEGYLNSASEGEEFCIYNRNPNACSYG；配列番号１５）で示される領域、第125位～第148位のアミノ酸配列（配列：YLANQWQVSKPKDNPLNEGTDAAR；配列番号１６）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号１５及び１６における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。より具体的には、例えば、配列番号１４の第130位～第146位のアミノ酸配列（配列番号１７：WQVSKPKDNPLNEGTDA）で示される領域及び配列番号１４のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加された変異型アミノ酸配列を有するシナプトジャイリン1のタンパク質領域が含まれる。
　「シナプトフィジン（Synaptophysin：SYP）」とは、シナプトフィジン/シナプトブレビンファミリーに属する4回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、小胞膜成分の組織化、小胞の細胞膜へのターゲティング、シナプス可塑性の制御等に関与していると考えられている。シナプトフィジンは、MRX96、腫瘍シナプス小胞タンパク質P38、MRXSYP、XLID96等の別名でも知られる。例示的なシナプトフィジンは、アミノ酸配列が配列番号１８で表される313アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトフィジンの小胞内ドメイン」とは、シナプトフィジンの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号１８における第50位～第106位のアミノ酸配列（配列：ELQLSVDCANKTESDLSIEVEFEYPFRLHQVYFDAPTCRGGTTKVFLVGDYSSSAEF；配列番号１９）で示される領域、第162位～第199位のアミノ酸配列（配列：KGLSDVKMATDPENIIKEMPVCRQTGNTCKELRDPVTS；配列番号２０）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号１９及び２０における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。より具体的には、例えば、配列番号１８の第178位～第190位のアミノ酸配列（配列番号２１：CRQTGNTCKELRD）で示される領域及び配列番号２１のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加された変異型アミノ酸配列を有するシナプトフィジンのタンパク質領域が含まれる。
　「シナプトタグミン1（Synaptotagmin 1：SYT1）」とは、シナプトタグミンファミリーに属する1回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、カルシウムイオン依存的にシナプス小胞と細胞膜との融合を促進するタンパク質の一つであると考えられている。シナプトタグミン1は、P65、SVP65、SYT、BAGOS等の別名でも知られる。例示的なシナプトタグミン1は、アミノ酸配列が配列番号２２で表される422アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトタグミン1の小胞内ドメイン」とは、シナプトタグミン1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号２２における第1位～第57位のアミノ酸配列（配列：MVSESHHEALAAPPVTTVATVLPSNATEPASPGEGKEDAFSKLKEKFMNELHKIPLP；配列番号２３）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号２３における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。より具体的には、例えば、配列番号２２の第1位～第8位のアミノ酸配列（配列番号２４：MVSASRPE）で示される領域及び配列番号２４のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加された変異型アミノ酸配列を有するシナプトタグミン1のN末端部分が含まれる。
　「シナプトジャイリン3（Synaptogyrin 3：SYNGR3）」とは、シナプトジャイリンファミリーに属する4回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、制御性エキソサイトーシス、ドーパミンのリサイクリング等に関与すると考えられている。例示的なシナプトジャイリン3は、アミノ酸配列が配列番号２５で表される229アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトジャイリン3の小胞内ドメイン」とは、シナプトジャイリン3の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号２５における第51位～第69位のアミノ酸配列（配列：TDSGPELRCVFNGNAGACR；配列番号２６）で示される領域、第126位～第147位のアミノ酸配列（配列：LTNQWQRTAPGPATTQAGDAAR；配列番号２７）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号２６及び２７における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「小胞アセチルコリントランスポーター（Vesicular Acetylcholine Transporter：VAChT）」とは、小胞アミントランスポーターファミリーに属する12回膜貫通型膜タンパク質の1つを指す。このタンパク質はアセチルコリンを分泌小胞に輸送し、細胞外に放出する膜貫通タンパク質である。小胞アセチルコリントランスポーターはVACHT、SLC18A3、CMS21等の別名でも知られる。具体的には、例示的な小胞アセチルコリントランスポーターは、アミノ酸配列が配列番号２９で表される532アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「小胞アセチルコリントランスポーターの小胞内ドメイン」とは、小胞アセチルコリントランスポーターの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号２９における第55位～第125位のアミノ酸配列（配列：PIVPDYIAHMRGGGEGPTRTPEVWEPTLPLPTPANASAYTANTSASPTAAWPAGSALRPRYPTESEDVKIG；配列番号３０）で示される領域、第174位～第182位のアミノ酸配列（配列：DYATLFAAR；配列番号３１）で示される領域、第235位～第242位のアミノ酸配列（配列：LYEFAGKR；配列番号３２）で示される領域、第311位～第325位のアミノ酸配列（配列：TIATWMKHTMAASEW；配列番号３３）で示される領域、第378位～第388位のアミノ酸配列（配列：RSFAPLVVSLC；配列番号３４）で示される領域、第444位～第447位のアミノ酸配列（配列：LGPI；配列番号３５）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号３０～３５における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「高親和性コリントランスポーター1（High Affinity Choline Transporter 1：CHT1）」とは、溶質キャリアファミリー5（Solute carrier family 5）に属する13回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、アセチルコリン合成のためのコリンを細胞外から高い親和性で取り込むためのナトリウムイオン及び塩化物イオン依存性の膜貫通型トランスポーターである。高親和性コリントランスポーターは、SLC5A7、HCHT、CHT等の別名でも知られる。例示的な高親和性コリントランスポーターは、アミノ酸配列が配列番号３６で表される580アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「高親和性コリントランスポーター1の小胞内ドメイン」とは、高親和性コリントランスポーター1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号３６における第1位～第6位のアミノ酸配列（配列：MAFHVE；配列番号３７）で示される領域、第 70位～第81位のアミノ酸配列（配列：GTAEAVYVPGYG；配列番号３８）で示される領域、第147位～第164位のアミノ酸配列（配列：GEMFWAAAIFSALGATISVIIDVDMHIS；配列番号３９）で示される領域、第213位～第237位のアミノ酸配列（配列：ADIGFTAVHAKYQKPWLGTVDSSEV；配列番号４０）で示される領域、第296位～第317位のアミノ酸配列（配列：ASTDWNQTAYGLPDPKTTEEAD；配列番号４１）で示される領域、第398位～第406位のアミノ酸配列（配列：LTKTVYGLW；配列番号４２）で示される領域、第457位～第481位のアミノ酸配列（配列：QPLIFYPGYYPDDNGIYNQKFPFKT；配列番号４３）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号３７～４３における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「小胞グルタミン酸トランスポーター1（Vesicular Glutamate Transporter 1：VGLUT1）」とは、小胞グルタミン酸トランスポーターファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、ナトリウム、リン酸イオンの他、L-グルタミン酸、塩化物イオン等の複数種類のイオンを輸送する多機能性共輸送トランスポーターと考えられている。小胞グルタミン酸トランスポーター1は、SLC17A7、BNPI等の別名でも知られる。例示的な小胞グルタミン酸トランスポーター1は、アミノ酸配列が配列番号４４で表される560アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「小胞グルタミン酸トランスポーター1の小胞内ドメイン」とは、小胞グルタミン酸トランスポーター1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号４４における第85位～第116位のアミノ酸配列（配列：VAIVSMVNNSTTHRGGHVVVQKAQFSWDPETV；配列番号４５）で示される領域、第162位～第169位のアミノ酸配列（配列：PSAARVHY；配列番号４６）で示される領域、第230位～第236位のアミノ酸配列（配列：QYSGWSS；配列番号４７）で示される領域、第324位～第341位のアミノ酸配列（配列：SQPAYFEEVFGFEISKVG；配列番号４８）で示される領域、第400位～第401位のアミノ酸配列（配列：SK）で示される領域、第457位～第469位のアミノ酸配列（配列：GAMTKHKTREEWQ；配列番号４９）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号４５～４９における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「小胞グルタミン酸トランスポーター3（Vesicular Glutamate Transporter 3：VGLUT3）」とは、小胞グルタミン酸トランスポーターファミリーに属する10回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、ナトリウム、リン酸イオンの他、L-グルタミン酸、塩化物イオン等の複数種類のイオンを輸送する多機能性ユニポーターと考えられている。小胞グルタミン酸トランスポーター3は、SLC17A8、DFNA25等の別名でも知られる。例示的な小胞グルタミン酸トランスポーター3は、アミノ酸配列が配列番号５０で表される589アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「小胞グルタミン酸トランスポーター3の小胞内ドメイン」とは、小胞グルタミン酸トランスポーター3の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号５０における第98位～第130位のアミノ酸配列（配列：VAIVEMVNNSTVYVDGKPEIQTAQFNWDPETVG；配列番号５１）で示される領域、第175位～第182位のアミノ酸配列（配列：PSAARVHY；配列番号５２）で示される領域、第243位～第249位のアミノ酸配列（配列：QYIGWSS；配列番号５３）で示される領域、第336位～第353位のアミノ酸配列（配列：SQPAYFEEVFGFAISKVG；配列番号５４）で示される領域、第412位～第413位のアミノ酸配列（配列：TK）で示される領域、第469位～第481位のアミノ酸配列（配列：GAMTRHKTREEWQ；配列番号５５）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号５１～５５における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「小胞GABAトランスポーター（Vesicular GABA Transporter：VGAT）」とは、アミノ酸/ポリアミントランスポーターファミリーに属する10回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、神経末端からの分泌のために、細胞質中の4-アミノブタン酸又はグリシンを小胞内のプロトンと交換して小胞内に輸送するアンチポーターである。小胞GABAトランスポーターは、VIAAT、SLC32A1、BA122O1.1等の別名でも知られる。例示的な小胞GABAトランスポーターは、アミノ酸配列が配列番号５６で表される525アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「小胞GABAトランスポーターの小胞内ドメイン」とは、小胞GABAトランスポーターの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号５６における第154位～第204位のアミノ酸配列（配列：FAAVVCCYTGKILIACLYEENEDGEVVRVRDSYVAIANACCAPRFPTLGGR；配列番号５７）で示される領域、第287位～第305位のアミノ酸配列（配列：SRARDWAWEKVKFYIDVKK；配列番号５８）で示される領域、第363位～第383位のアミノ酸配列（配列：ADETKEVITDNLPGSIRAVVN；配列番号５９）で示される領域、第460位～第461位のアミノ酸配列（配列：TG）で示される領域、第511位～第525位のアミノ酸配列（配列：SLEGLIEAYRTNAED；配列番号６０）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号５７～６０における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「シナプス小胞糖タンパク質2B（Synaptic vesicle glycoprotein 2B：SV2B）」とは、主要ファシリテータースーパーファミリー（major facilitator superfamily）のシナプス小胞糖タンパク質2ファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、神経細胞や内分泌細胞における、調節性分泌の制御に関与し、神経細胞におけるボツリヌス神経毒Eに対するタンパク質受容体として機能することが示唆されている。シナプス小胞糖タンパク質2Bは、KIAA0735、HsT19680、SLC22B2等の別名でも知られる。