JP2024516303A - 薬物フィンガプリンティング - Google Patents

Abstract

本発明は、神経障害および潜在的な治療的処置を特徴付けるために使用されることができる、測定された神経活動電位内の特徴を識別するために光遺伝学的アッセイを使用する方法およびシステムを提供する。本発明は、健康な電気的励起可能細胞の特徴およびパターン特性を識別することを含む。それらの特徴は次いで、疾患状態または他の摂動を表すことが疑われる細胞内の同一のタイプの特徴と比較される。疾患の重要な指標の簡潔な、高度情報表現に到達するために、新規のアルゴリズムおよび統計的方法が使用される。

Description

発明の分野
本発明は概して、疾患を特徴付け、治療的化合物を特徴付ける方法およびシステムに関する。

背景
疾患、脳卒中、および脳損傷によって引き起こされるものなどの神経学的障害は、最大で十億人の人間に全体的に影響を及ぼすように推測される。神経学的障害の原因、活動の機構、および潜在的な処置を理解するために、有意なリソースがささげられてきた。神経学的障害を引き起こす機構を理解することに費やされた時間およびリソースに関わらず、多くの症候群の機能的病因は、未知のままである。これは、神経学的障害を処置することへの潜在的な治療薬を効率的にスクリーニングすることに妨害をもたらす。

神経科学薬の発見における進歩が制限されることは、一次的治療的エンドポイントを予測する出力により変換可能なモデルシステムが不足していること、およびスクリーニング技術が不足していることの両方に部分的に起因する。例えば、神経科学薬の発見において動物モデルに依存することは、強いモデル検証が不足していることに部分的に起因して、いくつかの臨床的な失望につながってきた。齧歯類モデルは、歴史的に、人類における効能の不良な予測子であった。加えて、動物モデルは典型的には、化合物ライブラリをスクリーニングするために必要なスループットを許容しない。

おそらくはより根本的に、既存の神経学的モデルおよびスクリーニングモダリティは、いくつかの有形の定義された測定にまたがる比較を可能にする方式において、神経障害および薬物反応を効率的に特徴付ける方法を不足している。むしろ、ほとんどのモデルおよびスクリーニングモダリティは、特定の障害または薬物を中心にして設計されるべきであり、それらの出力は、特定の実験を超えて関連する最小の情報を提供する。

要旨
本発明は、神経障害を識別および特徴付け、潜在的な治療的処置を発見および／または検証するのに有用である、神経活動電位の特徴を識別するために光遺伝学的アッセイを使用する方法およびシステムを提供する。本明細書で説明されるように、本発明は、健康な電気的励起可能細胞の特徴およびパターン特性を識別することを含む。それらの特徴は次いで、疾患状態または他の摂動を表すことが疑われる細胞内の同一のタイプの特徴と比較される。疾患の重要な指標の簡潔な、高度情報表現に到達するために、新規のアルゴリズムおよび統計的方法が使用される。この簡明な「フィンガプリント」は、疾患または状態「表現型」を診断または特徴付けるために有用である。加えて、処置の効能のための治療的化合物をスクリーニングし、承認された治療を再利用しまたは新たな方向を設定し、標的外活性を判断し、インシリコで治療的候補に疾患を合致させ、探索アルゴリズムに適切な方式において化合物効果の間の類似性および差異を特徴付けるために、それらの同一の特徴が使用される。

本発明によれば、神経活動電位の特性およびパターンに影響を及ぼす障害に対するそれらの影響を識別する方式において、薬物がフィンガプリントされることができる。本発明の方法は、健康な細胞および疾患細胞を示す様々な特徴を測定するために、光電気生理学技術を利用する。健康な細胞の特徴から発散するそれらの特徴は、障害を特徴付ける「フィンガプリント」を結果としてもたらす。障害とのそのフィンガプリントの相関関係（関連する症状学、他の診断試験などによる）は次いで、関連する障害についての診断基準として使用される。加えて、同一のフィンガプリンティング技術は、治療的効能を判断し、潜在的な処置（例えば、障害の回復を促進するための薬物または他の介入的方法）を識別するために広く有用である。

本発明における使用のためのフィンガプリントは、高さ、幅、持続時間、形状、タイミング、周波数、屈折、破裂、同調、刺激との関係、およびその他など、活動電位の特徴の使用を含む。しかしながら、以下で説明されるように、本発明の方法は、特定の細胞状態に特有である他の情報（例えば、色変化／強度）をも提供し得、したがって、フィンガプリントを作成するための有用なデータをも提供し得る。本質的に、いずれかの細胞状態を区別する定量的または定質的な差異は、細胞の状態に一意であるフィンガプリントを構築するために組合せで使用される。

本発明における使用のための活動電位の特性は、光電気生理学技術を使用して取得される。そのような技術は、慣習的なパッチクランプ技術よりもいくつかの不利な点を有する。例えば、慣習的な電気生理学技術が細胞膜にまたは細胞膜の近傍に配置された物理センサを必要とする場合、光パッチは、電気シグナルを視認可能な蛍光に変換し、視認可能な蛍光は、ビデオによるスケールにおいて捕捉されることができる。活動電位特徴は、動画から自動で抽出され、未処理データと比較して複雑度が低減するが、それから派生する細胞を特徴付ける活動電位の一意なマップを提供するフィンガプリントを結果としてもたらす。これは、特徴およびフィンガプリントが、例えば、細胞タイプ、細胞状態、疾患表現型、および薬理学的反応の詳細な分析のための基礎を提供することを可能にする。よって、活動電位特徴のそれらのフィンガプリントは、横幅、深度、および粒度により神経細胞に対する障害の影響および治療薬を特徴付けるための有形の測定を提供する。

疾患細胞から取得されたフィンガプリントは、関連するベースラインを提供する目的のために、試験細胞との直接の比較として使用される。フィンガプリントは、適切な情報科学を提供する方式において使用されることができる。よって、フィンガプリントは、デジタル的にオーバレイされることができ、またはフィンガプリントを成すようになる特性は、試験細胞から取得された特性を判断するために使用されることができる。神経学的障害のフィンガプリント特性を比較し、潜在的な薬物の影響を判断することによって、薬物の治療的効能が判断される。

加えて、本発明のシステムおよび方法は、健康な細胞および公知の神経障害を有するものの活動電位における差異を識別するために有用である。差異は、障害のフィンガプリントを表す。細胞に対する推定上の治療的化合物の影響は、フィンガプリントを作成するために同様にマッピングされる。疾患細胞および／または標準の細胞の効能と比較するときの効能を判断するために、治療的フィンガプリントが有用である。よって、本発明は、例えば、障害に対する潜在的な治療的処置を識別し、薬物候補の潜在的な副作用を予測し、現存の処置、相乗効果のある処置、または複数の化合物を使用した組合せの処置と比較して副作用が低減しまたは副作用がない候補処置を識別し、更には、潜在的な第２の処置の使用のための既知の化合物を即時にスクリーニングするために有用である。

本発明は、神経障害を処置するための推定上の治療的化合物の治療的効能を予測する方法を提供する。例示的な方法は、１つまたは複数の刺激された健康な神経細胞タイプ内の活動電位の特徴を識別するステップを含む。それらの特性（フィンガプリント）は次いで、疾患状態にある同一の細胞タイプ内で取得された活性と比較される。差異は、診断として有用である。加えて、細胞は、推定上の治療的化合物に曝露され得る。特性は、治療的効能を判断するように、健康な細胞にマッピングされる。

本発明はまた、推定上の治療薬の副作用を予測するために有用である。例示的な方法は、化合物が存在するときに識別された活動電位特徴のうちの１つまたは複数が他の治療的化合物の既知の副作用と関連付けられる程度に基づいて、推定上の治療薬の副作用を予測するステップを含む。

本発明の方法はまた、組合せ治療法の治療的効能を予測するために有用である。１つの実施例として、本発明の方法は、所望の臨床的成果と関連付けられたフィンガプリントと比較して、それらの組み合わされたフィンガプリントに基づいて、異なる治療的モダリティの連結の分析のために有用である。

本発明の好ましい実装態様は、光遺伝学的アッセイによるものである。よって、神経細胞は、細胞活性の１つまたは複数の光学リポータまたは細胞活性および／もしくは光学アクチュエータを含み得る。

例示的な方法では、本発明は、推定上の治療的化合物が存在しないときと対比して推定上の治療的化合物が存在するとき、神経細胞によって排他的に占有された空間の領域を識別するように、活動電位の特徴によって定義された空間に活動電位をマッピングするステップを企図する。

本発明はまた、治療的効能を有する化合物を識別する方法を提供する。治療的効能を有する化合物を識別する例示的な方法は、健康な細胞のフィンガプリントへの類似性を増大させる方式において、刺激された神経細胞が治療的化合物に曝露されるときに存在する神経活動電位の特徴を識別するステップを含む。方法はまた、推定上の治療的化合物の存在下で神経細胞を刺激するステップを含み得る。方法は次いで、化合物が投与された神経細胞内の刺激の下の活動電位の特徴が、同一の刺激に曝露された健康な神経細胞に存在すると予想された特徴に合致するかどうかを決定するステップを含む。推定上の治療的化合物は次いで、先述の決定するステップの結果に基づいて、治療的効能を有するとして識別される。

本発明はまた、薬物発見のための方法を提供する。本発明に係る薬物発見のための例示的な方法は、神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップを含む。神経は次いで、試験化合物に曝露され、神経が刺激され、活動電位のフィンガプリントが、所望の治療的成果による細胞のフィンガプリントと合致または近似するかどうかが決定される。

本発明はまた、神経障害を診断し、治療的効能を予測する方法を提供する。例示的な方法では、細胞を有する試料が対象から取得される。細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：induced pluripotent stem cell）由来神経細胞を導出するために使用され得る。試料からまたは試料から導出された細胞は、特徴を識別するように刺激される。識別された活動電位特徴は、神経障害表現型を発現する細胞内で識別された実質的に同一の特徴にマッピングされる。特徴が対象由来細胞と神経障害細胞との間で合致する程度に基づいて、対象が神経障害を有するとして診断される。類似の手順は、治療的介入が作用しておりまたは作用する可能性が高いことを示す特徴を示すそれらの細胞を識別することによって、治療的効能を決定するために使用される。

本発明の他の利点および特徴は、以下の詳細な開示を考慮すると、当業者にとって明らかである。

図１は、経時的な例示的な測定を提供する。

図２は、例示的な活動電位特徴／パラメータを示す。

図３は、部分的電圧トレースの比較を示す。

図４は、活動電位特徴／パラメータのレーダプロットを提供する。

図５は、活動電位特徴の２つの例示的なレーダプロットを提供する。

図６は、次元空間にマッピングされた活動電位特徴を示す。

図７は、識別された活動電位特徴を示す。

図８は、例示的な顕微鏡の構成要素を示す。

図９は、顕微鏡のプリズムを示す。

図１０は、光学的光パターニングシステムを示す。

図１１は、ｈｉＰＳＣ由来運動神経の画像オーバレイを示す。

図１２は、ｈｉＰＳＣ由来運動神経からの電圧トレースを示す。

図１３は、各々のポイントが識別された活動電位であるラスタプロットを提供する。

図１４は、細胞にわたって平均化されたスパイク率のプロットを提供する。

図１５は、活動電位から抽出されたスパイク形状パラメータを提供する。

図１６は、活動電位から抽出されたスパイクタイミングパラメータを提供する。

図１７は、活動電位から抽出されるような、細胞にわたる適応平均を提供する。

図１８は、刺激依存の抽出された値を示す。

図１９は、活動電位特徴を示すレーダプロットを提供する。

図２０は、表現型反転および副作用を例示する図である。

図２１は、表現型／副作用空間に投影された多くのウエルを示すプロットである。

図２２は、神経スパイキングにおける薬物誘発変化を示すレーダプロットを提供する。

図２３は、化合物の存在下の細胞に対する濃度反応曲線を提供する。

図２４は、顕微鏡から取得された高ＳＮＲ蛍光電圧レコーディングを示す。

図２５は、記録されたスパイクを示すラスタプロットを示す。

図２６は、刺激の間の平均発火頻度を提供する。

図２７は、ウエルに記録されたスパイクの数を示すヒートマップを提供する。

図２８は、個別の細胞に対して記録されたスパイクの平均数のプロットを提供する。

図２９は、スパイクの平均数のプロットを提供する。

図３０は、ノックアウト突然変異の結果を示す。

図３１は、複数の細胞株にまたがって記録された電圧トレースからのスパイクを提供する。

図３２は、複数の細胞株にまたがって記録された電圧トレースからのスパイクを提供する。

図３３は、電圧トレースの多次元レーダプロットを提供する。

図３４は、疾患を提供する。

図３５は、スパイクパラメータおよびスパイク率を提供する。

図３６は、ＣｈｅＲｉｆｆおよびＱｕａｓＡｒが或る神経において発現されることを示す。

図３７は、顕微鏡を使用して取得された蛍光画像を提供する。

図３８は、アゴニストに反応した単一の細胞ＰＳＰの調節を示す。

図３９は、シナプス後電位（ＰＳＰ：postsynaptic potential）を示す単一細胞蛍光トレースを示す。

図４０は、対照薬理学に対する平均ＰＳＰトレースを示す。

図４１は、ＰＳＰエリア内の薬物誘発変化をプロットする。

図４２は、高スループットスクリーニングのための例示的な方法の図である。

図４３は、開示のコンピュータシステムを示す。

図４４は、回帰的ブートストラッピング再サンプリングルーチンの図である。

図４５は、薬物フィンガプリントを生成するオートエンコーダを示す。

図４６は、化合物に対する薬物フィンガプリントを示す。

図４７は、神経への曝露のために化合物がどのようにメッキされたかを示す。

図４８は、平均発火頻度に対する濃度依存影響を示す。

図４９は、ＫＣＮＱ２ Ｒ２０１Ｃ機能獲得表現型を示す。

図５０は、細胞に対するレチガビンの効果を示す。

図５１は、或るイオンチャネル調節因子に対する類似性マトリックスである。

図５２は、類似として２つの薬物を識別するクエリを示す。

図５３は、類似としてＩＣＡ－２７２４３およびレチガビンを識別するクエリを示す。

図５４は、ＵＢＥ３Ａ ＡＳＯ候補が二次元において適度に摂動的であることを示す。

図５５は、スクランブルされたＡＳＯ配列からの結果を示す。

図５６は、トランスフェクション試薬が単独で摂動を示すことを示す。

図５７は、ＱＳ００６９５６７：３がＧＳＫ ３７８７に対する類似の薬物フィンガプリントを有することを示す。

図５８は、ＱＳ０１１３１７２：２がＧＳＫ ３７８７に対する類似の薬物フィンガプリントを有することを示す。

図５９は、活性検出器としての薬物フィンガプリントを例示する。

は、ＱＳ０１４１９１３と称する化合物に対する薬物フィンガプリントである。

は、化合物ＱＳ０３２１０８３に対する薬物フィンガプリントである。

詳細な説明
本発明は、神経学的障害および潜在的な治療的処置を特徴付けるために使用される、神経活動電位における特徴またはパラメータを識別するために光遺伝学的アッセイを使用する方法およびシステムを提供する。病理を有する神経細胞の活動電位に固有の特徴は、障害を特徴付けるフィンガプリントを作成するように識別およびマッピングされる。フィンガプリントは、診断的用途および治療的用途の両方において使用される。

本発明の方法およびシステムは、神経細胞内の薬物活性および／または神経障害のフィンガプリントを作成するために使用されるシグナルを提供するために、光遺伝学的アッセイを使用する。光遺伝学では、生きている細胞内の或るイベントを制御および観察するために光が使用される。例えば、蛍光電圧指標などの蛍光エンコーディング遺伝子が細胞の中に導入される。このリポータは、例えば、膜電位における変化に反応して光学シグナルを生成し、それによって、光学リポータとして機能する、膜貫通タンパク質であり得る。或る波長において刺激光により励起されるとき、リポータが活発化され、異なる波長の放出光を生み出す。蛍光電圧指標について、蛍光の強度における変化は、膜電位における変化を示す。試料内の細胞も、光依存性イオンチャネルなどの光遺伝学アクチュエータを含み得る。そのようなチャネルは、特定の波長の刺激光に反応し、活動電位を誘発するために使用されることができる、細胞膜にわたるイオンの流れに関連する膜電位における変化を起こす。本発明の方法およびシステムは、細胞活性の追加のリポータ、およびそれらを作動させるための関連するシステムを使用し得る。例えば、タンパク質は、細胞内カルシウム、細胞内代謝物、または第２のメッセンジャレベルにおける変化を報告する。

