CN102203622A - 突触小泡循环的测定和系统 - Google Patents

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Abstract

部分而言，本发明提供用于分析突触小泡循环的方面的平台。根据其他方面，本发明提供神经元细胞培养平台和用于分析突触小泡循环的方面的平台。根据其他方面，本发明提供测量多个细胞中突触小泡循环的方面的方法。根据其他方面，本发明提供用于鉴定测试物的方法，所述测试物作为突触小泡循环的方面的调节剂。

Description

突触小泡循环的测定和系统
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2008年9月4日提交的美国临时申请序列号61/094,361的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及鉴定突触传递调节剂的系统和方法。
发明背景
突触小泡循环在神经传递中处于中心地位。该过程通常在神经末梢发生并涉及以下步骤：伴随神经递质释放的小泡胞吐、空小泡胞吞以及小泡的再循环和再利用。包含在突触小泡中的神经递质转运蛋白将神经递质装载到小泡中。经装载的小泡转位至末梢的细胞质膜，在那里它们选择性地停靠在活性区附近并成为可融合状态(fusion competent)。通常，细胞内钙浓度的升高引发小泡融合以及引发神经递质释放到突触间隙。而后神经递质可结合并活化受体。融合后，小泡蛋白质和膜通过网格蛋白介导的胞吞作用回收，重新装填神经递质，并再循环用于随后的释放。因此，神经传递涉及通过重复的胞吐作用和胞吞作用进行的正常突触小泡循环。突触小泡循环的破坏可导致多种精神和神经疾病。
发明概述
本发明部分地基于对能刺激神经元细胞的动作电位以及并行检测多个神经元细胞培养物中突触传递方面的新平台和方法的开发。在一些方面，本发明克服了与以高通量形式分析突触传递相关的长久以来的挑战。因此在一些方面，本发明提供以高通量方式鉴定突触传递调节剂的平台和方法。本发明还基于这样的发现，即采用本文公开的新平台和方法，在一些情况下，可采用低数值孔径的空气物镜阵列，以高通量方式高度灵敏地检测突触小泡循环的方面。因此，在一些方面，本发明提供以高通量方式分析突触小泡循环的方面的平台和方法。在另一些方面，本发明提供在多个平行培养物中分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台。
本发明提供了用于鉴定突触小泡循环调节剂的平台、系统和方法。本发明的方法和系统可鉴定用于表征突触小泡循环通路的试剂和工具以及用于监测和/或调节该通路的诊断剂和/或治疗剂等。
在一些实施方案中，本发明提供了基于例如突触小泡循环活性的至少一个方面的突触小泡循环测定。在一些实施方案中，突触小泡循环测定监测突触小泡循环的动态、效率和/或其他特征(如频率、持续时间和/或突触疲劳)。
在一些实施方案中，本发明提供了通过采用本发明的突触小泡循环测定来鉴定调节(如刺激和/或抑制)突触小泡循环之试剂的系统和方法。
本发明的调节剂可以是任何种类的化学实体(例如，多肽、核酸、抗体、小分子、碳水化合物、脂质、微生物等)。
本发明所用的突触小泡循环测定通常包括：多个细胞(例如，包含至少一个具有突触前末梢的细胞，所述突触前末梢显示功能性突触小泡循环或者至少一种突触小泡循环活性)、报告物(如，可用于跟踪突触小泡循环或至少一种突触小泡循环活性的报告物)、刺激系统(如，电、声、超声或光学刺激系统以引发突触小泡循环，例如，通过引发动作电位)以及检测系统(例如，捕获由报告物产生的信号的成像系统)。
在一些实施方案中，以高通量形式安排和/或实施突触小泡循环测定。例如，本发明的方法可包括使用单个仪器同时测量多个突触小泡循环测定(例如，至少4、16或更多个突触小泡循环测定)的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法可包括在单个仪器上每小时测量至少24(例如，至少48、96、384或更多个)个突触小泡循环测定。在一些实施方案中，本发明所用仪器适于筛选多孔板(例如，24、48、96或384孔板)。
根据本发明的一个方面，提供了分析突触小泡循环的方面的平台。所述平台包含a)多个孔；b)多个电极对，其中每个电极对设置为(i)放置在孔中和(ii)产生适于在孔内的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置为检测报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触前蛋白相连，并且其中发光信号的存在指示神经元细胞中突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，多个孔含有多个神经元细胞。在一些实施方案中，孔中的多个神经元细胞在10至1,000,000个神经元细胞的范围内。在一些实施方案中，孔中的多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。在一些实施方案中，所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。在一些实施方案中，所述神经元细胞是原代神经元，任选地，其中所述原代神经元是大鼠原代神经元。在一些实施方案中，所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。在一些实施方案中，电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。在一些实施方案中，每个电极对中的电极均为基本同心的圆柱体，并且其中同心圆柱体被环形绝缘材料分隔。在一些实施方案中，所述平台还包含电极转移系统，其设置为将多个电极对中的每个电极对有效放置在多个孔中的一个孔内。在一些实施方案中，所述平台还包含与所述多个电极有效连接的电源。在一些实施方案中，将所述电源设置为对每个电极对提供预定电压。在一些实施方案中，所述电压的范围为1V至400V。在一些实施方案中，所述电压的范围为5V至20V。在一些实施方案中，所述平台还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中将所述脉冲发生器设置为向每个电极对提供预定的电压脉冲。在一些实施方案中，所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率提供多个预定电压脉冲。在一些实施方案中，所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。在一些实施方案中，所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。在一些实施方案中，预定时间为最多2分钟。在一些实施方案中，所述预定时间的范围为0.1至20秒。在一些实施方案中，所述预定时间的范围为5至15秒。在一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。在一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。在一些实施方案中，每个脉冲起始之间的持续时间为0.1至5毫秒。在一些实施方案中，脉冲数的范围为1至1000。在一些实施方案中，所述平台还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。在一些实施方案中，每个检测器均包含光学传感器。在一些实施方案中，每个检测器包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。在一些实施方案中，将所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。在一些实施方案中，所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。在一些实施方案中，所述物镜的数值孔径为0.5。在一些实施方案中，所述物镜不是油浸或水浸镜头。在一些实施方案中，所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)照相机。在一些实施方案中，多个检测器设置为同时检测多个孔中的信号。在一些实施方案中，所述检测系统包含与检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。在一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。在一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。在一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。在一些实施方案中，所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素(synaptophysin)、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。在一些实施方案中，多个神经元细胞表达具有腔部分(lumenal portion)的突触小泡蛋白，其中所述突触小泡蛋白与报告分子连接。在一些实施方案中，所述报告分子与突触小泡蛋白的腔部分相连。在一些实施方案中，所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。在一些实施方案中，所述报告分子为pHluorin。在一些实施方案中，所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示的序列。在一些实施方案中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下发出的荧光。在一些实施方案中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下发出的荧光。在一些实施方案中，所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
根据本发明的另一个方面，提供了分析突触小泡循环的方面的平台。所述平台包含a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；b)多个电极对，其中每个电极对放置在多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；和c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子。
根据本发明的另一个方面，提供了分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子；b)刺激器系统，其设置为诱导所述孔中存在的神经元细胞的突触小泡循环；和c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置为检测来自孔中存在的多个神经元细胞的至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。
在一些实施方案中，所述突触小泡蛋白包含腔部分。在上述任何方面的一些实施方案中，所述刺激器系统包含多个电极对，其中将每个电极对放置在多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。在任何上述方面的一些实施方案中，孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。在任何上述平台的一些实施方案中，孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。在任何上述平台的一些实施方案中，所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。在任何上述平台的一些实施方案中，神经元细胞是原代神经元，任选地，其中所述原代神经元是大鼠原代神经元。在任何上述平台的一些实施方案中，所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。在任何上述平台的一些实施方案中，所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。在任何上述平台的一些实施方案中，电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。在任何上述平台的一些实施方案中，每个电极对中的电极均为基本同心的圆柱体，并且其中同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。在任何上述平台的一些实施方案中，所述平台还包含电极转移系统，其设置为将多个电极对中的每个电极对有效放置在多个孔中的一个孔内。在任何上述平台的一些实施方案中，所述平台还包含与多个电极有效连接的电源。在任何上述平台的一些实施方案中，将所述电源设置为对每个电极对提供预定的电压。在任何上述平台的一些实施方案中，所述电压的范围为1V至400V。在任何上述平台的一些实施方案中，所述电压的范围为5V至20V。在任何上述平台的一些实施方案中，所述平台还包含与电源和多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器设置为向每个电极对提供预定的电压脉冲。在任何上述平台的一些实施方案中，所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率提供多个预定电压脉冲。在任何上述平台的一些实施方案中，所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。在任何上述平台的一些实施方案中，所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。在任何上述平台的一些实施方案中，预定时间最多2分钟。在任何上述平台的一些实施方案中，所述预定时间的范围为0.1至20秒。在任何上述平台的一些实施方案中，所述预定时间的范围为5至15秒。在任何上述平台的一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。在任何上述平台的一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。在任何上述平台的一些实施方案中，每个脉冲起始之间的持续时间为0.1至5毫秒。在任何上述平台的一些实施方案中，脉冲数的范围为1至1000。在任何上述平台的一些实施方案中，所述平台还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中将所述计算机设置为控制所述电压脉冲。在任何上述平台的一些实施方案中，每个检测器均包含光学传感器。在任何上述平台的一些实施方案中，每个检测器包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。在任何上述平台的一些实施方案中，将所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。在任何上述平台的一些实施方案中，所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。在任何上述平台的一些实施方案中，所述物镜的数值孔径为0.5。在任何上述平台的一些实施方案中，所述物镜不是油浸或水浸镜头。在任何上述平台的一些实施方案中，所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件照相机。在任何上述平台的一些实施方案中，所述多个检测器设置为同时检测来自多个孔的信号。在任何上述平台的一些实施方案中，所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。在任何上述平台的一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。在任何上述平台的一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。在任何上述平台的一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。在任何上述平台的一些实施方案中，所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。在任何上述平台的一些实施方案中，所述报告分子与突触小泡蛋白的腔部分相连。在任何上述平台的一些实施方案中，所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。在任何上述平台的一些实施方案中，所述报告分子为pHluorin。在任何上述平台的一些实施方案中，所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。在任何上述平台的一些实施方案中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。在任何上述平台的一些实施方案中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。在任何上述平台的一些实施方案中，所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
在本发明另一方面中，提供了分析突触小泡循环的方面的平台。所述平台包含a)多个孔；b)多个电极对，其中每个电极对设置为(i)放置在孔中，并且(ii)产生适于在孔中的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示了神经元细胞中突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，多个所述孔包含多个神经元细胞。
根据本发明的另一方面，提供了分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台。所述平台包含a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；b)多个电极对，其中每个电极对放置在多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在孔中的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示了神经元细胞中突触小泡循环的方面。
在本发明的另一方面，提供了用于分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台，所述平台包含a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中多个所述神经元细胞包含与小泡蛋白相连的报告分子；b)设置为诱导所述孔中存在的神经元细胞的突触小泡循环的刺激器系统；以及c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示了神经元细胞中突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述刺激器系统包含多个电极对，其中每个电极对被放置在多个孔中的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述突触小泡蛋白包含腔部分。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜是油镜或水镜(oil or water objective len)。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜是空气物镜。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜与光学检测器有效连接。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述光学检测器是电荷耦合器件照相机。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述平台被设置为检测来自报告分子的发光信号，所述报告分子与神经元细胞的突触小泡蛋白相连，所述神经元细胞已被刺激产生至少5个动作电位。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述检测系统包含多个物镜。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，每个电极对中的电极均为基本同心的圆柱体，并且其中同心圆柱体被环形绝缘材料分隔。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述平台还包含电极转移系统，其设置为将所述多个电极对中的每个电极对有效放置在多个孔中的一个孔内。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述平台还包含与多个电极有效连接的电源。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，将所述电源设置为对每个电极对提供预定的电压。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述电压的范围为1V至400V。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述电压的范围为5V至20V。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述平台还包含与电源和多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器设置为向每个电极对提供预定的电压脉冲。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率提供多个预定电压脉冲。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，预定时间最多2分钟。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述预定时间的范围为0.1至20秒。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述预定时间的范围为5至15秒。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，每个脉冲起始之间的时间为0.1至5毫秒。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，脉冲数的范围为1至1000。在任何上述本发明方案的一些实施方案中，所述平台还包含与脉冲发生器有效连接的计算机，其中将所述计算机设置为控制所述电压脉冲。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述检测系统包含光学传感器。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述检测系统包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜设置为从收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜的数值孔径为0.5。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述物镜不是油浸或水浸镜头。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述检测系统包含多个检测器，所述多个检测器设置为同时检测多个孔中的信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述检测系统包含与检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，将每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，将每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述报告分子与突触小泡蛋白的腔部分相连。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述报告分子为pHluorin。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)中所示序列。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。在任何上述本发明方面的一些实施方案中，所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
根据本发明的另一方面，提供了在多个细胞中测量突触小泡循环的方面的方法。所述方法包括a)在多个孔的每一个中提供电极对和多个细胞，所述细胞表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子；b)用所述电极对在多个细胞中诱导足以在细胞中引发突触小泡循环的一系列动作电位；以及c)在所述多个孔中检测所述报告分子的发光信号，其中所述报告分子的发光信号是对突触小泡循环的方面的度量。在一些实施方案中，所述多个细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，孔中的多个神经元细胞是在10至100000个神经元细胞的范围内。在一些实施方案中，孔中的多个神经元细胞是在1000至2000个细胞/mm2孔底面积的范围内。在一些实施方案中，所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。在一些实施方案中，神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。在一些实施方案中，所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。在一些实施方案中，多个所述神经元细胞表达与报告分子融合的突触小泡蛋白。在一些实施方案中，电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。在一些实施方案中，每个电极对中的电极均为基本同心的圆柱体，并且其中同心圆柱体被环形绝缘材料分隔。在一些实施方案中，所述方法还包括采用电极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对放置在多个孔中的一个孔内。在一些实施方案中，与多个电极有效连接的电源诱导所述动作电位。在一些实施方案中，通过向每个电极对提供预定电压诱导所述动作电位。在一些实施方案中，所述电压的范围为1V至400V。在一些实施方案中，所述电压的范围为5V至20V。在一些实施方案中，脉冲发生器与电源和多个电极对有效连接，其中所述脉冲发生器向每个电极对提供预定的电压脉冲。在一些实施方案中，所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率提供多个预定电压脉冲。在一些实施方案中，所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。在一些实施方案中，所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。在一些实施方案中，预定时间小于或等于2分钟。在一些实施方案中，所述预定时间的范围为0.1至20秒。在一些实施方案中，所述预定时间的范围为5至15秒。在一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。在一些实施方案中，每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。在一些实施方案中，每个脉冲起始之间的时间为0.1至5毫秒。在一些实施方案中，脉冲数的范围为1至1000。在一些实施方案中，所述电压脉冲由与脉冲发生器有效连接的计算机控制，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。在一些实施方案中，所述发光信号由检测器检测。在一些实施方案中，所述检测器包含光学传感器。在一些实施方案中，报告分子的发光信号用多个检测器检测，其中每个检测器与电荷耦合器件照相机有效连接。在一些实施方案中，每个检测器包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。在一些实施方案中，所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。在一些实施方案中，所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。在一些实施方案中，所述物镜的数值孔径为0.5。在一些实施方案中，所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。在一些实施方案中，计算机与所述多个检测器有效连接并将来自检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。在一些实施方案中，每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。在一些实施方案中，每个检测器检测来自多个突触的发光信号。在一些实施方案中，每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。在一些实施方案中，所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。在一些实施方案中，所述突触小泡蛋白具有腔部分。在一些实施方案中，所述发光报告分子与腔部分相连。在一些实施方案中，所述发光报告分子为pH敏感的报告分子。在一些实施方案中，所述发光报告分子为pHluorin。在一些实施方案中，所述发光报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。在一些实施方案中，在7.0至8.0范围的pH下，所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于在5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。在一些实施方案中，在7.0至8.0范围的pH下，所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于在7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。在一些实施方案中，所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。在一些实施方案中，所述方法还包括d)使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；e)在细胞中诱导第二系列的动作电位，其足以在细胞中引发突触小泡循环；f)检测所述多个孔中的报告分子的第二发光信号；其中在步骤(c)中检测到的发光信号与在步骤(f)中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力，其中在步骤(c)中检测到的发光信号与对照发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述方法还包括d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；e)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种对照剂相接触；其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在具有对照剂的孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述方法还包括d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述检测器待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在具有阴性对照的孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述方法还包括使阴性对照孔中的多个细胞与不调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。在一些实施方案中，所述方法还包括d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述检测器待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在具有阳性对照的孔中检测到的发光信号之间无显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。在一些实施方案中，所述方法还包括使阳性对照孔中的多个细胞与调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。在一些实施方案中，所述测试物为小分子。在一些实施方案中，所述测试物为多肽。在一些实施方案中，所述测试物是抗体。在一些实施方案中，所述测试物是核酸。在一些实施方案中，所述核酸是选定的DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、短干扰RNA、短发夹RNA、小RNA(microRNA)、核酶或适体(aptamer)。在一些实施方案中，所述测试物是碳水化合物。在一些实施方案中，所述测试物是脂质。在一些实施方案中，所述脂质是磷脂、甘油三酯或甾类。在一些实施方案中，所述方法还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环方面之调节剂的测试物的毒性。在一些实施方案中，所述方法还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环方面的调节剂的测试物的效力。在一些实施方案中，所述方法是高通量的筛选方法。在一些实施方案中，所述发光信号是荧光水平。在一些实施方案中，所述发光信号是在预定时间内获得的多个荧光水平。在一些实施方案中，所述发光信号是荧光增加速率。在一些实施方案中，所述发光信号是荧光减少速率。