例示的なシナプス小胞糖タンパク質2Bは、アミノ酸配列が配列番号６１で表される683アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプス小胞糖タンパク質2Bの小胞内ドメイン」とは、シナプス小胞糖タンパク質2Bの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号６１における第130位～第148位のアミノ酸配列（配列：SFALPSAEKDMCLSSSKKG；配列番号６２）で示される領域、第204位～第205位のアミノ酸配列（配列：CR）で示される領域、第259位～第277位のアミノ酸配列（配列：PHYGWGFSMGTNYHFHSWR；配列番号６３）で示される領域、第412位～第535位のアミノ酸配列（配列：PDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDND；配列番号６４）で示される領域、第587位～第592位のアミノ酸配列（配列：NSESAM；配列番号６５）で示される領域、第650位～第653位のアミノ酸配列（配列：GITK；配列番号６６）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号６２～６６における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「シナプス小胞糖タンパク質2C（Synaptic vesicle glycoprotein 2C：SV2C）」とは、主要ファシリテータースーパーファミリー（major facilitator superfamily）のシナプス小胞糖タンパク質2ファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、神経細胞や内分泌細胞における、調節性分泌の制御に関与し、神経伝達物質輸送、膜貫通輸送に関与すると考えられている。シナプス小胞糖タンパク質2Cは、SLC22B3、KIAA1054等の別名でも知られる。例示的なシナプス小胞糖タンパク質2Cは、アミノ酸配列が配列番号６７で表される727アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプス小胞糖タンパク質2Cの小胞内ドメイン」とは、シナプス小胞糖タンパク質2Cの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号６７における第176位～第191位のアミノ酸配列（配列：LPSAETDLCIPNSGSG；配列番号６８）で示される領域、第248位のアミノ酸配列（配列：R）で示される領域、第302位～第320位のアミノ酸配列（配列：PHYGWSFSMGSAYQFHSWR；配列番号６９）で示される領域、第459位～第578位のアミノ酸配列（配列：KPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYS；配列番号７０）で示される領域、第631位～第636位のアミノ酸配列（配列：TSESMM；配列番号７１）で示される領域、第691位～第698位のアミノ酸配列（配列：SLVSITKS；配列番号７２）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号６８～７２における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「小胞関連膜タンパク質1（Vesicle Associated Membrane Protein 1：VAMP1）」とは、シナプトブレビンファミリーに属する1回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、輸送小胞の細胞膜等へのターゲティング及び／又は膜融合に関与していると考えられている。小胞関連膜タンパク質1は、SYB1、CMS25、SPAX1、シナプトブレビン1等の別名でも知られる。例示的な小胞関連膜タンパク質1は、アミノ酸配列が配列番号７３で表される118アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「小胞関連膜タンパク質1の小胞内ドメイン」とは、小胞関連膜タンパク質1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号７３における第117位～第118位のアミノ酸配列（配列：FT）で示される領域が含まれる。
　「シナプトジャイリン4（Synaptogyrin 4：SYNGR4）」とは、シナプトジャイリンファミリーに属する4回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、同じファミリーの他のタンパク質と同様に4つの膜貫通領域を持つ。例示的なシナプトジャイリン4は、アミノ酸配列が配列番号７４で表される234アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトジャイリン4の小胞内ドメイン」とは、シナプトジャイリン4の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号７４における第46位～第65位のアミノ酸配列（配列：YQNKMESPQLHCILNSNSVA；配列番号７５）で示される領域、第125位～第144位のアミノ酸配列（配列：ANQWQHSPPKEFLLGSSSAQ；配列番号７６）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号７５及び７６における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「シナプトタグミン4（Synaptotagmin 4：SYT4）」とは、シナプトタグミンファミリーに属する1回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、KIF1Aとの相互作用により、神経細胞の有芯小胞（dense-core vesicle）の移動に関与すると考えられている。シナプトタグミン4は、KIAA1342、HsT1192等の別名でも知られる。例示的なシナプトタグミン4は、アミノ酸配列が配列番号７７で表される425アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトタグミン4の小胞内ドメイン」とは、シナプトタグミン4の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号７７における第1位～第16位のアミノ酸配列（配列：MAPITTSREEFDEIPT；配列番号７８）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号７８における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「シナプトタグミン7（Synaptotagmin 7：SYT7）」とは、シナプトタグミンファミリーに属する1回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、カルシウムイオン依存的に分泌小胞やシナプス小胞と細胞膜との融合を促進するタンパク質の一つであると考えられている。シナプトタグミン7は、IPCA-7、PCANAP7、MGC150517等の別名でも知られる。例示的なシナプトタグミン7は、アミノ酸配列が配列番号７９で表される403アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプトタグミン7の小胞内ドメイン」とは、シナプトタグミン7の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号７９における第1位～第16位のアミノ酸配列（配列：MYRDPEAASPGAPSRD；配列番号８０）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号８０における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「分泌型キャリア関連膜タンパク質5（Secretory Carrier Membrane Protein 5：SCAMP5）」とは、分泌型キャリア関連膜タンパク質ファミリーに属する4回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、サイトカイン等のカルシウム依存的なエキソサイトーシスに関与していると考えられている。分泌型キャリア関連膜タンパク質5は、MGC24969、HSCAMP5等の別名でも知られる。例示的な分泌型キャリア関連膜タンパク質5は、アミノ酸配列が配列番号８１で表される235アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「分泌型キャリア関連膜タンパク質5の小胞内ドメイン」とは、分泌型キャリア関連膜タンパク質5の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号８１における第61位～第67位のアミノ酸配列（配列：WLIGGGG；配列番号８２）で示される領域、第126位～第148位のアミノ酸配列（配列：IPGWGVCGWIATISFFGTNIGSA；配列番号８３）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号８２及び８３における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「シナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質（Synaptic Vesicle 2-Related Protein：SVOP）」とは、主要ファシリテータースーパーファミリーのシナプス小胞糖タンパク質2ファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、膜貫通型トランスポーター活性を有すると考えられている。シナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質は、SLC22B4、DKFZp761H039、SCF22B4等の別名でも知られる。例示的なシナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質は、アミノ酸配列が配列番号８４で表される548アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「シナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質の小胞内ドメイン」とは、シナプス小胞糖タンパク質2関連タンパク質の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号８４における第109位～第122位のアミノ酸配列（配列：PQLHCEWRLPSWQV；配列番号８５）で示される領域、第178位～第180位のアミノ酸配列（配列：VLR）で示される領域、第231位～第238位のアミノ酸配列（配列：VMPSLGWR；配列番号８６）で示される領域、第338位～第373位のアミノ酸配列（配列：TTELFQAGDVCGISSRKKAVEAKCSLACEYLSEEDY；配列番号８７）で示される領域、第423位～第424位のアミノ酸配列（配列：RN）で示される領域、第479位～第489位のアミノ酸配列（配列：AQVMLESSVYL；配列番号８８）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号８５～８８における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「興奮性アミノ酸トランスポーター3（Excitatory Amino Acid Transporter 3：EAAT3）」とは、グルタミン酸トランスポーターサブファミリーに属する8回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、グルタミン酸、アスパラギン酸、システインの取込みを媒介するナトリウム依存性の高親和性アミノ酸トランスポーターと考えられている。興奮性アミノ酸トランスポーター3は、SLC1A1、HEAAC1、EAAC1等の別名でも知られる。例示的な興奮性アミノ酸トランスポーター3は、アミノ酸配列が配列番号８９で表される524アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「興奮性アミノ酸トランスポーター3の小胞内ドメイン」とは、興奮性アミノ酸トランスポーター3の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号８９における第39位～第61位のアミノ酸配列（配列：REHSNLSTLEKFYFAFPGEILMR；配列番号９０）で示される領域、第115位～第205位のアミノ酸配列（配列：SIKPGVTQKVGEIARTGSTPEVSTVDAMLDLIRNMFPENLVQACFQQYKTKREEVKPPSDPEMNMTEESFTAVMTTAISKNKTKEYKIVGM；配列番号９１）で示される領域、第267位～第286位のアミノ酸配列（配列：AGKIIEVEDWEIFRKLGLYM；配列番号９２）で示される領域、第381位～第393位のアミノ酸配列（配列：IAQLNDLDLGIGQ；配列番号９３）で示される領域、第428位～第440位のアミノ酸配列（配列：LPAEDVTLIIAVD；配列番号９４）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号９０～９４における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「オートファジー関連タンパク質9A（Autophagy-Related Protein 9A：ATG9A）」とは、オートファジー関連タンパク質9ファミリーに属する5回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、オートファゴソーム膜上のリン脂質組成を改変し、その拡張を媒介することでオートファジーに関与するリン脂質スクランブラーゼである。オートファジー関連タンパク質9Aは、APG9L1、FLJ22169、MATG9等の別名でも知られる。例示的なオートファジー関連タンパク質9Aは、アミノ酸配列が配列番号９５で表される839アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「オートファジー関連タンパク質9Aの小胞内ドメイン」とは、オートファジー関連タンパク質9Aの小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号９５における第85位～第128位のアミノ酸配列（配列：SCVDYDILFANKMVNHSLHPTEPVKVTLPDAFLPAQVCSARIQE；配列番号９６）で示される領域、第398位～第406位のアミノ酸配列（配列：DEDVLAVEH；配列番号９７）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号９６及び９７における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「グルコーストランスポーター4（Glucose Transporter Type 4：GLUT4）」とは、糖トランスポーターファミリーに属する12回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、インスリンによって制御されるグルコーストランスポーターであり、体循環からのグルコースの除去に重要な役割を果たす。グルコーストランスポーター4は、SLC2A4等の別名でも知られる。例示的なグルコーストランスポーター4は、アミノ酸配列が配列番号９８で表される509アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「グルコーストランスポーター4の小胞内ドメイン」とは、グルコーストランスポーター4の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号９８における第46位～第81位のアミノ酸配列（配列：NAPQKVIEQSYNETWLGRQGPEGPSSIPPGTLTTLW；配列番号９９）で示される領域、第133位～第142位のアミノ酸配列（配列：ASYEMLILGR；配列番号１００）で示される領域、第193位～第201位のアミノ酸配列（配列：ESLLGTASL；配列番号１０１）で示される領域、第309位～第323位のアミノ酸配列（配列：YSTSIFETAGVGQPA；配列番号１０２）で示される領域、第375位～第384位のアミノ酸配列（配列：ERVPAMSYVS；配列番号１０３）で示される領域、第439位～第445位のアミノ酸配列（配列：QYVAEAM；配列番号１０４）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号９９～１０４における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　「ATPアーゼ H+輸送アクセサリータンパク質1（ATPase H+ Transporting Accessory Protein 1：ATP6AP1）」とは、液胞型ATPアーゼサブユニットS1ファミリーに属する1回膜貫通型タンパク質の1つを指す。このタンパク質は、分泌小胞の内腔の酸性化に必要なプロトン輸送性液胞（V型）-ATPアーゼタンパク質複合体のサブユニットと考えられている。ATPアーゼ H+輸送アクセサリータンパク質1は、VATPS1、XAP3、ATP6IP1、ATP6S1等の別名でも知られる。例示的なATPアーゼ H+輸送アクセサリータンパク質1は、アミノ酸配列が配列番号１０５で表される470アミノ酸からなるヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「ATPアーゼH+輸送アクセサリータンパク質1の小胞内ドメイン」とは、ATPアーゼ H+輸送アクセサリータンパク質1の小胞内ドメインの全部又は一部を指す。小胞内ドメインの全部としては、例えば、配列番号１０５における第42位～第419位のアミノ酸配列（配列：EQQVPLVLWSSDRDLWAPAADTHEGHITSDLQLSTYLDPALELGPRNVLLFLQDKLSIEDFTAYGGVFGNKQDSAFSNLENALDLAPSSLVLPAVDWYAVSTLTTYLQEKLGASPLHVDLATLRELKLNASLPALLLIRLPYTASSGLMAPREVLTGNDEVIGQVLSTLKSEDVPYTAALTAVRPSRVARDVAVVAGGLGRQLLQKQPVSPVIHPPVSYNDTAPRILFWAQNFSVAYKDQWEDLTPLTFGVQELNLTGSFWNDSFARLSLTYERLFGTTVTFKFILANRLYPVSARHWFTMERLEVHSNGSVAYFNASQVTGPSIYSFHCEYVSSLSKKGSLLVARTQPSPWQMMLQDFQIQAFNVMGEQFSYASDCA；配列番号１０６）で示される領域が含まれる。また、小胞内ドメインの一部としては、例えば、配列番号１０６における任意の長さの部分配列で示される領域が含まれる。部分配列の長さは抗SYT2 N末端抗体に関する記載に準ずる。