例示的な方法では、遺伝子編集技術（例えば、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：transcription activator-like effector nuclease）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガドメインの使用）は、同質遺伝子型であるが、目的の変異体に対する対照細胞を作成するために使用される。細胞は、神経、星状細胞、または心筋細胞などの電気的に励起可能な細胞に転化される。細胞は、特定の神経サブタイプ（例えば、運動神経）に転化され得る。細胞は、細胞電気活性の光学リポータを発現するように引き起こされ、光学リポータは、細胞が活動電位を示すとき、細胞膜電位における変化に反応して蛍光シグナルを放出する。細胞はまた、細胞活性の光学アクチュエータを発現するように引き起こされ得、光学アクチュエータは、光によって活性化されると、細胞内の活動電位を引き起こす。

細胞は次いで、例えば、推定上の治療的化合物の存在下の光学的作動、シナプス作動、化学的作動、または電気的作動を通じて刺激される。刺激に反応して、細胞は、活動電位を示し得る。本明細書で説明される顕微鏡法および分析方法を使用して、推定上の治療的化合物の存在下の刺激への細胞の反応は、光学リポータからの蛍光シグナルを使用して測定される。光学リポータからのシグナルは、刺激によって引き起こされた活動電位など、細胞の膜電位における変化を示す。検出可能な蛍光シグナルの特徴またはパラメータが次いで識別される。

膜電位の光学リポータおよび細胞活性の光学アクチュエータを発現する神経に対して経時的に測定が行われ得る。刺激は、いくつかの発症および持続時間の変化する強度または勾配の強度のパルス内の神経に方向付けられた光である。測定（光学電圧トレース）は、リポータによって生成された蛍光シグナルにおけるスパイクを示す。各々のスパイクは、活動電位候補である。

図１は、膜電位の光学リポータから測定された例示的な電圧トレースを提供する。

図２は、光学リポータからのシグナルにおいて識別されることができる特徴またはパラメータの限定された実施例を提供する。示されるように、スパイクタイミング、形状、幅、周波数、および高さなどの特徴は、シグナルにおいて識別されることができる。図２は、一握りの特徴を提供するが、現在開示されているシステムおよび方法は、光学リポータから測定されたシグナルにおける少なくとも３００個の個別のおよび一意な活動電位特徴を識別する。それらの特徴は、特定の疾患表現型および／または薬効を特徴付けるフィンガプリントを作成するために使用されることができる。

図３は、野生型神経（「ＷＴ」）および特定の神経障害をモデル化するノックアウト突然変異（「ＫＯ」）を有する神経から記録された平均活動電位波形の比較を示す。この例では、ＫＯ細胞は、ＷＴ細胞と比較するとき、電圧トレース上のスパイク幅が低減した活動電位特徴を示す。健康な細胞または野生型細胞と神経障害を有する細胞との間の識別された活動電位特徴における差異は、障害に対する機能的表現型を提供する。類似の比較は、例えば、少なくとも３００個の個別の活動電位特徴のいずれかを使用して、異なる治療的化合物および／または刺激に曝露された細胞において行われることができる。

図４は、対照細胞（例えば、ＷＴ神経）および疾患細胞（例えば、ＫＯ神経）において測定および識別された活動電位特徴のレーダプロットを提供する。活動電位特徴ごとの値は、対照細胞の値に正規化される。プロットされた活動電位特徴は、この比較において統計的に有意であるとして決定されており、全ての測定された活動電位特徴の選択されたサブセットである。プロットされた特徴における差異は、疾患の機能的表現型を提供する。

図５は、２つの例示的なレーダプロットを提供する。左のプロットは、刺激された野生型／対照細胞（例えば、光学リポータの神経発現）、障害をモデル化する神経障害または疾患または細胞を有する対象からの刺激された細胞、および既知の治療薬が存在するときに刺激された疾患／モデル細胞に対する測定された活動電位特徴のサブセットを含む。測定された特徴の大きさは、野生型／対照細胞に対して測定された値に正規化される。既知の治療薬が存在するときに刺激された細胞において識別された一意な活動電位特徴は、特定の神経障害または疾患を処置する際に治療薬の効能と相関付けられることができる。野生型／対照細胞内のそれらの同一の特徴についての値により収束する、治療薬が存在するときに刺激された細胞において識別された一意な活動電位特徴は、治療薬の利点と相関付けられることができる。野生型／対照のそれらから発散する特徴は、既知の治療薬の潜在的な副作用と相関付けられることができる。

「推定上の治療的化合物」のプロットは、刺激された野生型／対照細胞、障害をモデル化する神経障害または疾患または細胞を有する対象からの刺激された細胞、および推定上の治療薬が存在するときに刺激された疾患／モデル細胞に対する識別され測定された活動電位特徴／パラメータのサブセットを提供する。

例示的な方法では、測定された活動電位特徴が推定上の治療的化合物の存在下で細胞に対して識別された後、特徴は、神経の疾患を処置する際に効果があると知られる１つまたは複数の化合物により処置された刺激された細胞に存在する実質的に同一の特徴に対してマッピングされる。

数百（例えば、約３００）の特徴／パラメータが識別され得、ベクトルとして約３００次元空間にマッピングされ得る。本明細書で説明される分析方法は、この次元をより簡明な埋め込みに低減させるために使用される。よって、ベクトルは、測定された活動電位特徴によって示されるように、疾患表現型および／または細胞に対する化合物効果を記述する。

図６は、次元空間にマッピングされた識別された特徴の実施例を提供する。簡潔のために、マップは、その各々が一意な活動電位特徴または特徴の群に対応する２つの次元を示すにすぎない。野生型／対照細胞に固有であり、疾患／モデル細胞に別個に固有な一意な特徴は、それらを明確に異なる群に分割させる。ベクトル６０３は、疾患（または、モデル化された疾患）表現型の反転を表す。ベクトル６０７は、化合物の存在下の疾患細胞、すなわち、化合物効果または薬物効果を刺激することによって引き起こされる特徴／パラメータを表す。示されるように、ベクトル６０７は、２つの別個の成分ベクトル、６０７ａおよび６０７ｂに解体される。成分ベクトルは、表現型反転ベクトル６０３に沿って降下し、疾患／モデル表現型を反転させることに対する化合物が有する効果（治療的利点）を表す。成分ベクトル６０７ｂは、成分ベクトル６０７ａに直交し、疾患／モデル表現型を反転させない化合物の効果を表し、よって、潜在的な副作用を表す。

図７は、既知の治療的化合物の存在下での刺激された細胞内の実質的に同一の特徴に対してマッピングされた推定上の治療的化合物の存在下での刺激された細胞に対する識別された活動電位特徴を示す。それらの活動電位特徴は、標的内スコア（図６においてベクトル６０７ｂによって示される）および標的外スコア（図６においてベクトル６０７ａによって示される）によって定義された二次元空間に投影される。図６にあるように、野生型／対照細胞は、共有された活動電位特徴に基づいて共にクラスタ化される（７０３）。同様に、疾患／モデル細胞は共にクラスタ化される（７０５）。推定上の治療的化合物の存在下での刺激された細胞に対する識別された活動電位特徴は、他の推定上の治療的化合物または既知の治療的化合物の存在下での刺激された細胞に対する実質的に同一の二次元ベクトル分解７０９にマッピングされる（７０７）。このマップでは、推定上の治療薬または既知の治療薬のいずれかの濃度を増大させることへの反応は、線分を介して接続され、野生型／対照細胞挙動に向かって動く疾患／モデル細胞挙動７０９、または直交する（標的外）方式において動く疾患／モデル細胞挙動７０７が示されることができる。

例示的な方法に戻り、推定上の治療的化合物の存在下で刺激されるときに細胞から識別された特徴／パラメータが、既知の治療薬が存在するときに刺激された細胞に対する実質的に同一の特徴に対してマッピングされた後、推定上の治療薬の治療的効能が予測される。

推定上の治療的化合物の治療的効能を予測することは、推定上の治療薬に対して識別された特徴が既知の治療的化合物に対するそれらの実質的に同一の特徴に合致する程度に識別することを含む。

図７において提供された実施例では、推定上の治療薬７０７に対するマッピングされ識別された特徴が既知の治療薬７０９に対する実質的に同一の特徴から発散することを理由に、推定上の治療薬の予測された治療的効果は低くなる。更に、推定上の治療薬の識別された特徴と既知の治療薬の実質的に同一の特徴との間の発散は、推定上の治療薬が副作用を引き起こす可能性を示し得る。

有利なことに、例示的な方法は、推定上の治療薬に対する予測された効能を導出するために、既知の効果がある化合物と関連付けられた特徴／パラメータを使用する。よって、効果がある化合物および推定上の治療薬が示された共通点、例えば、構造的類似性または共通する診療的指標を有さない場合でさえ、予測がなおも導出されることができる。更に、いずれかの化合物が細胞における効果をどのように達成するかに関する先験的情報に対する必要性がない。むしろ、比較のための基準を提供する、活動電位特徴において示されるように、化合物によって引き起こされた細胞挙動における変化が使用される。

本発明はまた、特定の神経の疾患または障害を処置するための治療的効能を有する化合物を識別する方法を提供する。この方法は、上記で説明された技術のいずれかを採用することができる。

例示的な方法では、神経活動電位の特徴は、既知の治療薬の存在下で刺激されるときの神経細胞に対して識別され、治療薬に曝露されていない神経細胞に対して識別される。一意であり、よって、曝露されない細胞において識別された特徴とは異なる治療薬に曝露された細胞に対して識別された特徴は、治療的効果または治療的利点を示し得る。方法は更に、活動電位特徴を識別するように、推定上の治療薬の存在下で神経細胞を刺激することを含む。次いで、方法は、推定上の治療薬が存在するときに刺激された神経細胞の活動電位特徴が、推定上の治療薬に曝露された神経細胞において識別された特徴と合致するかどうかを決定することを含む。この決定するステップに基づいて、推定上の治療薬の治療的効能が決定されることができ、特徴が合致する程度を確認する。

本発明はまた、薬物スクリーニングおよび／または発見のための方法を提供する。実施形態では、これは、活動電位特徴を分析して、細胞に対する機能的表現型を生成するための新規の機械学習システムを使用して達成される。説明として、機械学習は、人工知能の分岐およびデータの使用に焦点を当てるコンピュータサイエンスであり、コンピュータアルゴリズムの機械学習は、経験を通じて、およびデータの使用によって自動で改善することができるコンピュータアルゴリズムの学習である。機械学習アルゴリズムは、それを行うように明示的にプログラムされることなく、予測または決定を行うために、訓練データとして既知の、試料データに基づいてモデルを作り上げる。概して、本発明の機械学習システムは、機能的表現型を生成するために使用される、不可欠な活動電位特徴のサブセットまたは複合体を識別する。機械学習システムは、特徴から機能的表現型を確立するように、それらの能力における活動電位特徴の相対的重要性を決定する。機械学習システムモデルは、様々な方法を使用して検証または訓練されることができる。

機械学習システムおよび関連するアルゴリズムの好ましい実施形態は、以下で詳細に説明される。しかしながら、いくつかの適切なタイプの機械学習アルゴリズムのいずれかは、開示される方法およびシステムの１つまたは複数のステップに対して使用され得る。適切な機械学習タイプは、ランダムフォレスト、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ：support vector machine）、相関ルール学習、帰納論理プログラミング、回帰的分析、クラスタリング、ベイジアンネットワーク、強化学習、計量学習、多様体学習、エラスティックネット、および遺伝的アルゴリズムなどのニューラルネットワーク、決定木学習を含み得る。機械学習タイプまたはモデルのうちの１つまたは複数は、本明細書で説明される方法ステップのいずれかまたは全てを完了させるために使用され得る。例えば、実施形態では、機械学習システムは、高度情報活動電位特徴を識別し、および／または機能的表現型を生成するために、ランダムフォレストおよび均整のとれた値、エラスティックネット分類器、ｙ認識主成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）、および階層型線形混合効果モデルのうちの１つまたは複数を使用し得る。以下で説明されるように、実施形態では、機械学習システムは、この構造を十分に活用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学用途のための強力かつ効率的なカスタムツールを構築するために、入れ子データに対する新規のアルゴリズムを利用する。

好ましい実施形態では、機械学習システムは、薬物フィンガプリントを導出するために、新規のアルゴリズムを使用する。本明細書で開示されるように、本発明の方法は、スパイク率、スパイク高さおよび幅、過分極化後の深度、スパイク発症のタイミングおよび発火の中止、第１のスパイクのスパイク間間隔、一定の刺激にわたる適合の程度、ならびにスパイク波形の第１の派生物および第２の派生物など、各々の神経の電気生理学測定を捕捉する。測定にまたがって、および測定内の刺激領域にまたがって、不変パターンが明らかである。実施例として、「高速活動電位動力学」は、スパイク形状のほぼ全ての測定を変え、発火頻度は、何らかの最大点まで刺激と共に増大する傾向があり、特性「周波数－強度」曲線をトレースする。それらの複合的、非線形の、多次元パターンは、疾患状態および化合物効果の一意な兆候をもたらす。

しかしながら、データセットが高次元であることを理由に、各々の細胞からの大多数の測定－数百の測定は、そのままでは下流での使用に対して困難である。次元は、データセットがどの程度の属性を有しているかを指す。高次元データは、本発明におけるケースのように、次元の数がびっくりするほど高く、その結果、計算が極端に難しくなる場合があるデータセットを記述する。高次元データにより、特徴の数は、観察の数をはるかに超え得る。高次元空間がまばらであり、ほとんどのベクトルが直交することを理由に、高次元読み出しは、多くのクラスタリング、マッチング、および分類タスクにおいて良好に機能しない傾向がある。

本発明の方法は、オートエンコーダニューラルネットワークを含む機械学習システムを使用することによってこの問題を解決する。オートエンコーダは、ラベル付けされていないデータの効率的なコーディングを学習するために使用される人工ニューラルネットワークのタイプであり、よって、教師無し学習技術である。オートエンコーダは、機械学習システムによって使用可能になるデータをコードする機械学習システムに対する処理ステップとしての役割を果たす。

オートエンコーダは、低次元ボトルネックを通じて流れる一連の非線形変換を通じて情報をプッシュし、次いで、ボトルネックの他の側に対する未処理データを再構築することを試みる。しかしながら、本発明の方法は、その高次元空間の内部で低次元マニフォールドに沿って多くの高次元データセットが存在するという仮説を使用する。よって、データ測定が高度に相関付けられることが多いことを理由に、高次元未処理データは、より低い次元の非線形マニフォールドに沿って高度に集中され、その結果、比較的少ない数の変数を使用して、データセットが記述されることができる。

実施形態では、オートエンコーダニューラルネットワークは、高次元未処理データに相関付けるより低い次元の非線形マニフォールドを発見することを目的に、多様な化合物兆候のデータセットに対して訓練される。このアプローチは、未処理データからの特徴検出および分類のために必要とされる表現をオートエンコーダが発見することを可能にする。このマニフォールドの次元は各々、根底にある生物学における異なるパターンの活性に関連する。よって、オートエンコーダは、未処理測定を生物学的表現にマッピングする能力を有する、表現学習アルゴリズムとして有効に作用する。

