JP2015514966A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、ミトコンドリア機能不全、代謝性疾患、神経性疾患および心臓病にともなう疾病の治療のための組成物に関するものである。またその新規の薬物の識別方法および治療における使用方法が提供される。
本発明は許可番号DK076685により国立保健局により与えられた米国政府援助を受けて作られている。米国政府は本発明に一定の権利を有することがある。
本発明は2012年2月16出願の米国暫定出願61/599,496、タイトル「アシル補酵素A:リソカルジオリピン アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質およびその使用方法」に対し優先権を主張し、それはここに参照としてその全てが採り入れられる。
カルジオリピン(CL)、ミトコンドリア・リン脂質は最初に心臓で同定され、正常な心臓機能の維持において中心的役割を果たしている。哺乳類では、カルジオリピン(CL)の生物学的機能は脂肪酸アシル鎖の構成により決定され、それは心臓、肝臓、および骨格筋のような代謝組織ではリノール酸(18:2)が支配的である。このユニークなアシル構成はミトコンドリア膜のプロトン勾配および種々のミトコンドリア酵素およびタンパク質の活性をサポートしていると信じられている。従って健常な哺乳類の心臓において支配的な種であるテトラリノレオイルカルジオリピン(TLCL)の減少は、拡張型心筋症の齧歯動物およびヒトの両方において、心臓疾患の発症中に起こる。カルジオリピン(CL)はホスファチジン酸から一連のステップで生合成される。新しく合成されたカルジオリピン(CL)はその脂肪酸アシル鎖にリノール酸を組み込むためにホスホリパーゼおよびアシル基転移酵素の絡んだリモデリングプロセスを経なければならない。従って欠陥のあるカルジオリピン(CL)リモデリングは、バース症候群における拡張型心筋症、カルジオリピン(CL)におけるリノール酸欠陥により特徴づけられるX染色体異常、ミトコンドリア機能不全、発育不全および好中球減少症の原因となる。さらに病理学的CLリモデリングからの異所カルジオリピン(CL)アシル構造は、すべてがミトコンドリア機能不全、カルジオリピン(CL)欠乏症、カルジオリピン(CL)におけるドコサヘキサエン酸(DHA)の高濃度化、およびミトコンドリア機能不全を特徴とする、加齢および、糖尿病、肥満、循環器疾患、および神経変性を含む加齢関連疾病における病態生理学的な状態のホストに伴うミトコンドリア機能不全という病因に関係づけられてきた。
本概要は本発明の性格と要点を簡潔に示すための発明の概要を示すために提供された。本概要は本発明の請求の範囲または意味を解釈または制限するものではないことを理解されたい。
本発明の実施形態は、なかんずく、リゾカルジオリピン、詳細にはアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能および/または活性を修飾する組成物に向けられている。詳細にはALCAT1の阻害薬は代謝性疾病、心臓疾患、ミトコンドリア機能不全に伴う一般的な疾病の治療に有用である。新規のALCAT1修飾物質の同定のための検定法が提供される。
本発明の実施形態は、なかんずく、リゾカルジオリピン、詳細にはアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能および/または活性を修飾する組成物に向けられている。詳細にはALCAT1の阻害薬は代謝性疾病、心臓疾患、ミトコンドリア機能不全に伴う一般的な疾病の治療に有用である。新規のALCAT1修飾物質の同定のための検定法が提供される。
ある実施形態ではアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:生体試料を試験薬と接触させるステップと、生体試料内のマイトフュージン分子の発現、機能または活性を測定するステップと、それによりアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質を同定するステップと、を有することを特徴とする方法が提供される。ある実施形態ではある試験薬がマイトフュージン分子の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させる場合、当該試験薬がALCAT1発現、機能または活性の阻害薬として同定される。好適にはALCAT1の発現、機能または活性が、正常なベースライン対照と比較して実質的に減少する。
他の実施形態ではMFN2の発現、機能または活性を測定するための検定法は:免疫検定法、生物検定法、バイオチップ検定法、ブロット検定法、ハイブリダイゼーション検定法、細胞ベース検定法、ハイスループットスクリーニング検定法、クロマトグラフィー、化学検定法、ファージディスプレイ検定法、またはそれらの組み合わせを含む。
もう1つの実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:生体試料を試験薬と接触させるステップと、(a)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、β−ミオシン重鎖(β−MHC)、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),または骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)からなる心筋症を示す肥大性マーカーの発現;(b)PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性;を測定するステップと、;それによりアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質を同定するステップと;を有することを特徴とする方法が提供される。
ある実施形態では、ある試験薬が心筋症を示す肥大性マーカーの発現をベースライン対照と比較して減少させる場合、当該試験薬がALCAT1発現、機能または活性の阻害薬として同定される。ある側面では、ある試験薬がPTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させる場合、当該試験薬がALCAT1発現、機能または活性の阻害薬として同定される。