根据本发明的另一方面，提供了鉴定作为突触小泡循环方面之调节剂的测试物的方法。所述方法包括a)提供多个孔，每个孔包含电极对以及表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；b)在所述多个细胞中诱导足以在细胞中引发突触小泡循环的第一系列动作电位；c)检测所述多个孔中报告分子的第一发光信号；d)使所述多个孔中的所述多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；e)在细胞中诱导第二系列动作电位，其足以在细胞中引发突触小泡循环；以及f)检测所述多个孔中报告分子的第二发光信号；其中第一和第二报告分子荧光水平之间的显著差异将测试物鉴定为突触小泡循环的方面的调节剂。
根据本发明的另一方面，提供了在多个细胞中检测突触小泡循环的方面的方法。所述方法包括a)在多个孔的每一个中提供电极对和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；b)用所述电极对在所述多个细胞中诱导一系列动作电位，所述动作电位足以在细胞中引发突触小泡循环；c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号；其中所述报告分子的发光信号是突触小泡循环的方面的度量；以及d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号和在对照孔中检测到的发光信号之间的比较鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
根据本发明的另一方面，提供了检测多个细胞中突触小泡循环的方面的方法。所述方法包括a)在多个孔的每一个中提供刺激器和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；b)用刺激器在多个细胞中诱导一系列动作电位，其足以在细胞中引发突触小泡循环；以及c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号；其中所述报告分子的发光信号是突触小泡循环的方面的度量。
附图说明
图1，突触小泡循环的示意图，显示了一些突触前蛋白质被认为发挥功能的位置。
图2，可用于在神经元细胞中刺激突触小泡循环的电极对的立视图。(A)所述电极对包含内部的棒状电极102和外部的圆环形电极104。所述电极对可与神经元细胞接触放置或放置在其附近。(B)(A)中显示的电极对的顶视图。
图3，(A)-(D)可应用于图2A-B的电极的电压波形的几个实施方案。
图4，(A)可应答于施加到电极的电压而在图2A-B的电极之间产生的瞬时电场
Figure BPA00001358691200131
(B)可在神经元细胞周围产生的瞬时电场
Figure BPA00001358691200132
图5，可用于刺激突触小泡循环的电极设置的多个实施方案的示意图。
图6，(A)-(B)电极组件的一个实施方案。电极102、104由盘503支撑，通过导线路510、512与电极电接触。(C)电极组件的立视图。
图7，(A)-(C)可用于基本同时地刺激多孔板中突触小泡循环的多电极组件的示意图。(A)顶视图；(B)立视图；(C)底视图。
图8，(A)多电极组件的一个实施方案，其中可单独地刺激电极对的行或排。(B)分离的导线路610的局部电接触722A-722L。
图9，可用于对一个或更多电极对施加电压波形的电路的实施方案的框图。
图10，描述突触小泡循环平台的一个实施方案的立视图。所述平台包含多孔板915，倒置显微镜910，放置装置945以及多电极组件600。在多个实施方案中，所述显微镜910对孔908中发生的突触小泡循环活性的至少一部分成像。
图11，描述突触小泡循环平台的一个实施方案的立视图。所述平台包含多孔板915，多电极组件600，透镜阵列1070，光检测器阵列1080。在多个实施方案中，透镜1072收集孔中突触小泡循环过程中所发出的至少部分荧光辐射，并导入对应的光检测器1082。突触小泡循环平台的该实施方案提供了在独立的容器(如包含神经元细胞的孔)中对突触小泡循环的平行监测。所述孔可以为多孔板中的分离的孔。
图12，Cypher5E(GE Healthcare)为在～pH5.5发出荧光并在～pH7.4淬灭的pH敏感染料。由于其在pH5.5(右)时具有与pH7.4(左)时不同的结构，因此在不同的pH下Cypher5E产生不同的荧光。
图13，显示在倒置显微镜上测量的原代神经元中整孔水平的突触小泡循环的示例性结果，所述神经元被表达synaptopHluorin的腺相关病毒感染。
图14。显示在平板显示(plate::vision)读板器上测量的原代神经元中整孔水平的突触小泡循环的示例性结果，所述神经元被表达synaptopHluorin的腺相关病毒感染。
图15，包含外径为6mm的外部铂环电极的示例性定制电极，其适合装入96孔板的孔中。
图16，显示了示例性结果(荧光图像和荧光信号记录)。在原代神经元中诱发动作电位从而获得该数据。所述神经元细胞培养在96孔板中，采用经改装的市售电穿孔系统(CellaxessCX3，Cellectricon AB，Moldnal，Sweden)进行刺激。该结果证明Cellectricon系统可在原代神经元中诱发动作电位，所述动作电位通过原代神经元培养物的Ca++成像来测量。该图中的比例尺为100μm。
图17，显示了实验的示例性结果(荧光图像和荧光信号记录)，所述实验中在96孔板中诱发突触小泡循环。所述电刺激系统与在图16的试验中所用的相同。该图证明Cellectricon系统可在原代神经元中诱发突触小泡循环，所述突触小泡循环通过原代神经元培养物的synaptopHluorin成像测量。
图18，显示了示例性结果，其说明当神经元被定制Cellectricon电极刺激时，平板可视读板器可利用synaptophysin-pHluorin报告子检测突触小泡循环。
图19，显示了示例性结果，其说明平板可视读板器系统可成功地检测应答于少量动作电位的synaptophysin-pHluorin。
图20，示例性高含量筛选系统的示意图。
图21，突触前HTS平台仪器的示例。(上)突触前HTS平台仪器的上室，显示了Tecan液体处理机械手端部的位置，电刺激端部模块和平板可视读板器的iCCD照相机。(下)下室，显示了脉冲发生器、读板器、读板器灯和多个电源的位置。
图22，采用突触前HTS平台的96平行突触前测定的结果，其中将记录相对于其应答峰值归一化。
图23，突触前HTS平台电刺激系统的一致性分析的示例性结果。(A)显示单个孔中应答于刺激系列(红色条)的sypHy荧光。(B)显示作为刺激电压函数的sypHy荧光峰值幅度以及EV50测量的推导。(C)显示作为96孔板孔的函数的EV50。所述电刺激系统为整个96孔板提供均一的电流密度。
图24，突触前HTS平台灵敏性分析的示例性结果。
图25，用突触前HTS平台检测突触小泡循环中由化合物诱导的变化。
图26，采用高含量成像系统对突触小泡循环的测量。
图27，采用Fluoroskan Ascent FL读板器对突触小泡循环的分析的示例性结果。
定义
试剂：如本文所用，术语“试剂”(也称为“测试物”或“候选试剂”)是指可被检测为潜在的调节剂的任何化合物或组合物。可采用的试剂的实例包括但不限于小分子、抗体、抗体片段、siRNA、shRNA、核酸分子(RNA、DNA、或DNA/RNA杂交体)、反义寡核苷酸、核酶、肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质、微生物、天然产物等。在一些实施方案中，试剂可为分离的或未分离的。作为一个非限制性实例，试剂可为试剂文库。如果发现试剂的混合物为调节剂，则可进一步将混合物纯化成分离的组分以确定哪个组分是靶标活性的实际调节剂。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”以其最广泛的意义表示可并入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有H2N-C(H)(R)-COOH的一般结构。在一些实施方案中，氨基酸是天然的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸为D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然肽中通常发现的20种标准L-氨基酸中的任意种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，不管其是合成制备而成还是从天然来源获得。如本文所用，“合成的氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代。氨基酸(包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它化学基团取代进行修饰，这可改变肽的循环半衰期而不对它们的活性产生不利影响。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并可指代游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。根据采用该术语的上下文，其是指代游离氨基酸还是肽的残基会显而易见。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段的非人动物。在一些实施方案中，所述非人动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫类和/或蠕虫类。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传改造动物和/或克隆。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，不管其是天然或者完全或部分合成产生的。本术语中也包括保留其特异结合活性的所有其衍生物。该术语还涵盖具有结合结构域的任何蛋白质，所述结合结构域与免疫球蛋白的结合结构域同源或大部分同源。这些蛋白质可来自天然来源，或者部分或全部合成产生。抗体可为单克隆或多克隆。抗体可为任何免疫球蛋白类型的成员，所述类型包括任何人的类型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文所用，术语“抗体片段”或“抗体的特征性区域”互换使用并指代短于全长的任何抗体衍生物。一般地，抗体片段至少保留全长抗体的特异结合能力的显著部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv双抗体(diabody)和Fd片段。抗体片段可通过任何方式产生。例如，抗体片段可通过完整抗体的片段化从而酶法或化学法产生和/或其可从编码部分抗体序列的基因重组地生成。作为替代地或另外地，抗体片段可被完全或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包含单链抗体片段。作为替代地或另外地，抗体片段可以包含连接在一起的多条链，例如通过二硫键连接。抗体片段可以任选地包含多分子复合体。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸，并更通常地包含至少200个氨基酸。
约：如本文所用，术语“约”或“大约”当用于一个或更多个目的值时表示与指出的参照值相似的值。在一些实施方案中，术语“约”或“大约”表示在指出的参照值两边(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值，除非另外指明或从上下文中显而易见(不含该数值会超过可能值的100％的情况)。
相关联：如本文所用，当用于指代两个或更多部分时，术语“相关联”、“缀合”、“连接”、“相连”、“附着”是指所述部分彼此物理地相关联或相连接以形成足够稳定的结构，使得所述部分在使用所述结构的条件下(例如生理条件)保持物理相连，所述相关联或相连接为直接相连或通过作为连接剂的一个或更多个额外部分相连。在一些实施方案中，所述部分通过一个或更多个共价键彼此连接。在一些实施方案中，所述部分通过涉及非共价结合的机制(例如氢键、亲和相互作用、静电相互作用、范德华力等)彼此连接。在一些实施方案中，足够量的弱相互作用可提供使部分保持物理相连的足够稳定性。
生物相容的：如本文所用，术语“生物相容的”是指对细胞无毒性的物质。在一些实施方案中，如果将物质在体内添加到细胞而不诱导炎性和/或其他体内不利作用，则认为所述物质是“生物相容的”。在一些实施方案中，如果将物质体外或体内添加到细胞导致小于或等于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或少于约5％的细胞死亡，则认为所述物质为“生物相容的”。
生物可降解的：如本文所用，术语“可生物降解的”是指在生理条件下降解的物质。在一些实施方案中，可生物降解的物质是通过细胞作用分解的物质。在一些实施方案中，可生物降解的物质是通过化学过程分解的物质。
对照：如本文所用，术语“对照”具有其在本领域所理解的作为对结果进行比较时的标准品的意义。通常，对照在实验中用于通过分离变量来提高实验的完整性，从而得出有关该变量的结论。在一些实施方案中，对照是与检测反应或测定同时进行的反应或测定，以提供比较。在一个实验中，施加“测试物”(即待测变量)。在第二个实验中，施加“对照”，而不施加所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即之前进行的检测或测定，或之前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是打印的或以其他方式储存的记录，或包含这些记录。对照可为阳性对照或阴性对照。
检测系统：本文所用的检测系统是用于监测突触小泡循环的方面的系统。检测系统通常提供对来自包含神经元细胞的孔中至少一个区域的发光信号的监测。检测系统可提供对发光信号的同时监测，每个发光信号来自多个孔中的包含神经元细胞的孔内的至少一个区域。检测系统可包含检测器，如光学传感器、物镜、光电倍增管等，其设置为检测来自孔中神经元细胞的报告分子的发光信号。检测系统可包括多个检测器，如光学传感器、物镜等，其每个都设置为检测来自孔中神经元细胞的报告分子的发光信号。检测系统通常包含光敏组件，其设置为将发光信号转化为数字电信号。例如，检测系统可包含与检测器有效连接的电荷耦合系统照相机。检测系统可与计算机有效连接，所述计算机设置为控制发光信号的检测。
去磷蛋白：如本文所用，术语“去磷蛋白(dephosphin)”是指在去磷酸化时调节突触小泡胞吞作用(例如，增强其效力)的蛋白质。通常，当去磷酸化时，所述去磷蛋白组装成蛋白质复合体中。在一些实施方案中，钙调磷酸酶(calcineurin)将去磷蛋白去磷酸化。
功能异常：如本文所用，术语“功能异常”是指分子或过程的功能异常。分子(例如，蛋白质)的功能异常可由与该分子相关的活性的增强或减弱所导致。分子的功能异常可由与该分子自身相关的缺陷所导致，或者与和该分子直接或间接相互作用或对其进行调控的其他分子相关的缺陷导致。过程(例如突触小泡循环)的功能异常可由与直接参与该过程的任何分子相关的活性的增强或减弱所导致，或者由与直接或间接与所述分子相互作用或调节所述分子的其他分子或过程相关的活性的增强或减弱所导致。
电刺激系统：如本文所用，术语“电刺激系统”是指包含至少一个电极组件的装置，其可与神经元细胞培养物、悬液和/或制备物相接触放置或放置在其附近。所述电刺激系统可任选地另外包含产生电压或电流波形的电装置。
电极组件：如本文所用，术语“电极组件”是指支持和包含电极对的装置。所述装置可另外包含与电极对中每个电极相连的导线或线路。
电极对：如本文所用，术语“电极对”通常是指两个导电元件，其设置为一个元件用作阴极而一个元件用作阳极。在一些实施方案中，例如参见图5H，术语“电极对”可用于多于两个的导电元件，其中所述元件中的一些设置为用作阴极，所述元件中的一些设置为用作阳极。
激发区：如本文所用，术语“激发区”是指细胞培养物、悬液和/或制备物中接受刺激波形的区域。所述刺激波形可在该区域的神经元细胞中激发突触小泡循环。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子或过程是一定形式的生物分子或过程，在所述形式中其显示其特征性性质和/或活性。
瞬时电场：如本文所用，采用术语“瞬时电场”描述随时间变化的电场的瞬间状态。例如，瞬时电场是随时间变化的电场某一瞬间的表现。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中(例如在试管或反应容器，细胞培养物中等)而不是在多细胞生物体中发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体(例如非人动物)中发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指以下物质和/或实体，(1)与最初产生时(在天然环境中和/或在试验设置中)和其相关联的至少一些组分相分离和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％的其初始相关联的其他组分相分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本100％或100％。如本文所用，如果基本无其他组分，则物质是“纯”的。如本文所用，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。应理解分离的细胞之前可能存在于体内，例如，原代细胞。
发光信号：如本文所用，术语“发光信号”是指从至少一个报告分子发出的光的量，或代表从至少一个报告分子发出的光的量的电信号，例如，数字电信号。发光信号可为来自至少一个报告分子的发光强度(例如荧光强度)的水平，例如最大强度水平。发光信号可为在预定时间中来自至少一个报告分子的多个发光强度(例如，荧光强度)水平。发光信号可为在预定时间内来自至少一个报告分子的发光(例如荧光)强度水平的增强或减弱速率。
调节剂：如本文所用，术语“调节剂”是指改变或引发活性的试剂，如化合物。例如，调节剂的存在可导致与无调节剂时的活性量相比某活性的量升高或降低。在一些实施方案中，调节剂是降低一种或更多种活性的量的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂完全阻止一种或更多种生物活性。在一些实施方案中，调节剂是提高至少一种活性的量的激活剂。在一些实施方案中，调节剂的存在产生在无调节剂的情况下不存在的活性。
多电极组件：如本文所用，术语“多电极组件”是指支持并包括多个电极对的装置。所述装置可以任选地另外包含连接多电极组件中每个电极的导线或线路。
神经元细胞：如本文所用，术语“神经元细胞”(也称为“神经元”)是指经历突触小泡循环或者突触小泡循环的一个或多个方面的细胞。在一些实施方案中，神经元细胞具有或可形成突触前末梢，其中所述突触前末梢具有功能性的突触小泡循环或经历突触小泡循环的一种或更多种活性。在一些实施方案中，神经元细胞在体外。在一些实施方案中，神经元细胞在体内。在一些实施方案中，神经元细胞是生长细胞的培养物、细胞悬液、与表面相连(例如在其上生长、贴附或附着等)的多个细胞、从体内来源(例如，采集自动物)基本纯化的多个神经元细胞和/或细胞系。在一些实施方案中，神经元细胞在活动物中(例如啮齿动物、人等)。在一些实施方案中，神经元细胞是原代神经元细胞和/或干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞为原代大鼠前脑神经元。神经元细胞可包括经历一种或更多种突触前小泡循环要素的细胞群。在一些实施方案中，神经元细胞可被转化、转染、感染和/或以其他方式诱导摄取用于跟踪突触小泡循环或其一种或更多种活性的所需报告物。在一些实施方案中，神经元细胞可用于本发明的突触小泡循环测定中。
神经元细胞系统：如本文所用，术语“神经元细胞系统”(也称为“神经系统”)是指经历突触小泡循环或突触小泡循环的一种或更多种活性的系统。在一些实施方案中，神经系统包含具有或可形成突触前末梢的至少一个细胞，其中所述突触前末梢具有功能性的突触小泡循环或经历一种或更多种突触小泡循环活性。在一些实施方案中，神经元细胞系统为体外系统。在一些实施方案中，神经元细胞系统为体内系统。在一些实施方案中，神经元细胞系统是包含以下的体外系统：生长细胞的培养物、细胞悬液、与表面相连(例如在其上生长、贴附或附着等)的多个细胞、从体内来源(例如，采集自动物)基本纯化的多个神经元细胞和/或细胞系。在一些实施方案中，神经元细胞系统包含在活动物中(例如啮齿动物、人等)的神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞系统包含原代神经元细胞和/或干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞系统可包含原代大鼠前脑神经元。神经元细胞系统可包含经历一种或更多种突触前小泡循环要素的细胞群。在一些实施方案中，神经元细胞系统中的细胞可被转化、转染、感染和/或以其他方式诱导以摄取用于跟踪突触小泡循环或其一种或更多种活性的所需报告物。在一些实施方案中，神经元细胞系统可用于本发明的突触小泡循环测定中。
核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上表示可并入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过或可通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个体核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指含有个体核酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”以及“多核苷酸”可互换使用。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单和/或双链DNA和/或cDNA。而且，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即不具有磷酸二酯键骨架的类似物。例如，认为所谓的“肽核酸”在本发明范围内，其是本领域已知的，其在骨架中具有肽键而不是磷酸二酯键。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包含内含子。核酸可从天然来源中纯化，采用重组表达系统生成并任选地被纯化，化学合成等。在适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖，骨架修饰等的类似物。核酸序列以5’至3’方向显示，除非另外指明。本文所用术语“核酸区段”表示作为更长核酸序列的一部分的核酸序列。在很多实施方案中，核酸区段包含至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5-丙炔基-胞苷、C-5-丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴代尿苷、C5-氟代尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)；化学修饰碱基；生物修饰碱基(如甲基化碱基)；内部插入碱基；经修饰的糖(例如2’-氟代核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺连接)。在一些实施方案中，本发明可特别地涉及“未修饰核酸”，意为为了便于或达成递送而未被化学修饰的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。
突触前蛋白质：如本文所用，术语“突触前蛋白质”是指优选地位于突触前末梢的蛋白质。通常，突触前蛋白质参与突触小泡循环。在一些实施方案中，突触前蛋白质包括突触蛋白、去磷蛋白和其它钙调磷酸酶底物。示例性的突触前蛋白质包括但不限于突触小泡蛋白，本文中也称为内在小泡蛋白(intrinsic vesicle protein)(例如突触小泡蛋白2(SV2)、小泡GABA转运蛋白、乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白、突触素(synaptophysin)、突触结合蛋白(synaptotagmin)、小泡相关膜多肽(vesicle-associated membrane polypeptide，VAMP)、神经递质转运蛋白(NT转运蛋白)、突触循环蛋白(synaptogyrin)、质子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸链蛋白(cystine string protein，CSP)、突触质膜蛋白(如钙通道、25kDa突触体相关蛋白(synaptosome-associated protein of 25kDa，SNAP-25)、突触融合蛋白(syntaxin))、胞浆蛋白(如SNAP、n-Sec1)、突触蛋白(synapsin)(例如，突触蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，发动蛋白(dynamin)I、PIP5K1γ和突触小泡磷酸酶I(synaptojanin I)。
多个：如本文所用，术语“多个”是指多于一个。
蛋白质：如本文所用术语“蛋白质”是指多肽(即通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链)。蛋白质可包含除氨基酸外的结构(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可通过其他形式加工或修饰。本领域的普通技术人员会理解“蛋白质”可为细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其特征性部分。本领域的普通技术人员会理解蛋白质有时可包含多于一条的多肽链，例如所述多肽链通过一个或更多个二硫键连接或通过其它方式相连。多肽可包含L-氨基酸、D-氨基酸或这两者，并且可含有任何多种本领域已知的氨基酸修饰或类似物。可用的修饰包括，例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”通常用于表示长度小于约100个氨基酸的多肽。
报告物：如本文所用，术语“报告物”(本文中也称为报告分子)是指当包含在神经元细胞中时，提供指示至少一种突触小泡循环活性的可检测信号(例如，发光信号如荧光信号)的任何物质。在一些实施方案中，通过病毒感染将报告物引入神经元细胞。在一些实施方案中，将报告物外部施加于神经培养物、悬液和/或制备物。在一些实施方案中，神经元细胞源自表达报告基因的转基因动物。在一些实施方案中，报告物是荧光团。在一些实施方案中，报告物是染料。
小分子：一般地，本领域认为“小分子”为大小小于约5千道尔顿(Kd)的有机分子。在一些实施方案中，所述小分子小于约4Kd、约3Kd、约2Kd或约1Kd。在一些实施方案中，所述小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。在一些实施方案中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施方案中，小分子是非聚合的。在一些实施方案中，小分子不是蛋白质、肽或氨基酸。在一些实施方案中，小分子不是核酸或核苷酸。在一些实施方案中，小分子不是糖类或多糖。
刺激系统：如本文所用，术语“刺激系统”是指引发突触小泡循环的任何系统或组合物。通常地，刺激系统通过在神经元细胞中起始动作电位来引发突触小泡循环。适于本发明的刺激系统可为电刺激系统、声或超声刺激系统、光刺激系统或生物化学刺激系统。
刺激波形：如本文所用，术语“刺激波形”通常表示施加到培养物、悬液和/或以其它方式制备的神经元细胞的随时间变化的刺激。例如，所述刺激可以是特征为大小和方向都可随时间变化的电场。刺激波形可通过在电刺激系统中施加到电极的一种或更多种电压波形或电流波形产生。
对象：如本文所用，术语“对象”或“患者”是指本发明组合物可施用的任何生物，例如，为了实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的对象包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物以及人；昆虫；蠕虫等)。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指显示目的特征或性质的完全或近乎完全的范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员应理解生物和化学现象很少(如果有的话)达到完成和/或进行完全或者实现或避免绝对的结果。因此本文采用术语“基本上”来表示在许多生物和化学现象中所固有的完全性的潜在缺乏。
易感：对疾病、异常和/或病症“易感”的个体未被诊断为患所述疾病、异常和/或病症。在一些实施方案中，对疾病、异常和/或病症易感的个体可不显示所述疾病、异常和/或病症的症状。在一些实施方案中，对疾病、异常和/或病症易感的个体会发生所述疾病、异常和/或病症。在一些实施方案中，对疾病、异常和/或病症易感的个体不会发生所述疾病、异常和/或病症。
突触小泡循环调节剂：如本文所用，术语“突触小泡循环调节剂”是指改变突触小泡循环的任何活性的任何物质。在一些实施方案中，所述突触小泡循环的相关活性包括突触小泡移动到突触前膜、停靠在突触前膜、准备与突触前膜的融合、感受Ca2+、与突触前膜融合、将神经递质释放到突触间隙、通过胞吞作用在突触前末梢回收突触小泡(其涉及网格蛋白介导的成核、突触前膜的内陷、突触小泡从突触前膜的分裂以及从胞吞的突触小泡去除网格蛋白的步骤)、突触前末梢中突触小泡的转位、突触前末梢中突触小泡的分选以及在突触小泡腔中装载神经递质。在一些实施方案中，突触小泡循环调节剂增强突触小泡循环的一种或更多种活性。在一些实施方案中，突触小泡循环调节剂抑制突触小泡循环的一种或更多种活性。示例性的突触小泡循环蛋白质包括，如突触小泡蛋白质2(SV2)、小泡GABA转运蛋白、乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白、突触素、突触结合蛋白、小泡相关膜多肽(VAMP)、神经递质转运蛋白(NT转运蛋白)、突触循环蛋白和质子泵。其它突触小泡循环蛋白质对本领域技术人员是显而易见的。
突触小泡循环平台：如本文所用，术语“突触小泡循环平台”是指至少包含刺激系统(例如电刺激系统)和检测系统的设备。在一些实施方案中，所述电刺激系统对培养物、悬液和/或以其它方式制备的神经元细胞递送刺激波形。在一些实施方案中，所述检测系统监测与突触小泡循环相关的活性。在一些实施方案中，采用突触小泡循环平台进行突触小泡循环测定(例如，鉴定突触小泡循环的调节剂的测定)。在一些实施方案中，所述突触小泡循环平台可由单个操作人员来操作。
突触小泡蛋白质：突触小泡蛋白质为与突触小泡相关的突触前蛋白质。突触小泡蛋白质通常具有跨膜部分，并且可具有腔部分和/或胞质部分。突触前蛋白质的腔部分是暴露于突触小泡腔的蛋白质结构域。应理解当突触小泡与突触膜融合时(例如在突触小泡循环的胞吐过程中)，突触小泡蛋白质的腔部分可变成暴露于细胞外空间。突触前蛋白质的胞质部分是暴露于突触小泡所存在之细胞的细胞质中的蛋白质结构域。应理解当突触小泡与突触膜融合时(例如在突触小泡循环的胞吐过程中)，突触小泡蛋白质的腔部分可保持暴露于细胞质。突触前蛋白质的跨膜部分是包埋在小泡膜中的蛋白质结构域。应理解当突触小泡与突触膜融合时(例如在突触小泡循环的胞吐过程中)，突触小泡蛋白质的跨膜部分变为包埋在细胞膜中。
治疗剂：如本文所用，词语“治疗剂”是指当施用给对象时具有治疗作用和/或引发所需的生物和/或药理作用的任何药剂。
随时间变化的电场：如本文所用，术语“随时间变化的电场”用于描述具有随时间变化的大小和方向的电场。
波形：如本文所用，术语“波形”通常用于表示多种随时间变化的物理量，例如，随时间变化的电压、随时间变化的电流、随时间变化的电场、随时间变化的荧光发射等。
具体实施方式
本发明提供用于鉴定突触小泡循环调节剂的系统和方法。本发明提供了突触小泡循环测定等。在一些实施方案中，采用突触小泡循环测定监测突触小泡循环的动态、效力和/或其它特性。在一些实施方案中，采用突触小泡循环测定鉴定影响(例如刺激和/或抑制)突触小泡循环至少一个方面的物质。
突触小泡循环测定通常包含细胞或细胞培养物，所述细胞或细胞培养物包含显示功能性突触小泡循环或其至少一种活性的突触前末梢，所述测定还包含报告物(例如，用于跟踪突触小泡循环或其至少一种活性的报告物)、刺激系统(例如，电、声、超声、光刺激系统以引发突触小泡循环，例如，通过起始动作电位)以及检测系统(例如，成像装置以捕获由报告物产生的信号)。在一些实施方案中，突触小泡循环测定可以高通量形式构建和/或实施。
突触小泡循环
当神经元激发时，动作电位的到达引发神经递质的释放，其通过胞吐作用发生。在突触前神经末梢中，含有神经递质的突触小泡移动到突触前膜，在那里它们停靠并准备感受钙离子，最终，其与突触前膜融合。到达的动作电位产生钙离子流入，其是在动作电位的下行程(down stroke)(尾电流)时通过电压依赖的钙选择性离子通道流入。而后钙离子引发生物化学级联，其导致突触小泡与突触前膜融合并将神经递质释放到突触间隙。突触小泡的融合由突触前末梢的一组称为SNARE的蛋白质驱动。通过该融合加入的膜随后通过胞吞作用回收，所述胞吞作用包括下列步骤：网格蛋白介导的成核、突触前膜的内陷、突触小泡从突触前膜的分裂以及从胞吞的突触小泡去除网格蛋白。胞吞的突触小泡在突触前末梢中转位和分选，它们的腔重新装载神经递质。
已知钙调磷酸酶参与突触小泡循环。例如，钙调磷酸酶将参与调节突触小泡循环的多种突触小泡循环蛋白质(包括但不限于突触蛋白和去磷蛋白)去磷酸化。所述突触蛋白是调节突触小泡运动和神经递质在突触释放的蛋白质家族。具体而言，认为突触蛋白参与调节在任何给定时间内可通过胞吐作用释放的突触小泡的数量。例如，认为钙调磷酸酶对突触蛋白I的去磷酸化在强刺激中增强突触小泡的运动。去磷蛋白调节已释放其神经递质的突触小泡的胞吞作用。示例性的去磷蛋白包括但不限于发动蛋白I、PIP5K1γ、突触小泡磷酸酶I、Eps15、Epsin、AP2、AP180。图1显示了突触小泡循环的示意图，其显示了认为的一些突触前蛋白质发挥功能的位置。
据报道突触小泡在突触前末梢的内化能力是有限的(如Balaji，J.，等，(2008).JNeurosci，28(26)：6742-6749所述，其通过引用并入本文)。在低强度的刺激中(例如，以小于10Hz引发少于100个动作电位)，所述能力并未饱和并且在该范围内增强刺激强度不改变胞吞作用的动态。在高强度刺激下(例如，以大于10Hz引发大于100个动作电位)，所述能力饱和，导致突触小泡的平均胞吞率降低。还认为突触小泡胞吞能力由突触前末梢细胞内的Ca++浓度调节。升高的细胞内Ca++水平导致突触小泡胞吞作用新位点的装配，其可能由钙调磷酸酶的激活和去磷蛋白的去磷酸化引起。
用于鉴定和/或表征调节物的平台和方法