　さらに、本発明の標的化剤には、小胞に存在する膜タンパク質の、小胞内腔に露出する非タンパク質領域に結合可能な抗体を使用することができる。このような非タンパク質領域としては、例えば、糖鎖、脂質等が挙げられる。上述の様な小胞内ドメイン上の糖鎖等に結合可能な抗体はもちろん、例えば、膜貫通ドメインを有さない脂質修飾タンパク質の脂質アンカーの一部が小胞内腔に露出している場合、それに結合可能な抗体を使用することができる。具体的には、例えば、Rab3a（配列番号１１０）等のRas関連タンパク質の脂質アンカー部分に結合可能な抗体等を使用することができる。また、例えば、表在性膜タンパク質の小胞膜内に存在する疎水性ドメインに結合可能な抗体を使用することができる。例えば、シナプシン1（Synapsin 1：SYN1：配列番号１０７）、シナプシン2（Synapsin 2：SYN2：配列番号１０８）、シナプシン3（Synapsin 3：SYN3：配列番号１０９）等のシナプシンファミリータンパク質の小胞膜内に存在する疎水性ドメインに結合可能な抗体等を使用することができる。
　本明細書における膜タンパク質の由来する動物は特に限定しないが、例えば、細胞に関して後述する各種の脊椎動物、哺乳動物由来であってよく、好ましくはヒト由来のタンパク質である。
　本明細書において、「標的化剤」とは、特定の物質を標的へと送達するための薬剤を指す。本明細書においては、標的化剤を用いることにより、所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）が運動神経細胞、特に運動神経細胞シナプスに輸送される。また、シナプス及びシナプス小胞への標的化においては、エンドサイトーシスによるシナプス小胞の回収に伴って細胞内、特にシナプス小胞内に取り込まれ、細胞体へと送達される。さらに、本発明の標的化剤により、輸送された物質が細胞質中で生理活性を発揮し得る。
　例えば、本発明の標的化剤がシナプス小胞に取り込まれると共に、輸送された所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）がシナプス小胞膜を透過し細胞質中に移行し得る。具体的には、例えば、生理活性物質が使用された場合、標的化剤中の少なくとも1つの生理活性物質が細胞質に移行し、核内の生体物質、細胞質中の所望の生体物質又は細胞質膜上の生体物質に作用することができる。生理活性物質が作用する生体物質は、細胞膜上又は細胞内に存在し得る物質であれば特に限定されず、例えば、タンパク質、核酸等の高分子化合物、脂質、糖、アミノ酸、ヌクレオチド等の低分子化合物、金属イオン等のイオン又は原子等のいずれでもよい。
　具体的には、例えば、核内の生体物質としては、DNA、RNA（mRNA、siRNA、miRNA等）、転写因子、核内受容体等が挙げられ、細胞質中の生体物質としては、上記核酸の他、細胞骨格、酵素、金属イオン等が挙げられる。細胞膜上の生体物質としては、例えば、細胞膜の脂質、細胞膜上受容体、受容体と共役している酵素及び細胞接着因子等が挙げられる。
　本明細書において、「運動神経細胞」とは、中枢からの刺激を効果器である骨格筋へと伝える神経細胞群を指す。運動神経細胞は、一般には、中枢神経細胞である一次運動神経細胞及び末梢神経細胞である二次運動神経細胞を含むが、本明細書における運動神経細胞は二次運動神経細胞である。
　本明細書において、「二次運動神経細胞」とは、細胞体を脊髄前角や脳幹に有し、骨格筋との接合部まで軸索を伸ばす運動神経細胞を指す。本明細書における運動神経細胞としては、例えば、α運動神経細胞、β運動神経細胞、及びγ運動神経細胞等が含まれる。また、脊髄の前核に細胞体を有する脊髄神経細胞の他、動眼神経、滑車神経、外転神経、顔面神経、舌下神経等の一部の脳神経も含まれる。本明細書における運動神経細胞は、通常、アセチルコリンを神経伝達物質として分泌し、コリン作動性神経細胞に分類される。しかし、アセチルコリン以外の神経伝達物質を分泌する運動神経細胞であってもよい。本明細書における運動神経細胞が投射する筋細胞は骨格筋細胞である。
　本明細書において、「骨格筋細胞」とは、骨格を動かす横紋筋を構成する細胞又はその表現型を有する細胞を指す。本明細書における骨格筋細胞は、骨に付着する筋肉細胞及び筋紡錘等の骨格筋に含まれるその他の筋肉細胞を広く含む。骨格筋の種類は特に限定しないが、例えば、横隔膜、外側広筋、内側広筋、大腿直筋、中間広筋、上腕二頭筋、前脛骨筋、後脛骨筋、腓腹筋、ヒラメ筋、三角筋、広背筋、胸鎖乳突筋、肋間筋、眼筋、顔面筋、舌筋、あぶみ骨筋等が挙げられる。また、本明細書における骨格筋細胞は、人工の幹細胞（iPS細胞及びES細胞等）及び／又は天然の幹細胞（間葉系幹細胞及び骨格筋幹細胞等）からin vitroで分化させた細胞等の培養骨格筋細胞も含む。
　本明細書において、細胞は、脊椎動物に由来する細胞であり得る。脊椎動物には、魚類、爬虫類、両生類、鳥類及び哺乳類が含まれる。具体的な哺乳類としては、例えば、霊長類（例えば、ヒト）が挙げられる。また細胞は、家畜（ニワトリ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、愛玩動物（熱帯魚、トカゲ、イヌ、ネコ、ウサギ等）、実験動物（カエル、マウス、ラット、サル等）に由来する細胞であり得る。細胞は1種類の組織、個体、及び動物種に由来する必要はなく、複数種類の細胞の混合物であってもよい。また、細胞が由来する組織及び個体の健康状態は特に限定しない。
　本発明の標的化剤によれば、所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）を運動神経細胞シナプスを介して運動神経細胞（例えば、運動神経細胞の軸索終末、軸索、軸索小丘、細胞体、樹状突起等）に標的化することができる。
　本明細書において、「シナプス」とは、神経細胞の軸索終末と、別の神経細胞の樹状突起（中枢神経系の場合）又は骨格筋、臓器等の細胞（末梢神経系の場合）との間に形成される、間隙を含む接合部を指す。
　本明細書において、シナプスは、化学的シナプス、例えば、興奮性シナプス、抑制性シナプス等であり得る。本明細書において、シナプスは、神経細胞と別の神経細胞との間に形成されるシナプス（例えば、神経細胞の軸索と別の神経細胞の樹状突起との間に形成されるシナプス）、又は神経細胞と他種細胞（筋細胞等）との間に形成されるシナプスであってもよいが、好ましくは、神経細胞のシナプス前部と骨格筋細胞上のシナプス後部により形成されるシナプス（「神経筋接合部」とも称される）である。
　本明細書において、「シナプス前部」とは、シナプスにおいて神経細胞の軸索終末に形成される膨大した部分を指し、「シナプス後部」とは、別の神経細胞の樹状突起又は骨格筋、臓器等の他の細胞におけるシナプス前部に面する部分を指す。また、「シナプス間隙」とは、シナプス前部とシナプス後部の間の空間を指す。シナプスでは、シナプス前部中に存在するシナプス小胞内に蓄積された神経伝達物質がシナプス間隙に放出され、シナプス後部に存在する受容体に結合することでシグナルが伝達される。
　本明細書において、「シナプス小胞」とは、シナプス前部の神経細胞の細胞質中に存在する分泌小胞を指す。本明細書におけるシナプス小胞には、神経伝達物質をその内部に含み、刺激に応じて細胞膜と融合して神経伝達物質をシナプス間隙に放出する小胞のみならず、神経伝達物質の放出後にエンドサイトーシス（バルクエンドサイトーシスを含む）によって神経細胞中に回収された小胞も含まれる。
　本発明の標的化剤はシナプス間隙において、細胞膜上に露出したシナプトタグミン2等の膜タンパク質の小胞内ドメインに結合し、エンドサイトーシスによってシナプス小胞に取り込まれ、それにより運動神経細胞の細胞体等まで送達することができる。そのため、本発明の標的化剤によれば、所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）を運動神経細胞の内部、特に運動神経細胞の細胞体へと標的化することができる。
　本明細書において、「膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体（小胞内ドメイン抗体）」とは、膜タンパク質の小胞内ドメインを抗原とし、それに特異的に結合可能な抗体を指す。
　例えば、本明細書において、「シナプトタグミン2の小胞内ドメイン（N末端部分）に結合可能な抗体（抗SYT2 N末端抗体）」とは、シナプトタグミン2の小胞内ドメインを抗原とし、それに特異的に結合可能な抗体を指す。
　抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも含むが、含まれる抗体は、IgG抗体分子、IgM抗体分子、又はそれらの抗原結合性断片及び抗原結合性誘導体であり得る。例えば、抗体は、完全抗体、Fab、Fab'、F(ab')2断片、また重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）をリンカーで連結した一本鎖抗体（scFv）断片、scFv-Fc、sc(Fv)2、Fv、ダイアボディー等であり得る。これらの抗体は、当業者であれば、上記したシナプトタグミン2のN末端のポリペプチド等、上述した各膜タンパク質の小胞内ドメイン又はその他の公知の膜タンパク質の小胞内ドメインを抗原として、容易に取得をし、又は合成をすることができる。また、本発明における抗体として市販品を使用することができる。抗体は、ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよく、本発明のコンジュゲート又は標的化剤がヒトに投与される場合には、その抗体部分は、ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体とすることが好ましい。
　本発明の標的化剤は複数種類の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含むことができる。この場合、これらの複数種類の小胞内ドメインは同じ膜タンパク質のものであっても、異なる膜タンパク質のものであってもよい。
　本発明において使用し得る抗体にはさらに、抗原結合性に影響しない範囲で当業者に理解され得る誘導体、例えば抗体精製を容易にしたり安定性を高めたりするための修飾が施された誘導体も含まれる。本明細書においては、シナプトタグミン2の小胞内ドメインとの結合性を保持する断片及び誘導体を、文脈に矛盾のない限り、「抗体」に含めることが意図される。
　本明細書における抗体の代わりに、対象分子に結合可能な任意の分子を本発明の標的化剤や運動神経細胞可視化剤として使用することができる。対象分子に結合可能な分子としては、例えば、アプタマー、環状ペプチド、対象分子の受容体又はリガンド、又はそれらの組合せ等が挙げられる。
　本発明の標的化剤は、シナプトタグミン2の小胞内ドメイン（N末端部分）に結合可能な抗体をはじめとする、膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体に加え、所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）をさらに含み得る。
　本明細書において、「標識物質」とは、その存在を検出可能なシグナルを発する物質を指す。標識物質としては、例えば、蛍光分子、化学発光物質等の特定の条件において光を発する発光性標識物質、光音響効果プローブ等の音波を発する発音性標識物質、又は放射性標識物質等が挙げられる。蛍光分子の例としては、特に限定するものではないが、蛍光タンパク質、フルオレセイン及びその誘導体、ピレン及びその誘導体、量子ドット等の蛍光分子が挙げられる。化学発光物質としては、例えばペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（ALP）等の酵素等が挙げられる。放射性標識物質としては、例えば14C、3H、125I等を含む試薬が挙げられる。光音響効果とは、光吸収に伴う断熱膨張によって熱弾性波が生じる現象をいい、この熱弾性波は音響波として検出することができる。光音響効果プローブとしては、例えば、インドシアニングリーン又はその誘導体、クルクミン誘導体、又はコリン誘導体等が挙げられる。使用する抗体、標識物質及び生理活性物質の吸光特性がわかっている場合には、必ずしも光音響効果用の標識物質を使用する必要はなく、例えば、発光性標識物質を光音響効果に基づいて検出してもよい。
　本明細書において、「生理活性物質」とは、生体又は細胞に対して直接的又は間接的に生理的効果を発揮し得る物質を指す。例えば、標的の運動神経細胞に生理的効果を発揮し得る低分子化合物、ペプチドやアプタマー等の機能性中分子、並びに抗体、酵素等のタンパク質及びDNA、RNA等の核酸等の生体高分子を含む高分子化合物等が挙げられる。例えば、シナプス形成促進剤、シナプス維持剤、筋肉増強剤又は神経細胞機能改変剤等の薬剤又はプロドラッグを生理活性物質として使用することができる。
　「生理的効果」とは、タンパク質、DNA及びRNA等の生体分子における量的及び／又は質的な変化をもたらす効果を指す。生理的効果の結果として、例えば、生体、器官、組織、細胞等の機能や性質等が変化し得る。例えば、シナプス形成の促進若しくは抑制、神経機能の低下の改善若しくは予防、又は神経細胞の過活動の改善若しくは予防等の効果が得られる。
　本発明の標的化剤に所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）を含む場合、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合可能な抗体をはじめとする、膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体と所望の物質とが共有結合により連結していない状態で（例えば、非共有結合的に連結した状態で）、又は共有結合により連結した状態で含まれる。共有結合により連結した状態で含まれる場合、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合可能な抗体をはじめとする、膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体と所望の物質とはコンジュゲート（「本発明のコンジュゲート」と称する）を形成する。
　本明細書において、「コンジュゲート」とは、2以上の分子が共有結合により連結された物質を指す。特に、本発明のコンジュゲートは、膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体と所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）とが連結している。具体的には、例えば、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合可能な抗体と所望の物質（標識物質及び／又は生理活性物質）とが連結している。
　本発明の標的化剤における抗体と所望の物質との間の共有結合及び非共有結合は、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合可能な抗体と所望の物質とが連結した状態で運動神経細胞の近傍まで到達可能な結合であれば特に限定しない。
