JP2015524408A - 難聴を治療するためのニコチンアミドリボシド - Google Patents

Abstract

本発明は、それを必要とする哺乳動物における難聴の予防または治療方法を提供する。当該方法は、哺乳動物において細胞内NAD+を増加させる薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む。本発明は、化合物が神経保護剤として作用するかどうかを判定する方法も提供する。【選択図】図２

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２０１２年７月１６日に提出された米国仮特許出願No. 61/672,169の利益を主張するものであり、参照することにより本明細書に組み込まれる。

背景技術
騒音曝露は、世界中の難聴の主な原因である。騒音曝露後には、通常蝸牛中の有毛細胞とシナプス接合を形成するらせん神経節神経線維などの蝸牛中の多様な構造に損傷が認められる。これらのシナプスはらせん神経節が音響情報を蝸牛から脳幹中の高次構造に伝達することを可能にする。騒音曝露後、有毛細胞は、神経突起における興奮毒性損傷につながる神経伝達物質を放出し、シナプス分裂や神経突起退縮をもたらす(Kujawa, S.G. et al., J. Neuroscience, 29, 14077-14085 (2009); Lin, H.W. et al., Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 12, 605-616 (2011); Spoendlin, H., Acta Oto-Laryngologica, 79, 266-275 (1975))。中程度の騒音曝露および神経突起退縮の後には、シナプス接続や聴力を回復するいくらかの神経突起再生が認められうる (Puel, J.L. et al., Neuroreport, 9, 2109-2114 (1998))。しかし持続的騒音曝露又は激しい音響損傷は永久的な神経突起変性をもたらしうる。

したがって、騒音誘発難聴の予防及び／又は治療のための新しい方法の必要性が依然として残っている。

発明の概要
本発明は、それを必要とする哺乳動物における難聴の予防または治療方法を提供する。当該方法は、哺乳動物における細胞内NAD+を増加させる薬剤の有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、それにより哺乳動物の難聴を予防または治療する。

本発明は、また化合物が神経保護剤として作用するかどうかを判定する方法を提供する。当該方法は、（ａ）哺乳動物を提供する工程、（ｂ）哺乳動物に薬剤を投与する工程、（ｃ）哺乳動物を騒音に曝露する工程および（ｄ）哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルを判定する工程を含み、それにより化合物が神経保護剤として作用するかどうかを哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルに基づき判定する。

図の数種の見解の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｃは、代表的なＮＦ−２００株の未処理神経突起（対照）、ロテノン処理神経突起及びロテノン及びＮＡＤ＋処理神経突起をそれぞれ描写する。

図2は、未処理神経突起（対照）、ロテノン処理神経突起及びロテノン及びＮＡＤ＋処理神経突起におけるビーディング（ｂｅａｄｉｎｇ）神経突起の割合のグラフ表示である。

図３Ａ〜３Ｃは、それぞれ８０００Ｈｚ、１６，０００Ｈｚ及び３２，０００Ｈｚのトーンバーストを用いて測定した騒音曝露されたＷｌｄＳマウス及び野生型マウスにおける閾値を図示する。

図４Ａ〜４Ｃは、それぞれ８０００Ｈｚ、１６，０００Ｈｚ及び３２，０００Ｈｚのトーンバーストに曝露前、曝露後及び曝露前後にニコチンアミドリボシドで処理したいずれかのC57BL6マウス又は未処理対照C57BL6マウスのC57BL6難聴を図示する。

図５は、内有毛細胞の基底部（base）に対するらせん神経節神経突起の空間的関係の図表示である。

図６は、曝露２４時間及び２週間後のビヒクル処理した対照マウス又はいずれかのニコチンアミドリボシド処理マウスの騒音曝露マウスにおけるらせん神経節神経突起と内有毛細胞間の距離の比較グラフである。

発明の詳細な説明
本発明は、それを必要とする哺乳動物の難聴を予防又は治療する方法を提供する。当該方法は、哺乳動物における細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、それにより哺乳動物の難聴を予防または治療する。