本发明提供用于鉴定调节突触小泡循环之物质的系统和方法。这些方法通常涉及包含突触前末梢的细胞或细胞培养物(所述突触前末梢显示功能性突触小泡循环或突触小泡循环的至少一个方面)、报告物(例如，用于跟踪突触小泡循环或至少一种突触小泡循环活性的报告物)、刺激系统(例如电、声、超声、光或生物化学刺激系统以引发突触小泡循环，例如，通过起始动作电位)以及检测系统(例如，成像装置以捕获由报告物产生的信号)。
提供了分析突触小泡循环的平台(本文中可称为突触小泡循环平台)。本文公开的一些平台适于以高通量方式分析突触小泡循环。通常将平台设置为在多个神经元细胞培养物的每一个中检测突触小泡循环的至少一个方面。可将这些平台设置为同时诱导多个神经元细胞培养物之每一个的动作电位，同时检测每个培养物的突触小泡循环的方面。或者，可将这些平台设置为在多个神经元细胞培养物的每一个中依次诱导动作电位，并依次检测每个培养物的突触小泡循环的方面。在一些本发明实施方案中，诱导动作电位与检测指示突触小泡循环的方面的发光信号平行地进行。
平台可包含适于培养神经元细胞的多个容器(例如，孔、管等)以及多个刺激器(例如，电极对、发声装置等)，所述刺激器设置为用于引发或诱导容器(例如孔)中神经元细胞的动作电位。通常将刺激器设置为放置在容器中或在其附近，并诱导容器中的多个神经元细胞的突触小泡循环。例如，可将电极对设置为放置在孔中并产生诱导孔中多个神经元细胞的突触小泡循环的一个或更多个电压脉冲。平台还可包含含有多个检测器的检测系统。通常将每个检测器设置为检测来自孔中存在的神经元细胞的发光信号。发光信号通常从与神经元细胞突触前蛋白质相连的报告分子发出，并且其指示神经元细胞中突触小泡循环的方面。平台中的每个容器(例如孔)通常包含多个神经元细胞。
神经元细胞
用于鉴定调节突触小泡循环之物质的系统和方法通常涉及神经元细胞的使用。在一些实施方案中，神经元细胞具有突触前末梢，其中所述突触前末梢形成功能性突触小泡循环。在一些实施方案中，神经元细胞不具有突触前末梢，但是可被诱导以形成突触前末梢，其中所述突触前末梢具有功能性的突触小泡循环。可通过在特定条件下培养和/或孵育细胞，来诱导细胞形成突触前末梢，其中所述突触前末梢具有功能性的突触小泡循环。
神经元细胞培养物可包含经历突触前小泡循环之一个或多个要素的细胞群。在一些实施方案中，突触小泡循环的相关活性包括突触小泡移动到突触前膜、在突触前膜的停靠、准备与突触前膜的融合、感受Ca2+、与突触前膜融合、将神经递质释放到突触间隙、通过胞吞作用回收突触前末梢的突触小泡(其涉及下列步骤：网格蛋白介导的成核、突触前膜的内陷、突触小泡从突触前膜的分裂以及从胞吞的突触小泡去除网格蛋白)、突触前末梢中突触小泡的转位、突触前末梢中突触小泡的分选以及将突触小泡腔中装载神经递质。在一些实施方案中，多个神经元细胞的成员彼此基本上类似。在一些实施方案中，多个神经元细胞的成员彼此基本上不类似。
在一些实施方案中，神经元细胞在活细胞的体外培养物中。在一些实施方案中，神经元细胞系统在细胞体外悬液(例如，在含有缓冲液、盐、电解质、去污剂等中一种或多种的基质中)中。在一些实施方案中，神经元细胞在包含与表面相连(例如，生长、固定、连系其上等)的多个细胞的体外培养物中。在一些实施方案中，神经元细胞在包含基本上从体内来源(例如，采集自动物)纯化的多个神经元细胞的体外培养物中。在一些实施方案中，神经元细胞可源自人或动物供体的皮质。在一些实施方案中，神经元细胞为稳定细胞系。在一些实施方案中，神经元细胞存在于活动物(例如，啮齿类动物、人等)体内。
在一些实施方案中，神经元细胞培养物为原代神经元细胞培养物。在一些实施方案中，原代神经元细胞培养物可源自来自下列的原代神经元：啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠等)、灵长类动物(例如，人、猴等)、哺乳动物(例如猫、狗等)和/或无脊椎动物(例如苍蝇、蠕虫等)。在一些实施方案中，原代神经培养物可源自动物前脑、海马、纹状体、小脑、神经调节区(例如，蓝斑核、腹侧被盖、黑质、中缝核、迈内特基底核、隔核)、脊髓或小脑。在一些实施方案中，适合的神经元细胞培养物可包括原代大鼠前脑神经元。
在一些实施方案中，神经元细胞为干细胞。在一些实施方案中，干细胞为神经干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞源自啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠等)、灵长类动物(例如，人、猴等)、哺乳动物(例如猫、狗等)和/或无脊椎动物(例如苍蝇、蠕虫等)。在一些实施方案中，干细胞在体外分化为神经元，并且分化的神经元包含具有功能性突触小泡循环的突触前末梢。参见Fico等，Stem Cells Dev，17(3)：573-584。
在一些实施方案中，神经元细胞为细胞系。在一些实施方案中，可采用的细胞系包括PC12细胞、皮质细胞系和/或永生化神经元细胞系。
在一些实施方案中，神经元细胞培养物可包含这样的细胞，其在某些培养条件下不形成显示功能性突触小泡循环的突触前末梢，但在不同培养条件下形成显示功能性突触小泡循环的突触前末梢。在一些实施方案中，神经元细胞可包含在所有培养条件下具有或形成显示功能性突触小泡循环的突触前末梢的细胞。
在一些实施方案中，突触小泡循环测定包含培养的神经元细胞。在一些实施方案中，从待在突触小泡循环测定中采用的细胞中移除培养基，并用适于电刺激(例如，具有所需电导性的溶液)的基质(例如，含有缓冲液、盐、电解质、去污剂等中一种或多种)进行替换。
在一些实施方案中，可转化、转染、感染和/或以其它方式诱导神经元细胞以使其摄取所需的突触小泡循环报告物。在一些实施方案中，用表达报告物的病毒(例如表达synaptopHluorin的病毒)感染细胞。在一些实施方案中，用驱动报告物表达的载体转化细胞。在一些实施方案中，用驱动报告物表达的表达盒对细胞进行转基因。在一些实施方案中，报告物的表达是可诱导的(例如，通过向培养基中添加一些代谢物)。在一些实施方案中，细胞自身不表达报告物，而是将报告物直接施用给细胞(例如，通过向培养基和/或悬浮基质添加报告物)。
平台中的每个容器(例如孔、管等)通常含有多个神经元细胞。容器(例如孔)中的所述多个神经元细胞的范围可为2至100个神经元细胞、100至1000个神经元细胞、1000至10,000个神经元细胞、10,000至100,000个神经元细胞、100,000至1,000,000个神经元细胞或1,000,000至10,000,000个神经元细胞。容器(例如孔)中的所述多个神经元细胞可为约2个神经元细胞、约10个神经元细胞、约100个神经元细胞、约1000个神经元细胞、约10,000个神经元细胞、约100,000个神经元细胞、约1,000,000个神经元细胞、约10,000,000个神经元细胞或更多个神经元细胞。基于本公开内容，本领域技术人员将明了其它适合的神经元细胞数目。
或者，可相对于细胞贴壁区域的大小(例如孔底面积)来确定多个神经元细胞。例如，所述多个神经元细胞的范围可为10至100个神经元细胞/mm2贴壁面积、100至1000个神经元细胞/mm2贴壁面积、1000至2000个神经元细胞/mm2贴壁面积、2000至3000个神经元细胞/mm2贴壁面积、3000至4000个神经元细胞/mm2贴壁面积、4000至5000个神经元细胞/mm2贴壁面积、5000至6000个神经元细胞/mm2贴壁面积、6000至7000个神经元细胞/mm2贴壁面积、7000至8000个神经元细胞/mm2贴壁面积、8000至9000个神经元细胞/mm2贴壁面积或9000至10000个神经元细胞/mm2贴壁面积。多个神经元细胞可为约10个神经元细胞/mm2贴壁面积、约100个神经元细胞/mmW贴壁面积、约1000个神经元细胞/mm2贴壁面积、约10,000个神经元细胞/mmW贴壁面积或更多个神经元细胞/mm2贴壁面积。基于本公开内容，本领域技术人员将明了其它适合的每贴壁面积的神经元细胞数目。
所述多个神经元细胞可包括单个细胞类型，或者至少两种不同的神经元细胞类型。所述神经元细胞可为分离自任何本文公开的动物的原代神经元，例如大鼠原代神经元。所述神经元细胞可选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。本文公开了其它示例性神经元细胞，并且本领域已知其它神经元细胞。
报告物
适于本发明的报告物(在本文中也称为报告分子)包括能产生或生成指示一种或更多种突触小泡循环活性的信号的任何报告蛋白质、基因、化合物或其它分子或物质。例如，FM染料(例如，FM1-43、FM2-10、FM4-64等)以及带荧光标签的抗突触小泡蛋白质腔结构域抗体(例如，突触结合蛋白抗体)可用于跟踪突触小泡循环。FM1-43是苯乙烯基吡啶分子(也称为苯乙烯基分子或苯乙烯基染料)，其是具有亲水和疏水区域的两亲分子。含有吡啶基团的亲水区域(通常称为头部)由具有双键桥的两个芳香环构成，其间是染料分子的荧光团部分。该荧光团基团的激发光在约500纳米，发射光在约625纳米。
FM1-43分子的疏水区域(也称为尾部)允许染料进入细胞或突触小泡的质膜。烃尾部的相互作用也可导致信号亮度的变化。然而，这些报告物通常需要大量的清洗来降低背景。因此，这些报告物对于基于细胞的均一测定(homogenous cell-based assay)来说可能不理想。如本文所用，“基于细胞的均一测定”是指使用在其施加到细胞后不需要清洗的报告物的测定。此外，由于需要清洗，这些报告物通常不能跟踪胞吞的动态过程，因为胞吞通常在清洗之前和期间发生。清洗步骤也使高通量筛选更加困难、成本高并耗时。
在一些实施方案中，在突触小泡循环测定中可采用的报告物为pH敏感报告物。通常地，这些报告物可在特定pH或pH范围具有特定的特征，而在不同的pH或pH范围具有其它特性。例如，pH敏感报告物在细胞外环境(约pH7.4)和突触小泡腔中(约pH5.5)可具有不同的荧光特征。例如，适用于本发明的pH敏感荧光报告物可在约pH7.4发出荧光，而在pH5.5不发出荧光。适用于本发明的pH敏感荧光报告物还可在约pH5.5发出荧光，而在pH7.4不发出荧光。以这种方式发挥功能的pH敏感报告物是有用的，因为未被胞吞的报告物不需要被清洗掉。
因此，通常pH敏感报告物不需要清洗步骤，这使测定均一化并且允许直接测量胞吞。这种报告物的实例包括：1)作为标签与突触小泡蛋白质腔结构域连接的pHluorin；和2)作为标签与突触小泡蛋白质腔结构域连接(例如，pHrodo和CypHer5E)或制备成插入突触小泡膜(类似于FM1-43)的pH敏感染料。
pHluorin是pH敏感绿色荧光蛋白(GFP)。其可通过作为标签与突触小泡蛋白质的腔结构域相连用来跟踪突触小泡循环。所述腔结构域标签有助于使pHluorin靶向到突触小泡的内部。pHluorin在～pH7.4发出荧光；荧光在～pH5.5淬灭。pHluorin可作为标签连接到VAMP2、vGlut1、突触小泡蛋白和突触小泡磷酸酶(见Miesenbock等(1998)Nature，394(6689)：192-5；Fernandez-Alfonso等(2006)Neuron，51(2)：179-86；Granseth等(2006)Neuron，51(6)：773-86；Voglmaier等(2006)Neuron，51(1)：71-86)。可通过多种方法将pHluorin递送到神经元(例如在多孔板中)，包括用表达带有pHluorin标签的突触小泡蛋白质的病毒进行感染，用驱动带有pHluorin标签的突触小泡蛋白质表达的载体转化或者生成表达带有pHluorin标签的突触小泡蛋白质的转基因动物(例如，小鼠或大鼠)。
突触小泡蛋白质是与突触小泡相关联的突触前蛋白质。突触小泡蛋白质通常具有跨膜区域并可具有腔部分和/或胞质部分。所述突触小泡蛋白可选自VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。通常，突触小泡蛋白质连接报告分子。例如，所述报告分子可连接到突触小泡蛋白质的腔部分。通常，报告分子是pH敏感报告分子。例如，报告分子可为pH敏感荧光蛋白质，如pHluorin。
pH敏感报告分子(例如，pH敏感荧光蛋白质如pHluorin)可在4.5至5.0、5.0至5.5、6.5至7.0、7.0至7.5、7.5至8.0或8.0至8.5的pH范围具有发射强度峰值。pH敏感报告分子可在最高约4.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或更高(包括系列数字之间的所有值)的pH具有最大发射强度。pH敏感报告分子可在6.5至8.5范围的pH下发出荧光，与4.5至6.5范围的pH相比，前者强度显著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。pH敏感报告分子可在6.5至7.5范围的pH下发出荧光，与5.0至6.0范围的pH相比，前者强度显著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。或者，pH敏感报告分子可在4.5至6.5范围的pH下发出荧光，与6.5至8.5范围的pH相比，前者强度显著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。pH敏感报告分子可在5.5至6.0范围的pH下发出荧光，与6.5至7.5范围的pH相比，前者强度显著更大，例如，高2倍、高5倍、高10倍、高20倍、高30倍、高40倍或更多。参照本公开内容，本领域技术人员会明确其它pH敏感报告分子的发射强度峰值的适合pH值。
pH敏感报告分子可在350nm至400nm、400nm至450nm、450nm至500nm、500nm至550nm、550nm至600nm或600nm至650nm的范围具有发射波长峰值。pH敏感报告物可在约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm或更大具有发射波长峰值。参照本公开内容本领域技术人员将明确其它pH敏感报告分子的适合发射波长峰值。
在一些实施方案中，可在本文公开的平台和方法中采用的报告分子pHluorin具有的氨基酸序列为
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFF KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNDHQVYIMADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNH
在一些实施方案中，pHluorin与突触素(synaptophysin)融合。可用于本文公开的平台和方法的基于突触素的pHluorin由以下核酸序列编码：
ATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGGACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTTCATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGTGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACGATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAACCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCCACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(SEQ ID NO：2；突触小泡蛋白-pHluorin)。
在一些实施方案中，pHluorin与VAMP2融合。在另一些实施方案中，pHluorin与vGlut融合。可在本文公开的平台和方法中采用的基于vGlut的pHluorin的实例由以下核酸序列编码：
ATGGAGTTCAGACAGGAGGAGTTCCGAAAACTTGCAGGCCGAGCACTGGGTCGACTGCATCGCTTGCTGGAGAAGCGGCAGGAGGGAGCAGAAACACTGGAGCTCAGCGCTGACGGCCGGCCCGTCACAACCCACACTAGAGACCCACCTGTGGTAGACTGTACCTGCTTTGGCCTGCCTAGAAGGTATATCATTGCAATCATGTCTGGGCTTGGCTTCTGCATCAGTTTTGGAATTAGATGTAACCTGGGGGTTGCGATTGTGAGTATGGTCAATAACTCAACGACACACAGAGGAAGCACCTCCGGTGGATCCGGGGGGACTGGGGGAAGCATGTCCAAAGGCGAAGAACTGTTACAGGCGTGGTGCCAATACTCGTGGAACTCGACGGCGATGTTAACGGACATAAGTTTTCCGTGTCCGGCGAGGGTGAGGGAGATGCTACATATGGAAAACTGACTCTGAAATTTATTTGTACCACCGGGAAACTGCCCGTGCCATGGCCTACCCTCGTCACTACACTGACGTATGGGGTTCAATGTTTCAGTAGGTATCCGGACCACATGAAAAGACACGATTTCTTCAAAAGCGCAATGCCCGAAGGCTACGTACAAGAACGCACTATATTCTTCAAGGACGACGGCAACTATAAAACCCGCGCAGAGGTTAAATTTGAGGGGGACACACTGGTAAATCGGATCGAGCTGAAGGGTATCGACTTTAAAGAAGACGGAAACATATTGGGCCATAAGCTGGAATACAACTATAATGATCATCAGGTGTATATCATGGCCGATAAGCAGAAAAATGGAATCAAGGCAAACTTCAAAATTAGGCACAATATTGAGGATGGGGGCGTCCAGCTGGCCGACCATTACCAGCAGAATACTCCAATAGGCGATGGACCGGTGTTGCTTCCTGATAATCACTACTTGTTTACCACTAGCACCCTCAGTAAGGATCCCAATGAGAAGCGGGACCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACTGCCGCTGGCATAACTCATGGGATGGATGAGCTCTACAAAGGAGGGACAGGGGGTACCGGTGGTAGTGGTGGAACCGGCGGCCATGTAGTGGTGCAGAAGGCCCAGTTCAATTGGGACCCAGAGACAGTGGGCTTGATCCACGGCTCTTTCTTTTGGGGTTATATCGTTACTCAAATCCCAGGCGGTTTCATTTGTCAGAAGTTCGCCGCCAACAGAGTGTTCGGCTTCGCAATAGTAGCCACCTCCACACTGAACATGCTGATTCCGTCTGCAGCCCGAGTGCACTATGGCTGTGTGATATTCGTGAGAATCCTGCAAGGTCTTGTCGAGGGCGTGACCTACCCAGCCTGTCACGGGATCTGGTCCAAATGGGCTCCACCACTGGAGCGATCCAGACTGGCGACCACTGCATTCTGTGGCAGTTACGCCGGCGCTGTCGTGGCTATGCCCCTGGCTGGTGTGCTGGTGCAGTACAGCGGATGGAGCAGCGTGTTCTACGTTTATGGCTCTTTCGGGATCTTTTGGTACCTCTTCTGGCTGCTCGTCAGCTACGAATCCCCCGCTCTGCACCCTTCCATCAGCGAGGAGGAGCGGAAATACATTGAAGACGCAATCGGTGAATCAGCAAAGCTGATGAACCCCGTGACGAAATTCAATACACCGTGGAGACGGTTTTTTACCTCCATGCCCGTGTACGCGATAATTGTTGCAAATTTCTGCCGGAGCTGGACATTCTATCTCCTCCTGATTAGCCAACCTGCCTACTTCGAAGAGGTCTTCGGGTTCGAGATCTCTAAAGTGGGTCTTGTGTCTGCGCTCCCTCACCTCGTTATGACCATTATTGTTCCTATCGGCGGGCAGATCGCTGATTTTCTTCGGTCAAGACATATTATGTCCACTACTAATGTGAGGAAGCTGATGAATTGCGGTGGGTTTGGCATGGAGGCGACCCTGCTTCTGGTGGTGGGTTACTCTCATTCCAAGGGAGTGGCGATCAGTTTCCTGGTCCTGGCCGTGGGATTTAGCGGCTTTGCCATAAGCGGTTTTAACGTTAATCACCTTGATATTGCTCCCCGCTACGCATCCATTCTCATGGGGATCAGCAACGGAGTCGGGACTCTGAGTGGAATGGTTTGCCCAATAATAGTCGGAGCGATGACTAAACATAAGACCCGAGAAGAATGGCAGTACGTGTTCCTGATTGCTAGTCTGGTCCATTACGGAGGCGTCATCTTCTATGGCGTCTTCGCCTCTGGGGAAAAACAACCATGGGCAGAGCCTGAAGAAATGTCCGAGGAAAAATGTGGGTTCGTCGGGCACGATCAGCTTGCCGGTTCTGATGAGTCCGAGATGGAGGACGAGGTTGAGCCCCCTGGGGCGCCTCCTGCACCGCCCCCAAGCTACGGCGCAACCCATAGCACTGTGCAGCCTCCTCGGCCACCTCCTCCAGTGCGGGATTACTAA.(SEQ ID NO：3；vGlut-pHluorin).。
以下给出可在本文公开的平台和方法中用于控制报告分子(例如pHluorin)表达的人突触蛋白I启动子序列。
ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTCGTGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG(SEQ ID NO：4；人突触蛋白I启动子)。
可采用其它适合的启动子。例如，对于一般表达，可采用CMV或鸡β肌动蛋白启动子。或者，对于神经元特异性表达，可采用神经元特异性烯醇酶或突触蛋白I启动子。对于谷氨酸能特异性表达可采用vGlu1启动子。对于GABA能特异性表达可采用GAD65、GAD67、生长激素释放抑制因子(somatostatin)或GABA小泡转运蛋白启动子。本领域技术人员会明确其它适合的启动子。
以下是可用于本文公开的平台和方法的表达盒的实例，其具有与人突触蛋白I启动子有效连接的突触素-pHlurin。
ACTAATCTCCCCGCGGGCACTGCGTGTGACCTCACCCCCCTCTGTGAGGGGGTTATTTCTCTACTTTCGTGTCTCTGAGTGTGCTTCCAGTGCCCCCCTCCCCCCAAAAAATGCCTTCTGAGTTGAATATCAACACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGGCTGGGGGTCAGTTCCGGGTGGTCAAGGAGCCCCTTGGCTTCGTGAAGGTGCTGCAGTGGGTCTTTGCCATCTTCGCCTTTGCTACGTGTGGCAGCTACACCGGGGAGCTTCGGCTGAGCGTGGAGTGTGCCAACAAGACGGAGAGTGCCCTCAACATCGAAGTTGAATTCGAGTACCCCTTCAGGCTGCACCAAGTGTACTTTGATGCACCCTCCTGCGTCAAAGGGGGCACTACCAAGATCTTCCTGGTTGGGGACTACTCCTCGTCGGCTGAATTCTTTGTCACCGTGGCTGTGTTTGCCTTCCTCTACTCCATGGGGGCCCTGGCCACCTACATCTTCCTGCAGAACAAGTACCGAGAGAACAACAAAGGGCCTATGATGGACTTTCTGGCTACAGCCGTGTTCGCTTTCATGTGGCTAGTTAGTTCATCAGCCTGGGCCAAAGGCCTGTCCGATGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGTGCCGCCAGACAGGGAACACCGGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTAACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACGATCACCAGGTGTACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAGGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGGCCCGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTTTACAACTTCTACTCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAACCGGTCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCATGCGCGCACCTCCAGGCGCCCCGGAAAAGCAACCAGCACCTGGCGATGCCTACGGCGATGCGGGCTACGGGCAGGGCCCCGGAGGCTATGGGCCCCAAGACTCCTACGGGCCTCAGGGTGGTTATCAACCCGATTACGGGCAGCCAGCCAGCGGTGGCGGTGGCTACGGGCCTCAGGGCGACTATGGGCAGCAAGGCTATGGCCAACAGGGTGCGCCCACCTCCTTCTCCAATCAGATGTAA(SEQ ID NO：5；hSyn-SypHy表达盒序列)。
示例性pH敏感性染料(Cypher5E(GE Healthcare)和pHrodo(Invitrogen))为小分子荧光团，其在～pH5.5发出荧光并在～pH7.4淬灭。例如，Cypher5E在不同的pH发出不同荧光是由于其在pH5.5和pH7.4时具有不同的结构(图12)。在一些实施方案中，可采用pH敏感性染料跟踪小泡胞吐、胞吞和/或重酸化。通常，pH敏感性染料可透过细胞膜。
通常，pH敏感染料可与一种或更多种靶向部分连接，所述部分引导pH敏感性染料转运到突触小泡并防止其扩散出突触小泡。在一些实施方案中，所述连接是共价的。在一些实施方案中，所述连接是非共价的(例如，通过氢键、静电相互作用、亲和相互作用、范德华力等)。作为一小部分例子，pH敏感性染料可与下列相连：膜插入物(类似于FM1-43)；识别突触小泡蛋白的腔结构域的抗体；识别蛋白质标签的抗体，所述标签在突触小泡腔中的存在水平高于突触小泡腔外的存在水平。pH敏感染料还可结合大的不透过膜的非特异性分子，如葡聚糖。它们在小泡处于细胞表面时通过扩散进入突触小泡。
电刺激系统
本发明用于鉴定和/或表征调节物的测定通常涉及电刺激系统。引发动作电位的场刺激基于外部电场和细胞的细胞膜相对简单的电阻特性之间的物理相互作用。如果将典型的细胞体作为具有高电阻外壳(质膜)和相对低电阻内部(细胞质)的物体，则简单的静电理论表明，如果放置在电场中，细胞会有电压降，其由电场强度E与细胞体的大小d的乘积得到。例如，可认为电压降在一系列电阻上产生，两个对应于质膜，一个对应于细胞质。考虑到质膜的电阻与细胞质相比高很多，这表明基本上所有电压降发生在质膜上。在细胞的一面膜会去极化～(E x d)/2，而在相反面其会以相同的量超极化。对于神经元，预计如果一面足够去极化则会起始动作电位。电位刺激通常涉及电极对，其间有电压降(例如～10V/cm)以产生电场。作为非限制性实例，对于典型的直径为50μm的细胞体，每个细胞膜上的电压降为约25mV。
在多个实施方案中，采用电刺激系统在神经元细胞中刺激动作电位。在一些实施方案中，电刺激系统提供细胞跨膜电位，其足以在神经元细胞中诱导动作电位。在一些实施方案中，可将电刺激系统调整为基本上同时在含有神经元细胞的多个独立孔(例如在多孔板的多个孔中)中激发动作电位。电刺激系统可调整为对含有活神经元细胞的一个或更多个孔提供多种或定制的刺激波形。刺激波形可包含随时间变化的电场。
电极对中的电极可具有基本呈曲线形的表面。例如，电极对中的电极可制成同心圆柱体的形状。电极对中具有不同直径的电极可以同心圆柱排布，将更小直径的电极基本上放置在更大直径电极的腔部分内；任选地，两个同心环柱体电极可被环形绝缘材料分隔。本文公开的平台可包含放置装置，例如，设置为将多个电极对中的每个电极对有效放置在多个孔的一个孔中的电极转移系统。例如，市售多孔板自动化仪器可被改造用作电极转移系统，例如，biomek
Figure BPA00001358691200381
实验室自动化仪器。
含有电刺激系统的平台可包含与多个电极对有效连接的电源。所述电源通常被设置为向每个电极对提供预定电压(如电压脉冲)。电压的范围可为1V至400V、1V至300V、1V至200V、1V至100V、5V至100V、5V至50V、5V至20V或5V至10V。电压脉冲可最高为1V、约2V、约3V、约4V、约5V、约6V、约7V、约8V、约9V、约10V、约20V、约30V、约40V、约50V、约60V、约70V、约80V、约90V、约100V、约200V、约300V、约400V或更高。根据本公开内容，本领域技术人员会明确其它适合的电压。
平台还可包含与电源和多个电极对有效连接的脉冲发生器。所述脉冲发生器通常被设置为向每个电极对提供预定电压脉冲。所述脉冲发生器可设置为在预定时间内以预定频率提供多个预定电压脉冲。因此，所述脉冲发生器可设置为提供特定的电压波形。本文公开了示例性的波形。计算机可与所述脉冲发生器有效连接，并设置为控制所述电压脉冲的多个方面，例如每个脉冲的大小、与多个脉冲相关的波形、脉冲的持续时间、脉冲的频率、每个脉冲起始之间的持续时间等。
由脉冲发生器产生的预定频率的范围可为0.2Hz至200Hz、0.2Hz至100Hz、0.2Hz至50Hz、0.2Hz至40Hz、0.2Hz至30Hz、0.2Hz至20Hz、0.2Hz至10Hz、10Hz至20Hz、10Hz至30Hz、10Hz至40Hz、10Hz至50Hz或10Hz至100Hz。预定频率可最高为0.2Hz、约1Hz、约2Hz、约3Hz、约4Hz、约4Hz、约5Hz、约10Hz、约15Hz、约20Hz、约30Hz、约40Hz、约50Hz、约60Hz、约70Hz、约80Hz、约90Hz、约100Hz或更高。根据本公开内容，本领域技术人员会明确其它适合的频率。
脉冲发生器产生电压或多个电压的预定时间的范围可为0.1秒至2分钟、0.1秒至1分钟、0.1秒至45秒、0.1秒至30秒、0.1秒至20秒、0.1秒至15秒、0.1秒至10秒、0.1秒至5秒或0.1秒至1秒。所述预定时间可为约0.1秒、约0.5秒、约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟、约2分钟或更多。根据本公开内容，本领域技术人员能明确其它适合的时间。
由电压发生器产生的脉冲的持续时间可有所不同。例如，多个脉冲中每个脉冲的持续时间可基本上相同，或者与多个中的其它脉冲具有不同的持续时间。脉冲持续时间的范围可为0.1毫秒(msec)至10msec、0.1msec至5smec、0.1msec至4smec、0.1msec至3smec、0.1msec至2smec、0.1msec至1smec或0.1msec至0.5smec。脉冲的持续时间可为约0.1msec、约0.2msec、约0.3msec、约0.4msec、约0.5msec、约0.6msec、约0.7msec、约0.8msec、约0.9msec、约1msec、约2msec、约3msec、约4msec、约5msec、约10msec、约20msec或更多。根据本公开内容的教导，本领域技术人员会明确其它适合的持续时间。
脉冲发生器产生的脉冲的数量(例如在多个脉冲中)也可有所不同。脉冲的数量的范围可为1至5000、1至2000、1至1000、1至500、1至400、1至300、1至200、1至100、1至50、1至40、1至30、1至20、1至10或1至5。脉冲的数量可为约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000或更多。根据本公开内容的教导，本领域技术人员会明确其它适合的脉冲数。
多个脉冲中每个脉冲的起始之间的时间可有所不同。多个脉冲中每个脉冲的起始之间的时间范围可为0.1msec至20msec、0.1msec至10msec、0.1msec至5msec、0.1msec至4msec、0.1msec至3msec、0.1msec至2msec、0.1msec至1msec或0.1msec至0.5msec。多个脉冲中每个脉冲的起始之间的时间可为约0.1msec、约0.2msec、约0.3msec、约0.4msec、约0.5msec、约0.6msec、约0.7msec、约0.8msec、约0.9msec、约1msec、约2msec、约3msec、约4msec、约5msec、约6msec、约7msec、约8msec、约9msec、约10msec、约20msec或更多。根据本公开内容的教导，本领域技术人员会明确其它适合的持续时间。
在多个实施方案中，对神经元施用的刺激波形诱导突触小泡的胞吐和胞吞作用，以使可在受控的实验条件下研究突触小泡循环。在一些实施方案中，通过将电压或电流波形施加到位于与神经元细胞接触或在其附近的电极对来产生刺激波形。将电压或电流波形施加到电极可在神经元细胞内产生随时间变化的电场和/或随时间变化的电流密度，并且这些电场和/或电流密度可改变细胞的跨膜电位并在神经元细胞中诱导动作电位。
如Ryan和Smith(1995，Neuron，14：983；通过引用并入本文)以及Ryan等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：5567；通过引用并入本文)所述，可通过施加激发波形来刺激培养物、悬液和/或其它制备物中的神经元细胞。一个重要的因素是将电极与含有神经元的浸液的接触区域最大化(并减少接触电阻)同时增加细胞周围的浸液的电阻。维度l(长)和截面积A的盐溶液块的电阻如下：R＝ιXρ/A，其中ρ为盐溶液的导电性(对于哺乳动物盐溶液来说～60Ω)。对于多孔板中的单孔，ι约为孔的直径(例如，对于96孔板～5mm)。可通过尽可能减少溶液的深度来降低A的值。例如，可将孔设计为将深度最小化(因而增加R)。在一些实施方案中，可采用～0.5mm的总厚度。在一些实施方案中，可制作装备入孔中的嵌片，以使两个电极片位于孔的两边而它们之间有所需的溶液深度(例如，～0.5mm)。