他の好適な実施形態では、ミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置する方法であって、細胞または患者に治療的に有効な量の、リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素の発現、機能、活性またはそれらの組み合わせを修飾する薬剤を投与するステップと; それによりミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置するステップと;を有することを特徴とする方法が提供される。ある実施形態ではリゾカルジオリピン・アシル基転移酵素がアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)である。
他の実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)は、ミトコンドリア性ポリヌクレオチド、ミトコンドリア性ポリペプチド、ミトコンドリア性タンパク質、mtDNAコピー数、ミトコンドリアの質量、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリア融合およびmtDNA変異率、を調整する。
他の好適な実施形態では、ミトコンドリア性タンパク質は、マイトフュージン、マイトフュージン−1(MFN1)、マイトフュージン−2(MFN2)、プロヒビチン、ペプチド、フラグメント、バリアント、変異体またはそれらの組み合わせを含む。
もう1つの実施形態では、マイトフュージンは場合により、同定されないALCAT1阻害薬を含む、ここに記載の任意の方法により同定される、1つ以上のALCAT1阻害薬を投与される。
ある実施形態では、LCAT1阻害薬がマイトフュージン−2(MFN2)の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増大させる。
もう1つの実施形態では、LCAT1阻害薬が正常なベースライン対照と比較して、活性酸素種(ROS)により測定される酸化ストレスを減少させる。
他の実施形態では、LCAT1阻害薬がカルジオリピン(CL)の構造、機能、活性、発現またはそれらの組み合わせを修飾する。
ある実施形態では、LCAT1阻害薬がミトコンドリア機能不全に伴う疾病または異常を阻止または処置する。事例は制限しないが、糖尿病、肥満、心臓疾患または異常、勃起不全、閉経、神経変性性疾患または障害、代謝性疾患または障害を含む。
他の好適な実施形態では、ミトコンドリア機能不全を生体外および生体内で防止または処置する方法であって、細胞または患者に治療的に有効な量の、マイトフュージン分子を投与するステップと; それによりミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置するステップと;を有することを特徴とする方法。
もう1つの好適な実施形態では、心筋症を罹患しまたは心筋症を発症するリスクのある患者を処置する方法であって、それを必要とする患者に治療的に有効な量のアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の阻害薬を投与するステップと、それにより心筋症を罹患する患者を処置するステップと、を有することを特徴とする方法が提供される。
他の好適な実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の阻害薬がここに記載の任意の方法により同定される。
他の実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)阻害薬を含む医薬組成物がここに記載の任意の方法により同定される。
他の好適な実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:生体試料を試験薬と接触させるステップと、生体試料内のALCAT1分子の発現、機能または活性を測定するステップと、それによりアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質を同定するステップと、を有することを特徴とする方法が提供される。好適には、ある試験薬がALCAT1分子の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させる場合、当該試験薬がALCAT1発現、機能または活性の阻害薬として同定される。
ある実施形態では、ALCAT1分子は、核酸、オリゴヌクレオチド、遺伝子、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、バリアント、フラグメント、変異体、またはそれらの組み合わせ、を含む。
ある実施形態では、生体試料は、体液、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含む。
他の実施形態では、任意の分子の発現、機能または活性を測定するための検定法は:免疫検定法、生物検定法、バイオチップ検定法、ブロット検定法、ハイブリダイゼーション検定法、細胞ベース検定法、ハイスループットスクリーニング検定法、クロマトグラフィー、化学検定法、ファージディスプレイ検定法、またはそれらの組み合わせを含む。
他の側面は以下に記載される。
本発明のいくつかの側面が実施例を参照して以下で記述される。多くの特定の詳細、関係、および方法が本発明の完全な理解のために提供される。しかし当業者には1つ以上の特定の詳細が無くても本発明が実施可能であり、また他の方法でも実施可能であることが理解できよう。本発明は行為またはイベントの表示された順番に限定されない、なぜなればある行為は、他の行為またはイベントと他の順番でおよび/または同時に起こりうる。さらに表示された全ての行為またはイベントが本発明にもとづく方法を実行するのに必要なわけではない。
本発明の実施形態は示された理論的側面なしに実行可能である。さらに理論的側面は表示された理論に縛られることを出願人は希求しないという了解のもとに示されている。