細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤は、細胞内ＮＡＤ＋を増加させるどんな適切な薬剤でもありえる。ひとつの実施形態において、薬剤はニコチンアミドリボシドである。

難聴は、多様な環境により起こりうる。難聴は騒音曝露により起こりうる。薬剤は哺乳動物に、騒音曝露の前、騒音曝露中及び／又は騒音曝露後に投与しうる。

難聴は薬物毒性により起こりうる。ある実施形態においては、薬物毒性はゲンタマイシン又はシスプラチンを用いる哺乳動物の治療に起因する。該薬剤は、毒性薬物に曝露前、曝露中及び／又は曝露後に投与しうる。

難聴は、メニエール病に関連しうる。メニエール病は、聴力やバランスに多かれ少なかれ影響することがある内耳の障害であり、眩暈、低音域の耳鳴り及び難聴の症状の発現により特徴付けられる。メニエール病に関連する難聴は、らせん神経節ニューロンに対する興奮毒性損傷に関与することが示唆されている。

加齢に伴った難聴、突発性の原因不明の難聴、あらゆる形態の中耳炎、耳に対する気圧性外傷などの難聴の他の原因もこの薬剤によってうまく治療しうる。

蝸牛インプラントのような聴覚のインプラントは、耳の中に埋め込み型デバイスを設置している間本来の聴力を維持しようとしている。この聴力の維持は細胞内ＮＡＤ＋増加させる薬剤の適用により促進されうる。

眩暈（めまい）、耳鳴り（耳内で鳴り響く音）及び聴覚過敏（大きな音に対する感受性）などの難聴に伴う併発状態も細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤によって効果的に治療しうる。

上記実施形態のいずれにおいても、当該薬剤は、らせん神経節神経細胞、有毛細胞、支持細胞及びシュワン細胞からなる群より選ばれる１以上の細胞において細胞内ＮＡＤ＋を増加させる。ある実施形態において、当該薬剤は、細胞中の酸化的損傷を抑制する。ある実施形態において、当該薬剤は、ＳＩＲＴ３を活性化する。内因性ＳＩＲＴ３は、ミトコンドリアのマトリックス中に位置する可溶性蛋白質である。培養細胞中のＳＩＲＴ３の過剰発現は、呼吸を増加させ活性酸素種の産生を減少させる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＳＩＲＴ３の活性化は上記細胞中の酸化的損傷の抑制に関与するものと考えられる。

ある実施形態においては、当該薬剤での哺乳動物の治療は難聴の予防をもたらす。他の実施形態においては、当該薬剤での哺乳動物の治療は難聴の緩和をもたらす。

細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤はいずれの適切な方法を用いても投与することができる。例えば、細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤を経口的、注射、または中耳洞への鼓室内注射により投与することができる。

本明細書において使用している用語「有効量」は、本発明の方法で使用する時に過度の有害な副作用（毒性、刺激又はアレルギー性反応など）無しに、合理的な恩恵／リスク比に釣り合う、所望の治療的反応を生み出すのに十分な成分の量を意味する。例えば、細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の有効量は難聴症状を抑制、弱める又は逆行させるのに有効な量でありえる。具体的な有効量は、治療を受けている特定の条件、患者の身体的条件、治療を受けている哺乳動物のタイプ、治療の持続時間、併用療法の性質（もしあれば）、適用される特定の剤形、及び薬剤の構成などの要因により変化しうる。

本発明にしたがって、哺乳動物、特にヒトに投与する薬剤の投与量は、所望の反応をもたらすのに十分であるべきである。かかる反応としては、全部又は一部において難聴の回復または予防が挙げられる。当業者は、薬剤の投与量及び投与レジメンは年齢、状態、哺乳動物の体重、ならびに難聴の原因の具体的なタイプ及び哺乳動物の難聴の程度などの多様な要因により決まることは理解できるであろう。また投与量のサイズは、投与ルート、タイミング及び投与の頻度、ならびに細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の投与や所望の生理的効果に伴ういずれかの有害な副作用の存在、性質及び程度によって決められるであろう。難聴の治療は哺乳動物へ薬剤の反復投与などの長期投与が必要かもしれない。