在图2A-B中显示了用于电刺激系统的电极对100的一个具体实例。在显示的实例中，电极组件包含两个电极，内电极102和外电极104。在多个实施方案中，电极102、104是导电的。电极可由金属、半金属、半导体、导电聚合物、不导电聚合物和/或其任何组合制成。当采用不导电材料制成时，可用导电材料包被电极。电极可由生物相容性金属或导电材料(例如，金、银、多种不锈钢合金、钛、铂、导电聚合物、铟锡氧化物(ITO)、其组合等)形成或包被。内电极102可为固体棒状组件、电线，或为空心圆柱状。如在图2A-B所示内电极的特征可为高Hi和直径Di。在多个实施方案中，外电极104至少在与神经元细胞培养物接触或紧邻的远端190为圆柱状或环状。外电极可为导线环、由导电材料的细带形成的环状带，或圆柱形的导电管。如图2A-B所示，外电极104的特征可为高Ho和直径Do。在一些实施方案中，Hi≈Ho并且Di＜Do。在一些实施方案中，Hi＜Ho并且Di＜Do。在一些实施方案中，Hi＞Ho并且Di＜Do。在一些实施方案中，内电极102作为阴极并且外电极104为阳极。在一些实施方案中，内电极102作为阳性并且外电极104为阴极。在多个实施方案中，激发区域150位于内电极102和外电极104之间。
电线110、112或它们的导电等同物(例如电路板上的导线路、二相同轴电缆等)可连接到内电极102和外电极104。在多个实施方案中，电线110、112或它们的等同物可具有低欧姆的电阻或阻抗，例如小于约100欧姆。在一些实施方案中，电线或它们的等同物可具有大于约100欧姆的欧姆电阻或阻抗。电线或它们的等同物可具有远距离的连接器120，其将电压或电流波形施加到电线。在多个实施方案中，电线或它们的等同物为一个或更多个电极对以及一个或更多个连接器提供电连接。在一些实施方案中，对电线或它们的等同物施加电压波形V1、V2。
在多个实施方案中，施加到连接器120的电压波形V1、V2由电极102、104传导并在电极之间的激发区150产生电场。电压波形V1、V2或电流波形I1、I2可源自电学领域的技术人员已知的多种类型的电装置，例如，它们可产生自函数发生器、波形发生器、可编程波形发生器、与数据获取硬件相组合的计算机、与模拟数字(A/D)板(其可将计算机处理器的数字输入转化成模拟输出)组合的计算机。在一些实施方案中，电压波形V1、V2中的一个或两个会随时间变化，并且它们的形状可由使用者选择或编程。图3A-D显示了可施加到连接器120并传导至电极102、104的电压波形的实例。施加的波形V1、V2的特征可为一个或更多个电压峰V1p1、V2p1、V2p2，电压偏移、波形的形状、电压变化速率以及周期的重复率。在一些实施方案中，V1或V2波形中的一个可基本维持在参照电位不变，例如0伏特、0.5伏特、-1伏特，如在图3A-B所示。在一些实施方案中，两个波形均可随时间变化，如图3C-D所示。应理解，具有可对电极对100施加具有不同的电压偏移、幅度、形状、变化速率和周期的多种波形中的任何一种。
在多个实施方案中，将电压波形施加到电极对在基本上位于电极102、104之间的激发区域150中产生随时间变化的电场。当电极接触或紧邻含有在基质中的神经元细胞的孔时，电场可耦合入基质中并影响基质中、细胞中、跨细胞膜的或任何其组合的离子运动。任何区域中电场的存在伴随着该区域中的电位梯度。含有神经元细胞培养物的孔中随时间变化的电位梯度和/或离子运动可改变神经元细胞的跨膜电位并刺激轴突的激活和相应的突触小泡循环。在多个实施方案中，突触小泡循环的刺激由施加到电极对100的电压或电流波形控制。
可对电极对施加多种的电压或电流波形。一般地，可在本发明中采用的电压或电流波形在这样的范围内，即在刺激引发动作电位和对细胞造成电穿孔或者以其他形式对细胞有毒性之间。在一些实施方案中，电极对100在含有神经元细胞培养物的孔中产生的电场
Figure BPA00001358691200421
的大小可在宏观区域的空间上有变化，而在微观区域上基本均匀，如在图4A-B中所示。图4A-B表示瞬时电场。在图4A-B中，线300代表在某时刻电场
Figure BPA00001358691200422
的方向，线的密度代表在所述时刻电场的大小。如在图4A所示，电场大小可在激发区中宏观区域的空间上有变化。例如，外部导体104附近线的密度比中央导体附近的低，从而外部导体附近的电场比中央导体附近的弱。如在图4B中所示，在单个细胞附近微观区域的空间上电场的大小可为基本相同的。
在本发明中可采用多种电极。在图2A-B和图5A-H中显示了示例性电极设计。例如，可采用圆形电极设计，因为其易于构建和应用。图2A-B所示的圆形电极对的一个有用特点是可同时观察激发区150中一定范围的电场值对细胞的作用。对于在某时刻施加到电极102、104的给定电压值V1、V2，电场在激发区150中会具有一定范围的值，所述值在中央导体102附近最高，而在外部导体104附近最低，如图4A所示。通过记录激发区150中多个环形区305的数据，可以同时观察不同电场值下电场激发对细胞的作用。
在多个实施方案中，含有神经元细胞培养物的孔中或位于激发区150的环形区305中的神经元细胞附近的瞬时电场大小
Figure BPA00001358691200431
可随时间在约0伏特每厘米(V/cm)和约5v/cm之间变化。如本文所用，将电场的瞬时大小定义为在某时刻电场的绝对值。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约10v/cm之间随时间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约20v/cm之间随时间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约30v/cm之间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约50v/cm之间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约75v/cm之间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约100v/cm之间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约150v/cm之间变化。在一些实施方案中，瞬时大小可在约0V/cm和约200v/cm之间瞬时地变化。一般地，孔中给定位置的电场的瞬间大小部分地取决于以下方面，即电极的几何构造、神经元细胞培养基以及附近的物质的电特性。在多个实施方案中，控制施加到电极102、104的电压或电流波形以在包含神经元细胞的孔中产生所需的电场的瞬时大小和对时间的变化谱。
在一些实施方案中，施加到电极的波形峰值(例如电压峰、多个电压峰、电流峰、多个电流峰)可根据仪器的性能和待检测的突触小泡循环参数来确定。例如，本发明中可使用方波。合适的方波可具有0至100V范围的幅度峰值、0至100mA范围的电流峰值、0至100Hz范围的重复率、0至1分钟范围的电刺激持续时间。表1中显示了适用于本发明的示例性参数。
在一些实施方案中，可采用荧光显微镜确定轴突中动作电位的刺激(Ryan和Smith，1995，Neuron，14：983；通过引用并入本文)。在一些实施方案中，可增加施加到电极对中的电极上的峰值直至观察到预期生物物理结果，例如，观察到指示神经元细胞中动作电位引发的荧光信号。对于图2A-B中所示的电极对，所需的结果可能首先在电极102附近出现。在一些实施方案中，可增加峰值直到在激发区150的预期部分检测到预期结果，并且将所述峰值选为随后的操作值。在一些实施方案中，可增加峰值到“临界值”(即首次观察到预期生物结果时的值)外的过量值，并且采用该峰值作为随后的操作值。
应理解可以多种几何构造形成电极。在图5A-H中显示了多种电极对设计的实例，其中电极具有远端490和插入激发区450。在图示中省略了导线和连接器以简化视图。在多个实施方案中，电极对(例如电极402a、404a)可浸入包含细胞和基质的孔中。在一些实施方案中，电极402a、404a可包含针或棒。在一些实施方案中，电极对可包含棒402c和薄板404c，或平行板402e、404e。如在图5G-H所示，电极对可包含多个电极元件402g、404h，例如，多个针、棒或板，或任何其组合。
在多个实施方案中，如图6A-B所示，至少一个电极对被整合入电极组件500。可将电极102、104固定或由固体材料503支撑。在一些实施方案中，固体材料503是不导电的，例如聚合物或塑料。在一些实施方案中，材料503是透明的，使得可从顶部501观察电极的放置。在一些实施方案中，材料503是不透明的，以使其阻挡光线。可通过胶、热连接、压配或任何其组合将电极102、104固定在材料503上。在多个实施方案中，导线510、512可排布在材料503上，并与电极102、104电连接。可通过焊接、导电胶或压力接触在导线和电极之间建立电连接513。在一些实施方案中，导线510、512在材料503相对的面上。在一些实施方案中，导线510、512可位于材料503的同一面。例如，对于在图2A-B中所示的电极组件，在图6A中显示的线路510、512的排布对制造来讲可能更加实用。对于在图5A-H中所示的电极布局，导线可位于支持材料503的同一面或相反面。
在图6C的照片中显示了电极组件的一个具体示例性实施方案。所述组件具有位于其远端190的电极对，与在图2A-B中所示的类似。在照片中可见外电极104。圆柱状固体材料503支撑内电极102和外电极104。电线110和112分别与内电极和外电极连接。在照片中一条电线的末端可见连接器120。
对于图7A-C，在多个实施方案中，在多电极组件600中排布了多个电极对602、604，所述组件适于在多孔板中使用，例如24孔板、96孔板、384孔板。在一些实施方案中，多电极组件包含对应多孔板每个孔的电极对。在一些实施方案中，多电极组件包含的电极对少于对应多孔板的孔数。电极602、604可由非导电材料的板603支撑。导线610可分布在板603的上表面并对每对电极的一个电极602提供电接触。可对所有线路610进行电连接并进一步连接到连接固定装置622(如接触板、插座、BNC插座)，使得对固定装置622施加波形提供将所述波形基本上同时施加到所有电极602。导线612可布置在板603的下表面并对每对电极的配对电极604提供电接触。可对所有线路612进行电连接并进一步连接到连接固定装置624(如接触板、插座、BNC插座)，使得对固定装置624施加波形提供将所述波形基本上同时施加到所有电极604。
在一些实施方案中，可采用地线层或导电材料层建立与每个电极对中电极602或604之一的接触，而不是采用单独的线路。例如，板603的一面可具有沉积于其上的薄金属或导电膜，电极602或604之一可焊接在所述薄膜上。在一些实施方案中，薄金属或导电膜可沉积在板603的两面，其中一面的膜与每个内电极602电连接，而相对面的膜与每个外电极604电连接。在这样的安排中，可能需要去除板603一面每个内电极周围的膜区域以使内部和外电极不会被所述膜短路，例如通过钻孔或加工。
在多个实施方案中，电极对602、604可布置成使得它们中的所有均可同时浸入到包含细胞和基质的多孔板的孔中。例如，电极对的中心到中心的间距与多孔板中孔的中心到中心的间距基本匹配。在多个实施方案中，电极602、604超出板603下表面的延长L允许电极对的远端690接触多孔板每个孔的底部或与之接近。在多个实施方案中，外电极604的直径Do的大小基本与多孔板中孔的内直径匹配或更小。在一些实施方案中，内电极的直径Di可为约1mm，并且外电极的直径Do可为约6mm。在一些实施方案中，内电极的直径Di可为约1mm，外电极的直径Do可为约3mm。
在一些实施方案中，每列电极对可独立于其它列被单独地激活。在图8A中所示的多电极组件700表示为单独刺激电极对列而提供的实施方案。对该实施方案，通过对连接固定装置722A-722L中的一个施加波形可单独地激活每列电极对。应理解线路610可沿行排列而不是沿列，以使每行电极对独立于其它行地被激活。
在一些实施方案中，连接固定装置722A-722L可分布在支持板603的至少一部分上。在一些实施方案中，导线610的模式可使得连接固定装置722A-722L位于图8B所示的位置。在一些实施方案中，放置的连接固定装置可与标准化的电连接器(例如多针的外凸或内孔连接器)电连接，所述连接器牢固地装配在支持板603上。采用标准连接器可减少准备时间并便于多电极组件600、700的相互替换。
在一些实施方案中，多电极组件600、700和多孔板可装配在放置装置上。所述放置装置可将多电极组件和多孔板放置在所选位置以使数据依次从一个或更多个孔中被记录。在一些实施方案中，所述放置装置包含运动控制平台。在一些实施方案中，放置装置由例如计算机、微处理器或微控制器自动控制。
图9的框图中显示了用于操作多电极组件600、700的电控制系统800的一个具体示例性实施方案。在多个实施方案中，电控制系统包含波形发生器810。波形发生器810产生一个或更多个波形信号818，其可被传输到放大单元870。放大单元可接受一个或更多个波形信号，并增加每个波形信号的幅度或电流或其两者。而后放大单元870可将放大信号878传输至多电极组件600、700。进入放大单元870的信号818可向多个分离的电线提供，可通过无线传输提供，或可通过多芯电缆束提供。从放大单元870传输的信号878可向多个分离的电线提供，可通过无线传输提供或可通过多芯电缆束提供。可在放大单元870的输入处或在信号放大后提供针对每个信号的电隔离。在多个实施方案中，电隔离防止所施加的电信号反射传递回波形发生器810。波形发生器810可接受来自外部来源的输入控制电信号802，例如起始一个或更多波形的施加的计时信号、幅度控制信号、重复率控制信号、波形形状控制信号。波形发生器810可向外部仪器提供输出控制电信号816，例如计时信号、引发信号、同步信号。
在一些实施方案中，波形发生器810可为计算机或个人电脑或笔记本电脑。在一些实施方案中，波形发生器810可为独立的功能发生器、可编程波形发生器、微处理器、微控制器或脉冲发生器。在一些实施方案中，波形可在计算机、微处理器或微控制器上执行的软件中产生，其控制计算机、微处理器或微控制器的一个或更多个输出端的电压或电流。在一些实施方案中，波形发生器810可包含与多端口数据获取装置或多端口模拟数字板组合的计算机、微处理器或微控制器。
在一些实施方案中，电刺激系统包含经改造的市售电穿孔系统。例如，从Cellectricon(Moldnal，Sweden)购得的CellAxessHT系统可改造成适合在多孔板孔中的神经元细胞中激发动作电位。CellAxessHT系统设计用于对在384孔板的孔中培养、悬浮和/或以其它方式包含的细胞进行电穿孔。对于细胞的电穿孔，在细胞附近施加电场，其中电场的大小足以穿过细胞膜产生水化通道。CellAxessHT系统具有可对384孔板中96个孔的细胞同时电穿孔的多电极组件。在一些实施方案中，CellAxessHT多电极组件不经改造地用于向384孔板测定孔中的神经元细胞提供刺激波形。在一些实施方案中，将CellAxessHT进行改造(例如，电极大小、间隔和/或排布的改变)以向96孔板测定孔中的神经元细胞提供刺激波形。
在一些实施方案中并作为一个额外的实例，从Cellictricon AB购得的改造的CellAxess CX3电穿孔系统可用于对孔中的神经元细胞进行电刺激。在多个实施方案中，经改造的CX3系统包含三对经改造的电极和低自发荧光的塑料组件。所述电极可在它们的激发区域提供基本一致的场。在多个实施方案中，将电极进行改造以装配在96孔板中，并能基本同时地刺激孔中神经元细胞的突触小泡循环。CX3系统可提供电压峰值在约1伏特至约100伏特的激发电压波形。
替代性刺激系统
在一些实施方案中，采用声或超声刺激来激发神经元细胞的动作电位。在一些实施方案中，声刺激包含施加到多孔板孔中(一个或多个)神经元细胞的一个或多个声或超声脉冲。在一些实施方案中，可将声能转换器与包含(一个或多个)神经元细胞的孔接触或置于其附近。在一些实施方案中，声能转换器的阵列可与包含神经元细胞的孔的阵列在空间上相匹配，并且将转换器的阵列与包含神经元细胞的孔的阵列接触或置于其附近。在一些实施方案中，转换器的阵列不需要与包含神经元细胞培养物的孔的阵列在空间上匹配。例如，转换器阵列中的转换器可与包含神经元细胞的孔的阵列中每逢第二、第三或第四个孔在空间上匹配。在一些实施方案中，声能转换器可以线性阵列排布，例如，对应多孔板行或列的阵列。在多个实施方案中，超声脉冲起始神经元中动作电位的引发。可在网站arraytherapeutic.com/research/index中获得声或超声刺激系统的实例。
在一些实施方案中，通过光学方法激发神经元细胞的动作电位。在一些实施方案中，可在神经元细胞中表达光门控离子通道，如光敏感通道(channelrhodopsin)。而后光脉冲可用于激活光门控离子通道，将神经元去极化并起始动作电位。在一些实施方案中，通过将具有光门控离子通道的培养、悬浮和/或以其它方式制备的神经元暴露在快速的光脉冲系列中来以高重复率进行动作电位的引发。可通过一个或更多光系统(发光二极管、二极管激光器、白炽灯、氖灯)提供光脉冲。在多个实施方案中，一个或更多发光系统的辐射提供光门控离子通道有应答性的波长。在多个实施方案中，一个或更多发光系统发出的辐射导向一个或更多神经元细胞。透镜、光过滤器、镜子或其它光学组件可将发出的辐射汇聚和/或导向一个或更多神经元细胞。
在一些实施方案中，发光设备的阵列以及所附的光学组件可与包含神经元细胞的孔阵列在空间上匹配，并且发光设备的阵列适于照射包含神经元细胞的孔的阵列。在一些实施方案中，发光设备的阵列不需要与包含神经元细胞的孔的阵列在空间上匹配。例如，发光设备可在空间上与包含神经元细胞的每第二、第三或第四个孔匹配。在一些实施方案中，所述发光设备可以线性阵列排布，例如对应多孔板行或列的阵列。在多个实施方案中，发光设备的光脉冲起始神经元细胞中神经元动作电位的激发。
在一些实施方案中，采用光激活谷氨酸受体LiGluR起始动作电位的激发。在多个方面，神经元细胞包含具有细胞外半胱氨酸的修饰的红藻氨酸受体，光激活配体可结合其上。以所选波长对相连的配体进行照射可翻转或转换配体的构象。在光转换时，谷氨酸被置于受体的结合穴，其可起始动作电位的激发。在多个实施方案中，采用一个或多个发光设备来对光激活配体进行光转换。发光设备可在阵列中排布并包含另外的光组件，如在以上对采用光门控离子通道的实施方案的描述中所述的。在一些实施方案中，采用LiGliR和光转换活化来诱导神经元细胞动作电位的高频率引发。
在一些实施方案中，可采用光传导刺激来诱导神经元的动作电位。光传导是允许使可兴奋细胞(如神经元)快速、非侵入性去极化的技术。通常地，光传导刺激可用于在神经元中诱导动作电位，所述神经元包括在培养物中生长的。细胞可在工业标准的多孔板中生长，和/或随后被放置在可重复使用的皿中在显微镜下进行活体观察。提供的电子可在使用者可设定的频率和强度下将细胞去极化。通常，光传导刺激不涉及对细胞的直接物理相连(如电极或晶体管接触)。可在网站membrasys.com/techynology.asp中找到光传导的实例。
检测技术
在多个实施方案中，突触小泡循环平台包含用于监测突触小泡循环相关活性的检测系统。在一些实施方案中，检测系统提供神经元细胞(例如，在多个孔中)的成像。在一些实施方案中，检测系统提供对从包含神经元细胞的孔的至少一个区域发出的光的监测。在多个实施方案中，检测系统与电刺激系统交换信息，以使突触小泡循环的刺激和检测基本同步。
在一些实施方案中，突触小泡循环测定具有一个或更多个以下特征：(a)所述测定是基于荧光的动态测定，例如在突触小泡循环活动期间包含神经元细胞的孔中的荧光量可随时间变化；(b)来自报告物的信号未被放大，其与通常用于高通量筛选测定的相比可提供更弱的信号；以及(c)突触小泡循环由受控的刺激系统激活。在多个实施方案中，突触小泡循环系统的检测系统能够检测来自一个或更多个神经元细胞的低水平、随时间变化的荧光信号，并且作为系统的一部分被物理性整合，使得其可与电激发系统联合运作。在一些实施方案中，检测系统可提供对检测信号的捕获、传送和/或分析。检测信号的分析在一些实施方案中可在约1分钟内完成。
平台还可包含含有至少一个检测器的检测系统。通常检测器包含设置为从孔中检测发光信号的光学传感器。检测器还可包含设置为从孔中收集发光信号的物镜。物镜可与光学传感器(如电荷耦合器件照相机等)有效连接。物镜可为空气物镜。或者，物镜可为浸水或浸油透镜。
通常，空气物镜与浸水或浸油透镜相比具有更低的数值孔径(numerical apertune，NA)。因为NA直接控制由物镜收集的发出光子的分数，通常空气物镜与浸水或浸油透镜相比收集更少的光子。申请人发现一些应用(例如可包含使用一个或更多个空气物镜的高通量平台)，与物镜相关的低收集效率可以多种方式进行补偿。例如，与空气物镜相关的低收集效率可通过增加视野中被拍照的突触数(例如通过增加神经元细胞数，通过增加视野区域大小等)和/或通过增加报告蛋白质表达的效率和特异性来补偿。因此，申请人发现可采用一个或更多个低数值孔径空气物镜以高通量方式以高敏感性检测突触小泡循环的方面，例如可检测到神经元细胞中应答于低至5至10个动作电位的突触小泡循环的方面。
物镜可具有的放大倍数为5x、10x、20x、40x、60x或100x。根据本公开内容的教导本领域技术人员会明确其它适合的放大倍数。物镜可具有的数值孔径范围为0.1NA至1.4NA、0.1NA至1.3NA、0.1NA至1.2NA、0.1NA至1.1NA、0.1NA至1.0NA、0.1NA至0.9NA、0.1NA至0.85NA、0.1NA至0.8NA、0.1NA至0.75NA、0.1NA至0.7NA、0.1NA至0.65NA、0.1NA至0.6NA、0.1NA至0.55NA、0.1NA至0.5NA、0.1NA至0.45NA、0.1NA至0.4NA、0.1NA至0.35NA、0.1NA至0.3NA、0.1NA至0.25NA、0.1NA至0.2NA或0.1NA至0.5NA。物镜可具有的数值孔径为约0.1NA、约0.15NA、约0.2NA、约0.25NA、约0.3NA、约0.35NA、约0.4NA、约0.45NA、约0.5NA、约0.55NA、约0.6NA、0.65NA、约0.7NA、约0.75NA、约0.8NA、约0.85NA、约0.9NA、约0.95NA、约1NA、约1.1NA、约1.2NA、约1.3NA、约1.4NA或更大。根据本公开内容的教导本领域技术人员会明确其它适合的数值孔径。
检测器可设置为检测多种视野面积的发光信号。所述检测器可设置为检测范围为0.1mm至10mm、0.1mm至9mm、0.1mm至8mm、0.1mm至7mm、0.1mm至6mm、0.1mm至5mm、0.1mm至4mm、0.1mm至3mm、0.1mm至2mm、0.1mm至1mm或0.1mm至0.5mm的视野区域的发光信号。物镜可设置为从约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更大的视野区域收集发光信号。根据本公开内容的教导，本领域技术人员会明确其它适合的视野区域。
检测系统可包含与检测器有效连接的计算机，并且其中计算机设置为将所述检测器的发光信号转化为表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。
在检测系统的一些实施方案中，可采用光学组件(例如透镜和滤镜)对神经元细胞中突触小泡循环的活性进行成像，在电荷耦合器件(CCD)检测器阵列上捕获荧光发射信号或荧光发射物的图像。成像系统可检测从报告荧光团(例如与突触小泡蛋白质腔内结构域连接的GFP)发出的荧光放射。捕获的图像可为多孔板孔的一部分。一旦在CCD阵列上电子化地捕获了图像，随后可在执行数据处理软件的计算机中处理信号。可依次地捕获图像或信号以提供突触小泡循环期间荧光的动态分析。
在图10中描述了可提供多孔板孔中突触小泡循环相关活性图像的检测系统的非限制性实例。在多个实施方案中，倒置落射荧光显微镜910用于对含有神经元细胞的孔中的荧光发射进行成像。例如，具有物镜920(例如，10X，0.45NA的空气物镜)的Zeiss Axiovert Z1可对孔908的至少部分中的突触小泡循环活性成像。在多个实施方案中，每个孔906的底部的至少一部分是透明的，以使孔中的神经元细胞可通过孔底部进行光学观察。图像可在与显微镜耦合的CCD阵列930上捕获。CCD阵列可与计算机进行信息交换，以使图像可被转移到并任选地储存入计算机的存储器中。随后可通过计算机加工图像以提取涉及突触小泡循环的相关信息。
在多个实施方案中，成像系统(例如显微镜910)允许开放性地到达多孔板915的孔908，以使多电极组件600可从平板上方放置入孔中，如图所示。在多个实施方案中，多孔板915装在放置装置945上以对多孔板的每个孔依次进行检查。放置装置945可方便地是自动化的和/或用计算机控制，并任选地与电激发系统、图像捕获装置和/或数据处理系统同步。对于数据的自动捕获和处理，CCD阵列930、显微镜910、放置装置945和多电极组件600可通过有线或无线连接962、964、966、968与中央控制器(例如计算机、微控制器、微处理器)交换信息。
在一些应用中，低速率的分析可能对实验者或使用者的需要已经足够，并且图10所示的突触小泡循环系统的实施方案的元件对特定应用可能是足够的。例如，在一些实施方案中，突触小泡循环的持续时间为约30秒至约150秒，例如约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约70秒、约80秒、约90秒、约100秒、约110秒、约120秒、约130秒、约140秒或约150秒。因此，每个孔可以任何这些持续时间成像。在一些实施方案中，每个孔可以短于这些持续时间的时间成像，例如，约5秒、约10秒、约20秒、约30秒或约40秒。采用单个显微镜每次检测一个孔，并假设与成像时间相比数据处理时间是可忽略的，对96孔板来说数据捕获和处理时间可在约1小时至约4小时之间，例如，约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时或约4小时。如果需要更高速的分析，可采用平行检测系统。
图11显示了可用于高通量突触小泡循环系统的实施方案的平行检测系统1000。在多个实施方案中，平行检测系统1000包含透镜阵列1070和检测器阵列1080。透镜阵列1070可包含透镜1072的阵列，所述透镜可在一个维度上分布(例如以对应孔906的行或列的多个孔的布局)，或可在两个维度上分布(例如以对应孔的行和列的多个孔的布局)。在一些实施方案中，透镜阵列1070的透镜可与多孔板中每个孔的位置在空间上匹配。透镜阵列1070不需要与行和/或列中的每个孔在空间上匹配。例如，透镜可与行和/或列的每隔一个孔匹配，或每第三个孔、每第四个孔、每第五个孔或每第六个孔。当透镜未与每个孔匹配时，可将多孔板915在读板时移动到未读的相邻孔。
检测器阵列1080可包含光检测器1082的阵列。光检测器1082可为高敏感检测器，例如光电倍增管、雪崩光电二极管、硅漂移检测器等。滤光镜可放置在检测器以上，例如，为了减少与孔906中荧光团标记样本的荧光发射的波长不同的波长的放射。在一些实施方案中，光检测器阵列1080中的检测器可与多孔板每个孔的位置在空间上匹配。在一些实施方案中，光检测器1082的分布布局可与透镜阵列1070中的透镜1072匹配。在多个实施方案中，每个透镜1072收集从孔906的至少一部分发出的荧光，并将收集的光导入对应的光检测器1082。来自每个光检测器1082的信号可通过有线或无线连接1062传导入中央控制器(例如计算机、微处理器、微控制器等)以进行随后的处理。在一些实施方案中，可采用光隔板或不透明材料将每个光检测器1082与邻接或附近的孔进行光分离，以使每个光检测器只接收从直接与其对应收集透镜1072相对的孔的荧光。在多个实施方案中，透镜1072可包被有抗反射涂层和/或通带涂层。
在一些实施方案中，可在本系统中采用能平行地对多个孔(例如，4、16、24、48、96、384孔)成像的读板器。例如，可采用市售读板器(例如，从Perkin Elmer，Waltham，MA购得的平板显示(plate::vision)系统)作为平行检测系统。该读板器能进行基于动态的荧光分析，并允许接近多孔板上方以整合多电极组件。平板显示(plate::vision)系统具有高收集效率的光学系统并具有为平行分析96孔而设计的特殊光学系统。发明人评价了平板可见系统平行记录多孔中突触小泡循环的能力并在实施例部分进行了详细描述。另外的适合的平行读板器包括但不限于FLIPR(Molecular Devices，Union City，CA)、FDSS7000(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)和CellLux(Perkin Elmer，Waltham，MA)。
在多个实施方案中，处理从图10所示的成像系统或图11所示的平行检测系统收集的信号以评价作为时间的函数的突触小泡循环或突触小泡活性。在一些实施方案中，将代表突触小泡循环的信号(例如荧光信号)作为时间的函数记录。可记录信号的强度和/或重复率。对于包含成像系统的实施方案，对于一个神经元细胞培养物可记录多个信号，其中每个信号对应培养物中的特定位置或神经元。对于包含成像系统的实施方案，可组合多个孔的信号以获得包含神经元细胞的孔的总信号或平均信号。
在多个实施方案中，代表突触小泡循环或神经活性的信号可作为本发明突触小泡循环测定的读数来评价。在一些实施方案中，突触传递的电生理分析可用作本发明测定的读数。例如，代表突触疲劳的信号可用作鉴定影响突触传递的化合物的本发明测定的读数。在一些实施方案中，代表突触小泡循环或神经活性的信号(例如荧光信号)可显示振动、波动、某些波形形状、指数轨道(例如，饱和或恢复)、增加速率(例如荧光增加速率)、减少速率(例如荧光减少速率)和/或噪声样特征。在多个实施方案中，可分析信号以定量观察到的特性。例如，代表突触小泡循环或神经活性的信号可显示指数衰减。对于这种信号，可将观察到的信号对包含指数衰减的数学表达式(如，exp(-t/τ))进行拟合以获得τ的值，其中t表示时间，τ表示特征性衰减常数。
刺激和检测系统的相互连接
在多个实施方案中，电刺激系统和检测系统相互连接并整合入突触小泡循环检测系统，如图10(低通量平台的示例性描述)和图11(高通量平台的示例性描述)所示。多电极组件600、其相关电子设备以及检测系统可通过通信连接966、962、964、968、1062与中央控制器(例如，计算机、微处理器、微控制器等)相连接，使得实验步骤、数据采集和数据处理可基本上自动化或半自动化。在多个实施方案中，多电极组件600的电极602、604可从多孔板上方方向与多孔板915孔906中的神经元细胞培养物相接触，并且检测系统位于孔下方。电刺激系统与检测系统与中央计算机相互连接的自动化实验步骤的例子为，计算机可执行以下步骤：(a)发出让放置装置945将第一个孔放置在显微镜物镜920上方的电子命令，(b)发出初始化显微镜操作参数的命令，例如选择透镜、滤镜设置，(c)初始化CCD阵列，例如电源设置、增益设置、电子快门速度等，(d)开始从CCD阵列获取数据，(e)向电子刺激系统发出电子命令以将一个或更多个波形施加到第一个孔中的电极，(f)发出终止波形施加的命令，(g)终止从CCD阵列接收数据，并且(h)向放置装置945发出移动到另一个孔的命令并重复(b-h)的循环。
在一些方面，可采用连接系统评价多种电极设计引发神经元细胞中突触小泡循环的能力，例如，如在实施例部分中示例的。一个非限制性实施例是，用表达synaptopHluorin、vGlut1-pHluorin-或synaptophysin-pHluorin-腺相关病毒感染96孔板培养物中的原代神经元。在培养阶段后，可用测定缓冲液替换培养基。而后可将平板放置在突触小泡循环系统中，并且将电极放置入孔中。施加电压波形，至少部分由synaptopHluorin产生的荧光被导入检测装置并记录(例如，作为图象、一系列图像、强度水平和/或一系列强度值的形式)。如图10所示，可用倒置显微镜进行一个或更多个细胞培养物中与突触小泡循环相关的活性的成像。如图11所示，随时间变化的荧光信号的检测可用倒置显微镜或透镜和光检测组件进行。针对不同电极设计可进行重复刺激，比较得到的数据以评价多种电极设计的效率。
平台
在一些实施方案中，本发明的突触小泡循环测定在低通量平台上进行。通常，低通量测定系统采用更好的光学设备(例如，落射荧光显微镜)，提供更好的分辨率。因此在一些实施方案中，低通量平台能表征单个突触。通常，低通量平台对定性单个化合物的作用尤其有效。例如，可采用低通量平台分析治疗特定疾病的已知药物以确定其是否影响突触小泡循环。图10中描述了示例性低通量平台。
高通量平台
在一些实施方案中，本发明的突触小泡循环测定可在高通量平台上进行。高通量平台对从大量候选物或测试物中鉴定突触小泡循环调节剂(例如刺激物和/或抑制物)的盲筛尤其有效。在一些实施方案中，高通量筛选测定可包括以下步骤：(a)提供本文所述的多个神经元细胞，(b)提供多个测试物以使多个测试物的成员与多个神经元细胞的每个接触，(c)如本文所述进行突触小泡循环测定，以及(d)确定与对照相比多个测试物的任何成员是否调节与突触小泡循环相关的一种或更多种活性。
在一些实施方案中，在多个孔中提供多个神经元细胞。例如，可采用多孔板(例如24、48、96或384孔板)进行高通量测定。图11描述了示例性高通量筛选系统。
为了在多孔板中诱导突触小泡循环，高通量平台通常包括刺激系统以在孔中产生场电位。在一些实施方案中，从上方可达到平板的孔以将刺激技术整合入测定系统。在一些实施方案中，可采用定制开发的多孔电刺激器。在一些实施方案中，适于本发明的多孔电刺激器包含可放置在含有多个神经元细胞的孔中的多个电极对。电极可包含内部的棒状导电电极，其被外部的圆柱状导电电极包围。刺激步骤可包含对电极施加一个或更多个激发电压波形，以在孔中电极对的电极之间的激发区产生电场。在多个实施方案中，刺激步骤包括通过施加刺激波形诱导突触小泡循环。
在一些实施方案中，可将多孔板电穿孔系统改造为适合的刺激系统。例如，可优化市售高通量电穿孔器(例如，设计为递送siRNA的Cellectricon提供的CellAxessHT)以将多孔板孔的电场电位覆盖最大化，从而用作本发明高通量突触小泡循环的刺激系统。在实施例部分详细地描述了市售高通量电穿孔器的定制改造的非限制性实例。本文描述了其它适于高通量平台的刺激系统。
通常，本发明的高通量测定是基于荧光的动态测定。通常，报告物的信号在突触小泡循环测定中未放大，因此导致信号弱。适合的成像系统具有高光子收集效率。高收集效率导致信噪比增加并减少动态读数时的曝光过度，因为测量性地激发荧光团所需的光较少。在多个实施方案中，适于本发明的成像/监测系统能够平行地监测含有多个神经元细胞的多个孔的指示突触小泡循环的信号(例如，荧光发光)。在一些实施方案中，适合的成像系统对含有神经元细胞的孔的至少一部分成像，并收集含有神经元细胞的孔的至少一部分的图像或一系列图像。在一些实施方案中，适于本发明的成像/测系统平行地收集并检测含有多个神经元细胞的多个孔的信号量(例如荧光发光)。在一些实施方案中，适合的监测/成像系统能进一步处理任何代表突触小泡循环一个或更多个方面的数据，例如，多种突触小泡循环过程的动态(例如胞吞、成核、内陷等)。通常，适合的成像系统能够在相对短的时间内(例如1分钟)进行荧光、动态分析。
在一些实施方案中，可采用定制或市售高含量筛选系统(例如，Pathway，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ；ImageXpress MICRO(Molecular Devices，Union City，CA；Opera，Perkin Elmer，Waltham，MA；ArrayScan，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。预计这些高含量筛选系统每小时能够进行至少12个突触小泡循环。在一些实施方案中，采用多孔板阅读器以通过提高筛选输出使系统适于化合物开发。适合的多孔板阅读器能够平行地对多孔板的多个孔成像。适合的读板器包括市售的读板器(例如，Perkin Elmer提供的plate::vision)。通常，适合的读板器能够进行动态、荧光分析，允许进入平板的上方，以整合刺激系统，具有高收集效率的光学设备和/或设计为平行地分析多个孔的特别光学设备。在检测系统部分描述了其他适合的成像系统。