このアプローチの成功は、コヒーレントなフィンガプリントを構築することを目的に使用される訓練データセットの性質によって達成される。オートエンコーダの挙動および有用性は大いに、使用される訓練データの関数である。訓練データセットは、目的の遺伝子標的を発見するように、神経作製からＲＮＡを最初に配列することによって作成される。標的は、多様な範囲の疾患および状態を表すように選択される。標的－活性化因子および阻害因子の両方を選択的に調節する化合物は次いで、手動で識別される。実施形態では、各々の神経から抽出された情報を最大にするために、本明細書で開示されるような撮像プロトコールにより、１０ポイントの投与反応を含む、化合物に対するデータが四重に収集される。これは、多くの異なるクラスの化合物に対して、活性レベルの範囲にまたがって、高度の活性化合物のデータセットを結果としてもたらす。このタイプのデータセットは、投与が増大するにつれて中心から更に移動する、太陽からの光線のような不活性の中心雲から外に放射する化合物に対するフィンガプリントの非常に多様なセットをオートエンコーダがコードすることを必要とする。加えて、それらのデータに対するオートエンコーダの深度、幅、非線形性、バッチサイズ、学習率、モーメント、勾配クリッピング、および訓練サイクルが最適化される。それらの調整されたハイパーパラメータは、モデル性能および有用性に大きな影響を有する。

未処理測定は、訓練または投影の前に階層型回帰的モデルを使用して順応される。それらは、対照神経のセットを指定し、各々のサブ群内のそれらのベースライン活性を推定する。サブ群は、例えば、細胞の各々のプレート、または各々の撮像日であり得る。サブ群は次いで、同一のレベルに整列される。サブ群は、例えば、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ：best linear unbiased prediction）を介して推定され得、ＢＬＵＰは、データセット全体を介して生成された前の予想により観察された群特有データを部分的にプールする。重要なことに、データをこのように整列させることは、神経の厳密な状態よりも、ベースラインの範囲にまたがってベースラインからの変化を反映するように、フィンガプリントの値および解釈を変化させる。このシフトは、異なるベースラインを有し得る、新規の細胞タイプからフィンガプリントを導出する能力など、オートエンコーダに対する重要な用途を有効にする。よって、本発明の方法は、いずれかの疾患に対する対照に対して、化合物効果および疾患表現型をフィンガプリントすることを有効にする。

いくつかの実施形態は、統計的推論のための階層型回帰的ブートストラッピングアルゴリズムを使用する。階層型ブートストラッピングアルゴリズムは、任意の数の入れ子データのレベルからのサンプリングをサポートし、統計的推論と共に検定力分析を可能にする。

非独立性が排他的な階層型であるときのケースでは、統計的モデリングは、困難かつ低速である場合がある。有効な統計的推論は、データから適切な推論を引き出すために必須である。非独立性を考慮しないアルゴリズムは、大幅に上昇した偽陽性率の下で動作する。実施形態では、回帰的階層型ブートストラッピング関数は、統計試験および信頼区間構築のための能力と共に、階層的な入れ子データに対する検定力分析を有する。本発明の方法は、推論および検定力計算の両方に対する高性能のソリューションとして、高性能の、回帰的階層型ブートストラッピングアルゴリズムを使用する。回帰的アルゴリズムは、任意の数のレベルにおいて階層型データからのサンプリングを可能にする。検定力分析は、実験的効率性および表現型解析能力を改善する。ブートストラッピング関数は、データの分散に関する想定を行わず、よって、広く適用可能である。統計的方法のために必要とされる想定を最小化することは、自動化に対してそれらをよりロバストかつ従順にする。重要なことに、アルゴリズムは、任意の数の出力特徴を同時に扱うことができる。

検定力分析特徴は、実験的設計を支援する規定された階層型構造を有する所望のシグナルサイズにおける検定力テーブルおよび曲線の構築を可能にする。検定力分析モダリティは、組織内で収集されたデータから実の測定ノイズのテーブルに注入された、目的の有効サイズの仕様を可能にする。そのようなテーブルを作成するために、＋／－対照データが化合物スクリーニングから採掘され、特徴ごとに、対照の間の平均差異が差し引かれ、収集されたデータの真の測定変数を残す。

他の実施形態は、訓練データセットに対する増補されたデータを作成するために、必要に応じた非回帰的ブートストラッピングアルゴリズムを使用する。一部の深層学習方法は、訓練データに過適合しやすいことを理由に、実施形態では、本発明の方法は、機械学習システムが過適合しやすくなることを回避するために有用な、増補された訓練データを提供するために、ブートストラッピングアルゴリズムを使用する。従来技術のデータ増補方法は、類似の合成データを生成するために、既存のデータの中にノイズを注入し、データセットの特性をパラメータ化することによって、過適合に対処してきた。対照的に、本発明の方法は、合成データに対するいずれの要件もなしに、訓練データ内から再サンプリングして（例えば、置き換えにより）、増補されたデータを作成するために、ブートストラッピングを使用する。

上述したように、本発明の方法は、単一ニューロン分解能によりデータを収集する。実施形態では、階層型ブートストラッピングアルゴリズムは、ウエルから収集されることができたデータの別のもっともらしい例を作成するように、置き換えによりウエルからニューロンを再サンプリングすることによって、この事実を利用する。各々の測定は次いで、測定認識方法を使用してウエルレベルにおいて凝集され、測定認識方法は、最適な凝集戦略（平均値、中央値、様々な程度のトリミングされた平均値）を各々の測定に適用する。それらのステップは、ウエルごとに任意の回数で再現される。上記説明されたデータセットでは、これは、ウエルレベルの訓練データのサイズにおいて１００倍に増大することを結果としてもたらした。重要なことに、これは、合成データを伴わず、全ての増補された試料は、実データの組合せであり、測定の間の全ての非線形依存性を維持する。メモリ制約を克服するために、この増補方法は、データスタックの作成の間に事前に適用され、次いで、ディスクに保存される。学習することを試みているマニフォールドをそれらがより密にサンプリングすることを理由に、この階層型ブートストラップ増補により訓練されたモデルは、非連続性をあまり有さず、あまり過適合しない。

或る態様では、本発明は、薬物発見のための方法を提供する。方法は、電気的励起可能細胞を化合物に曝露することと、細胞の電気活性を測定することと、細胞の活動電位特徴を識別することと、識別された特徴に基づいて、化合物の治療的効能を判断するために、機械学習システムを使用することと、を含む。重要なことに、機械学習システムは、いずれかの疾患に対する化合物の治療的効能に関する結果を生み出す能力を有する。これは、上記好ましい実施形態において説明されたような機械学習システムの性質によって達成される。

上述したように、活動電位特徴は、単一の細胞に対して識別され得、スパイク率、スパイク高さ、スパイク幅、過分極化後の深度、スパイク発症のタイミング、発火の中止のタイミング、第１のスパイクのスパイク間間隔、一定の刺激にわたる適合の程度、スパイク波形の第１の派生物、およびスパイク波形の第２の派生物のうちの１つまたは複数を含む。機械学習システムは、化合物の治療的効能と関連付けられた電気活性の特徴を識別するように訓練される。

識別された特徴が測定の間の非線形関係を有する表形式データの出力であり得ることを理由に、機械学習システムは、上記説明されたようなオートエンコーダニューラルネットワークを含み得る。オートエンコーダは、ラベル付けされていないデータの効率的なエンコーディングを学習するために使用される人工ニューラルネットワークのタイプであり、よって、教師無し学習技術である。オートエンコーダは、機械学習システムによって使用可能になるデータをコードする。上記説明されたように、オートエンコーダは、必然的に、未処理測定を生物学的表現にマッピングするように構成された表現学習アルゴリズムであり得る。重要なことに、オートエンコーダは、手動で選択された遺伝子標的と、標的を調節する手動で選択された化合物を使用して訓練され得る。それらの標的は、いずれかの疾患に対するものであり得る。本発明の方法は、機械学習システムが訓練された全ての疾患に対する表現型を発展させ、よって、いずれかの疾患に対する薬物発見を可能にする。

オートエンコーダは、オートエンコーダの深度、幅、非線形性、バッチサイズ、学習率、モーメント、勾配クリッピング、および訓練サイクルを最適化することによって、ハイパーパラメータ調整を使用して更に訓練され得る。それらの調整されたハイパーパラメータは、モデル性能および有用性に対する大きな影響を有する。未処理測定は、上記説明されたような高性能の、回帰的階層型ブートストラッピングアルゴリズムを使用して順応され得る。

実施形態では、本発明の方法は、化合物内の活性を検出することを提供する。どの生物学的試料が活性の兆候を示す化合物を含有するかを知ることは貴重である。例えば、スクリーニングにおいて生物学的活性化合物を発見すること、または検出可能な活性により最低投与を発見することである。薬理学では、生物学的活性または薬理学的活性は、生き物に対する薬物の有益な効果または悪影響を記述する。測定が差異を包含し、測定自体が最も共通する複数の比較手順に対する独立した要件でない時間の前に既知でないことを理由に、これは、高次元読み出しにより行うことは困難である。そのようなケースに対する適切な方法は、特徴にまたがって凝集された組合せ試験を伴い、いくつかの計算量が多いノンパラメトリックアプローチは、シミュレーションおよびパーミテーション方法を含む。

この課題に対処するために、本発明は、神経フィンガプリンティング方式活性検出器を提供する。実施形態では、方法は、試料ごとにフィンガプリントを計算し、次いで、どのフィンガプリントが対照ウエルの高ｎ次レプリケーションによって定義された「不活性の雲」の内部に存在するかを決定する。不活性である非常に低い確率を与える試料は次いで、活性としてラベル付けされる。この技術は、２つのアセット：１）フィンガプリントを発見するための上記説明されるようなものなどの適合されたフィンガプリンティングアルゴリズムと、２）フィンガプリント空間の中心において「不活性の雲」を育成するための対照試料、によって有効にされる。不活性の確率の決定は、多変量ガウス分布およびノンパラメトリックカーネル密度推定を含む、いくつかの計算的に安価の技術を使用して行われることができる。

薬物スクリーニング／発見のための例示的な方法は、神経疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別することを含む。方法は神経を試験化合物に曝露することと、例えば、神経内で発現された細胞活性の光学アクチュエータを刺激することによって、活動電位を発火させるように神経を刺激することと、を更に含む。試験化合物に曝露された神経内で刺激によって引き起こされた活動電位の特徴／パラメータが測定および識別される。次いで、方法は、治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴が刺激によって引き起こされた活動電位に存在するかどうかを決定することを含む。方法は、刺激された活動電位内の特徴が神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられるとして識別された特徴と合致する場合、神経の疾患に対する推定上の治療薬として試験化合物を識別することを含む。

本明細書で説明される方法では、治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップは、神経の疾患を処置する際に既知の効能を有する化合物に曝露された神経の活動電位特徴を識別することから導出される。代わりにまたは加えて、神経の疾患を有する神経の活動電位特徴および神経の疾患を有さない神経の活動電位特徴を比較することによって、特徴が識別されることができる。同様に、野生型／対照神経と、疾患表現型をモデル化する細胞との間で比較が行われることができる。モデルは、例えば、疾患表現型を引き起こすノックイン突然変異またはノックアウト突然変異を含み得る。代わりにまたは加えて、モデルは、作動されるとき、疾患表現型を引き起こし、または疾患の状態から神経を救援する、細胞活性のアクチュエータを含み得る。疾患の神経および健康な細胞の活動電位特徴をマッピングすることは、多次元空間に対するベクトルを使用して記述されることができる、疾患に対する表現型を提供する。特徴は、例えば、関係データベースに記憶されることができ、その結果、試験される化合物ごとに、治療的効能と関連付けられた特徴は、再識別される必要がない。この表現型を反転させる活動電位特徴を誘発する化合物は、推定上の治療薬として識別されることができる。

本発明に係る薬物スクリーニングのための例示的な方法は、神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位特徴を識別することと、識別された特徴のデータベースを作成することと、を含む。方法は更に、複数の試験化合物の特徴に関するデータを取得することを含む。試験化合物の特徴は、神経の疾患に対する治療的効能を有する候補化合物を識別するように、データベースにおける治療的効能と関連付けられた特徴と比較される。

本発明はまた、神経障害を処置するための１つまたは複数の治療的効果を特徴付ける方法を提供する。

治療的効果を特徴付ける例示的な方法は、治療的化合物の非存在下での神経障害を有する１つまたは複数の刺激された神経細胞の活動電位の特徴を識別することを含む。それらの特徴は、関係データベースに記憶され得る。方法は更に、既知の治療的化合物の存在下で神経障害を有する１つまたは複数の神経細胞において活動電位を刺激することを含む。次いで、方法は、既知の治療薬が存在するときに刺激された神経細胞の活動電位特徴が、治療的化合物の非存在下での神経細胞の活動電位特徴と異なるかどうかを決定することを含む。治療的効果は、決定ステップに基づいて特徴付けられる。

本発明の方法は、決定された異なる活動電位特徴を引き起こす１つまたは複数の化合物に対して、データベースであることができる化合物のライブラリをスクリーニングすることによって、神経障害を処置するための推定上の治療的化合物を識別することを含み得る。

本発明はまた、対象における神経の疾患を診断する方法を提供する。例示的な方法は、対象から細胞試料を取得することと、試料から導出された１つまたは複数の神経細胞に膜電位の光学リポータを発現させることと、を含む。神経細胞は、活動電位特徴がそれから識別される活動電位を示すように刺激される。識別された活動電位特徴は、神経障害表現型を発現する刺激された神経細胞に存在する実質的に同一の特徴に対してマッピングされる。診断は、識別された特徴が障害表現型を有する神経細胞内の実質的に同一の特徴に合致する程度に基づいて予測される。

試料の導出された神経細胞は、人工多能性幹細胞であり得、人工多能性幹細胞は、神経細胞に分化している。

開示の或る方法およびシステムでは、関係データベースが使用される。データベースは、フィンガプリント、すなわち、例えば、特定の神経障害表現型を発現する細胞から識別され、および／または、細胞を物理的介入もしくは化学的介入に曝露することによって引き起こされた活動電位特徴を含み得る。関係データベースはまた、フィンガプリントに帰属可能な追加のデータを含み得る。例えば、データベースは、構造的特徴、活性基、濃度依存効果、既知の副作用、選択性、効力、効能、活動の機構、血液脳関門を交差する能力、他の化合物との交差反応性などの特定の既知の治療的化合物または推定上の治療的化合物に関連するデータを含み得る。

治療的効能の薬物発見および予測の方法は、関係データベース内のデータを使用して、候補化合物および組合せ治療法の事前スクリーニングを採用し得る。そのような事前スクリーニングは、例えば、最終的な分析および医薬品化学最適化に準拠する化合物の選択を得るために、反応基およびアグリゲータなどのライアビリティに起因して、潜在的な候補化合物を取り除くために使用されることができる。

本発明のシステムおよび方法は、細胞が活動電位を示すときに引き起こされた膜電位における変化に反応して検出されたシグナルを作成するために、光遺伝学を使用する。光遺伝学では、生きている細胞内の或るイベントを制御および観察するために、光が使用される。例えば、蛍光電圧指標などの蛍光色エンコーディング遺伝子が細胞の中に導入されることができる。リポータは、例えば、膜貫通タンパク質であり得、膜貫通タンパク質は、膜電位における変化に反応して光学シグナルを生成し、それによって、光学リポータとして機能する。或る波長において刺激光により励起されるとき、リポータが活発化され、異なる波長の放出光を生み出し、異なる波長の放出光は、膜電位における変化を示す。試料内の細胞も、光依存性イオンチャネルなどの光遺伝学アクチュエータを含み得る。そのようなチャネルは、特定の波長の刺激光に反応し、活動電位を誘発するために使用されることができる、細胞膜にまたがるイオンの流れに関連する膜電位における変化を起こす。

それらの光遺伝学的リポータによって生み出された時間可変シグナルは、生きている細胞の化学的状態または電子的状態の過程の図表を作るように再現して測定される。

よって、本発明の方法およびシステムにおいて使用される試料は、電気活性の光学アクチュエータと、電気活性またはイオン濃度の光学リポータとを発現する細胞を含む。試料は、第１の細胞がアクチュエータを発現し、第２の細胞がリポータを発現するように構成され得る。細胞は、アクチュエータを作動させるように、光などの刺激と接触され得る。例えば、開示の或る方法およびシステムでは、細胞は、感光性アクチュエータタンパク質を発現し、感光性アクチュエータタンパク質は、刺激する光ビームに曝露されるとき、タンパク質における変化を引き起こし、それによって、細胞内の膜電位における変化を起こす。結果は、細胞「発火」、すなわち、活動電位または再生シグナルが、電気的活性細胞内で伝播することである。或る方法およびシステムでは、励起光ビームは、膜電位の蛍光光学リポータタンパク質に伝送される。リポータによって放出された結果として生じる蛍光は、膜電位における対応する変化を測定するために使用され、その結果、活動電位特徴／パラメータが識別されることができる。