適当な薬剤投与量及び投与レジメンは、当業者に公知の従来の範囲発見技法（range-finding technique）により決められる。一般には、治療は細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の最適な用量より少ない、より低用量から始める。その後投与量は、この条件のもと最適な効果に達すまで少しずつ増量する。本発明の方法は、典型的に、上記細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の哺乳動物の体重ｋｇあたり約０．１〜約３００ｍｇの投与を含むだろう。

細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤は哺乳動物に、単独で又は薬剤と製薬上許容し得る担体を含む医薬組成物の形態で投与することができる。

細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤は、医薬組成物として、すなわち、意図する投与形態について適切に選択され、また従来の製薬学的プラクティスと一致するような１以上の適当な製薬学的希釈剤、増量剤、賦形剤又は担体（本明細書では製薬上許容し得る担体と本明細書では総称する)と一緒の混合剤として投与しうる。医薬組成物は、いかなる適切な形態、例えば、経口、直接注射又は鼓室内投与に適する形態でありうる。担体は、固形又は液剤であってもよく、担体の種類は通常予定の投与ルートに基づいて選択される。細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤は、錠剤又はカプセル剤の形態、リポソーム、凝集粉として、もしくは液剤形態で製薬上許容し得る担体と一緒に同時投与してもよい。適当な固形担体の例としては、ラクトース、スクロース、ゼラチンおよび寒天が挙げられる。カプセル剤または錠剤は容易に製剤化することができ、嚥下または咀嚼を容易にすることができる；他の固形形態としては、顆粒、および原末などが挙げられる。錠剤は適当な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香味料、滑沢剤および溶融助剤を含んでもよい。適当な液状製剤の例としては、（ａ）水、製薬上許容し得る油脂類、アルコール類もしくは他の有機溶媒（エステルなど）での溶液又は懸濁剤、（ｂ）エマルジョン、（ｃ）シロップ、（ｄ）エリキシル剤、（ｅ）チンキ剤、懸濁剤、（ｆ）非発泡性顆粒から再構成された懸濁剤および発泡性顆粒から再構成された発泡性製剤などが挙げられる。かかる液状製剤は、例えば、適当な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味料、増粘剤及び溶融助剤を含んでもよい。経口製剤は、任意で風味材料及び着色剤を含む。非経口および静脈投与形態は予定の投与ルート、例えば急速静注（ｂｏｌｕｓ）または点滴、に適合させるためのミネラル類および他の物質を含んでもよい。注射可能な剤形は、例えば、腹腔内、皮下もしくは筋肉内投与形態が挙げられうる。いくつかの実施形態においては、細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤は、栄養補助食品、すなわち食品または飲料との混合物として投与することができる。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤を含んでも、神経突起損傷を治療するのに使用する他の化合物も含んでもよい。

本発明は、化合物が聴覚保護剤として作用するかどうかを判定する方法も提供する。該方法は、（ａ）哺乳動物を提供する工程、（ｂ）哺乳動物に薬剤を投与する工程、（ｃ）哺乳動物を騒音に曝露する工程および（ｄ）哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルを判定する工程を含み、それにより化合物が神経保護剤として作用するかどうかを哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルに基づき判定する。

化合物が聴覚保護剤として有用であるかどうかを知ることは難しいこともある。本明細書に記載するように、難聴がサーチュイン及びＮＡＤ＋感受性経路であり、ニコチンアミドリボシドが難聴、特に騒音誘発難聴から保護および該難聴を治療することを見出した。したがって、騒音誘発難聴パラダイムを使用して化合物がニューロンにおいて作用するかどうかを評価することによって化合物が難聴を予防および／または治療しうるかどうかに関して評価がされうる。もし化合物が聴覚関連細胞においてＮＡＤ＋を増加させることができれば、難聴、特に騒音誘発難聴からの保護を示し、また難聴を治療することができるであろう。