通常，高通量平台涉及采用单个仪器同时测量多个突触小泡循环测定。对高通量平台来说，具有在尽可能多的突触小泡循环模式中检测尽可能多的突触小泡循环的组分的能力是理想的。为了能够在不同模式的胞吞(例如，饱和和不饱和)中研究突触小泡循环，重要的是测定系统能够在高和低强度刺激系列之中和之后测量突触小泡循环报告信号。低强度刺激系列(例如，小于10Hz，小于100个动作电位)诱导不饱和胞吞模式，而高强度刺激系列(例如，大于10Hz，大于100个动作电位)诱导饱和胞吞模式。在一些实施方案中，采用能够检测应答于以至少10Hz递送的至少50个动作电位的突触小泡循环(例如胞吐作用)的仪器。该刺激范围允许在不饱和和饱和两种胞吞模式下分析突触小泡循环。在一些实施方案中，适合的仪器具有能够检测应答于以至少10、20、30、40或50Hz递送的至少50、100、200、300或更多个动作电位的突触小泡循环的能力。
在一些实施方案中，可通过使每孔反应荧光团的数目最大化来增加本发明测定的信号强度。例如，可通过神经元高密度铺板来获得更高的突触密度，从而增加信号强度。在一些实施方案中，每孔可铺至少20,000个神经元/cm2。在一些实施方案中，可同时监测至少50(例如，至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多)个突触。
在一些实施方案中，可通过增加表达指示突触小泡循环的报告物(例如，突触小泡蛋白-pHluorin)的神经元的百分比来增加本发明测定的信号强度。在一些实施方案中，本发明使用的至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的神经元表达指示突触小泡循环的报告物。可采用多种方法将神经元高效地用报告物标记。例如，可采用病毒感染。适于本发明的一个示例性病毒表达系统是基于腺相关病毒的表达系统。通常，采用腺相关病毒表达系统可获得大于～90％的感染率。在一些实施方案中，采用可在兴奋性和抑制性神经元两者中表达报告物的启动子。
在一些实施方案中，报告物标记的神经元可获得自携带报告基因的转基因动物(例如小鼠)。可采用本领域已知的标准方法生成表达所需报告基因(例如，突触小泡蛋白-pHluorin)的转基因动物。转基因动物提供可靠和高重复率的标记和信号。
在一些实施方案中，可通过增加标记有指示突触小泡循环的报告物(例如vGlut1-pHluorin)的功能性突触小泡的级分来增加信号强度。例如，可基于对再循环(例如可采用用V型ATP酶抑制剂巴佛洛霉素进行的碱性陷阱)的小泡总数的计数来评估pHluorin标记的功能性突触小泡的级分。用几百个动作电位刺激可导致所有可与质膜融合的小泡融合至少一次。在巴佛洛霉素的存在下，pHluorin荧光限制在升高状态下。最大荧光除以量子大小得到在每个突触中标记vGlut1-pHluorin的小泡数。可将该数字与用FM1-43标记获得的值进行比较。FM1-43为有机双亲荧光跟踪物，其在突触小泡进行胞吞时对其进行标记。可通过对标记FM1-43的小泡计数来测量小泡集合的总大小(Ryan等，Nature(1997)Jul 31；388(6641)：478-82，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，至少40％(例如至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％)的功能性突触小泡被指示本发明突触小泡循环的报告物标记。
本领域技术人员应理解改变仪器灵敏度、报告物信号强度和其它参数可增加本发明测定的信噪比。增加的信噪比能测量应答于至少10、20、30、40或50Hz的更少的动作电位(例如，40、20、10、5个或更少的动作电位)的突触小泡循环，并能测量除总突触小泡循环外其它的突触小泡循环过程(例如，释放的概率)。这些本文所述的测定的修改和变化在本发明的范围内。
测试物
可检测用作突触小泡循环潜在调节剂(例如，抑制剂或刺激剂)的多种候选试剂。示例性的测试物包括但不限于化学化合物、小分子、蛋白质或肽、抗体、共晶、纳米晶体、微生物(例如病毒、细菌、真菌等)、核酸(例如，DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、适体等)、碳水化合物(例如单、双或多糖)、脂质(例如磷脂、甘油三酯、甾族化合物等)、天然产物、其任何组合。还可采用基于计算机的推理性药物设计法来设计候选试剂。通常，在筛选测定中检测多个测试物(例如，候选试剂文库)以筛选潜在调节剂。在一些实施方案中，测试物为生物可降解和/或生物相容性的。
肽
在一些实施方案中，可通过筛选由重组噬菌体产生的随机肽文库或化学文库来获得突触小泡循环的潜在调节剂，例如，Scott和Smith，Science，249：386-390(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249：404-406(1990)。采用“噬菌体法”可构建非常大的文库(106-108化学实体)。第二种途径主要采用化学方法，例如Geysen法(Geysen等，Molecular Immunology 23：709-715(1986)；Geysen等J.Immunologic Method 102：259-274(1987))以及Fodor等(Science 251：767-773(1991))的方法。Furka等，14th International Congress of Biochemistry，卷5，Abstract FR：013(1988)；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.37：487-493(1991)，Houghton(美国专利No.4,631,211，公布于1986年12月)以及Rutter等(美国专利No.5,010,175，公布于1991年4月23)描述了生成肽混合物的方法，可检测所述肽混合物能否作为涉及突触小泡循环活性的调节剂。
在一些实施方案中，可采用合成文库(Needels等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10700-4(1993；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926(1993)；Lam等，国际专利公开No.WO 92/00252；Kocis等，国际专利公开No.WO 9428028，其中每个通过全文引用并入本文)等来筛选本发明突触小泡循环的调节剂。一旦鉴定到潜在的调节剂，可从化学物文库筛选或者重新合成化学类似物，所述化学文库如可购自供应商(如ChemBridge Libraries(chembridge.com)、BIOMOL International、ASINEX、ChemDiv、ChemDB、ICCB-Longwood)的。
小分子
在一些实施方案中，筛选作为突触小泡循环调节剂的小分子文库、其类似物。在一些实施方案中，可筛选重新合成的化合物文库以鉴定具有突触小泡循环调节功能的新化合物。在一些实施方案中，可筛选包含药物(包括FDA批准药物)的公共文库以鉴定之前未知是否具有突触小泡循环调节活性的现有化合物。在一些实施方案中，可采用本领域公知方法合成含有现有化合物的衍生物或类似物的经改造文库以鉴定新的或改善的突触小泡循环调节剂。适合的小分子化合物文库可从供应商(如ChemBridge Libraries(chembridge.com)、BIOMOL International、ASINEX、ChemDiv、ChemDB、ICCB-Longwood)获得。在一些实施方案中，适合的小分子文库含有大量(如，＞100,000种化合物)为了多样性和良好“药物样”特性而选择的商业化合物。
反义RNA和核酶
在一些实施方案中，可筛选作为突触小泡循环潜在调节剂的反义分子。反义分子为具有与指定的mRNA互补的核苷酸序列的RNA或单链DNA分子。当将实验室制备的反义分子注入含有所研究基因转录的正常mRNA的细胞中时，反义分子可与mRNA碱基配对，防止mRNA转录为蛋白质。所得的双链RNA或RNA/DNA被与这些分子特异结合的酶消化。因此，发生mRNA耗尽，阻止了基因产物的翻译，使得反义分子可用于阻止有害蛋白质产生的药物。本领域普通技术人员公知生成和利用反义RNA的方法(参见，例如，C.Lichtenstein和W.Nellen(编)，Antisense Technology：A Practical Approach，Oxford University Press(December，1997)；S.Agrawal和S.T.Crooke，Antisense Research and Application(Handbook of Experimental Pharmacology，卷131)，Springer Verlag(1998年4月)；I.Gibson，Antisense and Ribozyme Methodology：Laboratory Companion，Chapman & Hall(1997年6月)；J.N.M.Mol and A.R.Van Der Krol，Antisense Nucleic Acids and Proteins，Marcel Dekker；B.Weiss，Antisense Oligonodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents，CRC Press(1997年6月)；Stanley等，Antisense Research and Applications，CRC Press(1993年6月)；C.A.Stein和A.M.Krieg，Applied Antisense Oligonucleotide Technology(1998年4月))。
在一些实施方案中，可基于参与突触小泡循环的蛋白质和基因序列信息设计适于调节突触小泡循环通路的反义分子和核酶。例如，可将反义分子和核酶设计为靶向突触前蛋白质，其包括但不限于内在小泡蛋白(例如突触小泡蛋白2(SV2)、突触素、突触结合蛋白、小泡相关膜多肽(VAMP)、神经递质转运蛋白(NT转运蛋白)、突触循环蛋白、质子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸链蛋白(cystine string protein，CSP)、突触蛋白)、突触质膜蛋白(如钙通道、25kDa突触体相关蛋白(SNAP-25)、突触融合蛋白)以及胞浆蛋白(如SNAP、n-Sec1)、突触蛋白(例如，突触蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，发动蛋白I、PIP5K1γ和突触小泡磷酸酶I)。
可通过本领域已知的任何用于合成核酸分子的方法制备反义分子和核酶。这些包括用于化学合成寡核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成。或者，可通过编码UGGT的DNA序列的体外和体内转录生成RNA分子。这些DNA序列可整合入具有适合的RNA聚合酶启动子(如T7或SP6)的多种载体中。或者，可将这些组成型或可诱导地合成反义RNA的cDNA构建体引入细胞系或组织。
可修饰RNA分子以增强细胞内稳定性和半衰期。可用的修饰包括但不限于在分子的5’和/或3’末端添加侧翼序列或在分子的骨架内采用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯键连接。该概念可扩展为加入非常规碱基，如肌苷、辫苷(queosine)和怀丁苷，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰-、甲基-、硫代-、类似修饰形式，其不易于被内源核酸内切酶识别。
干扰RNA
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默机制，其与上述的基于反义和核酶的方法不同。认为dsRNA分子在多种品系的细胞中首先被称为DICER(Bernstein等，Nature 409：363，2001)的RNaseIII样酶加工成更小的dsRNA分子后指导mRNA的序列特异性降解，所述更小的dsRNA分子由两条21nt的链构成，其中每条具有5’磷酸基团和3’羟基，并包含与另一条链精确互补的19nt区，因而其中具有侧翼为2nt 3’突出的19nt双链体区域。因此RNAi由短干扰RNA(siRNA)介导，其通常包含约19个核苷酸长的双链区域，并通常在每条链上具有1-2个核苷酸的3’突出，得到的总长通常为约21至23个核苷酸。
还应理解siRNA可具有一定长度范围，例如，双链部分的范围可为15-29个核苷酸。应理解siRNA在任一个或两个末端可具有平末端或3’突出。如果存在该3’突出，其长度通常为1-5个核苷酸。
当通过如转染、电穿孔或微注射的方法转入哺乳动物细胞或通过多种基于质粒的方法的任何一种在细胞中表达时，siRNA显示出下调基因表达。在如Tuschl，T.，Nat.Biotechnol.，20：446-448，May 2002中综述了用siRNA进行的RNA干扰，也参见Yu，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，99(9)，6047-6052(2002)；Sui，G.等，Proc.Nail.Acad.Sci.，99(8)，5515-5520(2002)；Paddison，P.等，Genes and Dev.，16，948-958(2002)；Brummelkamp，T.等，Science，296，550-553(2002)；Miyagashi，M.和Taira，K.，Nat.Biotech.，20，497-500(2002)；Paul，C.等，Nat.Biotech.，20，505-508(2002)。
事实上，已经在包括哺乳动物在内的多种生物中实现了通过RNAi进行的体内特异性基因表达抑制。例如，Song等，Nature Medicine，9：347-351(2003)公开了将Fas siRNA化合物静脉注射入患自身免疫性肝炎的实验室小鼠特异性地降低了小鼠肝细胞中Fas mRNA水平和Fas蛋白质的表达。也已证明其它几种将siRNA递送入动物的方法是成功的。参见，如McCaffery等，Nature，418：38-39(2002)；Lewis等，Nature Genetics，32：107-108(2002)；和Xia等，Nature Biotech.，20：1006-1010(2002)。
siRNA可包含两条单独的核酸链或具有能形成发夹(茎环)结构的自身互补区的单链。结构、长度、错配数、环的大小、突出处的核苷酸特性等多种变化与有效的siRNA引发的基因沉默相关。不希望局限于任何理论，认为多种不同前体的细胞内加工(例如，通过DICER)导致能有效介导基因沉默的siRNA的产生。通常应该靶向外显子而不是内含子，并且还尤其需要选择与靶标转录本3’部分中的区域互补的序列。通常优选的是选择包含约等摩尔比例的不同核苷酸的序列并且避免一段单残基多个重复。
因此siRNA可包含通常具有约19个核苷酸长的双链区域的RNA分子，所述RNA分子通常在每条链上具有1-2个核苷酸的3’突出，得到的总长通常为约21至23个核苷酸。如本文所用，siRNA还包括可在体内加工以产生这种分子的多种RNA结构。这些结构包括含有两个互补元件的RNA链，所述互补元件彼此杂交形成茎、环或任选地形成突出(优选3’突出)。通常，茎约19bp长，环约1-20、优选约4-10、更优选约6-8个核苷酸长和/或突出通常约1-20、并优选约2-15个核苷酸长。在本发明的一些实施方案中，茎最小19个核苷酸长，并可多达约29个核苷酸长。4个核苷酸或更大的环与更短的环相比更不易于产生空间束缚，因而被优选。悬挂可包含5’磷酸和3’羟基。悬挂可包含多个U残基(例如1至5个U残基)，但不必须。
在一些实施方案中，可根据参与突触小泡循环的蛋白质和基因序列信息设计siRNA。例如，可将siRNA设计为靶向编码突触前蛋白质的基因，所述突触前蛋白质包括但不限于内在小泡蛋白(例如突触小泡蛋白2(SV2)、突触素、突触结合蛋白、小泡相关膜多肽(VAMP)、神经递质转运蛋白(NT转运蛋白)、突触循环蛋白、质子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸链蛋白(cystine string protein，CSP)、突触蛋白)、突触质膜蛋白(如钙通道、25kDa突触体相关蛋白(SNAP-25)、突触融合蛋白)以及胞浆蛋白(如SNAP、n-Sec1)、突触蛋白(例如，突触蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，发动蛋白I、PIP5K1γ和突触小泡磷酸酶I)。
可采用常规RNA合成方法合成适合的siRNA。例如，它们可采用恰当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常用的DNA/RNA合成仪化学合成。在如Usman等，J.Am.Chem.Soc.，109：7845-7854(1987)和Scaringe等，Nucleic Acids Res.，18：5433-5441(1990)中公开了RNA合成的多种可用方法。从供应商(Ambion(Austin，Tex.，USA)、Dharmacon Research(Lafayette，Colo.，USA)、Pierce Chemical(Rockford，Ill.，USA)、ChemGenes(Ashland，Mass.，USA)、Proligo(Hamburg，Germany)和Cruachem(Glasgow，UK))可获得定制siRNA合成服务。
发明siRNA可全部由天然RNA核苷酸构成，或可包含一个或更多个对以上反义分子提及的核苷酸类似物和/或修饰。可例如通过在一个或更多个游离链末端引入核苷酸类似物以减少降解(例如，核酸外切酶的降解)来稳定siRNA结构。或者，可通过编码相关分子的DNA序列的体外转录产生siRNA分子。这种DNA序列可被整合入具有适合RNA聚合酶启动子(例如T7、T3或SP6)的多种载体中。
抗体
在一些实施方案中，可筛选作为潜在的突触小泡循环调节剂的抗体。例如，可根据参与突触小泡循环的蛋白质和基因序列信息设计抗体。例如，可将抗体设计为靶向突触前蛋白质，其包括但不限于内在小泡蛋白(例如突触小泡蛋白2(SV2)、突触素、突触结合蛋白、小泡相关膜多肽(VAMP)、神经递质转运蛋白(NT转运蛋白)、突触循环蛋白、质子泵)、外周小泡蛋白(例如，Rab、胱氨酸链蛋白(cystine string protein，CSP)、突触蛋白)、突触质膜蛋白(如钙通道、25kDa突触体相关蛋白(SNAP-25)、突触融合蛋白)以及胞浆蛋白(如SNAP、n-Sec1)、突触蛋白(例如，突触蛋白I、II和III)以及去磷蛋白(例如，发动蛋白I、PIP5K1γ和突触小泡磷酸酶I)。还可将抗体设计为靶向钙调磷酸酶、钙调磷酸酶激活剂、抑制剂和/或底物。
可采用本领域已知方法生成抗体。例如，在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，(1988)中描述了抗体生成的方案。通常，抗体可在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、骆驼、羊驼、鲨鱼或其它适合的宿主中产生。或者，抗体可在鸡中制成，产生IgY分子(Schade等，(1996)ALTEX 13(5)：80-85)。在一些实施方案中，适于本发明的抗体是非人灵长类动物抗体。例如，在狒狒中产生治疗有效抗体的一般技术可见于如Goldenberg等，国际专利公开No.WO 91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer 46：310(1990)中。在一些实施方案中，可使用杂交瘤方法制备单克隆抗体(Milstein and Cuello，(1983)Nature 305(5934)：537-40)。在一些实施方案中，也可通过重组方法产生单克隆抗体(美国专利No.4,166,452，1979)。
在一些实施方案中，适于本发明的抗体可包括人源化或人抗体。非人抗体的人源化形式为包含最短的源自非人Ig序列的嵌合Ig、Ig链或片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它抗体的抗原结合序列)。一般地，人源化抗体具有自非人来源引入的一个或更多个氨基酸残基。这些非人氨基酸通常被称为“输入”残基，其通常获取自“输入”可变结构域。通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列替换对应的人抗体序列来进行人源化(Riechmann等，Nature 332(6162)：323-7，1988；Verhoeyen等，Science.239(4847)：1534-6，1988)。这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利No.4,816,567，1989)，其中基本上少于完整人可变区结构域被对应的非人物种的序列所替换。在一些实施方案中，人源化抗体通常是一些CDR残基以及可能一些FR残基被啮齿类动物抗体类似位点的残基替换的人抗体。人源化抗体包括人Ig(受体抗体)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基所替换。在一些情况下，对应的非人残基替换人Ig的Fv构架残基。人源化抗体可包含不存在于受体抗体或输入的CDR或构架序列的残基。一般地，人源化抗体包含基本上至少一个、通常两个全部的可变结构域的全部，其中大部分(如果不是全部的)CDR区域对应非人Ig，大部分(如果不是全部的)FR区域是人Ig共有序列的。人源化抗体还任选地包含至少一部分Ig恒定区(Fc)，通常是人Ig的恒定区(Riechmann等，Nature 332(6162)：323-7，1988；Verhoeyen等，Science.239(4847)：1534-6，1988)。
人抗体还可采用多种技术生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom等，Mol Immunol.(1991)28(9)：1027-37；Marks等，J Mol Biol.(1991)222(3)：581-97)和人单克隆抗体的制备(Reisfeld和Sell，1985，Cancer Surv.4(1)：271-90)。类似地，可采用将人Ig基因引入转基因动物来合成人抗体，其中所述转基因动物中内源Ig基因部分或全部失活。在攻击后，观察到人抗体的生成(其在所有方面都非常类似于在人体中所见的)，包括基因重排、组装和抗体库(Fishwild等，High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice，Nat Biotechnol.1996July；14(7)：845-51；Lonberg等，Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications，Nature 1994April 28；368(6474)：856-9；Lonberg和Huszar，Human antibodies from transgenic mice，Int.Rev.Immunol.1995；13(1)：65-93；Marks等，By-passing immunization：building high affinity human antibodies by chain shuffling.Biotechnology(NY).1992 July；10(7)：779-83)。
其它
在一些实施方案中，可采用本发明测定筛选天然产物文库。
在一些实施方案中，可在对细胞进行刺激(例如，电刺激)之前在选定的时间内将神经元细胞与测试物一起孵育。在多个实施方案中，将选定量的测试物加入含有神经元细胞的孔。在多个实施方案中，将不同量和/或类型的测试物加入含有神经元细胞的不同孔中。在多个实施方案中，将基本相同量和/或类型的测试物加入含有神经元细胞的不同孔中。
在多个实施方案中，可将测试物的测定结果与对照比较以确定是否任何试剂成员调节一种或更多种突触小泡循环活性。在一些实施方案中，对照是在除未被测试物处理外其它都相同的神经元细胞中检测到的相同的一种或更多种突触小泡循环活性。在一些实施方案中，神经元细胞在不被测试物处理时可显示正常的突触小泡循环。在一些实施方案中，未处理的神经元细胞可显示缺陷的突触小泡循环(例如，从患有神经疾病的动物或人中分离的神经元细胞)。在一些实施方案中，如果与未处理的对照相比，测试物引起突触小泡循环的增强，则认为所述测试物为潜在的突触小泡循环增强剂。在一些实施方案中，如果与未处理的对照相比，测试物引起突触小泡循环的抑制，则认为所述测试物为潜在的突触小泡循环抑制剂。
在一些实施方案中，可采用本发明的方法测量突触小泡循环的特定活性。特别地，可测量突触小泡循环的多阶段(例如，胞吐、胞吞、再循环等)的活性。在一些实施方案中，可采用以下参数测量胞吐作用，所述参数包括但不限于释放概率、释放系列、停靠的小泡、集合大小。在一些实施方案中，胞吞作用可采用指示如未饱和、饱和或稳定状态的参数进行测量。如本文所用，未饱和表示小泡内化位点不限制的胞吞作用。饱和表示小泡内化位点被限制的胞吞作用。在一些实施方案中，可通过检测相对于第一次应答在休息阶段(如1分钟)后再刺激的应答大小来检测再循环。在一些实施方案中，可检测高频率引发。如本文所用，术语“高频率引发”通常表示在10Hz或高于其的频率的引发。通常，导致突触小泡释放的持续高频率引发的时间与引发频率呈反比。在一些条件下，在高频率引发中可发生突触疲劳。例如，认为预备好可释放突触小泡集合是有限的(例如，10个小泡)。因此，在10Hz或高于其的引发频率下，当引发在预备好可释放的集合被消耗后(例如，超过多于10个动作电位)持续，则会发生突触疲劳。可采用电生理学(例如，细胞外场记录(extracellular field recording))或成像分析(例如，采用synaptopHluorin)。
可采用本文所述的适合的突触小泡循环测定进一步检测可能的调节剂以确定调节作用和/或预测效率。还可采用其它测定检测可能的调节剂以确定它们对突触小泡循环或神经传递信号通路的作用。在一些实施方案中，可采用磷酸签名(phosphosignature)测定检测可能的调节剂以确定它们调节钙调磷酸酶和/或去磷蛋白或其它突触蛋白磷酸化状态的能力。在一些实施方案中，可进一步检测可能的调节剂治疗神经或精神疾病的能力，特别是与突触小泡循环功能异常相关的疾病。在一些实施方案中，可在动物模型中检测可能的调节剂。例如，可在神经或精神疾病的动物模型(例如，小鼠精神分裂症模型)中检测可能的调节剂。在一些实施方案中，可在与突触小泡循环相关(例如，突触疲劳、突触疲劳的恢复)的电生理测定中检测可能的调节剂。
按照本发明鉴定的突触小泡循环调节剂可参与调节多种直接或间接参与突触小泡循环的步骤、过程和/或生物通路。例如，钙调磷酸酶的激活(例如，通过直接激活或抑制钙调磷酸酶与抑制剂(即DSCR1或cabin)的相互作用或者抑制抑制酶)可增强运动和胞吞作用。抑制细胞周期蛋白依赖激酶5(CDK5)可增强突触小泡循环。抑制双特异酪氨酸磷酸化和调节激酶1A(dual-specificity tyrosine-phosphorylated and regulated kinase 1A，Dyrk1A)或蛋白激酶C(PKC)也可增强突触小泡胞吞作用。抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)(例如ERK1)可增强突触小泡胞吞作用和/或运动。调节Ca++通道(包括调节Ca++外流蛋白(effluxer)或其它去除或螯合Ca++的蛋白质)可调节该过程的任何部分。G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)(包括毒蕈碱型乙酰胆碱受体)调节突触小泡循环的所有步骤；因此，这些受体的激动剂和拮抗剂可被鉴定为突触小泡循环多个方面的调节剂。在表1中显示了可被调节剂影响的突触小泡循环的示例性方面和鉴定这些调节剂的测定参数。
治疗性应用
本发明涵盖了以下认识：对调节突触小泡循环的物质可用于治疗一些疾病(例如，与突触小泡功能失常相关的疾病)，等等。在一些实施方案中，本文鉴定的突触小泡循环调节剂可用于治疗(例如，缓解、改善、减轻、抑制、预防、延缓发作、降低严重性和/或降低发病)与突触小泡循环功能失常相关的疾病、障碍和/或病症的一种或更多种症状或特征。例如，本发明涵盖以下认识：突触小泡循环的调节剂可用于治疗精神障碍、疾病或病症(包括但不限于精神分裂症、双相型障碍、癫痫)；神经疾病、障碍或病症(包括但不限于阿尔兹海默氏病、酒精性Korsakoff疾病(KS)、多发性硬化和帕金森氏病)和/或其它疾病、障碍或病症(包括但不限于唐氏综合征、威廉斯氏综合征、特定性语言障碍和注意力缺乏多动障碍(ADHD))。
一个非限制性实例是，抑制突触小泡循环的调节剂(例如，在抑制兴奋型突触传递或增强突触小泡循环的抑制)可用于治疗癫痫。调节(例如，增强或稳定)5-羟色胺能突触小泡循环的调节剂可用于治疗抑郁。调节(例如，增强或稳定)多巴胺能小泡循环的调节剂可用于治疗帕金森氏病。调节(例如，增强)胆碱能小泡循环的调节剂可用于治疗阿尔兹海默病。调节(例如，增强或稳定)谷氨酰胺能或非谷氨酰胺能的小泡循环可用于治疗焦虑症。
可使用任何有效治疗疾病、障碍和/或病症(涉及突触小泡循环功能失常的疾病、障碍和/或病症)的量将突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物施用给对象。任何特定患者或生物体的具体治疗有效剂量水平取决于多种因素，所述因素包括医疗领域公知的待治疗的疾病和疾病的严重性；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径以及所采用的具体化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物等因素。
在一些实施方案中，可一天一次或多次以足以递送约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg(每天每对象体重)的剂量水平施用突触小泡循环调节剂和/或其组合物以获得所需的治疗作用。所需的剂量可以一天三次、一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次递送。在一些实施方案中，所需的剂量可采用多次施用递送(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)。
药物组合物
本发明还提供含有一种或更多种突触小泡循环调节剂以及一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。这种药物组合物可任选地包含一种或更多种另外的治疗活性物质。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适于对人伦理性施用的药物组合物，本领域技术人员应理解这些组合物普遍性适于施用给所有类型的动物。为使组合物适于施用给多种动物而对适于施用给人的药物组合物进行的改变已经很成熟，并且普通的兽药理学技术人员只需要通过普通试验(如果需要)来设计和/或实施这种改变。所包括的施用药物组合物的对象包括但不限于人和/或其它灵长类动物；哺乳动物(包括市售哺乳动物如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠)；和/或鸟类(包括市售鸟类如鸡、鸭、鹅和/或火鸡)。
本文所述的药物组合物的制备可通过任何已知或在此之后在药理领域开发的方法制备。一般地，这种制备方法包括以下步骤，将活性成分与赋形剂和/或一种或更多种附加成分相结合，然后，如果必要和/或需要，将产物成形和/或包装成所需的单或多剂量单位。
本发明的药物组合物可以单个单位剂量和/或多个单个单位剂量被成批制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定活性成分量的药物组合物的分离的量。活性成分的量通常等于将施用给对象的活性成分的剂量和/或这种剂量的方便化部分(例如，这种剂量的二分之一或三分之一)。
本发明药物组合物中活性成分、可药用赋形剂和/或任何额外成分的相关量根据待治疗对象的特性、体型和/或状态而异，并且还取决于待施用组合物的施用途径。例如，所述组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
药物制剂可另外地包含可药用赋形剂，本文所用的药物赋形剂包括适于所需的具体剂型的任何和所有溶剂、分散基质、稀释液或其它液体载体、助分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体结合剂、润滑剂等。Remington的The Science and Practice of Pharmacy，21版，A.R.Gennaro(Lippincott，Williams & Wilkins，Baltimore，MD，2006；其通过引用并入本文)公开了用于制备药物组合物的多种赋形剂以及制备它们的已知技术。除了迄今为止任何与物质或其衍生物不相容的传统赋形剂基质(如通过产生任何不需要的生物作用或以其他有害方式与任何其它药物组合物成分相互作用)，其应用包含在本发明范围内。
在一些实施方案中，可药用赋形剂的纯度至少为95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人或兽用。在一些实施方案中，赋形剂被美国食品与药品监督管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂为药用级别。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于药物组合物制造的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这些赋形剂可被任选地包含在药物制剂中。根据制备者的判断，如可可油和栓剂蜡的赋形剂、着色剂、包被剂、甜味剂、调味剂和/或香味剂可存在于组合物中。
在如Remington的The Science and Practice ofPharmacy，21版，A.R.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2005(通过引用并入本文)中有制备和/或制造药剂中的一般考虑事项。
施用