　本明細書において、「シナプス形成促進剤」とは、シナプス前部及び／又はシナプス後部の形成を促進する作用を有する薬剤を指す。シナプス形成促進には、例えば、シナプスの接合力を増強すること、例えば、（ｉ）シナプス前部及び／若しくは後部の表面積及び／若しくは体積の増加、（ｉｉ）シナプス前部に特異的に発現するタンパク質（例えば、シナプシン1又はシナプシン2等）の量、密度、集積速度、集積頻度等の増加及び／若しくは定性的な変化、（ｉｉｉ）シナプス後部に特異的に発現するタンパク質（例えば、LRRTMファミリータンパク質）の量、密度、集積速度、集積頻度等の増加及び／若しくは定性的な変化をもたらすことが含まれる。
　本明細書において、「シナプス維持剤」とは、シナプス前部及び／又はシナプス後部の退縮を抑制する又はそれを補助する作用を有する薬剤を指す。シナプス維持には、例えば、シナプスの接合力の減弱を抑制する又はそれを補助すること、例えば、（ｉ）シナプス前部及び／若しくは後部の表面積及び／若しくは体積の減少の抑制又はその補助、（ｉｉ）シナプス前部に特異的に発現するタンパク質（例えば、シナプシン1又はシナプシン2等）の量、密度、集積速度、集積頻度等の減少及び／若しくは定性的な変化の抑制又はその補助、（ｉｉｉ）シナプス後部に特異的に発現するタンパク質（例えば、LRRTMファミリータンパク質）の量、密度、集積速度、集積頻度等の減少及び／若しくは定性的な変化の抑制又はその補助をもたらすことが含まれる。
　本明細書において、「筋肉増強剤」とは、筋肉の増強若しくは減弱の抑制をもたらす作用又はそれを促進する作用を有する薬剤を指す。筋肉の増強の種類は、筋肉の機能が強化される限り特に限定しないが、例えば、筋肉の表面積及び／若しくは体積の増加、筋束、筋線維、筋原線維、筋節、筋細胞等の筋肉を構成する各要素の数、密度等の増加及び／若しくは定性的な変化、並びに／又は筋肉を構成する細胞中の特定のタンパク質の発現量の変化をもたらす作用、筋量及び／若しくは筋力（例えば骨格筋の筋量若しくは筋力）を増加させる作用、又はこれらの作用により筋肉の減弱をもたらす作用等が挙げられる。
　具体的なシナプス形成促進剤、シナプス維持剤及び筋肉増強剤としては、限定するものではないが、例えば、本発明者らが見出した、特開２０２２－０５３５３５において開示される化合物（例えば、チアミン及びその誘導体）、特開２０２３－０２８８４８において開示される化合物（例えば、アトロピン、ブスルファン、クロモカルブ、プロカインアミド、ウデナフィル、プロピフェナゾン及びそれらの誘導体）等が挙げられる。
　本明細書において、「神経細胞機能改変剤」とは、神経細胞が発揮する機能を変化させる作用又は促進する作用を有する薬剤を指す。神経細胞の機能改変は、神経細胞の機能の程度及び／又は性質が変化する限り特に限定しないが、例えば、神経細胞の電気生理学的特性（刺激の伝導及び伝達の特性等）の変化、遺伝子発現様式の変化、並びに形態学的な特性の変化（神経突起の伸長、退縮及び分岐、並びにシナプスの形成及び退縮等）等が含まれる。
　具体的な機能改変剤としては、限定するものではないが、例えば、AP-1阻害剤（例えば、本発明者らが見出したＷＯ２０２０／１９６７２５に開示される化合物等）、FUS阻害剤、SOD1阻害剤、TDP-43阻害剤（例えば、アナカルジン酸の化合物等）、KIF1A阻害剤、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）等の細胞骨格改変剤等が挙げられる。
　本明細書において、「細胞骨格改変剤」とは、細胞骨格の形成、維持、分解、分岐、走行及び局在からなる群から選択される一以上を抑制及び／又は促進する薬剤を指す。本明細書における細胞骨格改変剤には、細胞骨格以外の分子に作用することにより細胞骨格の形成等を改変する薬剤も含まれる。細胞骨格には、微小管、中間径フィラメント及びアクチンフィラメントのいずれも含まれる。例えば、細胞骨格改変剤として、細胞骨格の形成、維持を抑制する薬剤、具体的には、例えば、微小管の重合阻害剤等を使用することができる。
　これらの薬剤は、神経細胞に対する作用を有していればよく、運動神経細胞特異的な作用を有する必要はない。
　本発明のコンジュゲートにおいては、抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体と標識物質及び／又は生理活性物質とが直接的に共有結合で連結していてもよく、それらがリンカー等を介して間接的に連結していてもよい。
　本発明の標的化剤がコンジュゲートを含まない場合、標識物質及び／又は生理活性物質は、抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体と結合可能な部分を有することが好ましい。具体的には、例えば、抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体に結合可能な抗体に共有結合により結合している標識物質及び／又は生理活性物質を使用することができる。この場合の「抗SYT2 N末端抗体に結合可能な抗体」及び「小胞内ドメイン抗体に結合可能な抗体」は、抗原が抗SYT2 N末端抗体である以外は「抗SYT2 N末端抗体」及び「小胞内ドメイン抗体」の定義の項における記載に準ずる。
　抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体に結合可能な部分と標識物質及び／又は生理活性物質の結合は、本発明の標的化剤又はコンジュゲートにおける結合に準ずる。したがって、抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体に結合可能な部分と標識物質及び／又は生理活性物質とは非共有結合により連結していてもよく、直接的に共有結合で連結していてもよく、リンカー等を介して間接的に連結していてもよい。
　本発明の標的化剤が標識物質及び／又は生理活性物質を含む場合、標識物質及び／又は生理活性物質と抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体とが非共有結合的に連結しているペプチド複合体の形で、標識物質及び／又は生理活性物質を本発明の標的化剤に含めることができる。
　標識物質及び／又は生理活性物質が抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体に結合する部位は、抗SYT2 N末端抗体のSYT2 N末端への結合等、小胞内ドメイン抗体の抗原への結合を損なわない限り特に限定しない。具体的には、例えば、高頻度可変領域（HVR）以外の部位又は定常領域に標識物質及び／又は生理活性物質を結合することができる。
　また、互いの機能を損なわない限り、標識物質及び／又は生理活性物質を複数含んでもよい。この場合、例えば、同じ物質を複数含んでもよく、互いに異なる物質を1つずつ又は複数含んでもよい。
　本発明において利用可能なリンカーとしては、当分野において好適に使用されるリンカーを適宜使用することができる。この場合、リンカーの構成及び鎖長は、得られるコンジュゲートの機能を損なわない範囲で適切なものを選択することができる。リンカーは、例えば、シナプスへの輸送後に切断可能なように構成されてもよい。また、リンカーは、例えば、シナプスへの輸送後に切断されないように構成されてもよい。
　リンカーは、当分野で通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば5～25個、好ましくは10～20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えばGSリンカー等を好適に使用することができる。また、例えば、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー等の切断可能なリンカーを使用してもよい。
　小胞内ドメイン抗体は、シナプス小胞と細胞膜の融合により一時的に細胞表面に露出した抗原である膜タンパク質の小胞内ドメインに結合し、シナプス小胞のエンドサイトーシスに伴って、その膜タンパク質と一緒に細胞内に送達され得る。本発明の標的化剤に含まれる抗SYT2 N末端抗体は、シナプス小胞と細胞膜の融合により一時的に細胞表面に露出したシナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合し、シナプス小胞のエンドサイトーシスに伴って、シナプトタグミン2と一緒に細胞内に送達され得る。したがって、標的化剤又はコンジュゲートは、標的となるシナプスのシナプス小胞に標識物質及び／又は生理活性物質が送達されるように設計されることが好ましい。シナプス小胞に送達され得る化合物の特徴は、当技術分野において周知である。本発明の標的化剤又はコンジュゲートの粒子径は、バルクエンドサイトーシスのエンドソームの直径が90nm～160nmであることから、その平均値（又は中央値）を、例えば、160nm以下、150nm以下、140nm以下、130nm以下、120nm以下、110nm以下、100nm以下、90nm以下とすることができる。また、シナプス小胞の直径が40nm～60nmであることから、本発明のコンジュゲートの粒子径は、その平均値（又は中央値）を、例えば、60nm以下、55nm以下、50nm以下、45nm以下、40nm以下、35nm以下、30nm以下、25nm以下、23nm以下、20nm以下、18nm以下、15nm以下、14nm以下、13nm以下、12nm以下とすることができる。例えば、標的化剤が標識物質及び／又は生理活性物質を含まない場合は、標的化剤に標識物質及び／又は生理活性物質が結合した際の全体の粒子径を上述の範囲とすることができる。ただし、例えば、シナプス小胞のエンドサイトーシスを阻害する目的で、又はシナプス表面若しくはシナプス間隙に物質を送達する目的で粒子径を大きく設計してもよい。また、例えば、シナプス小胞への送達の際には既に標識物質及び／又は生理活性物質が分離されているように設計する場合には、分離前の粒子径を大きく設計してもよい。
　本発明のコンジュゲート又は標的化剤は、血液脳関門を通過するように構成される必要は無い。通常は、本発明のコンジュゲート又は標的化剤は、血液脳関門を通過せず、そのため、中枢神経系には作用せず、末梢に存在するシナプスにおいてのみ作用し得る。
　シナプスを介した運動神経細胞への標的化作用は、例えば、生理活性物質を含む本発明のコンジュゲート又は標的化剤を脊椎動物等の対象（例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト、その他脊椎動物）に投与し、本発明のコンジュゲート又は標的化剤による、対象の神経細胞における生理的効果を評価することにより判定することができる。生理的効果の評価は、例えば、本発明のコンジュゲート若しくは標的化剤を投与した群と投与していない群との生理的効果の程度を比較することにより、及び／又は本発明のコンジュゲート若しくは標的化剤を投与した群と生理活性物質を単体で投与した群の生理的効果の程度を比較することにより、行うことができる。
　本発明者等は、先に、神経細胞を、LRRTM分子（LRRTM2の細胞外ドメイン等）が表面に固定されたマイクロビーズと共に共培養することにより、シナプス前部の形成を誘導することができることを見出している（ＷＯ２０２１／００６０７５）。
　したがって、被験物質がシナプスを含む運動神経細胞への標的化作用を有するか否かはまた、神経細胞とマイクロビーズとの共培養により誘導されたシナプス前部に被験物質が局在するか否かを調べることにより判定することもできる。
　「LRRTM（ロイシンリッチリピート膜貫通型神経タンパク質、leucine-rich repeat transmembrane neuronal protein）ファミリータンパク質」とは、LRRTMファミリーに属するタンパク質を指す。LRRTMファミリーは、シナプス後部側のシナプスオーガナイザータンパク質ファミリーの1つであり、シナプス前部の形成を誘導する活性を有する。ヒトを含む哺乳類では、LRRTMファミリータンパク質として、LRRTM1、LRRTM2、LRRTM3、及びLRRTM4の4種類が報告されている。マイクロビーズに使用されるLRRTMファミリータンパク質はそのいずれであってもよい。
＜コンジュゲート＞
　本発明は、シナプトタグミン2の小胞内ドメイン（N末端部分）に結合可能な抗体（「抗SYT2 N末端抗体」と称する）等のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体（「小胞内ドメイン抗体」と称する）と、標識物質及び／又は生理活性物質とのコンジュゲートに関する。本発明のコンジュゲートは、例えば、運動神経細胞のシナプス小胞内に取り込まれ、運動神経細胞に送達される。
＜運動神経細胞又はそのシナプスの可視化剤＞
　本発明は、運動神経細胞又はそのシナプスの可視化剤である標的化剤（「本発明の可視化剤」と称する）を提供する。
　本発明の可視化剤は、運動神経細胞又はそのシナプスを可視化する用途に使用するための、標識物質を含む標的化剤である。
　「運動神経細胞を可視化する」とは、運動神経細胞の全体又は一部分を検出可能な状態にすることを指す。運動神経細胞の一部分を可視化する場合、可視化される部分は無作為であっても、所定の部分であってもよい。例えば、所定の部分としてシナプスを可視化することができる。その場合、本発明の可視化剤をシナプス可視化剤として利用することができる。「シナプスを可視化する」とは、シナプス前部及び／又はシナプス後部を検出可能な状態にすることを指す。そのため、本発明の可視化剤には、直接目視により検出可能な標識物質の他、検出可能な任意の標識物質を使用することができる。同様に、本発明の可視化剤は、運動神経細胞の軸索終末、軸索、軸索小丘、細胞体、樹状突起等を可視化することができる。
　本発明の可視化剤は、in vivo又はin vitroにおいて使用され得る。標識物質のシグナルの検出は、運動神経細胞が生きている間に、又は運動神経細胞を固定した後に行うことができる。運動神経細胞が生きた状態での検出に適した標識物質は当技術分野において公知である。例えば、in vivoイメージングの分野において公知の蛍光物質、化学若しくは生物発光物質等の発光性物質、光音響効果プローブ等の発音性物質、放射性同位体等の放射性物質又は造影剤等が挙げられる。
　本発明の可視化剤は、任意の用途、例えば、運動神経細胞又はシナプス（神経筋接合部を含む）若しくはシナプス小胞の数、サイズ若しくは位置を可視化するため、又は外科手術若しくは診断において組織を可視化するために使用され得る。
　本発明の可視化剤は、他の試薬等、例えば、本発明の可視化剤に含まれる標識物質の検出のために必要な試薬等と共にキットの形態で提供されてもよい。
　特に、例えば、標識物質が酵素等である場合、その基質を本発明の可視化剤と共に提供することができる。
＜組成物又は医薬組成物＞
　本発明はさらに、本発明のコンジュゲート又は標的化剤を含む、組成物（本発明の「組成物」）又は医薬組成物（「本発明の医薬組成物」）に関する。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、生理活性物質を含む本発明の標的化剤を含む。本発明の組成物又は医薬組成物は、標的化剤の他に、必要に応じて、添加剤（例えば、担体（固体や液体担体等）、賦形剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、緩衝剤、pH調整剤）等を含んでもよい。このとき、添加剤は、組成物又は医薬組成物の剤形に応じて適宜選択することができる。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、限定するものではないが、例えば固形製剤、液体製剤、ジェル剤、エアロゾル剤等の任意の剤形に調製されたものであってよい。なお、組成物又は医薬組成物を液体製剤として用いる場合には、それを使用する直前に、例えば、生理食塩水で再構成することを意図した乾燥物として調製することもできる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、結晶セルロース、デンプン等が挙げられる。結合剤としては、例えば、デンプン糊、アラビアゴム糊、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、セルロース類、炭酸塩等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ワックス、タルク等である。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、シナプス形成促進剤、シナプス維持剤又は筋肉増強剤を生理活性物質として含む場合、シナプス形成を促進することにより神経機能の低下を改善又は予防することができる。したがって、本発明の組成物又は医薬組成物は、神経機能の低下、例えば、神経の損傷による神経機能の低下、老化による神経機能の低下、若しくは疾患による神経機能の低下等を改善若しくは予防するため、又は神経機能の向上のために使用することができる。
　本明細書において、「神経の損傷」とは、神経の任意の箇所での損傷を指し、体外から物理的に与えられた損傷、及び、がん、腫瘍等の体内の要因に起因する損傷を含む。
　本明細書において、「老化」とは、時間の経過と共に生物の個体に起こる種々の機能低下、形態変化、外観変化等及びその過程を指す。