以下の実施例で本発明をさらに説明するが、もちろん、それらは本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

下記略語を本明細書において使用する：ＨＢＳＳ−／−、ハンクス液；ＤＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。

ニコチンアミドリボシドは、Yang, T. et al., J. Med.Chem. 50, 6458-6461 (2007)に既述の通り合成した。他の化学物質および試薬は下記に異なる記載以外はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。

雄性および雌性Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスをジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratories）から購入した。ＷｌｄＳ^＋／＋マウスは、マイケルコールマン博士（Dr. Michael Coleman）(バブラハムインスティチュート、ケンブリッジ大学)の親切な贈物であった。

らせん神経節ニューロン培養

分離したらせん神経節ニューロンをＰ５ラットから採取した。簡潔には、仔ラットをすばやく断頭し、蝸牛を切り離した。蝸牛軸を切り離し、３７℃で４５分分解した（０．１％トリプシン、０．１％コラゲナーゼ、ＨＢＳＳ−／−）。連続研和（Sequential trituration）を火炎研磨したピペットで行い、組織から細胞を放出させ、細胞をラミニン／ポリリシンでコーティングした２４ウエルプレートに移した。ニューロンは、培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｎ２サプリメント、１０μｇ／ｍｌインスリン、２５μｇ／ｍｌＢＤＮＦ、２５μｇ／ｍｌＮＴ３）中で一晩インキュベートした。神経突起変性を誘発するために、培養物を１０ｍＭ ＮＡＤ＋の存在下もしくは不在下で２時間ロテノン（１０μＭ）と一緒にインキュベートした。

細胞免疫組織学

らせん神経節ニューロン培養物を４％パラホルムアルデヒトで固定し、１０分間０．５％トリトンＸ−１００（登録商標）／ＰＢＳで透過処理した。洗浄後、細胞を４％ロバ血清で阻害し、４℃で一晩マウス抗ＮＦ２００（１：１０００）と一緒にインキュベートした。その後神経突起ビーディングを既述の不偏コンピュータ化プロトコル（ｕｎｂｉａｓｅｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）(Sasaki, Y. et al., J. Neuroscience, 29, 5525-5535 (2009))を使用して測定した。

蝸牛組織学/免疫組織学

マウス蝸牛をWhitlon, D.S. et al., Brain Research Protocols, 6, 159-166 (2001)に記載されたように調製した。マウス蝸牛は、迅速な断頭後側頭骨から素早く切り離した。いったん分離したら、蝸牛頂をやさしくフェネストレートし（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｅ）、蝸牛を直ちに４％パラホルムアルデヒトで固定した（４℃で一晩）。その後蝸牛を３回ＰＢＳを換えて洗浄し、脱灰溶液（１０％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ ｐＨ７．４）中で定速回転４℃で１週間インキュベートした。脱灰溶液は毎日入れ換えた。蝸牛を３回ＰＢＳを換えて洗浄してから、スクロース濃度を１０〜３０％へ徐々に上げて処理した。蝸牛を３０％スクロース中で４℃で一晩インキュベートした。蝸牛をＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中でさらに２４時間インキュベートした。最後のインキュベーションの後に、蝸牛をクリオモルド（ｃｒｙｏｍｏｌｄ）の底部に対して平行に蝸牛軸を注意深く並べながら該モルドに移し、ドライアイスで凍結した。中央の（Ｍｉｄ）蝸牛軸サンプルを１０μｍ厚さに切断し、ガラススライド（ＶＷＲ ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ（登録商標）Ｐｌｕｓ）に載せた。切片は染色する前２時間乾燥した。