可通过任何途径施用本发明突触小泡循环调节剂和/或药物组合物。在一些实施方案中，可通过多种途径的一种或更多种途经施用突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物，所述途径包括经口、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、鞘内、皮下、脑室内、透皮、皮内、经直肠、阴道内、腹膜内、外用(例如，通过粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗液和/或滴液)、经粘膜、经鼻、口含、肠内、经玻璃体、瘤内、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷剂、鼻喷剂和/或气溶胶，和/或通过门静脉导管。在一些实施方案中，可通过全身静脉内注射施用突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物。在一些特定实施方案中，可静脉内和/或经口施用突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物。在一些特定实施方案中，可采用允许突触小泡循环调节剂穿过血脑屏障的方式施用突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物。有许多穿过血脑屏障的策略，包括但不限于增加分子的疏水特性；将分子作为辍合物引入靶向血脑屏障受体的载体(如转铁蛋白)等。在另一个实施方案中，可脑内(更优选地脑室内)施用分子。在另一个实施方案中，可渗透性破坏血脑屏障以有效地将活性剂递送到脑(Neuwelt等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA“Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption，”Oct.10，1995)。在又一个实施方案中，可在靶向血脑屏障的脂质体中施用药剂。已知脂质体中药剂的施用(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，New York，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327页；一般性地参见上文)。所有这些方法均在本发明的预想中。在特定的实施方案中，可通过门静脉导管施用突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物。然而，本发明涵盖通过任何恰当途径的突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物的递送，所述途径考虑到药物递送技术的可能进展。
一般地，最适合的施用途径取决于多种因素，包括突触小泡循环调节剂的性质(例如，它们在胃肠道、血流等环境中的稳定性)、患者的情况(例如，患者是否能够耐受特定的施用途径)等。本发明涵盖通过任何恰当途径的药物组合物的递送，所述途径考虑到药物递送技术的可能进展。
试剂盒
本发明提供方便地和/或有效地实施本发明方法的多种试剂盒。通常试剂盒会包含足够量和/或数量的组分以使使用者对对象进行多个处理和/或实施多个试验。
在一些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种(i)跟踪突触小泡循环的报告物；(ii)适于培养多个神经元细胞的多个孔；(iii)刺激系统；(iv)检测系统；以及(v)一种或更多种测试物质。在一些实施方案中，试剂盒还可任选地包含一种或更多种(vi)已知调节突触小泡循环的阳性对照物质；(vii)已知不调节突触小泡循环的阴性对照；以及(viii)使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒包含如本文所述采用突触小泡循环测定鉴定的一种或更多种突触小泡循环调节剂。在一些实施方案中，这种试剂盒用于治疗、诊断和/或预防患有和/或对疾病、病症和/或障碍(例如，与突触小泡循环功能异常相关)易感的对象。在一些实施方案中，这种试剂盒包含下列一种或更多种：(i)至少一种突触小泡循环调节剂或其药物组合物；(ii)用于施用给对象的注射器、针、敷贴器等；以及(iii)使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒包含不同报告物的集合；细胞类型；测试物质；突触小泡循环调节剂和/或其药物组合物等。
在一些实施方案中，试剂盒可包含另外的组分或试剂。例如，试剂盒可包含细胞培养基、组织培养基、缓冲液等。在一些实施方案中，试剂盒可包含使用说明。例如，说明可指导使用者如何进行鉴定突触小泡循环调节剂的筛选。说明可指导使用者制备包含调节剂的药物组合物的正确步骤和/或向对象施用药物组合物的正确步骤。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有突触小泡循环调节剂的药物组合物的多个单位剂量。可提供备忘录，例如以数字、字母和/或其它标记和/或带有日历插页，标示可施用剂量的治疗时间表中的天/次数。可包含与药物组合物剂量类似或不同形式的安慰剂剂量和/或膳食钙添加物以提供每天摄取剂量的试剂盒。
试剂盒可包含一个或更多个容器或包装物以使单独的组分或试剂分别放置。试剂盒可包含用于开启为销售目的相对密封的包装物的工具(例如，封装有说明、包装材料(如泡沫聚苯乙烯等)的塑料盒)。
实施例
实施例1：pHluorin报告物
在本实施例中，采用称为pHluorin的pH敏感性GFP研究突触小泡循环，pHluorin靶向突触小泡蛋白质的腔内结构域。以这样的方式使用的小泡蛋白质包括VAMP、突触结合蛋白、vGlut1和突触素。当突触静息时，这些蛋白质将pHluorin放入突触小泡腔，腔的内部pH维持在5.5。在该酸性pH下，荧光淬灭。当受到刺激时，突触小泡被胞吐并释放质子，导致pH升高，pHluorin发出荧光。而后，小泡重新内化并酸化，荧光再次淬灭。以该方式，在单个突触检测的荧光变化被用来跟踪突触小泡循环。在本实施例中，采用synaptopHluorin(小泡蛋白质VAMP2与融合了vGlut1的pH敏感GFP的融合)。
通过在孔中引入以高浓度铺板的高百分比神经元细胞，采用synaptopHluorin测量整个孔细胞群水平的突触小泡循环。一种将synaptopHluorin引入神经元的方式是通过病毒感染。采用synaptopHluorin的病毒递送来确认在细胞群水平检测突触小泡循环的能力。采用腺相关病毒(MOI＝1000)在体外将synaptopHluorin递送入生长11天的铺在96孔透明塑料底平板(Nunc)的大鼠胚胎皮质神经元中。在体外的21天时，用Zeiss Axiovert Z1倒置落射荧光显微镜采用不足以分辨单个突触的低放大倍数光学设备(10X，0.45NA物镜)对神经元成像。在存在或不存在外部Ca++的情况下用离子霉素处理神经元，离子霉素是引发突触小泡胞吐作用并导致synaptopHluorin发出荧光的钙离子载体(calcium ionophore)。在外部Ca++的存在下用离子霉素处理培养物显示synaptopHluorin信号升高约20％，而无外部Ca++时培养物的应答显著减弱(约3％)。因此，本实施例证明可在细胞群水平用低放大倍数光学设备采用synaptopHluorin作为报告物测量突触小泡循环。
作为替代地或另外地，通过生成在脑中表达报告物(例如，突触小泡蛋白-pHlurin)的转基因动物(例如，小鼠或大鼠)将基于pHlurin的突触小泡循环报告物引入以大百分比培养的神经元中。可采用本领域技术人员已知的任何方法产生这种转基因动物。
实施例2：pH敏感性染料报告物
用于测量突触小泡循环的第二种示例性报告物利用小泡内酸性pH和酸感受染料。可购得当pH从细胞外的7.4升到泡内的5.5时荧光增强的胞吞报告物。这些染料包括CypHer5E(GE Healthcare)和pHrodo(Invitrogen)。这些染料通过在神经元被刺激时进入突触小泡作为突触小泡循环的报告物发挥作用。当小泡被胞吞并重新酸化时，报告物发出荧光。以该方式，通过荧光强度的增强测量胞吞作用，随后的胞吐作用通过荧光强度的降低测量。
采用任何方法将pH敏感性染料递送到突触小泡。将pH敏感性染料直接缀合到识别突触小泡蛋白质腔内结构域的抗体(例如，识别突触结合蛋白腔内结构域的单克隆抗体；突触系统(Synaptic Systems))。作为替换地或另外地，将染料与膜插入物质相缀合(例如，苯乙烯染料，如FM1-43)。在单独使用pH敏感性染料时，当刺激神经元，则突触小泡胞吐，使染料进入突触小泡。而后突触小泡被胞吞，通常通过几次清洗步骤洗掉残留的表面染料。通过将pH敏感性染料与例如FM1-43染料的插入组分相缀合，产生无需清洗步骤的跟踪突触小泡循环的突触小泡循环报告物。
为了使用染料，通常将细胞在测定缓冲液中孵育。将pH敏感性染料(例如与抗体、膜插入物等缀合的)加入测定缓冲液。用一系列的电压刺激细胞，导致突触小泡胞吐作用并使染料进入突触小泡。当突触小泡胞吞时，在重新形成的小泡中跟踪染料。当突触小泡重新酸化时，当由恰当的光波长刺激时，染料发出荧光。
实施例3：成像系统
在感染有表达synaptopHluorin的腺相关病毒的原代神经元中采用具有10X，0.45NA物镜的Zeiss Axiovert Z1以全孔水平对突触小泡循环成像(见图13)。此外，采用该显微镜，平板的孔是开放可到达的，以操作刺激系统。所述刺激系统用于检测单个化合物对突触小泡循环的作用。采用落射显微镜对突触小泡循环成像的过程通常需要2分钟，因此，在此配置下通常需要约2-3小时对96孔板的所有孔成像。
所使用的替代性成像系统为市售的读板器plate::vision(Perkin Elmer)。该读板器能进行基于动态的荧光分析，可从板上方接近板以使刺激系统整合，具有高收集效率的光学设备，并具有为平行分析96孔板设计的特有光学设备。
评价了plate::vision读板器平行记录多个孔中的突触小泡循环的能力。采用synaptopHluorin腺相关病毒在体外感染生长12天的铺在96孔板的原代大鼠神经培养物。用有或无外部Ca++的Tyrode溶液替换培养基。在plate::vision读板器上测量整板的荧光基线记录。然后，向所有孔加入离子霉素，测量1分钟内每2秒钟的荧光变化。结果显示在Ca++的存在下用离子霉素刺激的孔荧光升高约20％，而Ca++的缺少极大地消除了荧光增加(＜5％)。这些变化与在Zeiss倒置落射显微镜上进行相似试验时观察到的变化相似。这些数据表明plate::vision读板器平行地测量96孔板多孔中的突触小泡循环(图14)。
实施例4：电刺激系统
为了将突触小泡循环可视化，刺激神经元以诱导突触小泡的胞吐作用和胞吞作用。通过施加电场电位刺激培养物中的原代神经元，其部分地描述于Ryan和Smith(1995，Neuron，14：983；通过引用并入本文)和Ryan等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：5567；通过引用并入本文)。在这些实施例中，以96孔形式将场电位施加到原代神经元上。96孔的电刺激器为定制的并用于在包含神经元细胞的孔中产生随时间变化的电场。在检测设备上检测电极设计触发突触小泡循环的能力，所述检测系统为上述Zeiss Axiovert Z1倒置落射荧光显微镜或plate::vision读板器。
定制开发的96孔电刺激器
在本实施例中，采用定制的电极对刺激突触小泡循环。定制电极对具有外直径为约6mm的外部铂环电极，其适合装入96孔板的孔中。在孔中央放置1mm直径的金线(图6C)。中央金线作为阴极，外部铂环作为阳极，它们被塑料装置固定。将电极放置入96孔板的孔中并与刺激分离器连接，所述刺激分离器与脉冲发生器连接。为了平行刺激96个孔，将96个这样的电极对连接形成8x12的阵列。
多孔板电穿孔系统的定制改造
CellAxessHT(从Cellectricon AB，Gothenburg，Sweden购得)为设计用于向384孔板中的细胞递送siRNA的高通量电穿孔器。其具有96孔电穿孔端部，每个电极对设计为装备入384孔板的孔中。为了在本实施例中作为突触小泡循环测定的刺激组件，对该系统的电极进行改造和/或优化以将96孔板孔的电场电位覆盖最大化。
实施例5：定制的Cellectricon CX3电极系统
在本实施例中，用改造的市售电穿孔系统证明动作电位引发的刺激。为进行本试验从Cellectricon AB购得了定制改造的CellAxess CX3电穿孔系统。该系统提供了三对电极，其能基本上同时地对96孔板3个孔中三个独立的神经元细胞培养物进行电刺激。仪器的电极被改造为在电极激发区中提供基本均匀的电场和/或电流密度。此外，用于安装电极的塑料组件被改造为包含低荧光材料，这使得数据获取时的背景荧光最小化。
测试定制的CX3在培养于96孔板的神经元细胞中诱导动作电位的能力。对于本实施例，向神经元细胞中加入Fluo-4Ca++指示剂并用CX3系统刺激。以20Hz进行10秒钟的电刺激，同时用具有10X，0.3数值孔径物镜的Zeiss Axiovert Z1获取随时间变化图像。刺激电压在约2伏特至约100伏特变化。一些实验条件在图16A中显示。较低的线表示用Axiovert Z1系统对包含多个神经元细胞的孔区域的成像持续时间。成像阶段为约1分钟。方框表示激发阶段。
当电刺激以10V进行时，在获得的神经元细胞图像中观察到由于电场刺激Ca++流入的大量增加。图16B显示了Ca++流入的增加。在t＝0秒获取的图像表明在施加电刺激之前神经元细胞的荧光放射基线。在t＝15秒获取的图像显示在激发阶段结束时荧光发射的增加。该增加的荧光发射是由于神经元中Ca++流入的增加并指示了动作电位的触发。
然后在一定范围的电压值内进行几个系列的电刺激以研究含有神经元细胞的孔中荧光的动态表现。在图16C中将作为时间的函数的不同激发电压下记录的相对Fluo-4信号痕迹作图。结果显示大范围激发电压(约5伏特至约25伏特之间)的刺激引发强Ca++流入，随后在电刺激结束后回归到基线。在更高的电压下(高于约50伏特)，Ca++信号不回归基线，这指示这些高电压的毒性。
在另外的电刺激神经元细胞的生物动态测试中，向几个孔系统中加入TTX，而后将所述孔系统进行与图16C所报告的相同的电刺激。图16D显示了该测试的结果。TTX(电压门控钠离子通道阻断剂)的加入阻断了神经元对低电压的应答，这表明这些频率处的Ca++流是由于CX3电极刺激所产生的动作电位。
检测定制的CX3电极系统在96孔板的神经元中诱导突触小泡循环的能力。用表达synaptopHluorin的腺相关病毒感染神经元。用CX3电极系统以约30Hz和约10伏特刺激细胞，同时用具有40x、0.6数值孔径的空气物镜的Zeiss Axiovert Z1获取随时间变化图像。一些实验条件在图17A中报告。成像阶段为约120秒，电刺激阶段为约10秒。如在图17B中所示，对于单个突触观察到荧光增加而后回归到基线。在电刺激阶段的大约结束时荧光峰值产生，其后荧光信号返回至约基线。图17C显示了图17B所示的突触的电密度测量，并显示了所述突触的荧光动态表现。这些数据表明CX3电极可在96孔板的神经突触中诱导突触小泡循环。
实施例6：技术整合
所选的刺激和检测系统可整合入单个突触小泡筛选系统。例如，已经开发了平行检测96孔板中突触小泡循环的系统。可在体外第12天用表达突触素-pHlurin的腺相关病毒感染96孔板中的原代神经元。在体外第21天，用测定缓冲液替换培养基，并将电极放入孔中。以10V/10Hz对神经元细胞施加随时间变化的电场30秒。在这段时间中，由检测装置记录荧光(如，由synaptopHluorin产生的)。
在本具体实施例中，我们证明plate::vision读板器、定制的Cellectricon CX3电极和突触素-pHlurin报告物可被成功整合。在7DIV用突触小泡蛋白-pHlurin AAV(MOI 2000)感染96孔板中的大鼠原代皮质神经元。在30DIV，将培养物装载入plate::vision读板器，将定制的Cellectricon CX3电极放入这些孔的两个中。以2秒/图像进行荧光动态读数20分钟，用30Hz、20V的脉冲系列刺激神经元10秒。以5分钟间隔施加该刺激3次(红箭头)。图18显示了这些孔的结果。将荧光的变化(dF)针对每个孔中的峰值荧光读数进行归一化。这些结果显示当神经元被定制的Cellectricon电极刺激时，plate::vision读板器可使用突触素-pHlurin报告物测量突触小泡循环。
我们还证明该系统可成功地检测突触素-pHlurin对不同数量的经刺激动作电位的应答。如上所述在7DIV用突触小泡蛋白-pHlurin AAV(MOI 2000)感染96孔板中的大鼠原代皮质神经元。在30DIV，将培养物装载入plate::vision读板器，将定制的Cellectricon CX3电极放入这些孔的两个中。以2秒/图像进行荧光动态读数20分钟，用30Hz、20V的脉冲系列对神经元进行50(箭头1)、100(箭头2)、200(箭头3)或300(箭头4)的刺激(见图19)。将荧光的变化(dF)针对每孔中的荧光峰值读数归一化。这些数据表明plate::vision读板器的灵敏度以及其测量小量的动作电位的能力。预计由于plate::vision系统的高信噪比以及刺激系列中动作电位应答的总和，plate::vision能够检测应答于以10Hz或更低频率递送的50个或更少动作电位的突触素-pHlurin。
实施例7：测量突触小泡循环的多个参数
通过改变刺激方式测量突触小泡循环的多种参数。表1提供了示例性参数和刺激范例。
表1
实施例8：高含量筛选系统
采用替代性成像系统BD Pathway高含量成像系统开发了高含量筛选系统。这些高含量成像系统通常为定制或从如Pathway，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ；ImageXpress MICRO(Molecular Devices，Union Ciity，CA；Opera，Perkin Elmer，Waltham，MA；或ArrayScan，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA购得。这些系统具有高光学敏感性并在动态测定中生成高分辨率随时间变化的图像。因此，数据具有单突触分辨率和高信噪比。然而，这些系统通常仅依次记录多孔板的单个孔。因此，由于通常对突触小泡循环成像需要2分钟，对96孔板的所有孔成像需要2至3小时。因此，高含量筛选系统通常每小时能测量至少约20个(例如，25、30、35、40、45或50)突触小泡循环测定。
将高含量读板器与电刺激系统整合，电刺激系统在单个孔中引发动作电位，而读板器监测那个孔的突触小泡循环。该系统是自动的以使突触小泡循环测定能整板进行而不需要人工干预。此外，采用操作板的机械手自动在单个仪器上操作多个板系列。图20显示了示例性高含量筛选系统。
采用高含量成像系统测量突触小泡循环。图26显示了结果。将大鼠胚胎皮质神经元在Greiner uClear 96孔板上铺板并在7DIV用sypHy-AAV感染。在25DIV，用测定缓冲液替换培养基，并将板装载入BD Pathway高含量成像系统。将Cellectricon CX3电极放入三个孔。以1Hz在Pathway上对神经元成像，采用CX3电极以1msec脉冲，30Hz刺激10秒。分析成像时间系列在读板期间的荧光变化。该高含量成像系统能测量Cellectricon电极系统刺激的突触小泡循环。
实施例9：突触前HTS平台系统(PHTSP)
构建了突触前HTS平台系统(图21)并采用该系统进行96个平行的突触前测定。
将大鼠胚胎前脑神经元铺入Greiner mClear 96孔板，在7DIV用hSyn-SypHy腺相关病毒感染。在25DIV，将神经元细胞平板的细胞培养基用pHluorin测定缓冲液替换，并将平板装载上平台。在plate::vision读板器上以1Hz对该板成像，并采用定制的CellAxessHT电极以15V、185ms的脉冲以30Hz刺激10秒。平行地检测所有孔的突触小泡循环。图22显示了多个孔的结果，记录根据它们的应答峰值归一化。两次失败可能是由于那些孔中的电极未与测定缓冲液正确地电接触。这些数据显示突触前HTS平台能平行测量96孔板所有孔中的突触小泡循环。
进行了突触前HTS平台电刺激系统的一致性分析。将大鼠胚胎前脑神经元铺入Greiner mClear 96孔板，在7DIV用hSyn-SypHy腺相关病毒感染。在25DIV，将神经元细胞平板的细胞培养基用pHluorin测定缓冲液替换，并将平板装载上平台。在plate::vision读板器上以1Hz对该板成像，并采用定制的CellAxessHT电极以从0至32V持续增加电压的185ms的脉冲在30Hz刺激10秒。图23显示结果。
进行了突触前HTS平台的敏感性分析。将大鼠胚胎前脑神经元铺入Greiner mClear 96孔板，在7DIV用hSyn-SypHy腺相关病毒感染。在25DIV，将神经元细胞平板的细胞培养基用pHluorin测定缓冲液替换，并将平板装载上平台。在plate::vision读板器上以1Hz对该板成像，并采用定制的CellAxessHT电极以15V、185ms的脉冲以从1至40Hz持续增加的频率刺激10秒(斜线阴影柱)。在这些条件下，突触前HTS平台能测量应答于以超过10秒(2Hz)递送的少至20动作电位的突触小泡循环(图24)。
用突触前HTS平台检测了化合物诱导的突触小泡循环变化。将大鼠胚胎前脑神经元铺入Greiner mClear 96孔板，在7DIV用hSyn-SypHy腺相关病毒感染。在25DIV，将神经元细胞平板的细胞培养基用pHluorin测定缓冲液替换，每隔一列加入钙调磷酸酶抑制剂环孢霉素A(CsA；20μM)。在本试验中未使用边缘孔。将板装载上平台，在plate::vision读板器上以1Hz对该板成像，并采用定制的CellAxessHT电极以15V、185ms的脉冲以30Hz刺激10秒。收集突触小泡循环波形并且对每孔计算刺激后突触小泡重新内化的时间常数(t)。钙调磷酸酶抑制后重新内化率显著减慢(对照＝36±0.5秒，n＝28；CsA＝42±0.5秒，n＝29；p＜0.0001)。图25所示的这些数据表明所述平台能够在突触小泡循环动态中检测化合物诱导的变化。
实施例10：基于读板器的检测系统
确定了Fluoroskan Ascent FL读板器能在表达突触小泡蛋白-pHluorin报告物的神经元细胞中检测突触小泡循环的方面(例如，胞吐作用)。将大鼠胚胎皮质神经元在Greiner uClear 96孔板中培养。在7DIV用SypHy-AAV感染培养物。在33DIV，用测定缓冲液替换培养基，将板装载上Fluoroskan Ascent FL读板器，以5Hz记录GFP荧光。该读板器采用光电倍增管(PMT)测量某时间单个孔的荧光水平。确定基线荧光水平，加入离子霉素(10uM)诱导突触小泡的胞吐作用，并用读板器测量所得的荧光变化。离子霉素导致荧光强度增加～15％，表明具有PMT光学设备的Fluoroskan Ascent FL能采用sypHy报告物检测突触小泡循环(图27)。
等同方案和范围
本领域技术人员了解或能仅采用常规实验确认本文所述的特定实施方案的许多等同实施方案。本发明的范围不受以上说明限制，而仅由所附权利要求限定。
本领域技术人员了解或能仅采用常规实验确认本文所述发明的特定实施方案的许多等同实施方案。本发明的范围不受以上说明限制，而仅由所附权利要求限定。
在权利要求中除非另外说明或从可上下文中明显推断，未限定数量时是指一个或多个。除非另外说明或从可上下文中明显推断，权利要求或说明书中在一个或更多个组成员之间包含“或”是指在给定产物或过程中有组成员的一个、多于一个或所有存在、参与或以其它方式与其相关。本发明包括其中只有一个组成员存在于、参与给定产物或过程或以另外方式与其相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或全部组成员存在于、参与给定产物或过程或以另外方式与其相关的实施方案。此外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和置换，其中所列一个或更多个权利要求中的一个或更多个限定、要素、项目、描述性术语等被引入另一个权利要求。例如，可修改从属权利要求使其包含其它基于同一独立权利要求的从属权利要求的一个或更多个限定。此外，当权利要求涉及组合物时，应理解涵盖将组合物用于任何本文公开的目的的方法，并且也涵盖根据任何本文公开的制造方法制造组合物的方法或其它本领域已知方法，除非另外指名，或本领域技术人员能明确会发生抵触或不一致。
当要素以列表(例如以Markush组形式)存在时，应理解也公开了每个要素的亚组，并且可从所述组中去除任何要素。应理解，一般来说，当本发明或本发明的方面包含特定要素、特征等时，本发明的一些实施方案或本发明的方面由这些要素、特征等组成或基本由其组成。为了简明，这些实施方案没有在本文中逐字特别给出。还应注意术语“包含”是开放的并可引入另外的要素或步骤。
当给出范围时，包含端点。此外，应理解除非另外指明或根据上下文和本领域技术人员的理解可明显推断出的之外，表达为范围的值可设想在本发明的不同实施方案中所述范围的任何具体值或子范围，至所述范围下限最小单位的十分之一，除非上下文中明确指明。
此外，应理解任何属于现有技术的本发明具体实施方案可从权利要求的任何一个或更多个中明确排除。因为这些实施方案被认为被本领域普通技术人员所知，其可被排除，即使本文未明确指出该排除。不论是否与现有技术中存在相关，可出于任何原因，从任何一个或更多个权利要求中排除任何本发明组合物的实施方案(例如，任何细胞类型；任何神经元细胞；任何突触小泡循环报告物；任何电刺激系统；任何成像系统；任何突触小泡循环测定；任何突触小泡循环调节剂；任何使用方法等)。
Figure IPA00001358690600011
Figure IPA00001358690600031
Figure IPA00001358690600041
Figure IPA00001358690600051
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔；
b)多个电极对，其中每个电极对设置成
(i)用于放置在孔中，以及
(ii)产生在所述孔中的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场，以及其中所述多个电极对基本上同时在所述多个孔中的神经元细胞中诱导突触小泡循环；和
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器检测来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
2.权利要求1的平台，其中多个所述孔包含多个神经元细胞。
3.权利要求2的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞在10至1,000,000个神经元细胞的范围内。
4.权利要求2或3的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
5.权利要求2至4中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
6.权利要求1至5中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
7.权利要求2至6中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
8.权利要求1至7中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
9.权利要求1至8中任一项的平台，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
10.权利要求1至9中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对有效地放置在所述多个孔中的一个孔内。
11.权利要求1至10中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
12.权利要求11的平台，其中所述电源向每个电极对施加预定的电压。
13.权利要求12的平台，其中所述电压的范围是1V至400V。
14.权利要求12的平台，其中所述电压的范围是5V至20V。
15.权利要求11至14中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器向每个电极对施加预定的电压脉冲。
16.权利要求15的平台，其中所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率施加多个预定的电压脉冲。
17.权利要求16的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
18.权利要求16或17的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
19.权利要求16至18中任一项的平台，其中预定时间为最多2分钟。
20.权利要求16至19中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
21.权利要求16至20中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
22.权利要求16至21中任一项的平台，其中每个脉冲的所述持续时间的范围最多10毫秒。
23.权利要求16至22中任一项的平台，其中每个脉冲的所述持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
24.权利要求16至23中任一项的平台，其中每个脉冲所述起始之间的时间为0.1至5毫秒。
25.权利要求16至24中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
26.权利要求16至25中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机控制所述电压脉冲。
27.权利要求16至26中任一项的平台，其中每个检测器包含光学传感器。
28.权利要求1至27中任一项的平台，其中每个检测器包含物镜，所述物镜收集来自孔的发光信号。
29.权利要求28的平台，其中所述物镜收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
30.权利要求28或29的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
31.权利要求28至30中任一项的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
32.权利要求28至30中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
33.权利要求1至32中任一项的平台，其中所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件照相机。
34.权利要求1至33中任一项的平台，其中所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。
35.权利要求1至34中任一项的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元中细胞突触小泡循环的方面的数据。
36.权利要求1至35中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。
37.权利要求1至36中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个突触的发光信号。
38.权利要求1至37中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。
39.权利要求1至38中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
40.权利要求1至39中任一项的平台，其中多个所述神经元细胞表达具有腔部分的突触小泡蛋白，其中所述突触小泡蛋白与报告分子连接。
41.权利要求40的平台，其中所述报告分子与所述突触小泡蛋白的腔部分连接。
42.权利要求1至41中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
43.权利要求1至42中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
44.权利要求1至42中任一项的平台，其中所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
45.权利要求42的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
46.权利要求42的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
47.权利要求46的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
48.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；
b)多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对产生足以在孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场，和其中所述多个电极对基本上同时在所述多个孔中的神经元细胞中诱导突触小泡循环；和
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器检测来自所述多个神经元细胞中至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。
49.权利要求48的平台，其中所述多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子。
50.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中所述多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子；
b)刺激器系统，其基本上同时诱导所述孔中存在的神经元细胞中的突触小泡循环；和
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器检测来自孔中存在的所述多个神经元细胞至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。
51.权利要求50的平台，其中所述突触小泡蛋白包含腔部分。
52.权利要求50或51的平台，其中所述刺激器系统包含多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。
53.权利要求48至52中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。