　老化により生じる状態としてフレイル及びサルコペニア等が知られている。フレイルとは、加齢と共に、心身の活力（運動機能、認知機能等）が低下し、複数の慢性疾患の併存等の影響も受けつつ、生活機能に障害が生じ、心身が脆弱化した状態を意味する。心身の活力の低下としては、例えば、認知機能障害、めまい、摂食障害、嚥下障害、視力障害、うつ、貧血、難聴、せん妄、易感染性、体重減少、筋量低下等が挙げられる。慢性疾患としては、高血圧、心疾患、脳血管疾患、糖尿病、呼吸器疾患、悪性腫瘍等が挙げられる。一方、サルコペニアとは、加齢又は疾患等により骨格筋量が低下し筋力が低下した状態を意味する。老齢マウスの神経筋接合部では、シナプス解離（synaptic detachment）、シナプス後部からの部分的又は完全な軸索の離脱等の形態の変化が見られることから、加齢に伴う神経筋接合部の形態の変化がサルコペニアにおける骨格筋量の低下等に関与していると考えられている。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、特に、フレイル又はサルコペニアを有するか、又はそれを有するリスクが高い対象において、老化による神経機能の低下を改善又は予防するために使用することができる。
　本発明において、疾患としては、例えば、神経疾患及び神経筋疾患が挙げられる。
　本明細書において、「神経疾患」とは、中枢神経又は末梢神経等の神経の障害により生じた疾患を指し、例えば、以下からなる群から選択される１以上の疾患を指す：アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、ジストニア、プリオン病、有棘赤血球舞踏病、副腎白質ジストロフィー、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、痙性対麻痺、脊髄空洞症、シャルコー・マリー・トゥース病、前頭側頭型認知症、てんかん、統合失調症、自閉症、自閉症スペクトラム障害等。
　本明細書において、「神経筋疾患」とは、運動神経、神経筋接合部、又は筋肉細胞のいずれかの障害により生じた疾患を指し、例えば、以下からなる群から選択される１以上の疾患を指す：筋ジストロフィー、ミオパチー、先天性筋無力症候群、遺伝性周期性四肢麻痺、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群等。
　筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、一次運動神経及び二次運動神経が選択的にかつ進行性に変性・消失する疾患であり、初期病態として神経筋接合部において骨格筋から運動神経が脱離することが知られている。したがって、骨格筋と運動神経との間のシナプスの形成を促進又は退縮の抑制をすることができるシナプス形成促進剤又はシナプス維持剤を含む本発明の組成物又は医薬組成物は、特に、筋萎縮性側索硬化症による神経機能の低下を改善又は予防するために使用することができる。
　例えば、本発明の医薬組成物は、本発明のコンジュゲート又は標的化剤を含む筋萎縮性側索硬化症治療用医薬組成物、脊髄性筋委縮症治療用医薬組成物等とすることができる。
　筋肉増強剤を含む本発明の組成物又は医薬組成物は、筋肉を増強することにより、筋力の低下を改善又は予防することができる。したがって、筋肉増強剤を含む本発明の組成物又は医薬組成物は、筋力の低下、例えば、外傷若しくは外科手術後の筋力の低下、老化による筋力の低下、疾患による筋力の低下を改善若しくは予防するため、又は筋肉機能の向上のために使用することができる。
　本明細書において、「外傷」とは、外的要因による組織又は臓器の損傷を指し、例えば、創傷、骨折、捻挫、内臓破裂、熱傷、凍傷等を含む。
　機能改変剤を含む本発明の組成物又は医薬組成物は、運動神経細胞の機能を改変することにより、神経細胞の低下又は亢進を改善又は予防することができる。したがって、機能改変剤を含む本発明の組成物又は医薬組成物は、神経細胞の過活動、例えば、疾患若しくは状態による神経細胞の過活動を改善若しくは予防するため、又は筋肉の緊張、例えば、老化による震え、外傷若しくは疾患による筋肉の緊張を改善若しくは予防するためにも使用することができる。
　具体的には、上述の各種疾患及び状態の他、例えば、異常不随意運動（ジスキネジア）（例えば、異常頭部運動、振戦、（有痛性）痙攣、筋線維束性攣縮等）、歩行及び移動の異常（例えば、失調性歩行、歩行困難等）、その他の協調運動障害（例えば、運動失調症等）、神経系及び筋骨格系に関するその他の状態（例えば、テタニー、異常反射、姿勢異常、痙縮、筋緊張亢進、筋緊張症、深部腱反射亢進、嚥下障害等）等を改善又は予防するために使用することができる。
　本明細書において「疾患」は、対象個体における識別可能な症状や原因によって分類可能な病的状態を指し、疾病及び障害を包含する。本発明において「状態」とは、対象個体における識別可能な症状を含む病的状態のうち、疾患に該当しないものを指す。
　本発明の組成物又は医薬組成物は、本発明の標的化剤を複数含んでもよく、その他の有効成分をさらに含んでもよい。その他の有効成分は、組成物又は医薬組成物に含まれる標的化剤の機能を損なわない限り、特に限定しない。標的化剤を複数種類含む場合、各標的化剤が結合可能な膜タンパク質は同じであっても異なってもよい。また、例えば、同じ膜タンパク質であっても、異なる部位に結合可能な抗体を含む標的化剤を含むことができる。これらの標的化剤に含まれる標識物質及び／又は生理活性物質は互いに異なっても同じであってもよい。
＜運動神経細胞又はシナプスへの標的化方法＞
　本発明は、運動神経細胞又はシナプスへの標的化方法に関する。本発明によれば、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合する抗体（抗SYT2 N末端抗体）等のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体（「小胞内ドメイン抗体」と称する）を運動神経細胞に接触させることにより、当該抗体を運動神経細胞内（特に運動神経細胞のシナプス小胞内）に取り込ませ、運動神経細胞（例えば、運動神経細胞の軸索終末、軸索、軸索小丘、細胞体、樹状突起等）に標的化することができる。このようにして、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに結合する抗体をはじめとする小胞内ドメイン抗体が運動神経細胞又はシナプスに標的化される。当該抗体に所望の物質（例えば、標識物質及び／若しくは生理活性物質）を直接的に又はリンカーを介して間接的に連結して本発明のコンジュゲートを製造し、これを運動神経細胞に接触させることにより、又は当該抗体と、当該抗体に結合可能な所望の物質を別々に運動神経細胞に接触させることにより、当該所望の物質を運動神経細胞内（例えば、運動神経細胞のシナプス小胞内）に送達することができる。したがって、本発明によれば、運動神経細胞又はシナプスの標的化方法が提供され、本方法は、運動神経細胞等の細胞に抗体（所望の物質と連結していてもよい）を接触させることを含む。
＜標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法＞
　本発明は、標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法であって、本発明のコンジュゲート又は標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程、及び標的化剤を運動神経細胞シナプスに送達する工程を含む方法に関する。
　本発明における接触の対象は、運動神経細胞を含んでいれば特に限定されない。接触は、例えば、運動神経細胞単体を対象として行ってもよいし、運動神経細胞以外の細胞を含む組織を対象として行ってもよい。例えば、本発明の標的化剤は神経筋接合部における運動神経細胞シナプスの前部を主な標的とするため、運動神経細胞が投射する骨格筋細胞をさらに含む組織を対象としてもよい。
　本方法における運動神経細胞は、脊椎動物（非ヒト哺乳動物、ヒト、その他脊椎動物）の運動神経細胞を含み得る。本方法における運動神経細胞は、好ましくはヒト運動神経細胞を含む。以下、ヒト運動神経細胞を例として本発明を説明するが、本方法はヒト運動神経細胞に限定されるものではない。
　ヒト運動神経細胞は、その由来に限らず制限なく用いることができる。例えば、これに限定されないが、ヒトから単離した細胞の初代培養、ヒトから単離され細胞株として樹立された細胞、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したヒト運動神経細胞を挙げることができる。ヒト運動神経細胞が由来する多能性幹細胞は、好ましくは、ヒト由来の多能性幹細胞である。
　本発明で用いる「多能性幹細胞」とは、自己複製能を有しin vitroにおいて培養することが可能で、かつ、個体を構成する細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞（ES細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（GS細胞）、体細胞由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、本方法で好ましく用いられるのはヒト由来のiPS細胞又はES細胞である。
　ES細胞は、受精卵から取得することが多いが、受精卵以外、例えば、脂肪組織、胎盤、精巣細胞から取得することもでき、いずれのES細胞も本発明の対象である。受精卵以外からES細胞を作製する方法は報告されており（例えば、ＷＯ２００３／０４６１４１）、それらの報告を適宜参照して用いることができる。
　iPS細胞は、体細胞に由来する人工的な幹細胞であって、特異的な再プログラム化因子を核酸又はタンパク質の形態で体細胞に導入することにより製造することができ、ES細胞とほぼ同等の特性（例えば、分化多能性及び自己複製に基づく増殖能）を示す。再プログラム化因子に含まれる遺伝子の例としては、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-MYC、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1、又はその組合せ等が挙げられる。iPS細胞を製造する方法については、多くの報告がなされており、これらの報告を参照し、それらを適宜変更して用いることができる。本方法で用いることができるiPS細胞は、好ましくはヒト由来のiPS細胞であり、例えば、ヒトの線維芽細胞由来のiPS細胞である。
　ヒトiPS細胞を末梢神経細胞へと分化誘導する方法は、多くの報告がなされており（例えば、Chambers, Stuart M., et al., Nature biotechnology 27.3 (2009): 275.）、これらの報告を参照し、適宜変更して用いることができる。あるいは、ヒトiPS細胞から分化誘導した様々な神経細胞が市販されており、例えば、FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.又はリプロセル（株）等から購入することができる。
　一実施形態において、本方法は、in vitroの方法である。別の実施形態において、本方法は、ex vivoの方法である。別の実施形態において、本方法は、in vivoの方法である。本方法がin vivoの方法である場合、対象はヒトを除く哺乳動物であり得る。
　本方法がin vitroの方法である場合、本方法は、シナプス形成を誘導する工程をさらに含んでもよい。本明細書において、「シナプス形成を誘導する」とは、神経細胞の軸索においてシナプス前部の形成を引き起こすこと、及び／又は別の神経細胞の樹状突起若しくは骨格筋、臓器等の細胞においてシナプス後部の形成を引き起こすことを指す。シナプス形成の誘導は、シナプス前部を形成しようとする細胞とシナプス後部を形成しようとする細胞とを共培養することにより行うこともできる。また、シナプス形成の誘導はその他の方法、例えば、運動神経細胞とLRRTM2の細胞外ドメインで被覆されたビーズとを共培養することにより行うことができる。シナプス形成を誘導する工程は、本発明の標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程と同時又はその前に行われ得る。
　本方法がin vitroの方法である場合、本発明の標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程は、本発明の標的化剤を、運動神経細胞を含む試料に接触させることにより行われる。接触の方法は、試料中の運動神経細胞と標的化剤が互いに接触可能であれば特に限定しない。例えば、標的化剤を試料に直接散布、噴霧、滴下、塗布することによって、試料を標的化剤に浸漬することによって、又はその組合せによって適用することができる。また、試料が他の担体（例えば、培養培地等）中に存在する場合、標的化剤をその担体に散布、噴霧、滴下、塗布することにより適用してもよい。
　適用量は特に限定せず、運動神経細胞の数やその他の条件を勘案して適宜設定することができる。例えば、IgG抗体の濃度で、0.01μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、5μg/mL以上、7μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上を適用することができる。
　本方法がin vivoの方法である場合、本発明の標的化剤を被験試料に接触させる工程は、本発明の標的化剤を対象に投与することにより行われる。
　投与方法は特に限定しないが、例えば、局所投与、経腸投与、及び非経口投与、具体的には、皮膚上投与、吸入投与、注腸投与、点眼、点耳、経鼻投与、膣内投与、経管栄養、経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、骨内投与、皮内投与、くも膜下（腔）投与、腹腔内投与、膀胱内投与、経皮投与、経粘膜投与、硬膜外投与、硝子体内投与等が挙げられる。
　投与量は特に限定せず、対象の動物種やその他の条件を勘案して適宜設定することができる。例えば、IgG抗体をマウス投与する場合、体重1kgあたりの用量が0.1mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2mg/kg以上、4mg/kg以上、又は5mg/kg以上を適用することができる。
　本工程において使用される標的化剤は1種類である必要はない。例えば、複数種類の標的化剤を一緒に又は別々に使用することができる。具体的には、例えば、コンジュゲートを含む標的化剤と、標識物質及び／又は生理活性物質を含まない標的化剤を使用することができる。また、使用する標識物質及び／又は生理活性物質も1種類である必要はなく、例えば、複数種類の標識物質及び／又は生理活性物質を一緒に又は別々に使用することができる。具体的には、例えば、標識物質及び生理活性物質を組み合わせて使用してもよい。
　本発明の標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程は複数回行うことができる。本工程を複数回行う場合、それぞれにおいて使用される標的化剤及び細胞の種類、並びに適用方法及び投与方法は、毎回同じでも異なってもよい。
　運動神経細胞に本発明のコンジュゲート又は標的化剤を接触させると、本発明の標的化剤は、シナプス小胞を介して運動神経に取り込まれる。本発明の標的化剤を運動神経に細胞に接触させる際には、運動神経細胞を活動させる又はその活動を促進させることができる。運動神経細胞を活動させる又はその活動を促進させることにより、本発明のコンジュゲート又は標的化剤の運動神経細胞内への取り込み効率を向上させることができる。通常、本発明のコンジュゲート又は標的化剤がシナプス小胞に取り込まれると、そのまま逆行輸送により軸索を通じて細胞体へと送達される。
　運動神経細胞を活動させる方法は特に限定しないが、例えば、十分な時間にわたり、運動神経細胞を自発的に活動させる方法、及び人工的な刺激によって運動神経細胞を活動させる又はシナプス小胞のエンドサイトーシスを促進する方法等が挙げられる。
　自発的に活動させる方法としては、例えば、十分な時間にわたり、活動可能な環境に運動神経細胞を置くことが含まれる。運動神経細胞が活動可能な環境は、当技術分野において周知である。
　自発的に活動させる方法において運動神経細胞を活動させる時間（例えば、本発明のコンジュゲート又は標的化剤との接触時間等）は特に限定しないが、例えば、本方法がin vitroの方法である場合、1時間以上、3時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、又は24時間以上とすることができる。また、本方法がin vivoの方法である場合、例えば、1時間以上、3時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、24時間以上、36時間以上、48時間以上、60時間以上、72時間以上、100時間以上、120時間以上、150時間以上、168時間以上、200時間以上又は240時間以上とすることができる。
　人工的な刺激によって運動神経細胞を活動させる又はその活動を促進させる方法としては、例えば、十分な時間にわたり、運動神経細胞が活発に活動し得る環境に運動神経細胞を置くことが含まれる。