スライドを５分間１．５％パラホルムアルデヒトで後固定した。スライドを洗浄後、０．５％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで１５分間インキュベートした。スライドを再び洗浄後２％ＢＳＡ／ＰＢＳで阻害した。続いて切片を製造業者の指示書に従い２０分間ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８（ファロイジン−４８８）（インビトロジェン）でインキュベートした。続いてスライドを洗浄後、４℃で一晩、１：１０００ウサギ抗ヘビー（ｈｅａｖｙ）ニューロフィランメント抗体でインキュベートした。スライドを洗浄後、室温で１時間１：１０００ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６ヤギ抗ウサギ抗体（インビトロジェン）でインキュベートした。最後の洗浄の後で、切片をＤＡＰＩ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と一緒にプロロングゴールドアンチフェイド（ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ）試薬で載せた。３色落射蛍光画像法はクールスナップ（Ｃｏｏｌｓｎａｐ）ＨＱ２カメラを伴うニコンエクリプスＴｉ（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）顕微鏡を使用して行った。

聴覚テスト

聴性脳幹反応テストを既述(Willott, J.F., Current Protocols in Neuroscience, 8.21B, B1-B12 (2005))のように行った。動物はケタミン及びキシラジン（それぞれ４０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて鎮静後試験した。聴性脳幹記録システム（インテリジェントヒアリングシステム、マイアミ（Ｍｉａｍｉ）、ＦＬ）を使用して、聴性誘発反応を誘発するために、８、１６および３２ｋＨｚで０．５ミリ秒（ｍｓｅｃ）のトーンバースト刺激を使用した。誘発反応は既述のＷｉｌｌｏｔｔのように音量が増えるに伴い高さが増える適切な時間間隔で波形を同定することによって判定した。

騒音曝露

防音室（ＭＡＣ−２、インダストリアルアコースティックカンパニー、ブロンクス、ＮＹ）に置かれたケージに動物をいれ２時間９０ｄＢオクターブ帯域に曝露した。マウスは、ケージの中を自由に動くことができた。オクターブ帯域は、トーンゲンソフトウェアー（ToneGen software）（ＮＣＨソフトウェアー、グリーンウッドビレッジ、ＣＯ）を用いて２個の下向き（down-facing）フォスターＦＴ−９６Ｈスピーカーが駆動するオーディオソース（Audiosource）Ａｍｐ１００アンプを通して発生させた。音圧レベルは、エクステック（Extech）マイクロフォン４０７７３６を使用し、０、３０、６０および９０分と音曝露の終了直前に再度確認した。

実施例１
本実施例は、らせん神経節神経炎が、以前に軸索変性を抑えることを示しているＮＡＤ制御シグナル伝達経路を有することを示す。

多様なニューロン中の軸索変性は、ＮＡＤ＋のミリモル濃度で処理することにより阻害しうる(Avery, M.A., et al., Current Biology, CB 22, 596-600 (2012))。らせん神経節神経突起もこのＮＡＤ感受性経路を有するかどうかを判定するために、後根神経節ニューロンの軸索中に軸索変性を誘導することがすでに示されているミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤(Press, C. et al., J. Neuroscience, 28, 4861-4871 (2008))であるロテインを使用して軸索変性を誘発させた。１０μＭロテノンを用いてＰ５ ＤＩＶ３ラットらせん神経節ニューロンを処理すると、神経突起ブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）の存在により測定した神経突起変性は、早ければ２時間でもたらされた。この効果は、１０ｍＭ ＮＡＤ＋でニューロンを同時に処理することにより阻害された。代表的なＮＦ−２００株の未処理神経突起（対照）、ロテノン処理神経突起、およびロテノン及びＮＡＤ＋処理神経突起をそれぞれ図１Ａ〜１Ｃに図示した。未処理神経突起（対照）、ロテノン処理神経突起、およびロテノン及びＮＡＤ＋処理神経突起におけるビーズ状に変性している（ｂｅａｄｉｎｇ）神経突起の割合を、図２にグラフで示した。これらのデータは、らせん神経節神経突起が軸索変性を抑制することがすでに示されているＮＡＤ＋制御シグナル伝達経路を有することを示唆している。