本発明による使用のための環境的に敏感な蛍光リポータは、ロドプシンタイプ膜貫通タンパク質を含み、ロドプシンタイプ膜貫通タンパク質は、膜電位における変化に反応して光学シグナルを生成し、それによって、膜電位の光学リポータとして機能する。アーチロドプシン型タンパク質ＱｕａｓＡｒ２およびＱｕａｓＡｒ３は、赤色光によって励起され、細胞膜電位に応じて強度において変化するシグナルを生み出す。それらのタンパク質は、膜電位の光学的測定を促進する、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどの遺伝子工学技術を使用して、細胞の中に導入されることができる。本発明はまた、参照によってその内容の全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４／０２９５４１３号に開示されるものなど、電圧を示すタンパク質により使用されることができる。

蛍光指標に加えて、細胞を化学的または電気的に摂動するための感光性化合物が発達してきた。光制御活性化因子を使用して、照射パターンを変化させることによって、試料全体、選択された領域、または個別の細胞に刺激が加えられることができる。光制御活性化因子の１つの実施例は、チャネルロドプシンタンパク質ＣｈｅＲｉｆｆであり、チャネルロドプシンタンパク質ＣｈｅＲｉｆｆは、それに降下する青色光の強度に大まかに比例して増大する大きさの電流を生み出す。１つの調査では、ＣｈｅＲｉｆｆは、約２２ｍＷ／ｃｍ２の青色光によって照射されるときにタンパク質を発現する細胞全体において、約１ｎＡの電流を生成した。

本発明のシステムおよび方法はまた、それらを作動させるための追加のリポータおよび関連するシステムを使用し得る。例えば、遺伝的にコードされたカルシウム指標（ＧＥＣＩ：genetically-encoded calcium indicator）など、細胞内カルシウムレベルにおける変化を報告するタンパク質が使用され得る。プレートリーダは、ＲＣａＭＰに対する黄色光など、ＧＥＣＩに対する刺激光を提供し得る。例示的なＧＥＣＩは、例えば、ｊＲＣａＭＰ１ａ、ｊＲＧＥＣＯ１ａ、またはＲＣａＭＰ２など、ＧＣａＭＰまたはＲＣａＭＰ変異体を含む。１つの実施形態では、アクチュエータは、青色光によって活性化され、Ｃａ２＋リポータは、黄色光によって励起され、オレンジ色光を放出し、電圧リポータは、赤色光によって励起され、近赤外線光を放出する。

光学的に調節された活性化因子は、励起性など特定の細胞特質の全ての光学的な特徴付けを有効にするように、蛍光指標と組み合わされることができる。例えば、光パッチ方法は、ＣｈｅＲｉｆｆなどの電気活性化因子タンパク質を、ＱｕａｓＡｒ２などの蛍光指標と組み合わせる。活性化因子および指標タンパク質は、異なる波長の光に反応し、細胞が光電流の大きさの範囲にわたって励起されるのと同時に膜電位が測定されることを可能にする。光パッチは、全ての目的のために参照によってその内容が組み込まれる、米国特許第１０，６１３，０７９号および米国特許第９，５９４，０７５号の内容を含む。

細胞の電気特性を測定することは、心臓および脳細胞（神経および心筋細胞それぞれ）など、電気的活性細胞を伴う疾患の学習、診断、および処置に対して最も重要なものである。それらの細胞に影響を及ぼす状態は、心臓病、心房細動、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、および多くのその他を含む。それらが試料内の細胞との正確な微細機械操作または直接の接触を必要としないことを理由に、全ての光学的測定は、パッチクランピングのような従来の方法に魅力的な代替を提供する。光学的方法は、高スループット用途にはるかに従順である。全ての光学的測定によって付与されるスループットにおける劇的な増大は、それらの状態の学習、診断、および処置に革命を起こす可能性を有する。

本発明の方法は、疾患表現型を示し、および／または、蛍光指標および感光性活性化因子を使用して既知の治療的化合物もしくは潜在的な治療的化合物に反応する細胞の活動電位特徴およびパターンを識別するために使用され得る。

例えば、本発明のシステムおよび方法は、幹細胞由来心筋細胞から活動電位（ＡＰ：action potential）およびカルシウムトランジェント（ＣＴ：calcium transient）波形を光学的に取得して、心筋細胞内の不整脈を特徴付けるために使用されることができる。試料内の心筋細胞は、ロドプシンタイプ膜貫通光学リポータを発現するように引き起こされることができる。心筋細胞内で発現された微生物チャネルロドプシンは、刺激光を使用して作動されることができる。ＡＰは、心筋細胞を通じて伝播する。膜電位の蛍光リポータを包含する細胞が照射され、ＡＰは、リポータの蛍光における変化を引き起こす。リポータからの光は、ＡＰ波形を構築するように方向付けられおよび分析される。構築されたＡＰ波形における不整脈は、例えば、既知の標準的な技術または他の分析技術との比較によって検出され得または特徴付けられ得る。ＡＰ波形の特徴／パラメータは、不整脈の表現型を特徴付けるフィンガプリントを構築するように抽出されることができる。

このフィンガプリントは、不整脈表現型を反転させる潜在的な治療的化合物をスクリーニングするために使用されることができる。本発明の方法およびシステムは、プレートのウエル内で生きている細胞が観察および撮像されることを可能にする構成において、近ＴＩＲ光により試料を照射するためのマルチウエルプレート顕微鏡を採用し得る。顕微鏡は、より強烈な照射と、対応するより低い開口数およびより大きな視野とを可能にする、対物レンズを通じてではなく、側面から試料を照射する。蛍光の波長とは明確に異なる波長における照射光を使用することによって、ＴＩＲ顕微鏡は、目的の明るいエリアと共に暗い背景を有する画像を結果としてもたらす、照射波長が光学フィルタにより画像からほぼ完全に取り除かれることを可能にする。顕微鏡は、活動電位特徴／パラメータがそれから抽出される細胞活動電位を示す測定を提供するように、蛍光を観察することができる。

ＱｕａｓＡｒ２およびＱｕａｓＡｒ３などの膜活動電位の蛍光リポータは、蛍光するために、強烈な励起光を必要とする。低い量子効率および急速なダイナミクスは、電位を測定するために強烈な光を要求する。したがって、照射サブシステムは、高ワットまたは高強度において光を放出するように構成される。量子効率およびピーク励起波長などの蛍光色素の特性は、それらの環境に反応して変化する。強烈な照射は、それが検出されることを可能にする。強烈な光によって引き起こされた自家蛍光は、複数の方法において顕微鏡によって最小化される。近ＴＩＲ照射の使用は、各々のウエルの底部分のみを照射光に曝露し、それによって、培地またはデバイスの他の構成要素の励起を低減させる。加えて、顕微鏡は、撮像光とは明確に異なる照射光を提供するように構成される。撮像サブシステムにおける光学フィルタは、照射光をフィルタ除去し、画像から望ましくない蛍光を取り除く。細胞を培養するための環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ：cyclic olefin copolymer）の皿は、ガラスと比較して背景の自家蛍光を低減させることを有効にする。プリズムは、インデックスマッチング低自家蛍光オイルを通じてマルチウエルプレートに結合される。プリズムはまた、低自家蛍光溶融シリカから構成される。

顕微鏡は、細胞の動的特性を光学的に特徴付けるように構成される。顕微鏡は：（１）網内の細胞間の相互作用を測定することを可能にし、または高スループットのために多くの細胞を同時に測定するための広い視野（ＦＯＶ：field of view）と、（２）ウエル内の個別の細胞の形態を検出し、シグナル処理における選択性を促進するための高空間分解能と、（３）個別の活動電位を区別するための高時間分解能と、（４）正確なデータ分析を促進するための高シグナル対雑音比と、を同時に達成することによって全ての光学的な特徴付けの完全な可能性を実現する。顕微鏡は、数十または数百の細胞を捕捉するのに十分な視野を提供することができる。顕微鏡および関連するコンピュータシステムは、１ミリ秒の次数での非常に短い曝露時間に対応する、少なくとも１キロヘルツの次数での画像獲得率を提供し、それによって、神経などの電気的活性細胞内で発生する急速な変化を記録することを可能にする。したがって、顕微鏡は、従来技術の顕微鏡よりも実質的に短い期間にわたって列挙された光学系を使用して、蛍光画像を獲得することができる。

顕微鏡は、細胞の動的特性を光学的に特徴付けることを促進するために、それらの高まる要件の全てを達成する。顕微鏡は、十分な分解能を有する広いＦＯＶおよび低い開口数（ＮＡ：numerical aperture）の対物レンズを有する集光能力を提供する。顕微鏡は、ｓＣＭＯＳカメラなどの高速検出器により２倍～６倍の範囲にある大きさにより撮像することができる。高速な撮像率を達成するために、顕微鏡は、典型的には、例えば、約６３５ｎｍ～約２，０００Ｗ／ｃｍ２の波長における５０Ｗ／ｃｍ２よりも大きい蛍光による、極端に強烈な照射を使用する。

高電力レベルにも関わらず、顕微鏡はそれにも関わらず、試料、細胞成長媒体、インデックスマッチング液体、および試料コンテナ内の特有でない背景蛍光を励起することを回避する。近ＴＩＲ照射は、試料および試料媒体の望ましくないエリアの自家蛍光を制限する。撮像サブシステムにおける光学フィルタは、望ましくない光が画像センサに到達することを防止する。加えて、顕微鏡は、照射光に対物ユニットを通過させるのではなく、側面から試料を照射することによって、対物レンズ内のガラス要素の望ましくない自家蛍光を防止する。顕微鏡の対物レンズは、物理的に大きくなり得、少なくとも５０ｍｍの前方開口および少なくとも１００ｍｍの長さを有し、多数のガラス要素を包含する。

図８は、例示的な顕微鏡８０１の構成要素を示す。顕微鏡は、マルチウエルプレート８０９を保持するように構成されたステージ８０５と、顕微鏡内に搭載された光のビームを放出するための励起光源８１５と、下からステージに向かってビームを方向付ける光学システム８６１と、を含む。光学システムは、ビームを空間的に均質化するためのホモジナイザ８２５を含む。顕微鏡８０１は、様々な機能を実行または制御するためのコンピュータ８７１またはコンピューティングシステムハードウェアを含みまたはそれらに通信可能に結合される。顕微鏡８０１は、光パターニングシステム８３１を含み得る。ステージ８０５は好ましくは、電動式ｘ，ｙ並進ステージである。

顕微鏡８０１は、画像センサ８３５を含む。画像センサは、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋ．（Ｓｈｉｚｕｏｋａ、ＪＰ）によって部品＃ Ｃ１５４４０－２０ＵＰの下で販売されたＯＲＣＡ－Ｆｕｓｉｏｎ ＢＴデジタルＣＭＯＳカメラまたはＨａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ．Ｋによって部品＃ Ｃ１４１２０－２０Ｐの下で販売されたＯＲＣＡ－ＬｉｇｈｔｎｉｎｇデジタルＣＭＯＳカメラなどのデジタルカメラユニットとして提供され得る。センサ８３５に対して使用する別の適切なカメラは、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）によってＫＩＮＥＴＩＸという商標の下で販売された背面照射ｓＣＭＯＳカメラである。

顕微鏡はまた、適切なチューブレンズなどの撮像レンズ８３７を含み得る。レンズ８３７は、ＺＥＩＳＳ Ｍｉｌｖｕｓの８５ｍｍレンズなどの８５ｍｍのチューブレンズであり得る。そのような撮像ハードウェアにより、顕微鏡は、９６－ウエルプレート内で５．５ｍｍの直径および３８４－ウエルプレートの全３．４５ｍｍウエル幅を有するエリアを撮像することができる。

顕微鏡８０１は好ましくは、制御システムを含み、制御システムは、並進ステージを移動させて、ビームの経路内でマルチウエルプレートの個別のウエルを位置付けるように動作可能なプロセッサに接続されたメモリを含む。必要に応じて、顕微鏡８０１は、光のビーム８２１を放出するための顕微鏡内に搭載された励起光源８１５を含む。光学システム８６１は、下からステージに向かってビーム８２１を方向付ける。

顕微鏡８０１は必要に応じて、二次光源８５３を含み得る。二次光源８５３は、光学システム８６１との何らかの類似性を共有するその自身の光学システムを有し得る。しかしながら、その自身の光学システムと共に光学システム８６１および二次光源８５３を含むことは、それらのシステムが独立して動作し、同時に動作し、または動作しないことを可能にする。いくつかの実施形態では、光学システム８６１とは異なる（例えば、はるかに高い）電力で二次照明システムが動作する。二次光源８５３およびそのシステムは、較正のために、または、光学システム８６１によって対処される光遺伝学的タンパク質のセットとは異なる電力において最良に動作する光遺伝学的タンパク質に対処するために使用され得る。

図９は、試料９０５に向かってビーム８２１をガイドするプリズム９０１を示す。光学システム８６１は、ステージの直下にあるプリズム９０１を含み、それによって、ビームがプリズムの側面に入射し、プレートのウエル９１１の中を通る。示されるように、水性試料８３８は、ウエル９１１の底面８１２上で生きている細胞８１３を含む。必要に応じて、インデックスマッチングレンズオイル８１９は、プリズム９０１をウエルの底部８１２に光学結合する。好ましくは、水性試料８３８を含有するプレートのウエル９１１がプリズム９０１の上に位置付けられるとき、プリズムは、プレートのウエルの底部８１２内での全内部反射を回避する角度シータにおいて、ビーム８２１を試料の中に方向付ける。示されるように、水性試料を含有するプレートのウエルがプリズムの上に位置付けられるとき、プリズムは、光をウエルの下から約１０（必要に応じて２０）ミクロンに制限する屈折の角度において、ビームを水性試料の中に方向付ける。

開示のシステムおよび方法により使用されることができる、本明細書で説明される顕微鏡は、マルチウエルプレートのウエルの下に位置付けられたその光学構成要素の全てを含むことができ、その結果、照射が対物レンズを通じてではなく側面から発生する。側面照射は、顕微鏡がより強烈な照射およびより広い視野を有することを可能にする。

必要に応じて、ステージの上のエリアは、プリズムなどの光学要素によって妨げから解放される。その構成は、試料への物理アクセスおよびその環境に対する制御を可能にする。よって、試料は、例えば、栄養培地内の生きている細胞であることができる。その構成は、慣習的なＴＩＲＦ顕微鏡と関連付けられた問題の多くを解決する。特に、試料細胞の薄い領域は、それらをフローチャンバの中に積み入れることによって細胞と物理的に干渉する必要なく、近ＴＩＲビームにより照射されることができる。代わりに、メンテナンスブロスなどの水性媒体内の生きている細胞が観察されることができる。試料は、要望通りに電極または他の機器により上から更に分析されることができる。顕微鏡は、蛍光電圧指標を発現する細胞を撮像するために使用されることができる。構成要素が試料と干渉しないので、生きている細胞は、本発明の顕微鏡を使用して学習されることができる。試料が蛍光電圧指標を発現する電気的活性細胞を含む場合、顕微鏡は、活動電位特徴を導出するように、それらの細胞における電圧変化、よって、それらの細胞の電気活性を見るために使用されることができる。