ここに開示される全ての遺伝子、遺伝子名、遺伝子産物は、ここに開示される組成物および方法が適用可能な、任意の種からの相同体に相当することを意図されている。従って語彙は,限定されないが、ヒトおよびマウスからの遺伝子および遺伝子産物を含む。特定の種からの遺伝子および遺伝子産物が開示された場合、その開示は例示目的ためだけであり、文脈で明示されないかぎり、限定と解釈されるべきではない。したがって例えば、開示された遺伝子に対して、それはある実施形態では哺乳類核酸に関係し、そしてアミノ酸配列は相同性のおよび/またはオルソロガスな遺伝子におよび、遺伝子産物は他の動物からの遺伝子産物、例えば限定されないが、哺乳類、魚類、両性類、爬虫類および鳥などにおよぶ。好適な実施形態では、遺伝子または核酸配列はヒトである。
(定義)
ここに使用される語彙は特定の実施形態のためだけであり、本発明を制限するためではない。ここで使用される「1つの」「その」は、そうでないと明示される場合を除き、複数形を包含する。さらに本明細書または請求項で使用される「を含む」「有する」「備える」またはその変化形は、「からなる」と同様に包含する意味である。
ここに使用される語彙は特定の実施形態のためだけであり、本発明を制限するためではない。ここで使用される「1つの」「その」は、そうでないと明示される場合を除き、複数形を包含する。さらに本明細書または請求項で使用される「を含む」「有する」「備える」またはその変化形は、「からなる」と同様に包含する意味である。
「約」「およそ」はある特定の値に対し当業者が決める許容可能な誤差範囲にあることを意味し、誤差範囲は部分的に数値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に依存する。例えば、当業界の慣習により「約」は1またはそれ以上の標準偏差の範囲内にある。あるいは「約」は所定の数値の20%までの範囲を意味し、好適には10%、より好適には5%、さらに好適には1%の範囲を意味してよい。特に生物システムまたはプロセスでは、その言葉は桁数を意味してよく、好適にはある数値の5倍以内、より好適には2倍以内である。実施形態または請求項で特定の数値が記載された場合は、特に明示されない限り、特定の数値に対する許容可能な範囲が想定されている。
「代替的に」または「代わりに」は、その後に記載された状況が起こっても起こらなくてもよく、記載は状況が起こる場合と起こらない場合をふくむ。
「実証する」「測定する」「評価する」「検知する」「査定する」および「検定する」はここでは相互置換え可能に使用され、任意の形態の測定を意味し、ある要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語は量的および/または質的な判定を含む。「検定する」は相対的または絶対的である。「の存在を検定する」は、存在するか否かの判定のみならず、存在する何かの量を判定することも含む。
「薬剤」は疾病または他の医学的症状を防止し、緩和し、または治療する分子、化学的存在、組成物、医薬品、治療薬、化学療法薬、または生物学的薬剤を含む。この用語は小分子化合物、アンチセンス剤、siRNA剤、抗体、酵素、ペプチド、有機または無機分子、天然または合成化合物およびそれらに類するものを含む。ある薬剤は本発明の方法に従って臨床試験の任意の段階で、プレ試験の段階で、またはFDA認可の後で検定可能である。
「ALCAT1」という用語は、制限なく、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、センスおよびアンチセンス ポリヌクレオチド鎖、相補的配列、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、相同的および/またはオルソロガスなALCAT1分子、アイソフォーム、前駆体、変異体、バリアント、誘導体、スプライスバリアント、対立遺伝子、異種、およびそれらの活性フラグメントを含むことを意図している。
「フラグメント」または「バリアント」とは、長さが少なくとも380アミノ酸残基で、そしてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の1つの連続した部位に対して100%同一であるフラグメントか、または全長ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質までのフラグメントに少なくとも90%、好適には95%同一のバリアントを意味する。バリアントは、オリジナルのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも10%、25%、50%、755または90%の活性が保持されるのであれば、例えば従来定義されたような伝統的アミノ酸置換、または非伝統的置換を含んでよい。またSUMO化、リン酸化、糖鎖修飾、スプライスバリアントおよびそれらに類するもの、のような翻訳後修飾を持つALCAT1分子、フラグメントまたはバリアントが含まれ、それら全てはALCAT1機能の有効性に影響を与える。
特に明示されないかぎり、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は交換可能に使用される。しかし通常は異なるサイズのペプチド配列を意味する。
「バリアント」はポリヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、野生型遺伝子に関係するポリヌクレオチド配列に及ぶ。この定義はまた、例えば、対立遺伝子の、スプライスの、種のまたは多形性のバリアントを含んでもよい。
スプライスバリアントは参照分子に対し有意の同一性を持ち、しかしmRNAプロセス中のエクソンの交互スプライシングに起因して、通常それより大きなまたは小さな数のポリヌクレオチドを持つ。その対応するポリペプチドは追加の機能ドメインを有するか、またはドメインがない。