実施例２
本実施例は、内因性ＮＡＤ＋生合成経路の遺伝子による能力増強が騒音誘発難聴を回復させることを示す。ウォラー変性スロー（ＷｌｄＳ）マウスは、ＮＡＤ生合成酵素ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１およびＵｂｅ４ａの遺伝子融合の３つの繰り返しを発現する(Coleman, M.P, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9985-9990 (1998))。ＷｌｄＳは、ニューロン中に高く発現され、その発現は、軸索トランザクションの後の末端軸索フラグメントの変性を著しく遅らせる(Araki, T. et al., Science, 305, 1010-1013 (2004))。ＷｌｄＳ発現は、種々の神経変性疾患にかかりやすいマウスの疾病表現型も緩和する(Samsam, M., et al., J. Neuroscience, 23, 2833-2839 (2003); Kaneko, S. et al., J. Neuroscience, 26, 9794-9804 (2006); Sajadi, A. et al., Current Biology, CB 14, 326-330 (2004))。ＷｌｄＳは、軸索の損傷後軸索中で作用し軸索のＮＡＤ生合成を維持する(Wang, J, et al., J. Cell Biol. 170, 349-355 (2005))、そのことは典型的に内因性ＮＡＤ生合成酵素の欠損をもたらす(Gilley, J. et al., PLoS Biology, 8, e1000300 (2010))。したがって、ＷｌｄＳマウスは、ＮＡＤ生合成の増加が軸索変性過程を妨げるために使用することができるかどうかの遺伝的テストを提供する。

ＮＡＤ生合成の増加が騒音誘発難聴から保護するかどうかをテストするために、音響外傷後にトーンバースト刺激により誘発した聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を測定した。ＡＢＲは、マウスがトーンバースト刺激を聞いた時に起こる。これらの実験において、９０ｄＢオクターブ帯域の騒音曝露１２０分間により音響外傷をマウスに誘発した。難聴の程度を数値化するために、「閾値変動」を測定した。これらの変動は、ＡＢＲを誘発するのに必要な音響強度のレベルの上昇を意味する。音響刺激を検出するための閾値は、特定の周波数および音量で０．５ミリ秒（ｍｓｅｃ）のトーンバーストにマウスを曝露させることにより判定する。音響強度が増えるに伴い高さが増えることを示すＡＢＲを誘発する最小の音響強度を試験された周波数の音響閾値と規定する（Ｗｉｌｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）。一過的閾値変動（ＴＴＳ）は、騒音曝露後２４時間の一時的難聴を意味し、永久的閾値変動（ＰＴＳ）は、曝露後２週間残存する難聴を意味する。

次に、騒音曝露されたＷｌｄＳマウスにおける閾値変動を、８０００Ｈｚ、１６，０００Ｈｚおよび３２，０００Ｈｚトーンバーストを使用して測定した。野生型マウスにおいて、一過的閾値変動は、３２，０００Ｈｚで３８ｄＢであった（図３Ｃ）。１６，０００Ｈｚにおいて、２１ｄＢの閾値変動が観測された（図３Ｂ）。１０ｄＢのより小さい変動は８０００Ｈｚで記録された（図３Ａ）。これらの閾値変動は１４日間持続した。これらの閾値変動の持続はマウスが永久的な難聴を有することを示している。騒音曝露の後により高い周波数でのより顕著な難聴は、従来の研究結果と一致する(Wang, Y. et al., Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 3, 248-268 (2002))。

対照的に、ＷｌｄＳマウスは騒音誘発難聴から顕著な保護を示した。音響損傷後２４時間では、マウスは８０００および１６，０００Ｈｚでは閾値変動を示さず、３２，０００Ｈｚで１０ｄＢの弱い閾値変動を示した（図３Ａ−３Ｃ）。１４日までは、いずれの周波数においても閾値変動は見られなかった。総合すると、これらのデータは、音響損傷後の一過的および永久的な両聴覚の損失に対して著名な抵抗性を示すことを証明している。