その上、顕微鏡は、試料内の特定の細胞のみを選択的に照射するために有用な、空間的にパターン化された照射のためのシステムを含む。

図１０は、試料への複数の波長の光を空間的にパターン化するための光学的光パターニングシステム１００１を示す。光パターニングシステム１００１は、光のビーム１００２を放出するための第１の光源１０１３を含む。光のビームは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ：digital micromirror device）１００５から反射する。ＤＭＤ１００５は、パターンの中へのビーム１００２を形成する。パターン化されたビームは、試料上に撮像される。ＤＭＤは、高速の単一の細胞の刺激のための完全に同期された１００マイクロ秒のパターンリフレッシュが、結合された神経上の個別のシナプス結合または僅かに遅れたパルスを測定して、スパイクタイミング依存可塑性を精査することを有効にする。光パターニングシステムは必要に応じて、第２の光源１０１４を含み得る。第１の光源は好ましくは、ビーム１００２の中に第１の波長の光を送信する。これは、第１の波長に対するフィルタ１０２３を使用して行われ得る。

ダイクロイックミラー１０４３は、第２の光源１０１４からビーム１００２の中に第２の波長の光を選択的に反射し得る。光パターニングシステム１００１は、いずれかのダイクロイックミラー（複数可）１０４３に光をガイドし、またはビーム１００２をコリメートするための、３０ｍｍのアクロマティックダブレットなどの１つまたはいずれかの数のレンズ要素（複数可）１０４１を含み得る。第２の光源１０１４は、第２の波長に対して特有の第２のフィルタ１０２４を使用して、第２の波長において光を提供し得る。光パターニングシステム１００１は、第３の光源１０１５と、第３のフィルタ１０２５と、必要に応じて、第４の光源１０１６および第４のフィルタ１０２６と、を含み得る。好ましい実施形態では、様々な波長からの光がビーム１００２に結び付けられると、ビーム１００２が、光パイプ１０２１を通過する。

１つの必要に応じた実施形態は、４つの波長：ＵＶ（３８０ｎｍ）、青色（４７０ｎｍ）、黄色／緑色（５６０ｎｍ）、および赤色（６２５ｎｍ）を有する４つの光源を使用する。ＵＶ（３８０ｎｍ）は、ＥＢＦＰ２もしくはｍＴａｇＢＦＰ２撮像、または細胞内カルシウムを撮像するために有用であり得る。５０ｍＷ／ｃｍ２の電力は、十分であり得る。青色（４７０ｎｍ）は、ＣｈｅＲｉｆｆ（例えば、チャネルの９５％よりも多くを開放するために２５０～５００ｍＷ／ｃｍ２において）、Ｃｈｒｏｎｏｓ（例えば、チャネルの大部分を開放するために５００ｍＷ／ｃｍ２において）、ＦＬＡＳＨ、または他のそのようなタンパク質を撮像するために使用され得る。黄色／緑色（５６０ｎｍ）は、ｊＲＧＥＣＯ１ａ（神経に対する５６０ｎｍにおける８０ｍＷ／ｃｍ２、もしくは心筋細胞に対する２５ｍＷ／ｃｍ２）、ＶＡＲＮＡＭ、または他のタンパクを撮像するために使用され得る。赤色（６２５ｎｍ）は、Ａｌｅｘａ６４７を有する標的タンパク質（例えば、５０ｍＷ／ｃｍ２において）、またはＢｅＲＳＴを有する細胞活性（例えば、神経に対する１～２０Ｗ／ｃｍ２）を測定するために有用であり得る。

光パターニングシステム１００１は、光源１０１３（典型的には、固体フレームまたはボードに搭載された）から試料にビーム１００２をガイドするための、１つまたはいずれかの数のラウンドミラー１０２６を含み得る。光パターニングシステム１００１は、最終角度を制御する順応可能なラウンドミラー１０２７を含み、最終角度によって、光がプリズムアセンブリ１００９に近づく。好ましい実施形態では、光パターンシステム１００１は、プリズムアセンブリ１００９を含み、プリズムアセンブリ１００９は、ＤＭＤ１００５および試料に光をガイドするための１つまたは複数のプリズムを含む。プリズムは好ましくは、マルチウエルプレートの底部を形成する材料の屈折率に合致する屈折率を有し得る。例えば、顕微鏡８０１は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によってＳＥＮＳＯＰＬＡＴＥという商標の下で販売された２４、９６、３８４、または１５３６個のウエルを有するガラス底マイクロプレートなどのプレートによる使用のために設計され得る。そのようなマイクロプレートは、１２７．７６ｍｍの長さおよび８５．４８ｍｍの幅を含む寸法を有する。マイクロプレートは、ホウケイ酸ガラス（１７５μｍの厚み）を含む。

プリズムアセンブリ１００９は、ダイクロイックミラー１００８を含み得、ダイクロイックミラー１００８は、ＤＭＤ１００５から外に選択された光の波長を跳ね返し、近ＴＩＲ角度において他の選択された波長を通過させることを可能にし、それによって、ウエルのちょうど下から１０～２０ミクロンにわたって試料を照射する。ここで、近ＴＩＲは、角度が臨界角度未満であることを意味すると理解されることができ、それによって、側面から来る光がマルチウエルプレートハードウェアの一部における全内部反射を示す（例えば、プレートのホウケイ酸ガラスの底部におけるＴＩＲを示さない）が、それにも関わらず、例えば、好ましくは、臨界角度の１０度以内、より好ましくは、ＴＩＲに対する臨界角度の５度以内、最も好ましくは、臨界角度の２度以内のものに非常に近い。

示されるように、撮像された試料は、撮像センサ１０３５に向かって通る（例えば、表されないチューブレンズを通過する）光１０３８を放出する。ダイクロイックミラーを理由に、試料は、空間的にパターン化された光により照射されることができ、また、試料ウエルの下から約１０ミクロンのみを通過する近ＴＩＲ光によって側面から照射されることができ（どちらもビーム１００２からのもの）、また、動画を記録するようにセンサ１０３５によって捕捉された放出光１０３８を放出することができる。

いずれかの適切なデジタルライトプロセッサまたは空間的パターニング機構がＤＭＤ１００５として使用され得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ１００５は、１０．８μｍピッチにおけるマイクロミラーの１９２０×１２００の画素アレイおよび２０．７×１３ｍｍのアレイサイズを有するＶｉａｌｕｘ Ｖ９６０１－ＶＩＳ ＤＭＤシステムである。光パターニングシステムは、必要に応じて、試料に対する縮小をもたらすための（例えば、２．７倍）、Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｌｖｕｓ １３５ｍｍなどのチューブレンズを含み得る。

表される実施形態では、各々の光源１０１３は、源をエテンデュに維持する６×６ｍｍの光パイプ１０２１上で撮像された３×３ｍｍのＬｕｍｉｎｕｓ ＬＥＤである。ＬＥＤから光パイプへの４レンズ設計（２ ４－ｆ撮像システム）は、集光効率を増大させ、角度のある内容を最小化する。表される光パターニングシステム１００１は、３つの明確に異なる波長において少なくとも３つのビームを放出するための少なくとも３つの（例えば、４つ）光源１０１３、１０１４、１０１５、１０１６を含む。好ましくは、光パターニングシステム１００１は、空間内で３つのビームを結び付け、３つのビームがホモジナイザおよび／または光パイプ１０２１を通過させるための１つまたは複数のダイクロイックミラー１０４３を有する。光パイプ１０２１は、源を均質化し、４つのＬＥＤ色の良好な重なりを保証する。光パイプ１０２１からの光は、ＤＭＤに向かって沿って通る。

顕微鏡８０１は、光のビーム８２１を放出するための、顕微鏡内に搭載された励起光源８１５を含み得る。光学システム８６１は、下からの角度においてステージに向かってビーム８２１を方向付ける。１つの潜在的な問題は、ビーム８２１の形状に影響を及ぼし得る収差である。よって、好ましくは、顕微鏡８０１は、光学システム８６１に、ビーム８２１を空間的に均質化するためのホモジナイザ８２５を含めることによって、細胞８１３の非均一な照射を回避する。レーザビーム均質化の異なる方法は、均一なビームプロファイルを作成するために使用される。例えば、均質化は、レンズアレイ光学系または光パイプロッドを使用し得る。

顕微鏡を使用して試料を撮像する例示的な方法は、本明細書で説明されるように、顕微鏡ステージ上にマルチウエルプレートを位置付けることを含み、プレートは、ウエルの底面上で生きている少なくとも１つの細胞を有する。撮像は、細胞の画像を取得するように実行される。画像は、ウエルの底部上の表面を「マスク」し、すなわち、細胞によって占有された底面のエリアおよび細胞によって占有されていないエリアを識別する空間的マスクを作成するように処理される。マスクを使用して、コンピュータは、空間的マスクを使用して細胞の範囲を定めるＤＭＤのマイクロミラーを選択的に活性化するように、ＤＭＤをシグナリングする。次いで、光源を使用して、顕微鏡は、ＤＭＤに光を照らすことによって試料を照射し、それによって、細胞によって占有された底面のエリア上に光を特異的に反射すると共に、細胞によって占有されていないエリア上に光のいずれをも反射しない。

方法は、マルチウエルプレートの複数のウエルの各々内で細胞に対する空間的マスクを作成することと、メモリ内で空間的マスクを保持することと、直列に複数のウエル内の細胞を選択的に照射するために、空間的マスクおよびＤＭＤを使用することと、を含み得る。必要に応じて、ＤＭＤは、非一時的メモリシステムに結合されたプロセスを含むコンピュータによって制御され、メモリシステムは、そこに記憶された空間的マスクを有する。

ロバストな高スループット演算のために、開示のシステムおよび方法は、例えば、光遺伝学的刺激（例えば、青色光刺激）を印加し、高速ビデオデータを記録し、ウエルの間で移動し、自動化された化合物添加のためのピペッティングロボットを動作させるために、ソフトウェアツール、例えば、顕微鏡による自動化および制御ソフトウェアの使用を採用し得る。ツールは、各々のマルチギガバイトビデオ内の各々の神経からの電圧対時間トレースを抽出するための分析ソフトウェアを含み得る。低減したデータは、関係データベースに記憶され得る、電圧トレース、識別された活動電位、および抽出された活動電位特徴／パラメータと共に、細胞タイプ、化合物、および化合物濃度などの関連するメタデータを含む。

（実施例１）
光遺伝学的タンパク質を発現するｈｉＰＳＣを使用した自動化活動電位特徴抽出
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ：human induced pluripotent stem cell）を、ｈｉＰＳＣ由来運動神経に分化させた。細胞は、光パッチツールキットから光遺伝学的タンパク質を発現しており（光学的刺激に加え、光学的電圧報告、例えば、ＣｈｅＲｉｆｆ＆ＱｕａｓＡｒ）、光パッチツールキットは、神経活動電位の同時の光学的刺激および記録を可能にする。

チャネルロドプシンＣｈｅＲｉｆｆは、青色光による活動電位刺激を有効にし、電圧感受性蛍光タンパク質ＱｕａｓＡｒは、赤色光による高速電気記録を有効にする。顕微鏡は、本明細書で開示されるように、１ミリ秒の時間的分解能および高シグナル対雑音比（ＳＮＲ：signal-to-noise ratio）により広い（０．５×４ｍｍ）視野（ＦＯＶ）にわたって１００よりも多い個別の神経からの同時電圧記録を取得した。顕微鏡におけるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）は、個別の細胞を直列に刺激するように、完全再構成可能な光学パターンと共に、多くのポストシナプスパートナからの記録を投影した。コンピュータシステムは、各々の個別の神経を識別し、その電圧トレースを計算するための完全自動化分析を提供した。

電圧トレースごとに、スパイクが検出され、不可欠なスパイク形状およびタイミングパラメータが計算された。各々の細胞が多くの活動電位を発火したので、例えば、細胞タイプ、細胞状態、疾患表現型、および薬理学的反応を区別するための豊富な情報が抽出され得る。加えて、電極無し記録は、細胞を最小に摂動し、化合物添加の前および後に同一の神経の記録を有効にし、それは、異なる神経サブタイプに対する化合物効果の識別を可能にし、それは、高度に均質の神経反応の生物学的「ノイズ」を克服した。細胞の自律的励起性および発火パターンに加えて、システムは、シナプス伝達、長期間増強／抑制、ならびにネットワークおよび回路挙動を学習することを可能にする。

ｈｉＰＳＣ由来運動神経は、マルチウエルプレートのウエルの中に置かれ、本明細書で説明されるような顕微鏡を使用して広範囲のスパイキング挙動を精査するように設計された刺激プロトコール（青色光パルス）により尋問された。刺激に反応した蛍光シグナルの記録は、顕微鏡によって取られた。

図１１は、システムを使用して自動化分析によって識別されたｈｉＰＳＣ由来運動神経のオーバレイ（色付けされた領域）による記録からの画像を示す。

図１２は、自動化分析によって識別されたｈｉＰＳＣ由来運動神経からの電圧記録を示す。選択された細胞からの電圧記録、および発火：強度を変化させるステップ、可変周波数のパルス列、およびランプを起こすために使用される青色刺激が示される。

各々の神経内の膜電位のリポータからの蛍光を捕捉した記録内の画素は、細胞の一意な発火パターンに従って時間内に共分散した。時間的共分散は、細胞ごとの重量マスクを生成するために使用された（図１１における色付けられた領域）。マスクされた画素は、電圧トレースを計算するように、記録内のフレームごとに平均化された。各々のＦＯＶは、カリウムチャネル開口薬ＭＬ２１３の添加の前および後の２回記録された。

図１２におけるトレースは、神経の挙動における根底にある変動性を証明する。多くの神経からの記録は、化合物が神経の活動電位に対して有していた効果を捕捉するように平均化された。トレースから、各々の個別の、記録された活動電位が識別された。

図１３は、ラスタプロットを提供し、ラスタプロットでは、各々のポイントは、識別された活動電位であり、各々の行は、単一の視野からの神経である。暗く色付けられたプロットは、ＭＬ２１３、静止電位を低下させ、神経内の活動電位発火を抑制するカリウムチャネル阻害因子の添加の前に神経の記録から導出された。明るく色付けられたプロットは、１μｍのＭＬ２１３の添加の後に記録から導出された。

図１４は、細胞に対して不可欠のスパイク率（発火頻度）を提供する。

図１５は、活動電位から抽出されたスパイク形状パラメータを提供する。

図１６は、活動電位から抽出されたスパイクタイミングパラメータを提供する。

図１７は、一定の刺激の持続時間にわたる活動電位周波数における変化から抽出されるような、細胞にわたる適応平均を提供する。

スパイク形状、スパイクタイミング特性、および適合は、システムによって細胞ごとに自動で抽出され、刺激に応じて測定された。

図１８は、ＭＬ２１３によって引き起こされた神経励起性における明確な低減を示す。全てのパラメータは、クラウドにおける並列化分析によって自動で抽出され、データベースに記憶されており、図がシステムによって自動で生成される。刺激依存の抽出された値は、未処理ビデオデータから数および複雑度を大いに低減させており、本明細書で説明されるような活動電位特徴が、細胞タイプ、細胞状態、疾患表現型、および薬理学的反応を区別するためのより詳細な分析のための基礎として機能することができる。更に、より深い深度および横幅の分析を提供するために、数百のパラメータは、各々の細胞の活動電位から抽出され得る。
（実施例２）
光遺伝学的タンパク質を発現するｈｉＰＳＣからの活動電位特徴を使用した化合物スクリーニング

この実施例では、ｉＰＳＣ由来励起皮質神経（ＮＧＮ２）は、培養において３０日の間に成長した。神経は、実施例１において説明されたような光パッチタンパク質を発現した。神経の２つのセットが成長した。１つ目は、野生型対照ラインであった。２つ目は、神経の疾患をモデル化するための遺伝子のノックアウト（ＫＯ）によって引き起こされた機能突然変異の機密損失を有していた。

細胞は、実施例１において説明されたような青色光を使用して刺激され、それらの活動電位は、電圧トレースとして記録した。記録は、対照細胞と、いずれかの試験化合物が存在しないときに刺激されるときの疾患－モデル細胞とから成っていた。記録はまた、無差別カリウムチャネル阻害因子４－ＡＰおよび無差別ナトリウムチャネル阻害因子ラモトリジンの存在下で刺激されるときの疾患－モデル細胞から成っていた。