種バリアントは種の間で異なるポリヌクレオチド配列である。本発明で特に使用されるバリアントは、野生型遺伝子産物のバリアントである。バリアントは核酸配列における少なくとも1回の置換変異に起因し、変化したmRNAをもたらすかまたは構造または基が変化するか変化しないポリペプチドをもたらす。任意の所定の天然または組換え遺伝子はゼロ、1、または多くの対立遺伝子形態を持ってよい。バリアントを引き起こす一般的な突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然的欠乏、追加、または置換に起因する。これらのタイプの変化のそれぞれは、単独でまたは他と組み合わせて、所定の配列において1回以上発生する。
スプライスバリアントは参照分子に対し有意の同一性を持ち、しかしmRNAプロセス中のエクソンの交互スプライシングに起因して、通常それより大きなまたは小さな数のポリヌクレオチドを持つ。その対応するポリペプチドは追加の機能ドメインを有するか、またはドメインがない。
種バリアントは種の間で異なるポリヌクレオチド配列である。本発明で特に使用されるバリアントは、野生型遺伝子産物のバリアントである。バリアントは核酸配列における少なくとも1回の置換変異に起因し、変化したmRNAをもたらすかまたは構造または基が変化するか変化しないポリペプチドをもたらす。任意の所定の天然または組換え遺伝子はゼロ、1、または多くの対立遺伝子形態を持ってよい。バリアントを引き起こす一般的な突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然的欠乏、追加、または置換に起因する。これらのタイプの変化のそれぞれは、単独でまたは他と組み合わせて、所定の配列において1回以上発生する。
結果として得られるポリペプチドは通常、相互に比較して有意のアミノ酸同一性を持つ。多形性バリアントは、所定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異種である。多形性バリアントはまた「一塩基多型(SNP)」またはポリヌクレオチド配列が一塩基分変異する単一塩基変異を包含する。SNPの存在は、例えば、1つの病態に対する傾向、すなわち易罹患性vs抵抗性、を持つ一定の集団を示唆する。
「心臓疾病」とは、心筋症、肥大性心筋症、拡張型心筋症、粥状動脈硬化、冠状動脈疾患、虚血性心疾患、筋心臓炎、ウイルス感染、傷、高血圧性心疾患、心臓弁膜症、先天性心臓病、心筋梗塞、鬱血性心不全、不整脈、心臓のリモデリングに至る病気、その他を含む心臓病の任意の種類に及ぶ。 心臓の病気は、例えば、収縮性の喪失(例えば、減少した駆出分画率によって示される)のような心臓組織への損傷のような任意の理由に起因しうる。
不十分な心機能によって特徴づけられる心臓損傷または心不全は、通常心機能の任意の障害または欠如、または異常な心機能の存在を含む。異常な心機能は、病気、怪我や老化の結果でありえる。ここでは異常な心機能は、心筋細胞、心筋細胞の集団または心臓自体の形態的および/または機能的な異常を含む。形態的および機能的異常の非限定的な例は、心筋細胞の物理的劣化および/または死、心筋細胞の異常成長パターン、心筋細胞間の物理的結合の異常、心筋細胞による物質の過少生産または過剰生産、心筋細胞が通常生産する物質の生産の失敗、および異常なパターンまたは異常な時期での電気衝撃の伝達、を含む。より広範なレベルの異常は、運動異常、減少した駆出率、心エコー検査法で観察される変化(例えば、膨張)、心電図における変化、運動耐性の変化、減少した毛管潅流、および血管造影法によって観察される変化を含む。異常な心機能は例えば、虚血性心疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、高血圧性心疾患、肺心臓病(肺性心)、心臓弁膜症;例えば、リウマチ熱、僧帽弁脱出、僧帽弁輪の石灰化、カルチノイド心臓病、感染性心内膜炎、先天性心臓病;心筋疾病、例えば、心筋炎、拡張型心筋症、高血圧性心筋症、鬱血性心不全に至る心不全;および心臓腫瘍、例えば、始原肉腫と二次腫瘍、を含む。心臓損傷はまた、例えば傷、例えば、ナイフの傷;生物学的(例えばウィルス性;自己免疫疾病)または化学的(例えば、化学療法、薬);手術;移植などを含む。
「脂質異常症」は、リポタンパク質の過剰生産または過少生産を含む、脂質代謝が異常である生物学的状態を意味する。リポタンパク質が一般的に過剰生産される脂質異常症は、血液中の全コレステロール、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールとトリグリセリド濃度の上昇をもたらし、同時に高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール濃度の減少をともなう。
「脂肪肝」または「肝臓脂肪症」は、肝臓が肝臓の肝細胞の中に正常値より大きいトリグリセリドを蓄えた状態を言う。トリグリセリドは、肝細胞内の微小胞性および大胞性液胞のどちらか又は両方に含まれる。肝臓の脂質含有量が5010重量%を超えるとき、診断はなされる。脂肪肝(FLD)はアルコールの摂取と関係している場合も関係していない場合もある(Reddy氏他著、Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2006,290:G852−G858参照)。
「アルコール性脂肪肝」は被験者が平均1日20グラム超のアルコールを摂取する脂肪肝の状態を言う。アルコール性脂肪肝(AFLD)は基本的に1日約60グラム以上のアルコールを摂取するすべての個人に発症する。AFLDは短期間でも中量から大量のアルコール摂取の後に起こることがある。被験者は、太りすぎでないか太りすぎである。肝硬変は、これを含む。
「非アルコール性脂肪肝」は、被験者が平均1日20グラム未満のアルコールを摂取する脂肪肝の状態を言う。被験者は、太りすぎでないか太りすぎである。
「非アルコール性脂肪肝炎」またはNASHは、肝臓で小葉性炎症を伴う脂肪のマクロ小嚢が発生する、非アルコール性脂肪肝の進行のステージを言う。肝臓で小葉性炎症を伴う脂肪のマクロ小嚢が発生する脂肪肝炎は、アルコール性脂肪肝においても起こりうる。
「脂肪壊死」は、肝臓において小葉性炎症と気球状変性を伴う脂肪のマクロ小嚢が発生する非アルコール性脂肪肝のステージを言う。脂肪壊死のレベルからの非アルコール性脂肪肝(NAFLD)の更なる進行は、肝臓内の脂肪マクロ小嚢、炎症と気球状変性の存在に加えて、線維症の発症を含む。肝臓において小葉性炎症と気球状変性を伴う脂肪マクロ小嚢が発生し、さらに線維症が発症した脂肪壊死はアルコール性脂肪肝でも起こりうる。