　本方法がin vitroの方法である場合、運動神経細胞を活動させる又はその活動を促進させる方法は、運動神経細胞に、化学的刺激及び／又は物理的刺激を与えることができる。運動神経細胞を活発に活動させるための刺激は、当技術分野においては周知である。化学的刺激に使用される化合物としては、例えば、アミオダロン、テトラエチルアンモニウム、4-アミノピリジン、バリウム、デンドロトキシン等のカリウムイオンチャネル阻害剤、バトラコトキシン等のナトリウムチャネルアゴニスト、Bay K8644等のカルシウムチャネルアゴニスト、高濃度のカリウムイオン若しくは神経伝達物質、又はこれらの組合せ等が挙げられる。物理的刺激としては、例えば、温度変化等が挙げられる。
　化学的刺激を行う場合、化合物の添加量は特に限定しない。例えば、1μM以上、10μM以上、50μM以上、又は100μM以上の濃度で添加することができる。
　刺激の時間は特に限定せず、刺激の種類及び強度等の条件を勘案して適宜設定することができる。例えば、2分以上、3分以上、4分以上、5分以上、8分以上、9分以上、10分以上、20分以上、25分以上、30分以上、又は1時間以上にわたり刺激を与えることができる。
　本方法がin vivoの方法である場合、運動神経細胞を活動させる又はその活動を促進させる方法は、対象に活発に活動させる方法（例えば、対象に運動をさせる方法や脳活動を活発化させる方法等）や、化学物質等により運動神経細胞の活動を促進する方法等により行うことができる。運動神経の活動を促進する化合物としては、上記化学的刺激に使用される化合物が挙げられ、対象に投与することができる。上記化学的刺激に使用される化合物は、薬学的に許容される濃度又は方法で投与され得る。化合物刺激が生体毒性を発揮することがないように上記化合物を対象に投与することができるが、生体毒性が発現する場合には対象への上記化合物の投与をしなくてもよい。運動神経細胞の活動を促進した場合、通常、自然発火させる方法と比較して短時間で同程度の効果が見込まれる。
　標識物質及び／又は生理活性物質を含まない標的化剤を使用する場合、標識物質及び／又は生理活性物質と標的化剤とを一緒に又は別々に運動神経細胞に接触させることができる。標識物質及び／又は生理活性物質と標的化剤とを別々に接触させる場合、標識物質及び／又は生理活性物質が標的化剤と結合可能であれば、そのタイミングは特に限定しない。例えば、標識物質及び／又は生理活性物質の接触は、標的化剤の接触の前から、又は標的化剤の接触の後に行うことができる。
　各接触の方法は、上述の接触方法に準じて選択することができる。例えば、各接触について、同じ方法又は互いに異なる方法を使用することができる。
　本方法は、必要に応じて、標的化の成否を確認する工程をさらに含んでもよい。本方法で使用した標的化剤が生理活性物質を含む場合には、例えば、標的化剤の項において上述したように、生理的効果が見られた場合に標的化が成功したものと判断することができる。また、本方法で使用した標的化剤が標識物質を含む場合には、後述の可視化方法の標識物質のシグナルを検出する工程に準じて、シグナルが検出された場合に標的化が成功したものと判断することができる。
　本方法において使用する標的化剤として本発明の医薬組成物を使用する場合、本方法を状態若しくは疾患の予防若しくは治療方法として使用することができる。
　この場合、本発明は、運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体及び生理活性物質を含む標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程、及び前記標的化剤を前記運動神経細胞シナプスに送達する工程を含む、状態又は疾患の予防又は治療方法に関する。本方法によれば、医薬組成物に関して例示した各種状態又は疾患を予防又は治療することができる。本方法の接触させる工程は、好ましくは対象に標的化剤及び／又は医薬組成物を投与することを含む。
　したがって、例えば、本発明の方法は、神経機能の低下、例えば、神経の損傷による神経機能の低下、老化による神経機能の低下、若しくは疾患による神経機能の低下等を改善若しくは予防するため、又は神経機能の向上のための方法である。一実施形態において、状態又は疾患は、神経機能の低下を呈する状態若しくは疾患である。一実施形態において、状態又は疾患は、神経疾患及び神経筋疾患である。一実施形態において、標的化剤は、前記抗体と前記生理活性物質とのコンジュゲートを含む。
　この場合、対象において生理的効果を十分に発揮させる工程をさらに含むことができる。例えば、使用される生理活性物質が単独で効果を発揮することができる物質である場合には、生理的効果が発揮されるのに十分な時間だけ対象を栄養が十分に与えられた環境下に置くことにより効果を発揮させることができる。また、例えば、使用される生理活性物質が効果を発揮するために他の物質が必要である場合、その物質を追加で投与することができる。
　この工程の時間は、対象の状態、生理活性物質の種類、投与量等によって適宜決定することができる。例えば、一般に生理活性物質を投与した場合に生理的効果が発揮されるまでの期間を基準に判断してもよく、生理的効果の確認を1回又は複数回行い、生理的効果が十分に発揮されるまで継続してもよい。
＜運動神経細胞又はそのシナプスの可視化方法＞
　本発明は、運動神経細胞又はシナプスの可視化方法であって、本発明の可視化剤を運動神経細胞に接触させる工程、前記可視化剤を運動神経細胞シナプスに送達する工程、及び前記標識物質のシグナルを検出する工程を含む方法に関する。
　本方法において、接触に用いる運動神経細胞は、上記の標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法について記載した通りのものである。
　一実施形態において、本方法は、in vitroの方法である。別の実施形態において、本方法は、ex vivoの方法である。別の実施形態において、本方法は、in vivoの方法である。本方法がin vivoの方法である場合、対象はヒトであるか、又はヒトを除く哺乳動物であり得る。
　本方法において、本発明の可視化剤を運動神経細胞に接触させる工程及び可視化剤を運動神経細胞シナプスに送達する工程は、標的化剤として可視化剤を使用すること以外は、上記の標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法について記載した本発明の標的化剤を運動神経細胞に接触させる工程及び標的化剤を運動神経細胞シナプスに送達する工程の通りである。
　本方法は、必要に応じて、標識物質からシグナルを発生させる工程をさらに含んでもよい。シグナルを発生させる方法は特に限定しない。シグナルを発生させる方法及びその要否は、使用する標識物質の種類等によって判断することができる。
　例えば、標識物質が蛍光分子又は放射性標識物質の場合には、可視化剤が標的の運動神経細胞シナプスに送達するのに十分な時間、つまり、可視化剤が標的の運動神経細胞シナプスに到達し、その運動神経細胞シナプスにおいて十分にシナプス小胞のエンドサイトーシスが起こるのに十分な時間待つことにより、標的においてシグナルを発生させることができる。この時間は、可視化剤を運動神経細胞シナプスに送達する工程の時間に準じて適宜選択することができる。
　例えば、標識物質が化学発光物質の場合には、可視化剤が標的の運動神経細胞シナプスに送達されるのに十分な時間待つことに加え、シグナルの発生に使用されるその基質等の物質を添加することにより行うことができる。
　本工程は、後述のシグナルを検出する工程と同時又はその前に行うことができる。
　本方法は、検出用物質のシグナルを検出する工程をさらに含む。検出に使用する方法は特に限定せず、使用する標識物質の種類等の条件に応じて適宜選択することができる。
　標識物質が蛍光物質である場合、例えば、標識物質の励起波長の光を含む励起光を運動神経細胞に照射し、標識物質の蛍光波長を検出可能な検出器を用いて検出することができる。また、標識物質が化学発光物質である場合、例えば、標識物質の発光波長を検出可能な検出器を用いて検出することができる。標識物質が放射性標識物質である場合には、標識物質が発する放射線を検出可能な検出器を用いて検出することができる。
　標識物質のシグナルの検出は、運動神経細胞を含む試料における運動神経細胞（例えば、シナプス、細胞体等）の存在、位置若しくは量を検出することを含む。
　本発明の方法は、試料中の標識物質のシグナルを検出する工程に加えて、試料で検出された標識物質のシグナルを標識物質を含む標準試料におけるシグナル、又は予め作成した基準値と比較して存在、位置又は量を判定する工程をさらに含み得る。標準試料は、特定の状態又は疾患か否かを判断するための基準となる生物試料であれば特に限定しない。具体的には、例えば、健常個体から得られたもの、試料と同じ個体から異なる回収時期に得られたもの、又は特定の状態若しくは疾患であることがわかっている個体から得られたもの等が挙げられる。標準試料は、例えば、試料と同じ生物種、個体、組織又は細胞に由来する生物試料であってもよく、他の生物種、個体、組織又は細胞に由来する生物試料であってもよい。また、基準値は、目的の状態か否かを判断するための基準となる値であれば特に限定しない。基準値は、例えば、標準試料で一般に検出されるシグナルの強度又は数等に基づいて設定することができる。
　いずれの場合においても、比較の方法は特に限定しない。例えば、目視により、数値の大きさにより又は統計的手法により行うことができる。
＜その他の発明＞
　本発明は、対象に物質を投与する方法を提供する。物質は、抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体と当該物質とのコンジュゲートの形態である。これにより、対象の細胞、例えば運動神経細胞に前記物質を送達することができる。前記物質が生理活性物質である場合には、当該生理活性物質を運動神経細胞等の細胞に送達することができる。また、前記物質が標識物質である場合には、当該標識物質の送達部位（例えば運動神経細胞又はそのシナプス）を観察することに用いることができる。本発明はまた、この方法に用いるための当該抗体と当該物質とのコンジュゲート、又は当該コンジュゲートを含む組成物を提供する。この場合、本発明は、運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体、又は上記抗体と標識物質及び／若しくは生理活性物質とのコンジュゲートを含む、運動神経細胞又はそのシナプスへの標的化用組成物に関する。
　本発明は、対象の運動神経細胞を可視化する方法であって、当該対象に抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体と標識物質とのコンジュゲートの有効量を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、この方法に用いるための当該抗体と当該標識物質とのコンジュゲート、又は当該コンジュゲートを含む組成物を提供する。
　本発明は、対象の運動神経細胞に生理活性物質を送達する方法であって、当該対象に抗SYT2 N末端抗体等の小胞内ドメイン抗体と当該生理活性物質とのコンジュゲートの有効量を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、この方法に用いるための当該抗体と当該生理活性物質とのコンジュゲート、又は当該コンジュゲートを含む組成物を提供する。
　本発明は、上記方法のいずれかにおいて使用するための、上記小胞内ドメイン抗体又は上記小胞内ドメイン抗体と上記標識物質及び／又は生理活性物質とのコンジュゲートを提供する。例えば、本発明は、状態又は疾患の予防又は治療方法において使用するための、上記小胞内ドメイン抗体又は上記小胞内ドメイン抗体と上記生理活性物質とのコンジュゲートに関する。また、例えば、本発明は、運動神経細胞又はそのシナプスへの標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法において使用するための、上記小胞内ドメイン抗体又は上記小胞内ドメイン抗体と上記標識物質及び／又は生理活性物質とのコンジュゲートに関する。
　本発明は、上記方法のいずれかに用いるための医薬の製造において使用するための、上記抗体又は上記抗体と上記物質とのコンジュゲートを提供する。
　また、本発明は、上記小胞内ドメイン抗体又は上記小胞内ドメイン抗体と生理活性物質とのコンジュゲートの、上記抗体及び生理活性物質を含む医薬の製造における使用を提供する。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：ヒト運動神経細胞シナプスへのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　LRRTM2の細胞外ドメインで被覆されたマイクロビーズを用いて、シナプトタグミン2抗体がヒト運動神経細胞シナプスに送達されるか否か、及びその条件を調べた。
１．細胞の培養
　Dead Cell Removalキット（Veritas社）を用い、同キットのプロトコルに従ってヒトiPS誘導運動神経細胞（40HU-005-2M；ixcells biotechnologies社）を解凍した。解凍後の細胞を96ウェルプレート（V底）に2×104細胞/ウェルの密度で播種し、運動神経細胞培養培地（Motor Neuron Maintenance Medium；ixcells biotechnologies社）中で1週間培養し、ニューロスフィアを作製した。作製されたニューロスフィアは、大きさと真円度を基準に選別し、この基準を満たしたものを以下の実験に用いた。
　96ウェルEZVIEW（登録商標）カルチャープレートLB（AGCテクノグラス株式会社）をポリ-D-リシン及びGeltrex（登録商標）Matrix（Thermo Fisher Scientific社）でコーティングした後、選別されたニューロスフィアをプレートに播種し、20日間培養した。培地としては、まず、上述の運動神経細胞培養培地を使用し、培養2日目に同培地での培地交換を行った。その後は、ニューロン培地（Neurobasal plus medium（B27 plus supplement（Thermo Fisher Scientific社）、20ng/mL BDNF、20ng/mL GDNF及びペニシリン・ストレプトマイシンを添加））を用いて、週3回培地交換を行った。いずれの培地交換も50μL/ウェルで行った。
２．LRRTM2ビーズの調製
　LRRTM2の細胞外ドメインで被覆されたマイクロビーズ（活性ビーズ）を、ＷＯ２０２１／００６０７５に開示されるようにして調製した。
　具体的には、ストレプトアビジン被覆マイクロビーズ（Streptavidin Coated Microspheres; Bangs Laboratories, Inc；ポリスチレン製、平均直径9.94μm）を洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.01% ウシ血清アルブミン（BSA）、0.05% TritonX-100）で2回洗浄し、ビオチン化抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体（Sigma-Aldrich社；マウスモノクローナル）と結合緩衝液（PBS、0.01% BSA）中で反応させ、ストレプトアビジン被覆マイクロビーズにビオチン化抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体を固相化した。得られたビーズを洗浄緩衝液で3回洗浄した（抗ヒトIgGFc抗体ビーズ）。
　次に抗ヒトIgGFc抗体ビーズを結合緩衝液に懸濁し、そこにヒトLRRTM2の細胞外ドメインとヒトIgGのFc部分との融合タンパク質（LRRTM2-Fc；R&D systems社）を添加し、LRRTM2-Fcを抗ヒトIgGFc抗体ビーズに固相化した。得られたビーズを洗浄緩衝液で洗浄し、結合緩衝液に懸濁した（LRRTM2ビーズ懸濁液）。
３．シナプス前部の誘導（図１）
　20日間の培養を経たプレートに0.1μg/ウェルになるようにLRRTM2ビーズを播種し、48時間、37℃で培養し、シナプス前部の形成を誘導した。
４．抗体液の調製
　抗体としては、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドに結合可能であるウサギ抗SYT2 N末端抗体（Polyclonal rabbit purified antibody SYT2 lumenal domain；カタログ番号105 223；Synaptic Systems社）、又は対照として、正常ウサギIgG抗体（Normal Rabbit IgG；カタログ番号AB-105-C；R&D Systems社）を用いた。
　ニューロン培地を37℃で30分間温めた後、培地に、終濃度が1μg/mL又は10μg/mLとなるように抗体を添加して混和した。この粗製抗体液を200gで3分間、室温で遠心し、その上清を抗体液として回収した。
５．抗体の導入
　シナプス前部を形成させたプレートにて、100μLの抗体液を用いて培地交換を行うことにより、抗体を導入した。