図１９は、青色光により刺激されるときの記録された活動電位特徴から抽出された活動電位特徴を示すレーダプロットを提供する。特徴についての値は、対照細胞記録に対して正規化される。左のプロットは、ナトリウムチャネル阻害因子の存在下で疾患－モデル細胞から抽出された特徴を示す。右は、カリウムチャネル阻害因子の存在下で疾患－モデル細胞から抽出された特徴を示す。記録されたトレースにおける差異は、レーダプロットに対して提供される特徴を選択し、赤色で疾患－モデルの機能的表現型を示す。４－ＡＰは、４－ＡＰの非存在下での疾患－モデル細胞と比較するとき、疾患－モデル細胞の活動電位特徴を対照細胞のものにより近くにすることによって、レーダプロットに示されるように、表現型を実質的に反転した。対照的に、ラモトリジンは、挙動を摂動したが、表現型を反転しなかった。

レーダプロットは、疾患表現型および化合物効果の容易な視覚化を可能にする。しかしながら、表現型および化合物効果は、約３００の抽出された活動電位特徴を次元空間にマッピングすることによって、より完全に記述される。

図２０は、その２つのみが示される、記録されたパラメータの約３００次元空間に、抽出された活動電位特徴をマッピングすることによって記述された表現型反転および「副作用」を例示する図である。対照細胞（ＷＴ）ウエルに対する抽出された特徴（緑色）は、ＫＯ細胞に対する特徴（赤色）にあるようにクラスタ化される。それらの集団の間のベクトルは、表現型（赤色）を表す。薬物効果（青色）は表現型ベクトルに沿った（表現型反転）および表現型ベクトルに直交する（副作用）成分に分離される。理想的な薬物は、突然変異の効果を取り消し、ＫＯクラスタから対照細胞クラスタにウエルを移動させる。

図２１は、表現型／副作用空間上に投影された多くのウエルを示すプロットである。ＷＴおよびＫＯウエルは、表現型方向に沿って分割されるウエルである。図２５からの２つの化合物（０．２８～６００μｍの８濃度）の適用は、濃度が増大するにつれてＫＯ細胞挙動に対する効果を増大させてきた。４－ＡＰは、ＷＴ挙動に向かっておよびＷＴ挙動を超えて細胞挙動を移動させると共に、ラモトリジンは、ＷＴおよびＫＯの両方から離れて挙動を移動させる。接続された薬物ポイントは、濃度が増大する順序にあり、２つのラインは、２週間続けての実験に対する実験的複製である。

よって、この実施例は、薬物化合物への細胞反応を正確に確認するために活動電位特徴が使用されることができることを示す。

（実施例３）
いくつかの化合物によって引き起こされた活動電位特徴に対する効果の特徴付け

この実施例は、現在開示されているシステムおよび方法が、それらの治療的効果を予測するために、活動電位特徴を使用して、様々な標的に効果がある、いくつかの化合物に対するフィンガプリントを導出するために使用されることができることを示す。

Ｅ１８ラットの海馬神経は、１４日の間に培養され、実施例１において説明されたような光パッチタンパク質を発現するように引き起こされた。細胞は、ＸＥ－９９１（Ｋｖ７．ｘ阻害因子）、ＭＬ－２１３（Ｋｖ７．ｘ開口薬）、ａ－デンドロトキシン（Ｋｖ１．ｘ阻害因子）、ＯＸＯ－Ｍ（ムスカリンアゴニスト）、４ＡＰ（無差別Ｋｖ阻害因子）、イスラジピン（Ｃａｖ１．ｘ阻害因子）、または対照ビークルが存在するときに刺激された。

図２２は、リスト化された化合物の１つが存在するときに刺激された細胞の記録から抽出された活動電位特徴のサブセットにすぎない、多くの次元に沿った神経スパイク挙動における薬物誘発変化を示すレーダプロットを提供する。活動電位特徴値は、対照ビークルが存在するときに刺激された細胞に対する特徴値に正規化された。レーダプロットに示されるように、各々の化合物は、細胞の活動電位特徴に対する識別可能かつ一意な効果を提供した。例えば、ＸＥ－９９１、電圧ゲートカリウムチャネルＫｖ７．ｘ阻害因子、およびＭＬ－２１３、Ｋｖ７．ｘ開口薬は、予想されるように、細胞反応を駆動した。

図２３は、化合物の様々な濃度の存在下で細胞に対する濃度反応曲線を提供する。各々のシンボルは、１つのウエル内の１００よりも多い細胞を表し、全ての測定が１日に取得された。よって、本システムおよび方法は、様々な化合物の治療的反応を解明することができるだけでなく、濃度依存反応をも示すことができる。その上、測定が１日に行われたように、現在開示されているシステムおよび方法は、高速の、高スループット薬物スクリーニングを有効にする。

（実施例４）
薬理学的効果および疾患表現型の一貫しかつ再現可能な測定

この実施例は、開示のシステムおよび方法を使用して取得された測定が、均一であり、一貫し、かつ再現可能であることを示す。よって、システムおよび方法は、高スループット薬物スクリーニングのための理想的なプラットフォームを提供する。

Ｅ１８ラットの海馬神経は、１４日の間に培養され、実施例１において説明されたような光パッチタンパク質を発現するように引き起こされた。細胞は、９６－ウエルプレートのウエルに置かれた。１μｍにおけるＭＬ－２１３は、プレートの交互のカラムに追加され、対照ビークルが残りのカラムに追加された。全てのウエル内の細胞が刺激され、それらの活動電位は、実施例１において説明されたような顕微鏡を使用して記録された。

図２４は、９６－ウエルプレート内の神経の顕微鏡から取得された高ＳＮＲ蛍光電圧記録を示す。青色光刺激が下に示される。

図２５は、各々のカラムにおいて記録されたスパイクを示すラスタプロットを示す。

図２６は、ウエルごとの青色光刺激ランプの間の平均発火頻度を提供する。示されるように、ビークルウエル（緑色）およびＭＬ－２１３ウエル（赤色）が明確に区別可能であるように、ＭＬ－２１３は、発火頻度を劇的に低減させる。

図２７は、青色光刺激ランプの間の各々のウエル内の記録されたスパイクの数を示すヒートマップを提供する。

図２８は、青色光刺激ランプの間の各々のウエル内の個別の細胞に対して記録されたスパイクの平均数のプロットを提供する。計算された０．３１のＺ’は、７３，０００個のウエルの１つ内の機能しない細胞を示し、測定がウエルにまたがって一貫することを示し、本発明のシステムおよび方法が薬物発見スクリーニングにおいて使用されることを可能にする。

図２９は、９６－ウエルプレートのウエル内の個別の細胞に対して記録されたスパイクの平均数のプロットを提供する。プレートの各々のカラムは、関節炎患者の関節において発見された炎症性メディエータの対照ビークルまたは混合物のいずれかと接触させられた。予想されるように、メディエータを有するウエル内の細胞は、対照ビークルを有するウエル内の活動電位よりも多くの活動電位を発火した。Ｚ’スコアは、異なる生物学的状態が存在するとき、および／または異なる薬物化合物の存在下で細胞の表現型を正確に区別するための、現在開示されているシステムおよび方法の再現性および一貫性を再度示す。炎症性メディエータの混合物は、参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１６５５７７号に説明されるような組成物であり得る。

（実施例５）
同質遺伝子型疾患モデルを使用した活動電位特徴抽出

多様な薬理学的機構をフィンガプリントおよび試験することに加えて、現在開示されているシステムおよび方法は、異なる疾患モデルに対する多くの神経タイプに適用されることができる。

野生型細胞が取得されており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、遺伝子をノックアウトして、同質遺伝子型クローンを生み出すために使用されており、同質遺伝子型クローンは、神経を拡大し、および神経に転化され、実施例１において説明されたような光パッチタンパク質を発現するように引き起こされた。ノックアウトは、機能の喪失に起因して単因性てんかん表現型を示す神経を引き起こした。ノックアウトは、機能の喪失に対するヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかを生じさせた。

図３０に示されるように、ノックアウトの標的であったタンパク質は、ホモ接合性ノックアウト細胞内で取り除かれており、ヘテロ接合性ノックアウト細胞内で発現を低減させてきた。

図３１は、複数の細胞株にまたがって記録された電圧トレースからのスパイクを提供し、複数の細胞株は、野生型（緑色）、ノックアウトに対するホモ接合性（ピンク色）、またはノックアウトに対し、臨床的に有効な化合物が存在するときに刺激されたホモ接合性（黒色）のいずれかであった。示されるように、異なる野生型細胞株および異なるノックアウト細胞株は、一貫したスパイク形状を提供したと共に、野生型およびホモ接合性ラインは、相互から一貫して異なる。更に、臨床的に有効な化合物の存在下での刺激は、野生型のものにより近いノックアウトのものからスパイク形状を一貫して移動させた。

図３２は、複数の細胞株にまたがって記録された電圧トレースからのスパイクを提供し、複数の細胞株は、野生型（緑色）、ノックアウトホモ接合性（ピンク色）、ヘテロ接合性ノックアウト突然変異を有する患者からのもの（紫色）、またはノックアウトを含まなかった患者ラインに対する家族性対照からのもの（青色）のいずれかであった。ヘテロ接合性患者細胞株は、一貫しているが、ホモ接合性ノックアウト変異株よりも深刻でない表現型を生じさせた。

図３３は、図３１におけるスパイクを提供した電圧トレースから抽出された、選択された活動電位特徴に対する多次元レーダプロットを提供する。プロットは、神経形態と、活動電位形状と、野生型細胞（緑色）、ホモ接合性ノックアウト細胞（ピンク色）、および臨床的に有効な化合物が存在するときに刺激されたホモ接合性ノックアウト細胞（緑色）の間のスパイク訓練挙動とにおける変化を明らかにする。予想されるように、臨床的化合物による処置は、全てのメトリックのためにＷＴに対する特徴に向かってホモ接合性ノックアウト細胞株の活動電位特徴を移動させる。

図３４は、突然変異および臨床的に有効な化合物が細胞挙動に対して有する効果を即時的に特徴付けるための、活動電位特徴の次元低減を表す疾患スコアを提供する。この疾患スコアは、試験された全てのラインにわたる一貫しかつ比較可能であるロバストな表現型を提供する。更に、予想されるように、この低減された次元でさえ、本発明の方法およびシステムは、ＷＴ表現型を救済するための薬物の能力を容易に決定することができる。

関連する実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、単因性てんかん疾患モデルに対するイオンチャネルに機能獲得突然変異を導入するために使用された。

図３５は、機能獲得細胞（青色）および野生型対照細胞（紫色）に対して測定されたスパイクパラメータおよびスパイク率を提供する。予想されるように、突然変異は、活動電位形状および疾患モデル神経とそれらの同質遺伝子型対照との間の発火挙動を変化させる。

よって、多様な薬理学的機構を試験することに加えて、開示のシステムおよび方法は、異なる疾患モデルに対する多くの神経タイプに適用されることができる。まさに提供される実施例では、開示のシステムおよび方法は、齧歯類ＣＮＳ神経と、齧歯類ＤＲＧ感覚神経と、ＮＧＮ２皮質の励起性、抑制性、運動性、感覚性、およびドーパミン作動性神経を含む、複数のタイプのヒトｉＰＳＣ由来神経とにおける疾患表現型および薬理学的効果を特徴付けるフィンガプリントを発達させるように活動電位特徴を記録するために使用された。その上、実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および患者由来神経を有する遺伝子ノックアウトまたはノックインを使用した、同質遺伝子型背景内の疾患モデルを含む、異なる神経疾患モデルを含む。

（実施例６）
高スループット、全領域刺激アッセイ

上記説明された固有励起性測定に加えて、開示のシステムおよび方法は、シナプス機能への鋭敏な測定を生成することができる。方法は、個別の細胞内の励起性および抑制性シナプス後電位（ＥＰＳＰおよびＩＰＳＰ）、カルシウム撮像またはマイクロ電極アレイにより取得されることができない情報を測定するために使用され得る。有利なことに、システムおよび方法は、励起性測定のスループットと比較可能なスループットにより、９６－ウエルプレートフォーマットおよび３８４－ウエルプレートフォーマットにおいてロバストに実装されることができる。

シナプス機能の高スループットスクリーニングは、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびフロックス構造を使用して、Ｅ１８ラットの海馬神経：アクチュエータＣｈｅＲｉｆｆを発現するシナプス前神経および電圧－センサＱｕａｓＡｒを発現するシナプス後神経の明確に異なる集団により実行された。全ての細胞は、ＣｒｅＯＦＦ－ＣｈｅＲｉｆｆ（Ｃｒｅは、ＣｈｅＲｉｆｆを切除し、発現をターンオフする）およびＣｒｅＯＮ－ＱｕａｓＡｒ（Ｃｒｅは、前方の向きに向かってＱｕａｓＡｒを反転させ、発現をターンオンする）を発現した。Ｃｒｅは、ＱｕａｓＡｒまたはＣｈｅＲｉｆｆのいずれかを発現する神経のばらばらの集団を生じさせる神経のサブセットを変換するように、低滴定量に添加された。青色光の短いパルスは、シナプス前細胞内の活動電位を作動させるように神経に伝達され、シナプス後電位は、シナプス後細胞内で検出された。

図３６は、ＣｈｅＲｉｆｆが神経のサブセット（シナプス前神経３６０１）（典型的には、１０～５０％）において発現され、ＱｕａｓＡｒが残り（典型的には、５０～９０％）（シナプス後神経３６０２）において発現されることを示す。

図３７は、黄水晶と癒合されたＱｕａｓＡｒ（緑色）、ＥＢＦＰ２と癒合されたＣｈｅＲｉｆｆ（青色）、および自動化画像セグメンテーションのために使用される核輸送ＴａｇＲＦＰ（赤色）を示す、本明細書で説明されたような顕微鏡を使用して取得された蛍光画像を提供する。
図３８は、シナプス後電位（ＰＳＰ）を示す単一細胞蛍光トレースを示す。シナプスシグナルは、ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、およびＧＡＢＡを薬理学的に隔離することによって独立して精査された。

図３９は、ＡＭＰＡＲおよびＧＡＢＡＡＲアッセイに対するアゴニストおよび阻害因子を制御することに反応した単一の細胞ＰＳＰの調節を示す。ＣｈｅＲｉｆｆ刺激が底部に示される。

図４０は、対照薬理学に対する平均ＰＳＰトレースを示し、黒色が薬物前を示し、シアンが競合阻害因子［ＡＭＰＡＲ：１００μｍのＮＢＱＸ／ＣＮＱＸ、３８９個の細胞、ＧＡＢＡＡＲ：２０μｍのガバジン、１７６個の細胞］を示し、緑色が陰性アロステリック調節因子（ＮＡＭ）［１００μｍのＧＹＫＩ５３６５５、２９１個の細胞、ＧＡＢＡＡＲ：３０μｍのピクロトキシン、１７６個の細胞］を示し、紫色がビークル対照［ＡＭＰＡＲ：１６７個の細胞、ＧＡＢＡＡＲ：２３６個の細胞］を示し、青色、赤色、および黄色が陽性アロステリック調節因子（ＰＡＭ）［ＡＭＰＡＲ：０．１～１μｍのシクロチアジド、５１２個の細胞、ＧＡＢＡＡＲ：０．１～１μｍのジアゼパム、２４４個の細胞］を示す。

図３９～４０に示されるように、適切なシナプス後チャネル阻害因子を使用することは、励起性と、ＡＭＰＡチャネルおよびＮＭＤＡチャネルから結果として生じる脱分極化電圧変化と、ＧＡＢＡＡチャネルからの抑制性過分極化電圧変化との隔離を有効にする。

図４１は、平均薬物前反応に正規化されたＰＳＰエリア内の薬物誘発変化を示すドット密度プロット（各々のドットが１つのシナプス後神経である）を与える。黒色のウィスカは、平均±ＳＥＭである。密度プロットは、測定された多数の個別の細胞をハイライトし、陽性チャネル調節因子および陰性チャネル調節因子の両方の明確な効果を示す。蛍光ラベルにより細胞タイプが識別される場合、追加の識見が取得されることができる。例えば、励起性細胞および抑制性細胞は、抑制性プロモータによって駆動されたＧＦＰを包含するレンチウイルス構築物により細胞を変換することによって区別されることができ、励起性サブタイプおよび抑制性サブタイプは、マウスＣｒｅラインを使用して識別されることができる。シナプスアッセイは、顕微鏡のＤＭＤにより単一のシナプス前細胞を刺激することによって、個別のシナプスを解決することができる。
（実施例７）
高スループットスクリーニング