「診断的」というフレーズは、病的状態の存在または性質を特定することを意味する。診断の方法は感度と無病正診率において異なる。診断検定法の「感度」は、陽性反応を示す病気にかかった個人のパーセンテージ(「本当の陽性」のパーセント)である。検定法によって検知されない罹患した個人は、「偽陰性」である。罹患しない、そして、検定法において陰性である主題は、「本当の陰性」と呼ばれる。
診断検定法の「無病正診率」は1マイナス偽陽性率である。ここで、「偽陽性」率は陽性反応を示す罹患していない個人の割合と定義される。特定の診断法が状態の決定的な診断を提供しないので、その方法が診断を補助するポジティブな徴候を提供するならば十分である。
診断検定法の「無病正診率」は1マイナス偽陽性率である。ここで、「偽陽性」率は陽性反応を示す罹患していない個人の割合と定義される。特定の診断法が状態の決定的な診断を提供しないので、その方法が診断を補助するポジティブな徴候を提供するならば十分である。
「診断する」というフレーズは病気または徴候を分類し、病気の重症度を判定し、病気進行をモニターし、病気の予後を予測し、および/または回復の見込みを予測することを意味する。「検出する」という語は、選択肢として任意の上記を含んでよい。本発明に基づく病気の診断は、被験者の生体試料の中から得られた本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの濃度の判定によって影響される可能性がある。ここで、判定されるレベルは疾病に罹患し易い素質または疾病の存在かまたは不存在と相関されてもよい。
「被験者から得られる生体試料」は、後で詳述されるように、被験者から物理的に取り除かれなかったサンプルを選択肢として含む点に留意する必要がある。
「被験者から得られる生体試料」は、後で詳述されるように、被験者から物理的に取り除かれなかったサンプルを選択肢として含む点に留意する必要がある。
「処置」は、進展を防止する、または、障害の病理または徴候を変える意図での干渉である。したがって、「処置」は治療的な処置と予防または防止処置の両方を意味する。「処置」は、緩和療法として特定されてもよい。処置が必要な被験者は、すでに障害を有する被験者のみならず、障害が防止されるべき被験者も含む。
腫瘍(例えば、ガン)治療において、治療剤は直接腫瘍細胞の病理を減少させるかもしれないか、他の治療剤(例えば、放射線や化学療法)による処置に対し、腫瘍細胞をより感受性にする可能性がある。したがって、病状、障害または状態の「処置する」または「処置」は、以下を含む:(1)病状、障害または状態に罹患するか、罹患し易い素質を持つが、まだ病状、障害または状態の臨床的または準臨床的兆候を経験または示さないヒトまたは他の哺乳類において発現する病状、障害または状態の臨床的兆候の発現を防止するか、遅らせる;(2)病状、障害または状態を抑制する、すなわち、病気の進展または再発(維持治療の場合)または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候を停止し、減少させ、または遅らせる;または(3)疾病の軽減、すなわち、病状、障害または状態または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候の退縮をおこさせる。処置される個人への利益は、統計的に有意であるか、少なくとも患者または医者に認識できるか、のいずれかである。
腫瘍(例えば、ガン)治療において、治療剤は直接腫瘍細胞の病理を減少させるかもしれないか、他の治療剤(例えば、放射線や化学療法)による処置に対し、腫瘍細胞をより感受性にする可能性がある。したがって、病状、障害または状態の「処置する」または「処置」は、以下を含む:(1)病状、障害または状態に罹患するか、罹患し易い素質を持つが、まだ病状、障害または状態の臨床的または準臨床的兆候を経験または示さないヒトまたは他の哺乳類において発現する病状、障害または状態の臨床的兆候の発現を防止するか、遅らせる;(2)病状、障害または状態を抑制する、すなわち、病気の進展または再発(維持治療の場合)または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候を停止し、減少させ、または遅らせる;または(3)疾病の軽減、すなわち、病状、障害または状態または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候の退縮をおこさせる。処置される個人への利益は、統計的に有意であるか、少なくとも患者または医者に認識できるか、のいずれかである。
化合物の「治療的に効果がある」量(すなわち、有効薬量)とは、治療的に(例えば、臨床的に)所望の結果を生成するのに十分な量を言う。組成物は、1日につき1回以上から1週につき1回以上投与されてよい;1日おきに1回を含む。効果的に被験者を処置するために特定の要因が投薬量およびタイミングに影響する可能性があり、その要因には、限定されないが、病気または障害(前の処置)の重症度、以前の処置、一般的健康状態、および/または年齢、および現在罹患している他の疾病を含む、ことを当業者は理解しよう。さらに、本発明の治療的に効果的な量の化合物による被験者の処置は、一回の処置または一連の処置を含む。
「予防的に効果的な量」は患者において代謝性疾病または障害の再発または拡大、または発生を防止するのに十分な薬剤の量を意味してもよい、ここで患者には限定されないが、代謝性疾病に罹患し易い患者、例えば遺伝子的に罹患し易い、または以前にアルコールのような環境要因に暴露されていた患者を含む。「予防的に効果的な量」はまた、疾病の防止において予防的利益を提供する予防薬の量を意味してもよい。さらに本発明の薬剤に関する「予防的に効果的な量」は、疾病の防止に予防的利益を提供する薬剤単独の量、または他の薬剤と組み合わせた量を意味してもよい。