54.权利要求48至53中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
55.权利要求48至54中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
56.权利要求48至55中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
57.权利要求48至56中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
58.权利要求48至57中任一项的平台，其中所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。
59.权利要求48和52至58中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
60.权利要求48和52至59中任一项的平台，其中所述每个电极对中的电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
61.权利要求48和52至60中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对有效放置在所述多个孔中的一个孔内。
62.权利要求48和52至61中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
63.权利要求62的平台，其中所述电源向每个电极对施加预定电压。
64.权利要求63的平台，其中所述电压的范围为1V至400V。
65.权利要求63的平台，其中所述电压的范围为5V至20V。
66.权利要求62至65中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器向每个电极对施加预定的电压脉冲。
67.权利要求66的平台，其中所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率施加多个预定的电压脉冲。
68.权利要求67的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
69.权利要求67或68的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
70.权利要求67至69中任一项的平台，其中预定时间最多2分钟。
71.权利要求67至70中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
72.权利要求67至71中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
73.权利要求67至72中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。
74.权利要求67至73中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
75.权利要求67至74中任一项的平台，其中所述每个脉冲起始之间的时间为0.1至5毫秒。
76.权利要求67至75中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
77.权利要求66至75中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机控制所述电压脉冲。
78.权利要求48至77中任一项的平台，其中每个检测器包含光学传感器。
79.权利要求48至78中任一项的平台，其中每个检测器包含物镜，所述物镜收集来自孔的发光信号。
80.权利要求79的平台，其中所述物镜收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
81.权利要求79或80的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
82.权利要求79的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
83.权利要求79至82中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
84.权利要求48至83中任一项的平台，其中所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件照相机。
85.权利要求48至84中任一项的平台，其中所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。
86.权利要求48至85中任一项的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞中突触小泡循环的方面的数据。
87.权利要求48至86中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。
88.权利要求48至87中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个突触的发光信号。
89.权利要求48至88中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。
90.权利要求49至89中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
91.权利要求49至90中任一项的平台，其中所述报告分子与所述突触小泡蛋白的腔部分相连。
92.权利要求49至91中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
93.权利要求49至92中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
94.权利要求50至93中任一项的平台，其中所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
95.权利要求92至94中任一项的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
96.权利要求92至95中任一项的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
97.权利要求48至96中任一项的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
98.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含：
a)多个孔；
b)多个电极对，其中每个电极对设置为
(i)用于放置在孔中，并且
(ii)产生在所述孔中的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场，以及其中所述多个电极对基本上同时在所述多个孔中的神经元细胞中诱导突触小泡循环；和
c)包含物镜的检测系统，所述物镜收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
99.权利要求98的平台，其中多个所述孔包含多个神经元细胞。
100.用于分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台，所述平台包含：
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；
b)多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，其中每个电极对产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场，以及其中所述多个电极对基本上同时在所述多个孔中的神经元细胞中诱导突触小泡循环；和
c)包含物镜的检测系统，所述物镜收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与所 述孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
101.用于分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台，所述平台包含：
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中多个所述神经元细胞包含与小泡蛋白相连的报告分子；
b)刺激器系统，基本上同时诱导所述孔中存在的神经元细胞中突触小泡循环；以及
c)包含物镜的检测系统，所述物镜收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与所述孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
102.权利要求101的平台，其中所述刺激器系统包含多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。
103.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白包含腔部分。
104.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述物镜是油镜或水镜。
105.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述物镜是空气物镜。
106.权利要求98至105中任一项的平台，其中所述物镜与光学检测器有效连接。
107.权利要求104的平台，其中所述光学检测器是电荷耦合器件照相机。
108.权利要求98至107中任一项的平台，其中所述平台设置为检测来自与神经元细胞的突触小泡蛋白相连的报告分子的发光信号，所述神经元细胞已被刺激而产生至少5个动作电位。
109.权利要求98至108中任一项的平台，其中所述检测系统包含多个物镜。
110.权利要求99至109中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。
111.权利要求99至110中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
112.权利要求99至111中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
113.权利要求99至112中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
114.权利要求99至113中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
115.权利要求99至114中任一项的平台，其中所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。
116.权利要求98、100和102至115中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
117.权利要求98、100和102至116中任一项的平台，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
118.权利要求98、100和102至117中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电 极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对有效放置在所述多个孔中的一个孔中。
119.权利要求98、100和102至118中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
120.权利要求119的平台，其中所述电源向每个电极对施加预定电压。
121.权利要求120的平台，其中所述电压的范围为1V至400V。
122.权利要求120的平台，其中所述电压的范围为5V至20V。
123.权利要求119至122中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器向每个电极对施加预定电压脉冲。
124.权利要求123的平台，其中所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率施加多个预定电压脉冲。
125.权利要求124的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至
100Hz。
126.权利要求124或125的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
127.权利要求124至126中任一项的平台，其中预定时间最多2分钟。
128.权利要求124至127中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
129.权利要求124至128中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
130.权利要求124至129中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。
131.权利要求124至130中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
132.权利要求124至131中任一项的平台，其中所述每个脉冲起始之间的持续时间为0.1至5毫秒。
133.权利要求124至132中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
134.权利要求124至133中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机控制所述电压脉冲。
135.权利要求124至134中任一项的平台，其中所述检测系统包含光学传感器。
136.权利要求124至135中任一项的平台，其中所述检测系统包含物镜，所述物镜收集来自孔的发光信号。
137.权利要求136的平台，其中所述物镜收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
138.权利要求135或136的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
139.权利要求138的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
140.权利要求136至139中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
141.权利要求98至140中任一项的平台，其中所述检测系统包含多个检测器，所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。
142.权利要求141的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。
143.权利要求141或142的平台，其中每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。
144.权利要求141至143中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个突触的发光信号。
145.权利要求141至144中任一项的平台，其中每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。
146.权利要求98至145中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
147.权利要求98至146中任一项的平台，其中所述报告分子连接到所述突触小泡蛋白的腔部分。
148.权利要求98至147中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
149.权利要求98至148中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
150.权利要求98至149中任一项的平台，其中所述报告分子包含在SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)中所示序列。
151.权利要求148至150中任一项的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
152.权利要求148至150中任一项的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
153.权利要求98至152中任一项的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
154.在多个细胞中测量突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供电极对和多个细胞，所述细胞表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子；
b)用所述电极对在所述多个细胞中基本上同时诱导足以在所述细胞中引发突触小泡循环的一系列动作电位；以及
c)在所述多个孔中检测所述报告分子的发光信号，
其中所述报告分子的发光信号是对突触小泡循环的方面的度量。
155.权利要求154的方法，其中所述多个细胞是神经元细胞。
156.权利要求154或155的方法，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100000个神经元细胞的范围内。
157.权利要求154或155的方法，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至2000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
158.权利要求154至156中任一项的方法，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
159.权利要求155至158中任一项的方法，其中所述神经元细胞是原代神经元，任选地，其中所述原代神经元是大鼠原代神经元。
160.权利要求155至159中任一项的方法，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
161.权利要求154至160中任一项的方法，其中多个所述神经元细胞表达与报告分子融合的突触小泡蛋白。
162.权利要求154至161中任一项的方法，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
163.权利要求154至162中任一项的方法，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
164.权利要求154至163中任一项的方法，其还包括采用电极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对放置在所述多个孔中的一个孔内。
165.权利要求154至164中任一项的方法，其中通过与所述多个电极有效连接的电源来诱发所述动作电位。
166.权利要求154至165中任一项的方法，其中通过向每个电极对施加预定电压来诱发所述动作电位。
167.权利要求166的方法，其中所述电压的范围为1V至400V。
168.权利要求166的方法，其中所述电压的范围为5V至20V。
169.权利要求165至168中任一项的方法，其中脉冲发生器与所述电源和所述多个电极对有效连接，并且其中所述脉冲发生器向每个电极对施加预定的电压脉冲。
170.权利要求169的方法，其中所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率施加多个预定电压脉冲。
171.权利要求170的方法，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
172.权利要求170或171的方法，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
173.权利要求170至172中任一项的方法，其中所述预定时间小于或等于2分钟。
174.权利要求170至173中任一项的方法，其中所述预定时间的范围为0.1至20秒。
175.权利要求170至174中任一项的方法，其中所述预定时间的范围为5至15秒。
176.权利要求170至175中任一项的方法，其中每个脉冲的所述持续时间的范围是最多10毫秒。
177.权利要求170至176中任一项的方法，其中每个脉冲的所述持续时间的范围是0.1毫秒至2毫秒。
178.权利要求170至175中任一项的方法，其中每个脉冲所述起始之间的时间是0.1至5毫秒。
179.权利要求170至175中任一项的方法，其中所述脉冲数的范围是1至1000。
180.权利要求169至179中任一项的方法，其中所述电压脉冲由与所述脉冲发生器有效连接的计算机控制。
181.权利要求155至180中任一项的方法，其中所述发光信号由检测器检测。
182.权利要求181的方法，其中所述检测器包含光学传感器。
183.权利要求181或182的方法，其中所述报告分子的发光信号用多个检测器检测，其中电荷耦合器件照相机与每个检测器有效连接。
184.权利要求181的方法，其中每个检测器包含物镜，所述物镜收集来自孔的发光信号。
185.权利要求184的方法，其中所述物镜收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
186.权利要求184或185的方法，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
187.权利要求186的方法，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
188.权利要求183的方法，其中所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。
189.权利要求183至188中任一项的方法，其中计算机与所述多个检测器有效连接并将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞中突触小泡循环的方面的数据。
190.权利要求183至189中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。
191.权利要求183至190中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个突触的发光信号。
192.权利要求183至191中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。
193.权利要求154至192中任一项的方法，其中所述突触小泡蛋白是：VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
194.权利要求154至192中任一项的方法，其中所述突触小泡蛋白具有腔部分。
195.权利要求194的方法，其中所述发光报告分子与腔部分相连。
196.权利要求154至195中任一项的方法，其中所述发光报告分子为pH敏感的报告分子。
197.权利要求154至196中任一项的方法，其中所述发光报告分子为pHluorin。
198.权利要求154至196中任一项的方法，其中所述发光报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
199.权利要求196的方法，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于在5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
200.权利要求197的方法，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于在7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
201.权利要求154至200中任一项的方法，其中所述发光信号在475nm至525nm范围内。
202.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)在所述细胞中基本上同时诱导第二系列的动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
f)检测所述多个孔中的报告分子的第二发光信号；
其中在步骤(c)中检测到的发光信号与在步骤(f)中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
203.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
在步骤(b)之前，使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；其中在步骤(c)中检测到的发光信号与对照发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
204.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种对照剂相接触；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在具有对照剂的孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
205.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括：
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待 检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在阴性对照孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
206.权利要求205的方法，其还包括使所述阴性对照孔中的多个细胞与不调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。
207.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在阳性对照孔中检测到的发光信号之间无显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
208.权利要求207的方法，其还包括使所述阳性对照孔中的多个细胞与调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。
209.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是小分子。
210.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是多肽。
211.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是抗体。
212.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是核酸。
213.权利要求212的方法，其中所述核酸是选定的DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、短干扰RNA、短发夹RNA、小RNA、核酶或适体。
214.权利要求202或203的方法，其中所述测试物是碳水化合物。
215.权利要求202或203的方法，其中所述测试物是脂质。
216.权利要求215的方法，其中所述脂质是磷脂、甘油三酯或甾类。
217.权利要求202至216中任一项的方法，其还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环的方面调节剂的测试物的毒性。
218.权利要求202至216中任一项的方法，其还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环的方面调节剂的测试物的效力。
219.权利要求154至218中任一项的方法，其中所述方法是高通量的筛选方法。
220.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光水平。
221.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是在预定时间内获得的多个荧光水平。
222.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光增加速率。
223.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光衰减速率。
224.鉴定作为突触小泡循环方面之调节剂的测试物的方法，所述方法包括
a)提供多个孔，每个孔包含电极对以及表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多 个细胞；
b)在所述多个细胞中基本上同时诱导第一系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
c)检测所述多个孔中报告分子的第一发光信号；
d)使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)在所述细胞中基本上同时诱导第二系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；以及
f)检测所述多个孔中报告分子的第二发光信号；
其中所述报告分子的第一和第二荧光水平之间的显著差异鉴定出所述测试物是突触小泡循环的方面的调节剂。
225.在多个细胞中测量突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供电极对和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；
b)用所述电极对在所述多个细胞中基本上同时诱导一系列动作电位，所述动作电位足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号；
其中所述报告分子的发光信号是突触小泡循环的方面的度量；以及
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中具有所述测试物的孔中检测到的发光信号与对照孔中检测到的发光信号之间的比较鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
226.测量多个细胞中突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供刺激器和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；
b)用所述刺激器在所述多个细胞中基本上同时诱导一系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；以及
c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号。

Claims (226)

1.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔；
b)多个电极对，其中每个电极对设置成
(i)用于放置在孔中，以及
(ii)产生适于在所述孔中的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置成检测来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触前蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
2.权利要求1的平台，其中多个所述孔包含多个神经元细胞。
3.权利要求2的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞在10至1,000,000个神经元细胞的范围内。
4.权利要求2或3的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
5.权利要求2至4中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
6.权利要求1至5中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
7.权利要求2至6中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
8.权利要求1至7中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
9.权利要求1至8中任一项的平台，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
10.权利要求1至9中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电极转移系统设置为将所述多个电极对中的每个电极对有效地放置在所述多个孔中的一个孔内。
11.权利要求1至10中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
12.权利要求11的平台，其中所述电源设置为向每个电极对施加预定的电压。
13.权利要求12的平台，其中所述电压的范围是1V至400V。
14.权利要求12的平台，其中所述电压的范围是5V至20V。
15.权利要求11至14中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器设置为向每个电极对施加预定的电压脉冲。
16.权利要求15的平台，其中所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率施加多个预定的电压脉冲。
17.权利要求16的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