開示の方法およびシステムは、細胞に対する疾患表現型および薬理学的効果を特徴付けるように、活動電位特徴から導出されたフィンガプリントを使用して薬物の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実装するために使用されることができる。

プレートの生成は、疾患関連表現型を識別し、高スループット薬物スクリーニングを最適化するために、薬物スクリーニングアッセイに対して自動化される。ヒートマップ分析および階層型混合効果モデルは、プレート内変動およびプレート間変動を特徴付けるために使用した。細胞のメッキおよび扱いにおける変化、刺激プロトコール、ならびにアッセイ持続時間が試験され、２０％を下回るプレート内変動およびプレート間変動を結果としてもたらすと共に、説明されるような０．３を上回るＺ’値を維持する。

ＤＭＳＯ許容差は、緩衝液対照値と比較したアッセイ窓の大きさにおける１０％を下回る変化を生み出すＤＭＳＯレベルを識別するように、濃度反応実験を使用して定義される。アッセイ用意の確認に従って、５つのスクリーニングプレートの小さいセットは、最終的なスクリーニング濃度の選択をガイドするように、ライブラリからランダムに選択される。化合物のそれらのプレートは、１、３、７、および１０マイクロＭの濃度において複製してスクリーニングされる。対照値からの３の標準偏差（ＳＤの）よりも大きい変化として定義されたヒットと共に、約１％のヒットレートを得る化合物濃度が選択される。この濃度を使用して、最小の偽陽性により多数の真のヒットが捕捉される。

ＦＤＡのパイロットスクリーニングは、薬物ライブラリを承認しており、ツール化合物は、世界的に承認されたおおよそ２４００個の薬物のライブラリを使用する。そのライブラリは、選択されたスクリーニング濃度において利用可能なツール化合物の選択されたセットを発見するようにスクリーニングされる。このライブラリが活性化合物を含有する可能性が高いので、このステップは、ＨＴＳに対するアッセイ用意の最終試験としての役割を果たし、ヒット選択基準を確立するためのデータセットを提供する。化合物ライブラリは、１００％のＤＭＳＯにおいてバーコードの３８４－ウエルプレート内で作製される。

例示的な方法は、ＨＴＳに対する試薬の生成およびバンキングを含む。均一な細胞作製を保証するために、１つは、３億個のｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２神経、１億個の一次齧歯類グリア、および光パッチ構築物をコードするレンチウイルスの大量のバッチを生成し、アリコートし、および凍結する。各々のバッチは、スクリーニングを１．５倍実行するのに十分である。効率性および均一性を改善するために、自動化細胞培養工程がＨＴＳ活性の全体を通じて適用される。

例示的な方法は、ＨＴＳスクリーニングおよびヒット確認を含む。化合物は、対照に対して保存された各々のプレート内の３２個のウエルと共に、選択されたスクリーニング濃度において３８４－ウエルフォーマット（ｎ＝１）においてスクリーニングされる。プレートごとのスキャン時間は、アッセイプロトコールに依存するが、全体的におおよそ９０分を要し、それは、３スクリーニング日／週において本明細書で説明されるような１つの顕微鏡上で５，０００よりも多い化合物／週のスクリーニングを有効にする。過度な変動（Ｚ’＜０．３）、少数の活性細胞、または均一でないメッキを有するプレートは、再現のためにフラグ付けされる。ヒット選択および確認は、ＨＴＳに従って行われる。

図４２は、高スループットスクリーニングのための例示的な方法の図である。

ヒットは、マルチパラメータ表現型スコアおよび副作用スコアの反転に基づいて最初に選択される。ヒット選択基準は、プレート内対照値からの３よりも多いＳＤ変化を示す化合物として定義されたヒットと共に統計的基準に基づいている。

最大で２００個の選択されたヒットの活性は、１倍および０．３倍のスクリーニング濃度において複製して最初に確認される。２倍の濃度は、単調でない濃度反応を有する化合物を識別することを支援する。確認されたヒットは、表現型反転および副作用を定量的に特徴付けるように、１１－ｐｔ濃度反応において試験される。結果は、プラットフォーム性能を確認する。
（実施例８）
コンピュータシステム

図４３は、１つまたは複数の電気的活性細胞の活性の記録を行うコンピュータシステム４７０１を示す。ビデオデータは、画像センサ１４３５から処理モジュール４７０５に流れ、処理モジュール４７０５は、既知の病理を有する細胞および病理を有さない細胞からの記録を含む、訓練データに対して訓練された機械学習システム４７０９に記録を提示するようにメモリに結合されたプロセッサを使用する。機械学習システム４７０９は、電気的活性細胞の表現型を報告する。処理モジュール４７０５は、機械学習システム４７０９への入力として提示され得る、ビデオデータ内の活動電位からの特徴を測定し得る。必要に応じて、バジェットラッパは、入力として使用されることになる制限された数（例えば、８、１０、または１２など）のそのような特徴のみを選択する。選択されたデータは、機械学習システム４７０９に入力として提示され、機械学習システム４７０９は、撮影される生きている電気的活性細胞の表現型を出力として与える。

出力が表現型であることを理由に、出力（よって、機械学習システム４７０９）は、細胞が病理によって影響を及ぼされるかどうかを報告する。よって、機械学習システム４７０９は、試験化合物が疾患によって影響を及ぼされた細胞に対する効能を有するときを示すことができる。

システム４７０１は、未処理動画データを圧縮するために動作可能である。処理モジュールは、センサ１４３５を介して、電気的活性細胞のデジタルビデオデータを取得することによって、圧縮を実行し得る。システム４７０１は、ブロックごとに、そのブロックの共分散マトリックスおよび固有値分解を計算し、固有値分解を切り捨て、いくつかの主成分のみを維持し、それによって、ブロックからのノイズを破棄することによって、ブロックワイズ方式においてビデオデータを処理する。更に、システム４７０１は、維持された主成分のみを使用して、圧縮されたビデオとしてビデオをメモリに書き込む。好ましい実施形態では、システム４７０１は、少なくとも１０の係数によって、好ましくは、更には約２０倍～２００倍圧縮によってビデオを圧縮し、システム４７０１がリモートストレージ４７２９に圧縮されたビデオを書き込むことを可能にし、リモートストレージ４７２９は、サーバシステム、クラウドコンピューティングリソース、または第三者システムであり得る。
（実施例９）
階層型ブートストラッピングアルゴリズム

実施形態は、統計試験および信頼区間構築と共に、階層的な入れ子データに対する検定力分析のための能力を有する階層型ブートストラッピング関数と、任意の数のレベルにおいて階層型データからサンプリングすることを可能にする回帰的再サンプリングアルゴリズムとを含む。入れ子データに排他的に焦点を当てることは（ビジネスのための関連しかつ貴重なケース）は、この構造を完全に活用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学用途のための強力かつ効率的なカスタムツールを構築することを有効にする。センサ１４３５を使用して行われる電気的活性細胞からの測定のために、処理モジュール４７０５は、特徴を回帰的に再サンプリングすることができる。

図４４は、処理モジュール４７０５によって呼び出されることができる回帰的再サンプリングルーチンの図である。メイン入力は、階層情報を包含するカラムのリスト（例えば、｛「ＣｅｌｌＩｄ」、「ＰｌａｔｅＩｄ」、「ＷｅｌｌＩｄ」｝）と、レベルごとに選択するいくつかの試料（ユーザによって指定されない場合、アルゴリズムは元のデータセットのサイズを模倣し、例えば、データが各々で９６個のウエルの有する６プレートの２ラウンドから成る場合、各々で９６個のウエルを有する６プレートの２ラウンドをサンプリングする）と、使用するエスティメータおよび有意レベルと、を使用する階層および特徴を定義するメタデータを有するテーブルを含む。ルーチンは、必要に応じて、集団に対する統計（提供されない場合、テーブル内の全ての数値特徴を使用する）および／または集団を指定するカラム（１または２の集団を現在サポートする）を計算するための特徴を含み得る。

全体的に、前処理は、統計を実行するように所望の数値特徴のマトリックスを抽出することと、階層情報を使用して、再サンプリング関数への群情報および入力を作製することとを含み得る。検定力分析を実行する場合、真の測定ノイズデータに指定されたサイズのシグナルを追加する。所望の回数の反復の間、試料行インデックス、特徴マトリックスにアクセスし、全ての特徴を一度に再サンプリングするための使用行インデックスは、全ての特徴に対する所望の試験統計を一度に計算し、所望のエスティメータに基づいて、結果テーブルを作製する。ルーチンは、所望の推定を包含する結果テーブル、反復ごとに計算された統計のテーブルを出力する。再サンプリングアルゴリズムの実装態様は、回帰的実装に起因して、任意の数のサンプリングレベルに適合する。メイン入力は、階層群情報（必要に応じて、集団情報を有するエクストラカラムを包含する）およびレベルごとに選ぶ試料の数（全てゼロである場合、群情報から試料サイズを推論し、同一のフォーマットの試料を返す）のマトリックスを含む。出力：再サンプリングされた行インデックスのベクトル。

第１の再サンプリングステップおよび回帰的呼び出しについての実施例として、ルーチンは、最高レベルにおいて所望の数をサンプリングする（提供される場合、集団情報を考慮に入れて）。試料ごとに、ルーチンは、対応する下位の階層レベルを選択し、下位レベルデータに対するアルゴリズムを呼び出す。試料インデックスは、元のテーブルからのサンプリングされた行インデックスを包含する１つの出力ベクトルに組み合わされる。

説明される回帰的ブートストラッピングアルゴリズムは、検定力分析を実行するために有用である。検定力分析は、所与の生物学的クエリまたは化学的クエリのためにどの程度の大きさで（ウエルの数、複製の数、試験の回数など）実験が実行されるべきであるかを決定するために有用であり得る。

別の実施形態は、訓練された機械学習システム４７０９がデータを過適合することを回避するように機械学習システム４７０９を訓練するときに有用な増補されたデータを作成するために、好ましくは非回帰的ブートストラッピングアルゴリズムを使用する。
（実施例１０）
オートエンコーダ

或る実施形態は、薬物に曝露された神経からの光遺伝学的データを処理し、薬物フィンガプリントを作成するためにオートエンコーダニューラルネットワークを使用する。深層オートエンコーダは、薬物空間を学習し、個別の化合物に対するフィンガプリントを構築することができる。

図４５は、８次元において薬物フィンガプリントを生成するオートエンコーダを示す。オートエンコーダは、バックアウトを拡大し、初期の入力を再構築することを試みる前に、８次元ボトルネックレイヤ（「埋め込み」）を通じて光パッチ測定から抽出された５１８個の特徴を低減させる。埋め込みは、情報密度であり、（先行する深度を理由に）高次表現を反映する。オートエンコーダは、いずれかのレイヤの間（例えば、５１８次元レイヤと５０次元レイヤとの間、または５０次元レイヤと２５次元レイヤとの間）のスウィッシュ活性化関数を実装し得る。活性化関数は、ニューラルネットワーク挙動を非線形データに拡張する。よって、オートエンコーダは、表現学習により薬物フィンガプリントを導出するために有用である。

図４６は、８次元における化合物に対する薬物フィンガプリントを示す。個別の化合物に対するフィンガプリントは、薬物空間内でプロットされる。ラインに沿ったドットは、希釈系列にまたがる代表的な化合物のフィンガプリントである。ドットの雲は、各々がビークル対照を表すドットである。化合物の濃度を増大させることは、オートエンコーダによって表されるとき、対照の雲から離れて移動する特徴を示す曝露された神経の試料を引き起こすようになることが分かり、理解され得る。４つのプロット内の各々の軸は、個別の次元を表す。

図４７は、陽性（レチガビン）対照および陰性（化合物なし）対照による、２．８倍の系列希釈において、化合物１～４の２つの複製の各々において、化合物が神経への曝露のためにどのようにメッキされたかを示す。４００を超える化合物は、神経励起性アッセイ内で１０ポイントの濃度反応曲線（ＣＲＣ：concentration response curve）において判断されてきた。

図４８は、刺激プロトコールの過程にわたる、平均発火頻度に対する濃度依存影響を示す。概して、最高濃度の化合物は、対照からの最大逸脱と関連付けられる。図４８の活動電位トレースは、図４５のオートエンコーダに示され、オートエンコーダは、化合物ごとに、図４６に示された２つの（１つの化合物の２つの複製）などの８次元フィンガプリントを導出する。化合物フィンガプリントは、濃度を増大させると共に中心内で青色ドットから放射する複製（図４６における実線／円対点線／ｘ）にまたがる優れた再現性を示す。

薬物フィンガプリンティングは、８次元薬物空間内でプロットされた濃度依存効果を示すために有用である。ここで重要な識見は、図４６に示されたフィンガプリントは、薬物の効果に特有であり、薬物の化学的性質に不可知であることである。図４６の４つのパネルが８次元において１つのフィンガプリント（ウエル、フィンガプリントの２つの複製）を示し、その薬物が非常に有用な効果の最大濃度を有する場合、対照雲から最も遠い図４６の４つのパネル内に現れるドットは、その有用な効果を表すことを思い出されたい。新規の薬物、例えば、大規模ライブラリ内の連結の化学的性質によって新たに発見または作成される１つは、フィンガプリントされ得、新規の薬物が同一のフィンガプリントを得る場合、その新規の薬物は、臨床的試験のための候補となり得る。潜在的な有用性が自明であるべきであると共に、１つの潜在的な使用ケースが簡潔さおよび明確さのために述べられ得る。既知の薬物は、高度に望ましくかつ有用な効能を有し得るが、非常に不安定であり得、または作るのが困難であり得る（例えば、感光性であり得もしくは有毒なエナンチオマを有し得る）。薬物フィンガプリンティングは、類似の効果を有するが共通し、または作るのにより簡易であり、またはより安定し、またはより長い貯蔵寿命を有し、またはより少ない化学的ライアビリティを有する薬物を探索するために使用されることができる。
（実施例１１）
疾患表現型反転

本発明の方法は、表現型を作成するために有用であり、健康な細胞および疾患の影響を及ぼされた細胞の両方の表現型を作成することを含み得る。

例えば、カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリＱメンバ２（ＫＣＮＱ２）タンパク質および遺伝子は典型的には、生命の最初の週内に発作を提示する、ＫＣＮＱ２脳症に関与する。ＫＣＮＱ２（Ｒ２０１Ｃ）内の位置２０１におけるアルギニンへのシステインの突然変異は、ＫＣＮＱ２脳症を起こし得る機能獲得突然変異であることが理解される。本発明の方法を使用して、Ｒ２０１Ｃ突然変異を有する神経およびＲ２０１Ｃ突然変異を有さない神経は、光パッチにより測定され得、オートエンコーダなどのシステムは、表現型を作成し得る。各々の表現型は、オートエンコーダによって８次元空間内でプロットされ得、オートエンコーダは、薬物フィンガプリントをもプロットし得る。開示の方法は、この稀な単因性てんかんをフィンガプリントし、表現型に対する薬理学的効果を評価するために使用された。

図４９は、８次元薬物フィンガプリント空間にマッピングされたＫＣＮＱ２ Ｒ２０１Ｃ機能獲得表現型を示す。表現型フィンガプリント（より明るいポイント）は、潜在的な治療的化合物を戻すための探索アルゴリズムを通じて稼働した。示されるように、合致の１つ、リノピルジン塩酸塩（ＫＣＮＱ２／３阻害因子）は、疾患表現型を反転させる。リノピルジンのいくつかの濃度による処置は、野生型パターン（より暗いポイント）に戻って機能獲得変異株の挙動を押し込む。薬物の増大する濃度が疾患の影響を及ぼされた表現型を反転させることを示すように、図の左上パネルに黒い矢印が描かれる。