「予防的に効果的な量」は患者において代謝性疾病または障害の再発または拡大、または発生を防止するのに十分な薬剤の量を意味してもよい、ここで患者には限定されないが、代謝性疾病に罹患し易い患者、例えば遺伝子的に罹患し易い、または以前にアルコールのような環境要因に暴露されていた患者を含む。「予防的に効果的な量」はまた、疾病の防止において予防的利益を提供する予防薬の量を意味してもよい。さらに本発明の薬剤に関する「予防的に効果的な量」は、疾病の防止に予防的利益を提供する薬剤単独の量、または他の薬剤と組み合わせた量を意味してもよい。
「サンプル」という語は、その最も広義な解釈を意味している。「サンプル」は例えば、一つ以上の細胞、組織または体液(限定されないが、個人または細胞培養構成物から単離された、プラズマ、血清、全血、脳脊髄液、リンパ、涙、尿、唾液、ミルク、膿と組織滲出液と分泌物)のような生体試料、および例えば実験室プロセスから得られたサンプルを意味する。生体試料は細胞から単離された染色体(例えば、分裂中期染色体のスプレッド)、細胞、細胞全体または組織から単離された細胞小器官または膜、溶液内のまたはノーザン分析用のような固体支持体に結合した、ゲノムDNAのような核酸、溶液内のまたはノーザン分析用のような固体支持体に結合したRNA、溶液内のまたは固体支持体に結合したcDNA,溶液内のまたは固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド,溶液内のまたは固体支持体に結合したcDNA,溶液内のまたは固体支持体に結合したペプチドまたはポリペプチド、組織、組織プリント、およびそれらに類するもの、を含んでよい。
多数の周知の組織または体液収集方法が、被験体における目的の変異体のDNA、RNAおよび/またはポリペプチドのレベルを決定するために、被験体由来の生体試料を収集するために利用可能である。例としては、限定されないが、細針生検、針生検、コア針生検および外科生検(例えば、脳生検)、および洗浄を含む。使用手順に関わりなく、生検/試料が得られると変異体のレベルを判定でき、したがって診断が可能となる。
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、組換えDNA、免疫学、細胞生物学、および当技術分野の他の関連技術が使用されてよい。例えば、Sambrookら編、(2001)分子クローニング:実験室マニュアル。第3版。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス:コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク; Sambrookら編、(1989)分子クローニング:実験室マニュアル。第2版。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス:コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク;Ausubelら編、(2005)分子生物学の最新プロトコル。ジョン・ワイリー・アンド・サンズ株式会社:ホーボーケン、ニュージャージー州; Bonifacinoら編、(2005)細胞生物学におけるカレント・プロトコル。ジョン・ワイリー・アンド・サンズ株式会社:ホーボーケン、ニュージャージー州;コリガンら編。(2005)免疫学におけるカレント・プロトコル、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社:ホーボーケン、ニュージャージー州;Coicoら編。(2005)微生物学におけるカレント・プロトコル、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社:ホーボーケン、ニュージャージー州;コリガンら編。(2005)タンパク質科学におけるカレント・プロトコル、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社:ホーボーケン、ニュージャージー州;エンナら編。(2005)薬理学におけるカレント・プロトコル、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ株式会社:ホーボーケン、ニュージャージー州;Hamesら編。(1999)タンパク質発現:実践的アプローチ。オックスフォード大学プレス:オックスフォード;フレッシュニー編(2000)動物細胞の培養:基本技術のマニュアル、第4版。ワイリー・リス編。;をとりわけ参照。上記にリストアップされたもののカレント・プロトコルは、年に数回更新される。
(ALCATlの組成および修飾物質)
好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つの阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つまたはそれ以上の用量濃度の複数の阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害剤と少なくとも1つの他の治療剤を含む。例えば、第二の治療剤は、特定の兆候を治療するものであってもよい。別の例では、薬剤は、例えば、異常な細胞増殖のような疾患の別の態様を標的とする。この場合、薬剤は、癌患者の治療に使用される化学療法剤であろう。
好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つの阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つまたはそれ以上の用量濃度の複数の阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害剤と少なくとも1つの他の治療剤を含む。例えば、第二の治療剤は、特定の兆候を治療するものであってもよい。別の例では、薬剤は、例えば、異常な細胞増殖のような疾患の別の態様を標的とする。この場合、薬剤は、癌患者の治療に使用される化学療法剤であろう。