６．運動神経細胞の自発的活動
　抗体の導入後、37℃で24時間培養することにより、運動神経細胞の自発的活動を促した。
７．細胞の固定
　培養の後、ニューロン培地を用いて洗浄した後、2%パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で固定した。
８．免疫細胞化学染色
　添加した抗体を一次抗体として、免疫細胞化学染色による染色を行った。固定後の細胞において、界面活性剤による細胞膜の透過処理及びブロッキングをした後、追加の一次抗体としてマウス抗βIIIチューブリン（Tuj1）抗体（カタログ番号801202；Biolegend社）を用いた一次抗体反応を行った。その後、各一次抗体に対する二次抗体反応を行い、蛍光画像を取得した。ブロッキングは、ブロッキング緩衝液（PBS＋2%正常ヤギ血清＋1% BSA＋1%ウシ胎児血清＋0.02% TritonX-100）を用いて行った。
　使用した二次抗体は以下の通り：
Alexa 488標識抗ウサギ抗体（カタログ番号A32731；Thermo Fisher Scientific社）；
Alexa 555標識抗マウス抗体（カタログ番号A32727；Thermo Fisher Scientific社）。
　蛍光画像の取得は、LAS Xソフトウェア（Leica社）を搭載した倒立ライブセル（ＤＭｉ８）顕微鏡蛍光顕微鏡（Leica社）を用いて、以下の励起波長、検出波長、露光時間及び検出閾値で行った。ガンマ補正値はいずれも1を用いた。
励起波長及び検出波長：
Alexa 488　　最大励起　490nm；最大検出　525nm；実際の検出　512nm；
Alexa 555　　最大励起　555nm；最大検出　580nm；実際の検出　595nm。
露光時間及び検出閾値：
Alexa 488　　露光時間　200ms；検出閾値　150～1500；
Alexa 555　　露光時間　50ms；検出閾値　100～3500。
　結果を図２－１及び３に示す。図２－１及び３は、それぞれ、抗体濃度が1μg/mL及び10μg/mLの場合の免疫細胞化学染色像を示す。
　抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照においては、いずれの濃度条件においてもシグナルは観察されなかった（図２－１Ａ及び図３Ａ）。一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、いずれの濃度条件においてもLRRTM2ビーズにおいて強いシグナルが観察された（図２－１Ｂ及び図３Ｂ）。LRRTM2ビーズ上には、シナプス後部は存在せず、運動神経細胞シナプス前部のみが存在する。このことから、SYT2 N末端を標的とすることにより、抗体がLRRTM2ビーズ表面に送達されることがわかった。また、シナプス小胞のエンドサイトーシスには十分な時間が経過していることから、導入された抗SYT2 N末端抗体は運動神経細胞シナプス小胞に取り込まれていると考えられる。
　また、1μg/mLの濃度で抗SYT2 N末端抗体を投与した実験におけるLRRTM2ビーズの拡大図を図２－２に示す。Tuj1で示される神経軸索が密集していないLRRTM2ビーズ（図２－２Ａ）では、LRRTM2ビーズ表面に神経軸索末端（図中のTuj1の強いシグナルの点）が観察されない。このことから、このLRRTM2ビーズ表面においてはシナプス形成がなされていないと考えられる。一方、神経軸索が密集しているLRRTM2ビーズ（図２－２Ｂ）では、LRRTM2ビーズ表面に神経軸索末端が観察される。このことから、このLRRTM2ビーズ表面においてはシナプス形成がなされていると考えられる。図２－２ＡのLRRTM2ビーズ表面には抗SYT2 N末端抗体のシグナルが検出されず、図２－２ＢのLRRTM2ビーズ表面には同シグナルが観察されることから、SYT2 N末端を標的とすることにより、運動神経細胞シナプス前部が存在する場合のみ、LRRTM2ビーズ表面に抗体が送達されることがわかった。
　さらに、抗体濃度が1μg/mLの場合（図２－１Ｂ）と比較して10μg/mLの場合（図３Ｂ）の方がそのシグナル強度は高かったことから、添加する抗体の濃度依存的にシナプス前部における抗体量が増加することがわかった。
　これらの結果から、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに対する抗体が、運動神経細胞のシナプス前部に送達され、その量は抗体濃度に依存することがわかった。
＜実施例２：細胞の刺激によるヒト運動神経細胞シナプスへのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　神経細胞の刺激によってシナプトタグミン2抗体がヒト運動神経細胞シナプスに送達されるかどうかを調べた。
　細胞の培養、LRRTM2ビーズの調製及びシナプス前部の誘導は、実施例１と同様に行った。
　神経細胞の刺激のために、4-アミノピリジンを含む抗体液を用いた。抗体液は以下の方法で調製した。
　ニューロン培地を37℃で30分間温めた後、培地に、終濃度が100μMとなるように4-アミノピリジン（Sigma Aldrich社）を添加して混和した。さらに、抗体を終濃度が2μg/mLとなるように添加して混和した。この粗製抗体液を200gで3分間、室温で遠心し、その上清を抗体液として回収した。
　シナプスを形成させたプレートにて、100μLの抗体液を用いて培地交換を行うことにより、抗体及び4-アミノピリジンを導入した。
　抗体及び4-アミノピリジンの導入後、室温で10分間又は30分間培養することにより、運動神経細胞を刺激した。
　その後の細胞の固定及び免疫細胞化学染色は実施例１と同様に行った。
　温度条件に関する実験は、温度条件以外は上記と同様に行った。
　37℃の温度条件については、抗体及び4-アミノピリジンの導入後、37℃で30分間培養することにより、運動神経細胞を刺激した。
　4℃の温度条件については、抗体及び4-アミノピリジンの導入後、4℃で30分間培養することにより、運動神経細胞を刺激した。
　一部の運動神経細胞に関しては、抗体及び4-アミノピリジンの導入後、4℃で30分間培養した後に、温度を37℃に上げて30分間培養することにより、運動神経細胞を刺激した。
　結果を図４及び５に示す。図４及び５は、それぞれ、反応時間が10分間及び30分間の場合の免疫細胞化学染色像を示す。
　抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照においては、いずれの時間条件においても、シグナルは観察されなかった（図４Ａ及び図５Ａ）。一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、いずれの時間条件においてもLRRTM2ビーズにおいてシグナルが観察された（図４Ｂ及び図５Ｂ）。このことから、運動神経細胞の自発活動によってのみならず、化学物質による運動神経細胞の刺激によっても抗SYT2 N末端抗体がシナプス前部に送達されることがわかった。
　また、反応時間が10分間の場合（図４Ｂ）と比較して30分間の場合（図５Ｂ）の方がそのシグナル強度はやや高かったことから、刺激を与える時間が長くなるほどシナプス前部における抗体の量が増加することがわかった。また、同様の実験を、細胞の活動が顕著に停止する低温条件（4℃）において行ったところ、LRRTM2ビーズにおける抗SYT2 N末端抗体のシグナルは37℃での実験に比べて顕著に低下した。さらに、このシグナルの低下は、温度を4℃から37℃に戻すことにより回復した。
　これらの結果から、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに対する抗体が、神経細胞の活動依存的に運動神経細胞のシナプス前部に送達され、その量は反応時間に依存することがわかった。
＜実施例３：静脈注射によるマウスの運動神経細胞シナプスへのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　静脈注射によって生体内に導入したシナプトタグミン2抗体が運動神経細胞シナプスに送達されるかどうかを調べた。
　導入する抗体は実施例１と同じものを用いた。
　抗体液は、終濃度が1mg/mLとなるように抗体をPBSに添加して混和したものを用いた。
　抗体液の投与は、野生型マウスに対し、5mg/kgの用量で尾静脈注射により行った。
　投与後12時間後、24時間後又は72時間後にマウスを屠殺し、腓腹筋を採取して固定した。
　固定した腓腹筋は組織包埋剤と共に冷凍し、この冷凍組織ブロックから、クライオスタッドを用いて、厚さ10μmの切片を作製した。
　投与した抗体を一次抗体として、免疫組織化学染色による染色を行った。作製した組織切片において、ブロッキングをした後、追加の一次抗体として、α-ブンガロトキシン抗体（α-BgtX抗体 Alexa Fluor 594 conjugate；カタログ番号B13423；Thermo Fisher Scientific社）及びシナプシン１抗体（SYN1抗体；カタログ番号106 308；Synaptic Systems社）を用いた一次抗体反応を行った。その後、各一次抗体に対する二次抗体反応を行い、蛍光画像を取得した。ブロッキングは、ブロッキング緩衝液（PBS＋2%正常ヤギ血清＋1% BSA＋1%ウシ胎児血清＋0.02% TritonX-100）を用いて行った。
　二次抗体としては以下の抗体を使用した：
Alexa 488標識抗ウサギ抗体（カタログ番号A32731；Thermo Fisher Scientific社）；
Alexa 647標識抗ギニアピッグ抗体（カタログ番号A21450；Thermo Fisher Scientific社）。
　蛍光画像の取得は基本的には実施例１と同様に行った。Alexa 647のシグナルの検出には、最大励起波長650nm、最大検出波長665nm、実際の検出波長705nmを用いた。Alexa 594のシグナルの検出には、最大励起波長590nm、最大検出波長617nm、実際の検出波長595nmを用いた。各シグナルの検出には、以下の露光時間及び検出閾値を用いた。ガンマ補正値はいずれも1を用いた。
露光時間及び検出閾値：
Alexa 488　　露光時間　150ms；検出閾値　130～1500；
Alexa 594　　露光時間　100ms；検出閾値　100～2500；
Alexa 647　　露光時間　100ms；検出閾値　130～1000。
　結果を図６及び７に示す。図６及び７は、それぞれ、投与後12時間後及び72時間後の免疫組織化学染色像を示す。ここで、α-BgtXは筋細胞膜上のアセチルコリン受容体のマーカーであり、SYN1はシナプス前部のマーカーである。
　抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照においては、いずれの時間条件においても、α-BgtX及びSYN1のシグナルが観察される神経筋接合部において、正常ウサギIgG抗体のシグナルは観察されなかった（図６Ａ及び図７Ａ）。
　一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、いずれの時間条件においても神経筋接合部において抗SYT2 N末端抗体のシグナルが観察された（図６Ｂ及び図７Ｂ）。
　シナプトタグミン2は運動神経細胞シナプス前部に発現することが知られている。このことから、静脈注射によって投与された抗SYT2 N末端抗体が、in vivoにおいて運動神経細胞シナプス前部に送達されることがわかった。また、シナプス小胞のエンドサイトーシスには十分な時間が経過していることから、投与された抗SYT2 N末端抗体は運動神経細胞シナプス小胞に取り込まれていると考えられる。
　また、抗体の投与後12時間の場合（図６Ｂ）と比較して72時間の場合（図７Ｂ）の方がそのシグナル強度はやや高かったことから、抗体への曝露の時間が長くなるほどシナプス前部における抗体の量が増加することがわかった。
　さらに、抗体の投与後72時間においても、マウス個体及び自律神経の投射先である肝臓においては抗SYT2 N末端抗体のシグナルは検出されず、異常も見られなかった。
　使用した抗SYT2 N末端抗体は、完全なIgG抗体であるため、血液脳関門を通過しない。また、シナプトタグミン2は感覚神経細胞には発現しないことが知られている。これに加え、肝臓においてシグナルが見られなかったことから、シナプトタグミン2の小胞内ドメインに対する抗体が、静脈注射によって運動神経細胞シナプス前部に送達されることがわかり、抗体の投与により大きな副作用が見られないこと、及び抗体の量は抗体への曝露時間に依存することがわかった。
＜実施例４：腹腔内注射によるマウスの運動神経細胞シナプスへのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　腹腔内注射によって生体内に導入したシナプトタグミン2抗体が運動神経細胞シナプスに送達されるかどうかを調べた。
　投与を10 mg/kgの用量で腹腔内注射により行った以外は実施例３と同様に実験を行った。
　結果を図８及び９に示す。図８及び９は、それぞれ、投与後12時間後及び72時間後の免疫組織化学染色像を示す。ここで、α-BgtXは筋細胞膜上のアセチルコリン受容体のマーカーであり、SYN1はシナプス前部のマーカーである。
　抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照においては、いずれの時間条件においても、α-BgtX及びSYN1のシグナルが観察される神経筋接合部において、正常ウサギIgG抗体のシグナルは観察されなかった（図８Ａ及び図９Ａ）。
　一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、いずれの時間条件においても神経筋接合部において抗SYT2 N末端抗体のシグナルが観察された（図８Ｂ及び図９Ｂ）。また、抗体の投与後にマウス個体及び自律神経の投射先である肝臓には異常は見られなかった。このことから、尾静脈注射によって抗体を投与した場合と同様に、腹腔内注射によっても抗SYT2 N末端抗体が運動神経細胞シナプス前部に送達されることがわかった。
＜実施例５：静脈注射によるマウスの運動神経細胞シナプス小胞へのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　静脈注射によって生体内に導入したシナプトタグミン2抗体が運動神経細胞のシナプス小胞に送達されるかどうかを調べた。
　導入する抗体は実施例１と同じものを用いた。
　抗体液は、終濃度が1mg/mLとなるように抗体をPBSに添加して混和したものを用いた。
　抗体液の投与は、野生型マウスに対し、5mg/kgの用量で尾静脈注射により行った。
　投与後72時間後にマウスを屠殺し、腓腹筋を採取して固定した。
　固定した腓腹筋は組織包埋剤と共に冷凍し、この冷凍組織ブロックから厚さ10μmの切片を作製した。切片をブロッキングした後、ナノゴールド標識抗ウサギ抗体（カタログ番号A-24922；Thermo Fisher Scientific社）を反応させた。
　切片を洗浄した後、2.5%グルタルアルデヒドを用いて固定し、R-gent Se-EM kit（カタログ番号500.033；Aurion社）とHQ-silver kit（カタログ番号2012；Nanoprobes社）を用いてナノゴールドのシグナルを増強した。続いて、切片を1%OsO4を用いて再度固定し、脱水処理した上で、エポンに包埋した。包埋された切片をウルトラミクロトーム（カタログ番号Leica EM UC7；Leica Microsystems社）を用いて超薄切片（厚さ70nm）を作製した。切片は、酢酸ウラン及びクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（カタログ番号JEM-1400plus、JEOL社）を用いて観察した。
　結果を図１０及び１１に示す。図１０及び１１は、運動神経細胞の軸索末端（図中、白色実線で囲まれた領域）と腓腹筋細胞（図中、黒色破線で囲まれた領域）の透過型電子顕微鏡像を示す。図中の黒点は抗体のナノゴールドの位置を示すシグナル（銀により増幅されたシグナル）を示す。
　抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照においては、運動神経細胞の神経軸索末端には、腓腹筋細胞及びそれ以外の領域と同様に、抗体のシグナルはまばらにしか観察されなかった（図１０Ａ）。ここで見られるシグナルは、アーティファクトを含んだバックグラウンドと考えられる。
　一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、運動神経細胞の神経軸索末端には、腓腹筋細胞及びそれ以外の領域と比較して、抗体のシグナルが顕著に観察された（図１０Ｂ）。このため、抗SYT2 N末端抗体を用いた場合には、抗体が運動神経細胞の神経軸索末端に取り込まれることがわかった。
　しかし、この拡大率で見られる細胞内の膜構造は、ミトコンドリア（矢尻）及び腓腹筋細胞のJunctional fold（ひだ状の構造）が主であり、この画像のみからは、シナプス小胞に抗体が取り込まれているかまではわからなかった。