図５０は、レチガビン、ＫＣＮＱ２チャネル活性化因子が、野生型細胞株に適用されるときの機能獲得Ｒ２０１Ｃ突然変異体に類似の細胞挙動を誘発することを示す。ここで、薬物フィンガプリンティングは、薬物が機能獲得突然変異の表現型を反復することを明らかにする。薬物および突然変異は両方、過活性イオンチャネルを誘発することが予想される。ここで、両方は、必然的に同一の挙動のフィンガプリントを得た。
（実施例１２）
最近傍発見

活動の同一の機構を有する化合物は、最近傍探索アルゴリズムを使用して合致されることができる。いくつかの実施形態は、薬物空間を通じた化合物経路を定義するために、方向および距離の両方を組み合わせた、重み付け最近傍マッチングアルゴリズムを使用する。これは、類似の経路を取る化合物を発見するために使用されることができる。フィンガプリント類似性に基づいて標的および標的クラスによって化合物を正確に群にする能力は、ＤＦＰデータを解釈する根底にある原理である。標的逆畳み込み、薬物再利用、ヒット選択、およびヒット拡大は全て、フィンガプリントの類似性を列挙するためのアルゴリズムからの利点を有する。

図５１は、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムゲートイオンチャネル調節因子に対する薬物フィンガプリント類似性マトリックスである。電圧ゲートナトリウムチャネル、電圧ゲートカリウムチャネル、および電圧依存カルシウムチャネルを調整する化合物は、化合物標的分類に基づいて同様にクラスタ化する薬物フィンガプリントを有する。活動の同一の機構を有する化合物は、最近傍探索アルゴリズムを使用して合致されることができる。薬物空間を通じた化合物経路を定義するために、方向および距離の両方を組み合わせた、重み付け最近傍マッチングアルゴリズムが使用され得る。これは、類似の経路を取る化合物を発見するために使用されることができる。

図５２は、高度に類似の薬物フィンガプリントを有するとして、ＭＬ２１３およびＩＣＡ－２７２４３とラベル付けされた、２つの薬物を識別するクエリを示す。

図５３は、高度に類似の薬物フィンガプリントを有するとしてＩＣＡ－２７２４３およびレチガビンを識別するクエリを示す。レチガビンは、処置を経験した成人患者における部分的てんかんのための補助的処置として使用される抗痙攣剤である。レチガビンは、カリウムチャネル開口薬として主に作用する。投与関連の悪影響は、臨床的試みにおいて疑わしかった。参照によって組み込まれる、Ben-Menachem, 2007, Retigabine: Has the Orphan Found a Home?, Epilepsy Currents 7(6):153-4を参照されたい。

ここで、最近傍アルゴリズムは、ＩＣＡ－２７２４３（クエリ化合物）のような化合物を正確に発見する。ＩＣＡ－２７２４３のように、ＫＣＮＱ２／３活性化因子であるＭＬ２１３およびレチガビン（合致する化合物）の両方は、４００個の化合物ライブラリにまたがってクエリされるとき、ＩＣＡ－２７２４３に類似するフィンガプリントを有するとして正確に識別された。識別された合致は、更なる事前の臨床的調査のための候補であり得る。
（実施例１３）
摂動アッセイ

薬物フィンガプリンティングは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む多様な治療的モダリティを分析または検証するために使用され得る。

実施例では、Ｅ３リガーゼＥ６関連タンパク質（Ｅ６ＡＰ、ＵＢＥ３Ａとしても既知である）は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子によってコードされ、ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現は、遺伝子刷り込みを介して規制される。Ｅ６ＡＰ発現の損失は、典型的には、発話障害および運動発達と共に発作によって特徴付けられる、エンジェルマン症候群の発達につながる。逆に、ＵＢＥ３Ａのコピー数多型（ＣＮＶ：copy number variations）は、Ｅ６ＡＰの過発現および自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ：autism spectrum disorder）のその後の発達に結び付けられ得る。いくつかの臨床的提示では、染色体１５の部分が複製される。このＤｕｐ１５ｑ症候群は、２つの形式、余分な等動原体染色体１５または染色体１５内のインタスティシャル複製の１つにおいてほとんど一般的に発生する。Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、筋緊張低下、全体的および細かい運動の遅れ、知的障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、ならびに乳児ひきつけを含むてんかんによって特徴付けられる。ＵＢＥ３Ａ遺伝子のＣＮＶと関連付けられた障害は、ＵＢＥ３Ａの過発現をノックダウンし、よって、ＵＢＥ３Ａ ＣＮＶと関連付けられた発作、知的障害、または自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するために有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：antisense oligonucleotide）により潜在的に処置され得る。

薬物フィンガプリンティングは、ＡＳＯを評価し、標的外ライアビリティの急速な全体的な判断を実行するために使用され得る。そのような評価は、標的外ライアビリティを有する配列を識別し、それらの配列を発達パイプラインから取り除き、最良の候補配列が前進することを保証するために使用され得る。

図５４は、１つの特定のＵＢＥ３Ａ ＡＳＯが次元２および６において適度に摂動的であることを示す。

図５５は、スクランブルされたＡＳＯ配列が、細胞単独と比較してフィンガプリントを系統的に変えないことを示す。すなわち、図５４において囲まれたデータポイントは、ここでは、「ＡＳＯ候補」と称するＵＢＥ３Ａをノックダウンするように設計された、ＡＳＯを更に分析するように研究者をガイドする。

図５６は、トランスフェクション試薬が単独で摂動を示すことを示す。あらゆるウエルは、摂動フィンガプリントを示した。データは、２００マイクロリットルおよび３００マイクロリットルのビークル専用フィンガプリントがほぼ同一であったことを示す。

フィンガプリントを解釈するために、フィンガプリント空間が全体的な薬物フィンガプリンティング（ＤＦＰ：drug fingerprinting）スクリーニングから発生することに留意されよう。かすかな背景は、ＤＦＰスクリーニングからのＤＭＳＯ対照雲（「不活性の雲」）である。

実線のかすかなドットは、ＤＦＰデータと整列されたＵＢＥ３Ａ ＡＳＯからの細胞専用対照である。実線の暗いドットは、対象のＵＢＥ ＡＳＯ介入ウエルである。
（実施例１４）
ヒット発見

ＧＳＫ ３７８７に非常に類似する薬物フィンガプリントを有する候補薬物が発見された。ＧＳＫ ３７８７は、強力かつ選択的なペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ（ＰＰＡＲδ：peroxisome proliferator-activated receptor δ）アンタゴニストである。参照によって組み込まれる、Palkar, 2010, Cellular and pharmacological selectivity of the peroxisome proliferator-activated receptor-β/δ antagonist GSK3787, Mol Pharmacol 78(3):419-430を参照されたい。薬物フィンガプリンティングは、ＱＳ００６９５６７：３が化学的構造類似性およびＰＰＡＲδ抑制因子ＧＳＫ ３７８７に類似するフィンガプリントを有することを発見しおよび示す。開示の方法に係る薬物フィンガプリンティングの利点および特徴は、方法が高スループットおよび自動化に資することである。未知の機能の多数の（数百、数千、数万の）多様な薬物は各々、光パッチ構築を発現する神経を有するウエルの中に分配され得る。蛍光顕微鏡を使用してデジタル動画が作られ得る。ソフトウェアは、動画内に蛍光的に示される活動電位の数百の（例えば、５１２の）特徴を読み込み得る。オートエンコーダは、それらを８次元に低減させ得、薬物フィンガプリントとしてそれらを表し得る。マッチングアルゴリズムは、最近傍を自動で発見し得、既知の機能の薬物に高度に類似する薬物フィンガプリントを多数の多様な薬物の１つが有することを報告し得る。

図５８は、ＧＳＫ ３７８７に非常に類似する薬物フィンガプリントを有する候補が発見されることを示す。
（実施例１５）
活性検出器

図５９は、ウエルとして不活性識別子に対して使用され得る、活性検出器としての薬物フィンガプリントを例示する。活性検出は、４００回の化合物スクリーニングの全体を通じて実行された。可変の濃度にわたる化合物の生物活性は、訓練された薬物空間内で自動で検出されることができる。活性化合物（淡い斑点）は、８次元薬物空間内で外に更に拡大すると共に、不活性化合物および不活性ＤＭＳＯ対照ウエル（暗い斑点）は、各々の２次元プロットの中心に残る。４００回の化合物スクリーニングの全体を通じて、レチガビン陽性ＣＴＬウエルの９９．８％および実験的ウエルの２５．１％（１０の濃度にまたがる４０３個の化合物）に対して活性が検出された。活性が検出された化合物に対し、最高の３分の１の投与を有するウエルの４９．５％および最高の投与の６１％に対して活性が検出された。よって、方法は、単純な、高スループットスクリーニングのために使用され得、または生物学的に不活性である化合物および／もしくは生物学的に活性である化合物を識別するようにライブラリを通過し得る。
（実施例１６）
薬物再利用

遺伝性てんかんに対して潜在的に有効な化合物に対するインシリコスクリーニングを検証する調査が実行された。

図６０は、てんかん関連ノックアウト突然変異（ＫＯ）を有する細胞および野生型（ＷＴ）細胞（より暗い斑点）上の候補化合物に対する薬物フィンガプリントである。

図６１は、候補化合物および既知の薬物に対する薬物フィンガプリントである。インシリコスクリーニングにより識別された選択された薬物（雲に戻るより暗いドット）がＫＯ神経に適用されるとき、ＫＯ細胞（雲から最も離れたより明るいドット）に対する表現型が救済されることができる。濃度が増大するにつれて（ライン）、ＫＯの表現型が変化し、薬物救済を示す、健康な（ＷＴ）神経表現型（明るいドットおよび雲）に戻る。対照状態を超えて通るラインは、高い濃度における過救済を示す。
参照による組み込み

特許、特許出願、特許公開、刊行物、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照および引用が本開示の全体を通じて行われてきた。全てのそのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体での参照によって本明細書で以下に組み込まれる。
同等物

本明細書で示されおよび説明されたものに加えて、本発明およびその多くの更なる実施形態の様々な修正は、本明細書で引用された科学的文献および特許文献への参照を含む、本文書の全内容から当業者にとって明らかであろう。本明細書における主題は、その様々な実施形態およびその同等物における本発明の実施に適合されることができる重要な情報、例示、およびガイダンスを包含する。

Claims (18)

1. 治療的効能を予測する方法であって、
   推定上の治療的化合物の存在下で電気的励起可能細胞内の特徴を識別するステップと、
   疾患細胞内で生物学的に活性であることが既知の１つまたは複数の化合物により処置される刺激された神経細胞に存在する実質的に同一の特徴に対して前記特徴をマッピングするステップと、
   前記識別された特徴が前記実質的に同一の特徴に合致する程度に基づいて、前記疾患に対する前記推定上の治療的化合物の効能を予測するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記識別された特徴のうちの１つまたは複数が前記実質的に同一の特徴から変化する程度に基づいて、前記神経の疾患を処置する際の前記推定上の化合物の副作用を予測するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 第２の推定上の治療的化合物の存在下で１つまたは複数の刺激された神経細胞内の活動電位の特徴を識別するステップと、
   前記実質的に同一の特徴に対して前記特徴をマッピングするステップと、
   前記推定上の化合物の前記識別された特徴が前記実質的に同一の特徴に合致する程度に基づいて、前記神経の疾患に対する前記推定上の治療的化合物および前記第２の推定上の治療的化合物の組合せの効能を予測するステップと、
   を更に含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記マッピングするステップは、前記推定上の治療的化合物が存在しないときと対比して前記推定上の治療的化合物が存在するとき、前記神経細胞によって排他的に占有された空間の領域を識別するように、前記活動電位の前記特徴によって定義された空間に前記活動電位をマッピングすることを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記予測するステップは、効果がある化合物が存在しないときと対比して前記効果がある化合物が存在するとき、前記神経細胞によって排他的に占有された空間の領域を識別することと、前記推定上の治療的化合物および効果がある化合物に対する前記識別された領域が重なる程度を決定することと、を含む、請求項１に記載の方法。
6. 治療的効果を特徴付ける方法であって、
   治療的化合物の非存在下で刺激された電気的励起可能疾患細胞の特徴を識別するステップと、
   公知の治療的化合物の存在下で前記電気的励起可能細胞を刺激するステップと、
   治療薬の存在下で前記刺激された電気的励起可能細胞の特徴を識別するステップと、
   既知の治療薬の存在下で前記電気的励起可能細胞の特徴が、前記治療的化合物の非存在下での前記電気的励起可能細胞の前記特徴とは異なるかどうかを決定するステップと、
   前記決定するステップに基づいて、治療的効果を特徴付けるステップと、
   を含む、方法。
7. 決定された異なる活動電位特徴を引き起こす１つまたは複数の化合物に対する化合物のライブラリをスクリーニングすることによって、前記神経障害を処置するための推定上の治療的化合物を識別するステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
8. 治療的効能を有する化合物を識別する方法であって、
   刺激された神経細胞が治療的化合物に曝露されるときに存在し、前記治療的化合物に曝露されていない刺激された神経細胞に存在しない神経活動電位の特徴を識別するステップと、
   推定上の治療的化合物の存在下で神経細胞を刺激するステップと、
   前記刺激された神経細胞内の活動電位の特徴が、前記治療的化合物に曝露された神経細胞内に存在すると予想された特徴に合致するかどうかを決定するステップと、
   前記決定するステップの結果に基づいて、治療的効能を有するとして前記推定上の治療的化合物を識別するステップと、
   を含む、方法。
9. 前記神経活動電位の前記識別された特徴のうちの１つまたは複数は、前記治療的化合物の副作用と相関付けられ、前記方法は、前記刺激された神経細胞内の活動電位の特徴が、副作用と相関付けられた前記１つまたは複数の特徴に合致するかどうかを決定するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記神経細胞は、推定上の治療的化合物の組合せが存在するときに刺激され、前記識別するステップは、治療的効能を有するとして前記組合せを識別する、請求項８に記載の方法。
11. 前記活動電位の前記特徴によって定義された空間に、前記推定上の治療的化合物の存在下で前記刺激された神経細胞の前記活動電位をマッピングするステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記決定するステップは、前記治療的化合物の存在下での刺激された神経細胞に対するマッピングされた活動電位特徴に、前記マッピングされた活動電位特徴を合致させることを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 薬物発見のための方法であって、
    神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップと、
    試験化合物に神経を曝露させ、活動電位を発火するように前記神経を刺激するステップと、
    前記特徴が前記刺激された活動電位に存在するかどうかを決定するステップと、
    前記刺激された活動電位内の前記特徴が前記識別された特徴に合致する場合、前記神経の疾患に対する推定上の治療薬として前記試験化合物を識別するステップと、
    を含む、方法。
14. 神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップは、
    活動電位を発火するように、前記神経の疾患を有する神経細胞および健康な細胞を刺激することと、
    前記疾患細胞および前記健康な細胞の前記活動電位の特徴を識別することと、
    前記疾患細胞におよび／または前記健康な細胞に排他的な活動電位特徴を決定することと、
    を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 神経の疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップは、
    治療的化合物の存在下および治療的化合物の非存在下での活動電位を発火するように、前記神経の疾患を有する神経細胞を刺激することと、
    前記治療的化合物の存在下での異なる前記細胞の活動電位の特徴を識別することと、
    を含む、請求項１３に記載の方法。
16. 薬物発見のための方法であって、
    疾患に対する治療的効能と関連付けられた活動電位の特徴を識別するステップと、
    前記特徴のデータベースを作成するステップと、
    複数の試験化合物の特徴に関するデータを取得するステップと、
    神経の疾患に対する治療的効能を有する候補化合物を識別するために、前記取得された特徴を前記データベース内の特徴と比較するステップと、
    を含む、方法。
17. 前記活動電位特徴は、電圧対時間トレーススパイク高さ、幅、形状変化、傾き、周波数、およびタイミングのうちの１つまたは複数を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 複数の試験化合物の特徴に関する前記データは、刺激された神経細胞の前記活動電位特徴に対して各々の化合物が有する効果を含む、請求項１６に記載の方法。