実施例3
本実施例は、活性薬剤としてニコチンアミドリボシドを使用して、ＮＡＤ＋レベルを上昇させるための薬理学的ルートが難聴の保護をもたらすことを示す。

ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、広く認められたＮＡＤ＋の前駆体である。これらの実験において、ＮＲを組織ＮＡＤレベルを５０％増加させる用量である１０００ｍｇ／ｋｇを１日２回、騒音曝露前５日及び騒音曝露後１４日（ＮＲ前＋後）、騒音曝露前５日（ＮＲ前）、または騒音曝露後１４日（ＮＲ後）のいずれかの間、腹腔内注射で投与した。ビヒクル処理したマウスに比べて、ＮＲ処理したマウスは、ごくわずかな一過的閾値変動を２４時間に８０００Ｈｚおよび１６，０００Ｈｚ（それぞれ６および８ｄＢ）で示した。また３２，０００Ｈｚ（１６ｄＢ）においては減少した閾値変動を示した。８０００Ｈｚ、６，０００Ｈｚおよび３２，０００Ｈｚでの難聴は、表に示し、それぞれ図４Ａ〜４Ｃに図示した。マウスはすべて３周波数において永久的な難聴から同様に保護された。これらのデータは、ＮＲ処理が、顕著に騒音誘発難聴を減少させたことを示した。

実施例4
本実施例は、内有毛細胞かららせん神経節神経突起の退縮におけるニコチンアミドリボシドの効果を示す。

騒音誘発難聴は、内有毛細胞かららせん神経節神経突起の退縮に関与する。最も顕著な難聴は、最も高い聞き取れる周波数を含む聴覚スペクトルの一部においてみられるので、聴覚スペクトルのこの部分が検出される蝸牛の基底回転に着目した。蝸牛のこの部分では、騒音誘発細胞損傷が最も多い。蝸牛の免疫蛍光標識化は、らせん神経節神経突起が内有毛細胞の基底部（base）に適切な接触を形成しているかどうかを直ちに示すことができる。内有毛細胞の基底部（base）に核が存在するので、内有毛細胞の基底部（base）は核の位置により境界が画定される。騒音に曝露されていない動物においては、らせん神経節神経突起は内有毛細胞の基底部（base）に隣接して見られる。予想通りに、騒音処理した動物において、らせん神経節神経突起は、騒音曝露後２４時間で２９．５±１２．９μｍ内有毛細胞から退縮した。残った神経突起は騒音曝露後１４日で退縮した（２３±３．６μｍ）。持続的な退縮は、騒音曝露後のビヒクル処理した動物において、有毛細胞とらせん神経節神経突起の間のシナプス接続の永久的な損失を示唆している。

次に、ＮＲ処理した動物におけるらせん神経節神経突起を試験した。ＮＲ処理した動物における騒音曝露は２４時間後（４．３±４．５μｍ）及び１４日後（２．５±３．５μｍ）の両方で最少の神経突起の退縮をもたらした。内有毛細胞に対するらせん神経節神経突起の関係は図５に図表で示す。対照動物およびＮＲ処理動物の騒音に曝露後のらせん神経節神経突起と内有毛細胞の間の距離は図６にグラフを使って示す。総合すると、これらのデータは、音響外傷前後のＮＲの連続投与は騒音曝露後の難聴及び神経突起退縮を抑制することを示唆している。

本明細書で引用された刊行物、特許出願及び特許などのすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれるべく、個別に、かつ具体的に示され、本明細書にその全てが明示されたと同程度に参照により明細書中に組み込まれるものである。