　そこで、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合のサンプルをさらに拡大して観察した（図１１）。すると、運動神経細胞の神経軸索末端中のシナプス小胞（図１１Ｂ中ａ及びｂ）に抗体が取り込まれている（図１１Ｂ中ｂ）ことがわかった。このことから、生体に抗体を投与した場合においても、抗SYT2 N末端抗体が運動神経細胞シナプス前部の細胞内のシナプス小胞内に送達されることがわかった。
＜実施例６：静脈注射によるマウスの運動神経細胞へのシナプトタグミン2抗体の送達＞
　静脈注射によって生体内に導入したシナプトタグミン2抗体が運動神経細胞内に送達されるかどうか調べた。
　導入する抗体は実施例１と同じものを用いた。
　抗体液は、終濃度が1mg/mLとなるように抗体をPBSに添加して混和したものを用いた。
　抗体液の投与は、野生型マウスに対し、5mg/kgの用量で尾静脈注射により行った。
　投与72時間後にマウスを屠殺し、脊髄を採取して固定した。
　固定した脊髄は組織包埋剤と共に冷凍し、この冷凍組織ブロックから、クライオスタッドを用いて厚さ10μmの切片を作製した。
　投与した抗体を一次抗体として、免疫組織化学染色による染色を行った。作製した組織切片において、ブロッキングをした後、追加の一次抗体として、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体（α-ChAT抗体；カタログ番号 #NBP1-30052；Novus BioLogicals社）を用いた一次抗体反応を行った。その後、各一次抗体に対する二次抗体反応を行い、蛍光画像を取得した。ブロッキングは、ブロッキング緩衝液（PBS＋2%正常ロバ血清＋1% BSA＋1%ウシ胎児血清＋0.02% TritonX-100）を用いて行った。
　二次抗体としては、実施例３と同じものを使用し、蛍光画像の取得は実施例３と同様に行った。
　結果を図１２～１４に示す。図１２は拡大率10倍（図１２）又は拡大率40倍（図１３及び１４）の対物レンズを用いて観察した場合の免疫組織化学染色像を示す。ここで、α-ChATは運動神経細胞中のコリンアセチルトランスフェラーゼのマーカーである。
　10倍の対物レンズを用いて脊髄前角（図１２中、破線の左側）を観察したところ、α-ChATのシグナルが観察される運動神経細胞のほとんどの細胞体において抗SYT2 N末端抗体のシグナルが確認された（図１２：矢尻）。
　さらに拡大率を上げ、40倍の対物レンズを用いて観察したところ、抗体として正常ウサギIgG抗体を使用した対照では、α-ChATのシグナルが観察される運動神経細胞の細胞体において、正常ウサギIgG抗体のシグナルは観察されなかった（図１３）。
　一方、抗体として抗SYT2 N末端抗体を用いた場合、運動神経細胞の細胞体においても抗SYT2 N末端抗体のシグナルが観察された（図１４：矢尻）。
　このことから、静脈投与された抗SYT2 N末端抗体は、神経筋接合部に存在するシナプスにおいてシナプス小胞に取り込まれた後、軸索中を逆行輸送されて細胞体まで送達されることが示唆された。
＜実施例７：静脈注射により送達されたシナプトタグミン2抗体の経時的な観察＞
　静脈注射によって生体内に導入され、運動神経細胞内に送達されたシナプトタグミン2抗体のシグナルを経時的に観察した。
　導入する抗体は実施例１と同じものを用いた。
　抗体液は、終濃度が1mg/mLとなるように抗体をPBSに添加して混和したものを用いた。
　脊髄の採取を投与後のは、野生型マウスに対し、5mg/kgの用量で尾静脈注射により行った。
　脊髄の採取を投与の6時間後、24時間後、72時間後、120時間後、168時間後、240時間後に行った以外は実施例７と同様に行った。
　結果を図１５及び１６に示す。図１５は投与の6～72時間後に採取した場合の免疫組織化学染色像を示し、図１６は120～240時間後に採取した場合の免疫組織化学染色像を示す。
　抗SYT2 N末端抗体のシグナルは投与後6時間のサンプルにおいても観察され（図１５）、その後も、投与後240時間に至るまで、観察したいずれの時点のサンプルにおいても抗SYT2 N末端抗体のシグナルは観察された（図１５及び１６）。
　また、シグナルは概して経時的に強くなる傾向が見られた。このことから、抗SYT2 N末端抗体は、その投与の6時間後までには細胞体にまで送達され、その後も、時間と共に集積していくと推定される。
＜実施例８：シナプトタグミン2抗体を用いた薬剤の送達による薬理効果の検証＞
　運動神経細胞内に送達されることが確認されたシナプトタグミン2抗体を用いて運動神経細胞内に薬剤を送達した場合、薬剤に基づく薬理効果が観察されるかどうか調べた。
１．運動神経細胞シナプス前部の誘導
　実験はLRRTM2の細胞外ドメインで被覆されたマイクロビーズを用いてシナプス形成が誘導されたヒト運動神経細胞を用いて行った。細胞の培養、LRRTM2ビーズの調製及びシナプス前部の誘導は実施例１に記載の通りに行った。
２．コンジュゲートの作製
　薬剤としては微小管重合阻害剤であるモノメチルアウリスタチンE（MMAE：カタログ番号 #HY-15575；MedChemExpress）を用いた。抗SYT2 N末端抗体及び対照の正常ウサギ抗体は実施例１で使用したものを用いた。MMAEと抗体のコンジュゲートをMagicLinkTM kit（broadpharm社）を用いて作製した。コンジュゲートの作製はメーカーのプロトコルに従って行った。
３．コンジュゲート溶液の調製
　ニューロン培地を37℃で30分間温めた後、培地に、終濃度が100μMとなるように4-アミノピリジン（Sigma Aldrich社）を添加して混和した。さらに、コンジュゲートを終濃度が1μg/mLとなるように添加して混和した。この粗製コンジュゲート溶液を200gで3分間、室温で遠心し、その上清をコンジュゲート溶液として回収した。
　また、さらなる対照群として、一部のサンプルではコンジュゲートでなくMMAE単体を導入した（サンプル数：13）。この場合、コンジュゲートの代わりに同濃度のMMAEを用いて上述の通りMMAE溶液を調製した。
４．コンジュゲートの導入
　シナプス前部を形成させたプレートにて、100μLのコンジュゲート溶液又はMMAE溶液を用いて培地交換を行い、37℃で30分培養することにより、コンジュゲートを導入した。
５．軸索の伸長反応
　導入の後に溶液を回収て洗浄し、コンジュゲート及びMMAEを含まないニューロン培地に培地交換した。その後、さらに24時間培養することにより、軸索を伸長させた。
６．細胞の固定、染色及び観察
　実施例１と同様に細胞を固定し、実施例１と同様にマウス抗βIIIチューブリン（Tuj1）抗体を用いた一次抗体反応及びAlexa 555標識抗マウス抗体を用いた二次抗体反応を行った。本実施例では、抗SYT2 N末端抗体の染色は行わなかった。蛍光画像の取得は実施例１の通りに行った。サンプル数は以下の通り：MMAE単独導入群、13サンプル；対照抗体群、17サンプル；SYT2抗体群、27サンプル。
７．軸索量の解析
　軸索量は、取得した蛍光画像におけるTuj1シグナルの輝度の合計値（＝（ピクセルあたりの蛍光強度）×（ピクセル数））として取得した。対照の正常ウサギ抗体とMMAEのコンジュゲートを使用した場合の結果を100%として標準化した値を相対軸索量として算出した。輝度の取得はLAS Xソフトウェア（Leica社）を用いて行った。
８．統計解析
　統計解析は、GraphPad Prism9（GraphPad Software社）を使用してt検定により行った。有意水準としてはp<0.05を用いた。
　結果を図１７～１９に示す。図１７及び１８は、対照の正常ウサギ抗体とMMAEのコンジュゲートを使用した対照抗体群（図１７）、及び抗SYT2 N末端抗体とのコンジュゲートを使用したSYT2抗体群（図１８）の軸索の様子を示す免疫細胞化学染色像である。また、図１９はその結果を定量的に示したグラフである。
　いずれの実験条件においても、ニューロスフィアから軸索が伸長し、シナプス前部も正常に誘導されていた（図１７Ａ及び１８Ａ）。
　MMAEは、軸索の伸長及び維持に重要な細胞骨格である微小管の重合を阻害する。そのため、MMAEの効果が強い程、軸索の伸長及び維持が阻害され、軸索量が減少すると予想される。
　対照抗体群では、ニューロスフィアから遠い遠位部でも多くの太い軸索と、膨らみとして観察されるシナプス前部が見られた（図１７Ｂ）。また、ニューロスフィアに比較的近い近位部では、軸索が互いに平行に近い状態で整列して走行している様子が観察された（図１７Ｃ）。
　一方、SYT2抗体群では、ニューロスフィアから遠い遠位部には少数の細い軸索のみが見られ、シナプス前部の形成も乏しかった（図１８Ｂ）。また、ニューロスフィアに比較的近い近位部では、軸索の走行が、対照抗体群ほどは整列しておらず、軸索の走行が乱れている様子が観察された（図１８Ｃ）。
　定量した結果からも観察結果が裏付けられた。対照抗体群（図１９中、「Cont. IgG-MMAE」）と比較して、SYT2抗体群（図１９中、「α-SYT2 IgG-MMAE」）では軸索量は有意に減少し、相対軸索量は約87.15%となった。また、SYT2抗体群の結果は、MMAEを単独で導入した単独導入群（図１９中、「MMAE」）と比較しても有意に減少し、軸索量は単独導入群の約82.7%であった。なお、単独導入群と対照抗体群では有意な差は見られなかった。
＜実施例９：薬理効果と神経活動の関係の確認＞
　神経細胞におけるシナプス小胞の取り込み機能を阻害することにより、実施例９で観察された抗SYT2 N末端抗体を用いた際の薬理効果が神経活動によるシナプス小胞の取り込みに依存していることを確認した。
　実験は抗SYT2 N末端抗体とMMAEとのコンジュゲートのみを用いて行った。神経細胞におけるシナプス小胞の取り込みを阻害する群として、シナプス形成を阻害した実験群（シナプス不形成群）とエンドサイトーシスを阻害した実験群（エンドサイトーシス阻害群）を用いた。シナプス不形成群及びエンドサイトーシス阻害群において運動神経細胞に以下の処理を行った以外は実施例９と同様に実験を行った。
　シナプス不形成群では、シナプス前部の誘導に使用するビーズとして、LRRTM2の細胞外ドメインで被覆されていないマイクロビーズを用いて実験を行った。
　エンドサイトーシス阻害群では、コンジュゲート導入時の培養を4℃で30分の条件で行った。
　サンプル数は各群3サンプルずつで行った。
　本実施例では、相対軸索量として、シナプス不形成群の軸索量を100%として標準化した値を用いた。
　結果を図２０～２３に示す。図２０～２２は、実施例９と同じ条件で行った正常発火群（図２０）、シナプス前部の誘導を行わなかったシナプス不形成群（図２１）及び低温処理によりエンドサイトーシスを阻害したエンドサイトーシス阻害群（図２２）の軸索の様子を示す免疫細胞化学染色像である。また、図２３はその結果を定量的に示したグラフである。
　いずれの実験条件においても、ニューロスフィアから軸索が伸長していた（図２０～２２）。
　正常発火群では、図１８に示す結果と同様に遠位部の軸索が少なく、MMAEの効果により軸索の伸長及び維持が阻害されていた（図２０）。これに対し、シナプス不形成群（図２１）及びエンドサイトーシス阻害群（図２２）のいずれにおいても、軸索は遠位部まで伸長しており、MMAEの効果が限定的であることが観察された。
　定量した結果からも観察結果が裏付けられた（図２３）。正常発火群では、シナプス不形成群と比較して軸索量が有意に減少し、相対軸索量は81.8%であった。また、正常発火群の結果は、エンドサイトーシス阻害群と比較しても有意に減少しており、軸索量はエンドサイトーシス阻害群の約80.6%であった。なお、シナプス不形成群とエンドサイトーシス阻害群では有意な差は見られなかった。
　これらの結果から、シナプス形成の阻害又はエンドサイトーシスの阻害等のシナプス小胞の取り込み機能を阻害により、抗SYT2 N末端抗体とMMAEのコンジュゲートによる薬理効果はほぼ完全に抑制されることがわかった。したがって、抗SYT2 N末端抗体とMMAEのコンジュゲートによる薬理効果は神経活動、特にシナプスにおけるエンドサイトーシスにより媒介されることが示唆された。
＜実施例１０：その他の膜タンパク質を標的とした場合の薬理効果の検証＞
　抗SYT2 N末端抗体を用いた場合と同様に、シナプス小胞に存在する他の膜タンパク質に対する抗体も薬剤の送達に利用可能かどうか調べた。
　実験は、使用する抗体以外は実施例９と同様に行った。使用した抗体は以下の通りである。
　抗SYT2 N末端抗体：Polyclonal rabbit purified antibody SYT2 lumenal domain（カタログ番号105 223；Synaptic Systems社）；サンプル数：27；
　抗SYP抗体：Anti-Synaptophysin Antibody Major synaptic vesicle protein p38, SYP（カタログ番号ANR-013；alomone labs社；エピトープ：配列番号２１）；サンプル数：20；
　抗SYNGR1抗体：Synaptogyrin 1 Antibody - BSA Free（カタログ番号NBP1-77371；Novus Biologicals社；エピトープ：配列番号１７）；サンプル数：20；
　抗SYT1抗体：Synaptotagmin1 antibody luminal domain（カタログ番号105 103；Synaptic Systems社；エピトープ：配列番号２４）；サンプル数：15；
　抗SV2A抗体：SV2A Polyclonal Antibody（カタログ番号BS-2407R；Bioss antibodies社；エピトープ：配列番号１３）；サンプル数：14
　本実施例では、対照の正常ウサギ抗体とMMAEのコンジュゲートを使用した場合の結果を100%として標準化した値を相対軸索量として算出した。
　結果を図２４に示す。図２４は各抗体を用いたコンジュゲートを導入した場合の相対軸索量を示す。
　抗SYT2 N末端抗体以外のシナプス小胞に存在する膜タンパク質を使用した場合であっても、軸索量は有意に減少し、相対軸索量は87.2%～90.7%となった（図２４）。使用する抗体の種類によっては、相対軸索量に有意な差は見られなかった。
　したがって、標的とする膜タンパク質の種類によらず、シナプス小胞に存在する膜タンパク質に対する抗体を使用することによって薬剤等を運動神経細胞に送達できることが確認された。また、それにより、標的細胞に対してその薬剤等に基づく効果を付与できることが示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 　運動神経細胞のシナプス小胞に存在する膜タンパク質の小胞内ドメインに結合可能な抗体を含む、運動神経細胞への標的化剤。
  2. 　標識物質及び／又は生理活性物質をさらに含む、請求項１に記載の標的化剤。
  3. 　前記抗体と、前記標識物質及び／又は前記生理活性物質とのコンジュゲートを含む、請求項２に記載の標的化剤。
  4. 　前記膜タンパク質が、ヒト由来のタンパク質である、請求項１に記載の標的化剤。
  5. 　前記膜タンパク質が、シナプトタグミン2、シナプス小胞糖タンパク質2A、シナプトジャイリン1、シナプトフィジン及びシナプトタグミン1からなる群から選択されるいずれか一のタンパク質を含む、請求項１に記載の標的化剤。
  6. 　前記小胞内ドメインが、4個以上のアミノ酸を含むドメインである、請求項１に記載の標的化剤。
  7. 　前記小胞内ドメインが、配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列；配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列；又は配列番号３、７～１２、１５、１６、１９、２０及び２３からなる群から選択されるいずれか一で示すアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の標的化剤。
  8. 　前記標識物質が蛍光分子である、請求項２に記載の標的化剤。
  9. 　運動神経細胞可視化剤である、前記標識物質を含む請求項２に記載の標的化剤。
  10. 　前記生理活性物質が、シナプス形成促進剤、シナプス維持剤、筋肉増強剤及び神経細胞機能改変剤からなる群から選択される一以上である、請求項２に記載の標的化剤。
  11. 　エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる、請求項１に記載の標的化剤。
  12. 　請求項２に記載の標的化剤を含む医薬組成物。
  13. 　請求項２～１１のいずれか一項に記載の標的化剤及び／又は請求項１２に記載の医薬組成物を運動神経細胞に接触させる工程、及び前記標的化剤及び／又は前記医薬組成物を前記運動神経細胞のシナプスに送達する工程を含む、運動神経細胞への前記標識物質及び／又は生理活性物質の標的化方法。
  14. 　請求項９に記載の運動神経細胞可視化剤を運動神経細胞に接触させる工程、前記運動神経細胞可視化剤を前記運動神経細胞のシナプスに送達する工程、及び前記標識物質のシグナルを検出する工程を含む、運動神経細胞可視化方法。
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