18.权利要求16或17的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
19.权利要求16至18中任一项的平台，其中预定时间为最多2分钟。
20.权利要求16至19中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
21.权利要求16至20中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
22.权利要求16至21中任一项的平台，其中每个脉冲的所述持续时间的范围最多10毫秒。
23.权利要求16至22中任一项的平台，其中每个脉冲的所述持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
24.权利要求16至23中任一项的平台，其中每个脉冲所述起始之间的时间为0.1至5毫秒。
25.权利要求16至24中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
26.权利要求16至25中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。
27.权利要求16至26中任一项的平台，其中每个检测器包含光学传感器。
28.权利要求1至27中任一项的平台，其中每个检测器都包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。
29.权利要求28的平台，其中所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
30.权利要求28或29的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
31.权利要求28至30中任一项的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
32.权利要求28至30中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
33.权利要求1至32中任一项的平台，其中所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件照相机。
34.权利要求1至33中任一项的平台，其中所述多个检测器设置为同时检测来自多个孔的信号。
35.权利要求1至34中任一项的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。
36.权利要求1至35中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。
37.权利要求1至36中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。
38.权利要求1至37中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。
39.权利要求1至38中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
40.权利要求1至39中任一项的平台，其中多个所述神经元细胞表达具有腔部分的突触小泡蛋白，其中所述突触小泡蛋白与报告分子连接。
41.权利要求40的平台，其中所述报告分子与所述突触小泡蛋白的腔部分连接。
42.权利要求1至41中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
43.权利要求1至42中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
44.权利要求1至42中任一项的平台，其中所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
45.权利要求42的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
46.权利要求42的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
47.权利要求46的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
48.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；
b)多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；和
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置成检测来自所述多个神经元细胞中至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。
49.权利要求48的平台，其中所述多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子。
50.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中所述多个神经元细胞包含与突触小泡蛋白连接的报告分子；
b)刺激器系统，其设置为诱导所述孔中存在的神经元细胞中的突触小泡循环；和
c)包含多个检测器的检测系统，其中每个检测器设置为检测来自孔中存在的所述多个神经元细胞至少一个亚组的发光信号，其中所述发光信号指示突触小泡循环的方面。
51.权利要求50的平台，其中所述突触小泡蛋白包含腔部分。
52.权利要求50或51的平台，其中所述刺激器系统包含多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。
53.权利要求48至52中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。
54.权利要求48至53中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
55.权利要求48至54中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
56.权利要求48至55中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
57.权利要求48至56中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
58.权利要求48至57中任一项的平台，其中所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。
59.权利要求48和52至58中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
60.权利要求48和52至59中任一项的平台，其中所述每个电极对中的电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
61.权利要求48和52至60中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电极转移系统设置为将所述多个电极对中的每个电极对有效放置在所述多个孔中的一个孔内。
62.权利要求48和52至61中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
63.权利要求62的平台，其中所述电源设置为向每个电极对施加预定电压。
64.权利要求63的平台，其中所述电压的范围为1V至400V。
65.权利要求63的平台，其中所述电压的范围为5V至20V。
66.权利要求62至65中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器设置为向每个电极对施加预定的电压脉冲。
67.权利要求66的平台，其中所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率施加多个预定的电压脉冲。
68.权利要求67的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
69.权利要求67或68的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
70.权利要求67至69中任一项的平台，其中预定时间最多2分钟。
71.权利要求67至70中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
72.权利要求67至71中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
73.权利要求67至72中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。
74.权利要求67至73中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
75.权利要求67至74中任一项的平台，其中所述每个脉冲起始之间的时间为0.1至5毫秒。
76.权利要求67至75中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
77.权利要求66至75中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。
78.权利要求48至77中任一项的平台，其中每个检测器包含光学传感器。
79.权利要求48至78中任一项的平台，其中每个检测器包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。
80.权利要求79的平台，其中所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
81.权利要求79或80的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
82.权利要求79的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
83.权利要求79至82中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
84.权利要求48至83中任一项的平台，其中所述检测系统包含与每个检测器有效连接的电荷耦合器件照相机。
85.权利要求48至84中任一项的平台，其中所述多个检测器被设置为同时检测来自多个孔的信号。
86.权利要求48至85中任一项的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞中突触小泡循环的方面的数据。
87.权利要求48至86中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。
88.权利要求48至87中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。
89.权利要求48至88中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。
90.权利要求49至89中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
91.权利要求49至90中任一项的平台，其中所述报告分子与所述突触小泡蛋白的腔部分相连。
92.权利要求49至91中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
93.权利要求49至92中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
94.权利要求50至93中任一项的平台，其中所述报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
95.权利要求92至94中任一项的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
96.权利要求92至95中任一项的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
97.权利要求48至96中任一项的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
98.用于分析突触小泡循环的方面的平台，所述平台包含：
a)多个孔；
b)多个电极对，其中每个电极对设置为
(i)用于放置在孔中，并且
(ii)产生适于在所述孔中的多个神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及
c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
99.权利要求98的平台，其中多个所述孔包含多个神经元细胞。
100.用于分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台，所述平台包含：
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞；
b)多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场；以及
c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与所述孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
101.用于分析突触小泡循环的方面的神经元细胞培养平台，所述平台包含：
a)多个孔，其中每个孔包含多个神经元细胞，并且其中多个所述神经元细胞包含与小泡蛋白相连的报告分子；
b)刺激器系统，设置为诱导所述孔中存在的神经元细胞中突触小泡循环；以及
c)包含物镜的检测系统，所述物镜设置为收集来自报告分子的发光信号，所述报告分子与所述孔中存在的神经元细胞的突触小泡蛋白相连，并且其中所述发光信号的存在指示所述神经元细胞中突触小泡循环的方面。
102.权利要求101的平台，其中所述刺激器系统包含多个电极对，其中每个电极对放置在所述多个孔的一个中，并且其中每个电极对设置为产生足以在所述孔中存在的神经元细胞中诱导突触小泡循环的电场。
103.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白包含腔部分。
104.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述物镜是油镜或水镜。
105.权利要求98至102中任一项的平台，其中所述物镜是空气物镜。
106.权利要求98至105中任一项的平台，其中所述物镜与光学检测器有效连接。
107.权利要求104的平台，其中所述光学检测器是电荷耦合器件照相机。
108.权利要求98至107中任一项的平台，其中所述平台设置为检测来自与神经元细胞的突触小泡蛋白相连的报告分子的发光信号，所述神经元细胞已被刺激而产生至少5个动作电位。
109.权利要求98至108中任一项的平台，其中所述检测系统包含多个物镜。
110.权利要求99至109中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100,000个神经元细胞的范围内。
111.权利要求99至110中任一项的平台，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至4000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
112.权利要求99至111中任一项的平台，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
113.权利要求99至112中任一项的平台，其中所述神经元细胞为原代神经元，任选地，其中所述原代神经元为大鼠原代神经元。
114.权利要求99至113中任一项的平台，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
115.权利要求99至114中任一项的平台，其中所述神经元细胞包含表达与报告分子融合的突触小泡蛋白的转基因，所述蛋白具有腔部分。
116.权利要求98、100和102至115中任一项的平台，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
117.权利要求98、100和102至116中任一项的平台，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
118.权利要求98、100和102至117中任一项的平台，其还包含电极转移系统，所述电极转移系统设置为将所述多个电极对中的每个电极对有效放置在所述多个孔中的一个孔中。
119.权利要求98、100和102至118中任一项的平台，其还包含与所述多个电极有效连接的电源。
120.权利要求119的平台，其中所述电源设置为向每个电极对施加预定电压。
121.权利要求120的平台，其中所述电压的范围为1V至400V。
122.权利要求120的平台，其中所述电压的范围为5V至20V。
123.权利要求119至122中任一项的平台，其还包含与所述电源和所述多个电极对有效连接的脉冲发生器，其中所述脉冲发生器设置为向每个电极对施加预定电压脉冲。
124.权利要求123的平台，其中所述脉冲发生器设置为在预定时间内以预定频率施加多个预定电压脉冲。
125.权利要求124的平台，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
126.权利要求124或125的平台，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
127.权利要求124至126中任一项的平台，其中预定时间最多2分钟。
128.权利要求124至127中任一项的平台，其中预定时间的范围为0.1至20秒。
129.权利要求124至128中任一项的平台，其中预定时间的范围为5至15秒。
130.权利要求124至129中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围最多10毫秒。
131.权利要求124至130中任一项的平台，其中所述每个脉冲的持续时间的范围为0.1毫秒至2毫秒。
132.权利要求124至131中任一项的平台，其中所述每个脉冲起始之间的持续时间为0.1至5毫秒。
133.权利要求124至132中任一项的平台，其中所述脉冲数的范围为1至1000。
134.权利要求124至133中任一项的平台，其还包含与所述脉冲发生器有效连接的计算机，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。
135.权利要求124至134中任一项的平台，其中所述检测系统包含光学传感器。
136.权利要求124至135中任一项的平台，其中所述检测系统包含物镜，所述物镜设置为收集来自孔的发光信号。
137.权利要求136的平台，其中所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
138.权利要求135或136的平台，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
139.权利要求138的平台，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
140.权利要求136至139中任一项的平台，其中所述物镜不是油浸或水浸镜头。
141.权利要求98至140中任一项的平台，其中所述检测系统包含多个检测器，所述多个检测器设置为同时检测来自多个孔的信号。
142.权利要求141的平台，其中所述检测系统包含与所述检测器有效连接的计算机，并且其中所述计算机设置为将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞突触小泡循环的方面的数据。
143.权利要求141或142的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个报告分子的发光信号。
144.权利要求141至143中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个突触的发光信号。
145.权利要求141至144中任一项的平台，其中每个检测器设置为检测来自多个神经元细胞的发光信号。
146.权利要求98至145中任一项的平台，其中所述突触小泡蛋白是VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
147.权利要求98至146中任一项的平台，其中所述报告分子连接到所述突触小泡蛋白的腔部分。
148.权利要求98至147中任一项的平台，其中所述报告分子为pH敏感的荧光蛋白。
149.权利要求98至148中任一项的平台，其中所述报告分子为pHluorin。
150.权利要求98至149中任一项的平台，其中所述报告分子包含在SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)中所示序列。
151.权利要求148至150中任一项的平台，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
152.权利要求148至150中任一项的平台，其中，在5.0至6.0范围的pH下所述pH敏感的报告分子发出荧光，其强度显著大于7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
153.权利要求98至152中任一项的平台，其中所述发光信号是475nm至525nm范围的荧光信号。
154.在多个细胞中测量突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供电极对和多个细胞，所述细胞表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子；
b)用所述电极对在所述多个细胞中诱导足以在所述细胞中引发突触小泡循环的一系列动作电位；以及
c)在所述多个孔中检测所述报告分子的发光信号，
其中所述报告分子的发光信号是对突触小泡循环的方面的度量。
155.权利要求154的方法，其中所述多个细胞是神经元细胞。
156.权利要求154或155的方法，其中孔中的所述多个神经元细胞是在10至100000个神经元细胞的范围内。
157.权利要求154或155的方法，其中孔中的所述多个神经元细胞是在1000至2000个细胞/mm2孔底面积的范围内。
158.权利要求154至156中任一项的方法，其中所述多个神经元细胞包括至少两种不同的神经元细胞类型。
159.权利要求155至158中任一项的方法，其中所述神经元细胞是原代神经元，任选地，其中所述原代神经元是大鼠原代神经元。
160.权利要求155至159中任一项的方法，其中所述神经元细胞选自：谷氨酸能神经元细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞。
161.权利要求154至160中任一项的方法，其中多个所述神经元细胞表达与报告分子融合的突触小泡蛋白。
162.权利要求154至161中任一项的方法，其中电极对中的每个电极具有基本呈曲线形的表面。
163.权利要求154至162中任一项的方法，其中每个电极对中的所述电极为基本同心的圆柱体，并且其中所述同心圆柱体被环形绝缘材料所分隔。
164.权利要求154至163中任一项的方法，其还包括采用电极转移系统将所述多个电极对中的每个电极对放置在所述多个孔中的一个孔内。
165.权利要求154至164中任一项的方法，其中通过与所述多个电极有效连接的电源来诱发所述动作电位。
166.权利要求154至165中任一项的方法，其中通过向每个电极对施加预定电压来诱发所述动作电位。
167.权利要求166的方法，其中所述电压的范围为1V至400V。
168.权利要求166的方法，其中所述电压的范围为5V至20V。
169.权利要求165至168中任一项的方法，其中脉冲发生器与所述电源和所述多个电极对有效连接，并且其中所述脉冲发生器向每个电极对施加预定的电压脉冲。
170.权利要求169的方法，其中所述脉冲发生器在预定时间内以预定频率施加多个预定电压脉冲。
171.权利要求170的方法，其中所述预定频率的范围为0.2Hz至100Hz。
172.权利要求170或171的方法，其中所述预定频率的范围为10Hz至50Hz。
173.权利要求170至172中任一项的方法，其中所述预定时间小于或等于2分钟。
174.权利要求170至173中任一项的方法，其中所述预定时间的范围为0.1至20秒。
175.权利要求170至174中任一项的方法，其中所述预定时间的范围为5至15秒。
176.权利要求170至175中任一项的方法，其中所述每个脉冲的持续时间的范围是最多10毫秒。
177.权利要求170至176中任一项的方法，其中所述每个脉冲的持续时间的范围是0.1毫秒至2毫秒。
178.权利要求170至175中任一项的方法，其中所述每个脉冲起始之间的时间是0.1至5毫秒。
179.权利要求170至175中任一项的方法，其中所述脉冲数的范围是1至1000。
180.权利要求169至179中任一项的方法，其中所述电压脉冲由与所述脉冲发生器有效连接的计算机控制，其中所述计算机设置为控制所述电压脉冲。
181.权利要求155至180中任一项的方法，其中所述发光信号由检测器检测。
182.权利要求181的方法，其中所述检测器包含光学传感器。
183.权利要求181或182的方法，其中所述报告分子的发光信号用多个检测器检测，其中电荷耦合器件照相机与每个检测器有效连接。
184.权利要求181的方法，其中每个检测器包含物镜，所述物镜设置成收集来自孔的发光信号。
185.权利要求184的方法，其中所述物镜设置为收集来自范围为0.2mm至5mm的视野区域的发光信号。
186.权利要求184或185的方法，其中所述物镜数值孔径的范围为0.4至1.4。
187.权利要求186的方法，其中所述物镜的数值孔径为0.5。
188.权利要求183的方法，其中所述多个检测器同时检测来自多个孔的信号。
189.权利要求183至188中任一项的方法，其中计算机与所述多个检测器有效连接并将来自所述检测器的发光信号转化成表征神经元细胞中突触小泡循环的方面的数据。
190.权利要求183至189中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个报告分子的发光信号。
191.权利要求183至190中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个突触的发光信号。
192.权利要求183至191中任一项的方法，其中每个检测器检测来自多个神经元细胞的发光信号。
193.权利要求154至192中任一项的方法，其中所述突触小泡蛋白是：VAMP2、vGlut1、突触素、小泡GABA转运蛋白；乙酰胆碱转运蛋白、儿茶酚胺转运蛋白或突触结合蛋白。
194.权利要求154至192中任一项的方法，其中所述突触小泡蛋白具有腔部分。
195.权利要求194的方法，其中所述发光报告分子与腔部分相连。
196.权利要求154至195中任一项的方法，其中所述发光报告分子为pH敏感的报告分子。
197.权利要求154至196中任一项的方法，其中所述发光报告分子为pHluorin。
198.权利要求154至196中任一项的方法，其中所述发光报告分子包含SEQ ID NO：1(hSyn-SypHy)所示序列。
199.权利要求196的方法，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于在5.0至6.0范围的pH下所发出的荧光。
200.权利要求197的方法，其中，在7.0至8.0范围的pH下所述pH敏感报告分子发出荧光，其强度显著大于在7.0至8.0范围的pH下所发出的荧光。
201.权利要求154至200中任一项的方法，其中所述发光信号在475nm至525nm范围内。
202.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)在所述细胞中诱导第二系列的动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
f)检测所述多个孔中的报告分子的第二发光信号；
其中在步骤(c)中检测到的发光信号与在步骤(f)中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
203.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
在步骤(b)之前，使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；其中在步骤(c)中检测到的发光信号与对照发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
204.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种对照剂相接触；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在具有对照剂的孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
205.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括：
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在阴性对照孔中检测到的发光信号之间的显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
206.权利要求205的方法，其还包括使所述阴性对照孔中的多个细胞与不调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。
207.权利要求154至201中任一项的方法，其还包括
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中在具有测试物的孔中检测到的发光信号与在阳性对照孔中检测到的发光信号之间无显著差异鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
208.权利要求207的方法，其还包括使所述阳性对照孔中的多个细胞与调节突触小泡循环的方面的对照剂相接触。
209.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是小分子。
210.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是多肽。
211.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是抗体。
212.权利要求202至208中任一项的方法，其中所述测试物是核酸。
213.权利要求212的方法，其中所述核酸是选定的DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、短干扰RNA、短发夹RNA、小RNA、核酶或适体。
214.权利要求202或203的方法，其中所述测试物是碳水化合物。
215.权利要求202或203的方法，其中所述测试物是脂质。
216.权利要求215的方法，其中所述脂质是磷脂、甘油三酯或甾类。
217.权利要求202至216中任一项的方法，其还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环的方面调节剂的测试物的毒性。
218.权利要求202至216中任一项的方法，其还包括在体内模型中监测被鉴定为突触小泡循环的方面调节剂的测试物的效力。
219.权利要求154至218中任一项的方法，其中所述方法是高通量的筛选方法。
220.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光水平。
221.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是在预定时间内获得的多个荧光水平。
222.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光增加速率。
223.权利要求154至219中任一项的方法，其中所述发光信号是荧光衰减速率。
224.鉴定作为突触小泡循环方面之调节剂的测试物的方法，所述方法包括
a)提供多个孔，每个孔包含电极对以及表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；
b)在所述多个细胞中诱导第一系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
c)检测所述多个孔中报告分子的第一发光信号；
d)使所述多个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
e)在所述细胞中诱导第二系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；以及
f)检测所述多个孔中报告分子的第二发光信号；
其中所述报告分子的第一和第二荧光水平之间的显著差异鉴定出所述测试物是突触小泡循环的方面的调节剂。
225.在多个细胞中测量突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供电极对和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；
b)用所述电极对在所述多个细胞中诱导一系列动作电位，所述动作电位足以在所述细胞中引发突触小泡循环；
c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号；
其中所述报告分子的发光信号是突触小泡循环的方面的度量；以及
d)使所述多个孔的至少一个孔中的多个细胞与至少一种测试物相接触，所述测试物待检测其调节突触小泡循环的方面的能力；
其中具有所述测试物的孔中检测到的发光信号与对照孔中检测到的发光信号之间的比较鉴定出所述测试物调节突触小泡循环的方面。
226.测量多个细胞中突触小泡循环的方面的方法，所述方法包括
a)在多个孔的每一个中提供刺激器和表达与突触小泡蛋白相连的荧光报告分子的多个细胞；
b)用所述刺激器在所述多个细胞中诱导一系列动作电位，其足以在所述细胞中引发突触小泡循环；以及
c)检测所述多个孔中报告分子的发光信号。
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