本発明を記載する文脈において（特に、下記特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくともひとつ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」及び同様の語の使用は、異なるように本明細書に記載されるか、文脈において明瞭に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように理解されるべきである。１以上の項目のリストが続く用語「少なくともひとつ（例えば、「ＡおよびＢの少なくともひとつ」）の使用は、異なるように本明細書に記載されるか、文脈において明瞭に否定されなければ、列挙された項目から選択されるひとつの項目（ＡもしくはＢ）を意味する又は列挙された項目の２以上のいずれかの組み合わせ（ＡおよびＢ）を意味するように理解されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、異なるように記載されていなければ、範囲を限定しない用語（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍ）として（即ち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として理解されるべきである。本明細書で異なるように記載されていなければ、本明細書の値の範囲の記載は単に、範囲内の各個別の値に個々言及することの略記法として役立つものと意図され、各々の個別の値は、それが本明細書で個々に記載されているように、本明細書に含まれるものとする。本明細書に記載のすべての方法は、異なるように本明細書に記載されるか、文脈において明瞭に否定されなければ、如何なる適切な順序で行うことができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な用語（例えば「などの」）の使用も単に、反対の請求が無い限り、本発明をよりよく説明することのみを意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須のいずれの非請求要素を示すものとしても理解されるべきではない

本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の態様を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書に記載する。上記の記載を読むと、それらの好適な実施態様の改変が、当業者に明白となるかもしれない。本発明者らは、当業者が適宜このような改変を用いることを予期する。本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なって本発明が実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用可能な法律によって許されるように、添付の特許請求の範囲に記載した主題の全ての改変物及び均等物を含む。更に、異なるように本明細書に記載されていなければ、又は異なるように文脈によって明瞭に否定されていなければ、その全ての可能な改変中の上記の要素の任意の組合せは本発明に包含される。

Claims (19)

1. 哺乳動物の難聴を予防、緩和又は治療する方法であって、哺乳動物における細胞内ＮＡＤ＋を増加させる薬剤の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより哺乳動物の難聴を予防または治療することを含む方法。
2. 薬剤がニコチンアミドリボシドである請求項１に記載の方法。
3. 難聴が騒音曝露によるものである請求項１又は２に記載の方法。
4. 薬剤を騒音曝露の前に哺乳動物に投与する請求項３に記載の方法。
5. 薬剤を騒音曝露中に哺乳動物に投与する請求項３に記載の方法。
6. 薬剤を騒音曝露後に哺乳動物に投与する請求項３に記載の方法。
7. 難聴が、薬物毒性により起こる請求項１又は２に記載の方法。
8. 薬物毒性が、ゲンタマイシン又はシスプラチンを用いる哺乳動物の治療に起因する請求項７に記載の方法。
9. 難聴が、メニエール病に関連する請求項１又は２に記載の方法。
10. 薬剤が、らせん神経節神経細胞、内有毛細胞および外有毛細胞、支持細胞ならびにシュワン細胞からなる群より選ばれる１以上の細胞中の細胞内ＮＡＤ＋を増加させる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 薬剤が細胞中の酸化的損傷を抑制する請求項１０に記載の方法。
12. 薬剤がＳＩＲＴ３を活性化する請求項１１に記載の方法。
13. 治療が難聴の予防をもたらす請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 治療が難聴の緩和をもたらす請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
15. 薬剤を経口的、注射、または中耳洞への鼓室内注射により投与する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 哺乳動物がヒトまたはイヌである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 化合物が聴覚保護剤として作用するかどうかを判定する方法であって、（ａ）哺乳動物を提供する工程、（ｂ）哺乳動物に薬剤を投与する工程、（ｃ）哺乳動物を騒音に曝露する工程および（ｄ）哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルを判定する工程を含み、それにより化合物が神経保護剤として作用するかどうかを哺乳動物の聴覚関連細胞中のＮＡＤ＋レベルに基づき判定する方法。
18. 薬剤がニコチンアミドリボシドである請求項１７に記載の方法。
19. 哺乳動物の聴覚関連細胞中の細胞内ＮＡＤ＋レベルの増加が、化合物が聴覚保護剤として作用することを示す請求項１７又は１８に記載の方法。