マイトフュージン−2(MFN2)はミトコンドリアの統合、融合、代謝および小胞体(ER)との繋留に必要とされるミトコンドリア タンパク質をコードする。ヒトにおけるMFN2の変異は、末梢神経障害およびシャルコー・マリー・ツース病の原因となる。MFN2欠乏は、肥満および2型糖尿病に伴うミトコンドリア機能不全に関与している。筋肉のMFN2の発現は、2型糖尿病患者において減少される。MFN2の発現は、肥満と負に相関し、インスリン感受性と正相関する。2型糖尿病における肥満外科手術によるインスリン抵抗性の改善は、筋肉においてMFN2の発現を増加させる。同様に、インスリン感受性を改善することが知られている適度な運動は、MFN2発現およびミトコンドリア生合成を有意に増加させる。さらに、マウス骨格筋におけるMFN2の標的化欠失は、mtDNAの不安定性および高い変異率の原因となり、激しいmtDNAの枯渇につながる。
カルジオリピン(CL)は酸化的リン酸化のために必要な重要なミトコンドリアのリン脂質である。CLは、リノール酸の豊富な含有量とミトコンドリア内膜のROS産生の場所近くの位置に起因して、活性酸化種(ROS)によるCL二重結合の酸化的損傷、CL過酸化として知られているプロセス、に高い感受性を示す。CLは、アポトーシスにおいて初期の酸化を受けるミトコンドリアで唯一のリン脂質であり、その酸化はサイトゾルへのシトクロムcの放出を誘発し、それはアポトーシス性消耗につながる。したがって、病理学的リモデリングからの異常なCLアシル組成は、一般に、糖尿病、肥満、心血管疾患、神経疾患、癌、老化、および他の年齢関連疾患(クレイプールSM&ケーラーCM編(2012)健康と病気におけるカルジオリピンの複雑さ、Trends Biochem Sci.Jan;37(1):32−41)に伴うミトコンドリア機能不全の病因に関係づけられてきた。
ALCAT1は、ROS産生、ミトコンドリア機能障害、およびインスリン抵抗性につながる、糖尿病、肥満症、および心筋症における酸化ストレスに応答して、CLの病理学的リモデリングを触媒することが最近確認されたリゾカルジオリピン・アシル基転移酵素である。アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)によるCLリモデリングはまたCLアシル組成の変化をもたらし、それは、CL欠乏、CLにおけるリノール酸の枯渇およびドコサヘキサエン酸(DHA)含有量の豊富化などを含む、加齢に伴う疾患を彷彿とさせる。
ALCATlの標的不活化は食事性肥満およびその関連する代謝合併症の発症を防ぐ。
ALCATlの標的不活化は食事性肥満およびその関連する代謝合併症の発症を防ぐ。
好ましい実施形態において、組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つの修飾物質を含む。好ましくは、その修飾物質はALCATlの発現、機能および/または活性を阻害する。
別の好ましい実施形態において、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の修飾物質を含む組成物は、患者におけるミトコンドリア機能不全を防止または処置するために使用される。患者におけるミトコンドリア機能不全は、代謝疾患または代謝障害に伴う。例としては、限定されないが:糖尿病、脂肪肝、不妊症、神経変性疾患、神経炎症性疾患、肥満、癌、自己免疫疾患、脳障害、腎疾患、肝疾患、心疾患、筋肉疾患、勃起不全、閉経、代謝性疾患または障害、加齢関連疾患、などを含む。
別の好ましい実施形態において、ミトコンドリア機能不全をインビトロまたはインビボで防止または処置する方法は、細胞または患者に、リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素の発現、活性、機能またはそれらの組み合わせを修飾する薬剤を、治療有効量だけ投与することを含む。好適には、リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素はアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)である。
別の好ましい実施形態では、ALCATlの修飾物質は:ミトコンドリアのポリヌクレオチド、ミトコンドリアのポリペプチド、ミトコンドリアのタンパク質、mtDNAのコピー数;ミトコンドリアの質量;ミトコンドリアの形態;ミトコンドリア融合、およびmtDNA変異率を調節する。好ましくは、ミトコンドリアのタンパク質は、マイトフュージン、マイトフュージン−1(MFN1)、マイトフュージン−2(MFN2)、そのプロヒビチン、ペプチド、フラグメント、バリアント、変異体またはそれらの組み合わせを含む。
ある実施形態では、マイトフュージン分子は必要に応じて、1つ以上のALCATl阻害剤と共に患者に投与される。ここでALCAT1の阻害剤は、ベースライン対照と比較してMFN2の発現、機能または活性を増大させる。別の実施形態では、ALCATlの阻害剤は、正常なベースライン対照と比較して、活性酸素種(ROS)により測定される酸化ストレスを減少させる。他の好適な実施形態では、ALCATlの阻害剤は、カルジオリピン(CL)の構造、機能、活性、発現またはこれらの組み合わせを修飾する。
別の好ましい実施形態では、インビトロまたはインビボでミトコンドリア機能不全を防止または処置する方法は、細胞または患者へマイトフュージン分子の治療的有効量を投与することを含む。好ましい実施形態において、マイトフュージン分子は:マイトフュージン−1(MFN1)、マイトフュージン−2(MFN2)、それらのフラグメント、バリアント、変異体、またはそれらの組み合わせを含む。好ましくは、マイトフュージンは、MFN2である。
ある実施形態ではアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害薬は、必要に応じて、細胞又は患者に投与される。好ましい実施形態において、ALCATlの阻害薬は、ベースライン対照と比較して、MFN2の活性、発現または機能を増加させる。ALCATlの阻害薬の有効性の他の測定は、活性酸素種(ROS)により測定される酸化ストレスを測定し、そして正常なベースライン対照と比較することを含む。別の好ましい実施形態では、ALCATlの阻害剤は、カルジオリピン(CL)の構造、機能、活性、発現、またはそれらの組み合わせを修飾する。
心臓機能障害、神経変性およびその他の疾患:
増加した酸化ストレスは心臓の肥大と機能不全に関与していると思われる。酸化ストレスの減衰は、左室のリモデリングと機能障害を防ぐことができる。酸化ストレスは、心筋症および心機能不全の病因に関連付けられてきたミトコンドリアの機能障害およびインスリン抵抗性の主要な原因因子であると考えられている。すべてのリン脂質の中でも、豊富な多価不飽和脂肪酸における含有量とROS産生部位の近くの位置に起因して、CLは反応性酸素種(ROS)によるCLの二重結合の酸化的損傷、それは脂質過酸化反応として知られているが、に非常に敏感である。したがって、CLはアポトーシスの間に早期に酸化を受ける、ミトコンドリアにおける唯一のリン脂質である。CL過酸化の根底にある分子メカニズムは未解明のままであるが、増加したDHAはCLを酸化的損傷に高感度にし、それは脂質過酸化およびミトコンドリア機能障害の悪循環をもたらすことが示されている。その結果、DHA含有量はCL欠乏と同時に高齢者の心臓において増大する。心筋細胞の虚血再灌流障害は、CLの過酸化を引き起こし、それはチトクロームcオキシダーゼ活性の有意な減少につながり、それは外部から追加されたCLによってのみ回復し、他のリン脂質または過酸化CLによっては回復しない。詳細には、ヒトにおける甲状腺機能亢進症の発症は、高レベルの酸化ストレスおよびCLの過酸化と関連し、それは甲状腺機能正常によって軽減することができる。甲状腺機能亢進症はげっ歯類においてCLリモデリングを刺激し、それは多価不飽和脂肪酸と過酸化可能指数の有意な増加をもたらす。
増加した酸化ストレスは心臓の肥大と機能不全に関与していると思われる。酸化ストレスの減衰は、左室のリモデリングと機能障害を防ぐことができる。酸化ストレスは、心筋症および心機能不全の病因に関連付けられてきたミトコンドリアの機能障害およびインスリン抵抗性の主要な原因因子であると考えられている。すべてのリン脂質の中でも、豊富な多価不飽和脂肪酸における含有量とROS産生部位の近くの位置に起因して、CLは反応性酸素種(ROS)によるCLの二重結合の酸化的損傷、それは脂質過酸化反応として知られているが、に非常に敏感である。したがって、CLはアポトーシスの間に早期に酸化を受ける、ミトコンドリアにおける唯一のリン脂質である。CL過酸化の根底にある分子メカニズムは未解明のままであるが、増加したDHAはCLを酸化的損傷に高感度にし、それは脂質過酸化およびミトコンドリア機能障害の悪循環をもたらすことが示されている。その結果、DHA含有量はCL欠乏と同時に高齢者の心臓において増大する。心筋細胞の虚血再灌流障害は、CLの過酸化を引き起こし、それはチトクロームcオキシダーゼ活性の有意な減少につながり、それは外部から追加されたCLによってのみ回復し、他のリン脂質または過酸化CLによっては回復しない。詳細には、ヒトにおける甲状腺機能亢進症の発症は、高レベルの酸化ストレスおよびCLの過酸化と関連し、それは甲状腺機能正常によって軽減することができる。甲状腺機能亢進症はげっ歯類においてCLリモデリングを刺激し、それは多価不飽和脂肪酸と過酸化可能指数の有意な増加をもたらす。
上述したように、ALCATlは、糖尿病、肥満症、および心筋症における酸化ストレスに応答してCLの病理学的リモデリングを触媒し、それはROS産生、ミトコンドリア機能障害、およびインスリン抵抗性につながる。ALCATlによるCLのリモデリングはまた、心臓疾患を連想させる、アシル組成を有するCLの生成に繋がり、それはTLCLの欠乏とDHAの富化を含む。本明細書の結果は、酸化ストレスと心機能障害の病因における酵素ALCAT1の役割を証明する。
好ましい実施形態では、心筋症罹患または心筋症のリスクにさらされる患者を治療する方法は、それを必要とする患者に、治療的有効量のアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害剤を投与することを含む。
別の好ましい実施形態では、心筋症罹患または心筋症のリスクにさらされる患者は正常で健康な対照と比較して、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)が欠乏している。好ましい実施形態では、ALCATlの阻害剤は、それがベースライン対照と比較して、増加したPINKの発現、機能または活性の結果を示した場合に、ALCATlの阻害剤として同定される。
好ましい実施形態では、心筋症罹患または心筋症のリスクにさらされる患者は、:BNP、β−MHC、ANFまたはACTA1からなる肥大マーカーを発現する。実施形態では、ALCATl阻害剤は、1つ以上のこれらのマーカーの発現をベースライン対照と比較して修飾する。
いくつかの実施形態では、心筋症罹患または心筋症のリスクにさらされる患者を処置する方法は、治療計画の一部として、それを必要とする患者に心筋症、障害またはそれらの症状を治療するための1つ以上の治療化合物を投与することを含む。
別の実施形態では、神経疾患または障害に罹患している患者を治療または予防する方法は、治療的有効量の1種類以上のALCAT1修飾物質を患者に投与することを含む。神経学的疾患または障害は、神経系および/または視覚系の任意の障害を指す。「神経障害」は、中枢神経系(脳、脳幹および小脳)、末梢神経系(脳神経を含む)、および自律神経系(そのうちの一部は中枢および末梢神経系の両方に位置している)が関与する障害を含む。神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症等を含む。
以下、本発明による組成物および方法を用いて処置可能ないくつかの神経疾患、症状、徴候および症候群の一覧である:後天性てんかん様失語症;急性散在性脳脊髄炎;副腎白質ジストロフィー;加齢関連黄斑変性;脳梁無形成;失認;アイカルディ症候群;アレキサンダー病;アルパーズ病;交互性片麻痺;アルツハイマー病;血管性認知症;筋萎縮性側索硬化症;無脳症;アンジェルマン症候群;血管腫症;無酸素症;失語症;失行;くも膜嚢胞;くも膜炎;Anronl−キアリ奇形;動静脈奇形;アスペルガー症候群; 血管拡張性失調症;注意欠陥多動性障害;自閉症;自律神経機能障害;背中の痛み;バッテン病;ベーチェット病;ベル麻痺;良性本質的眼瞼けいれん;良性焦点;筋萎縮症;良性頭蓋内圧亢進症;ビンスヴァンガー病;眼瞼けいれん;ブロッホ‐サルズバーガー症候群;腕神経叢損傷;脳膿瘍;脳損傷; 脳腫瘍(多形性膠芽腫を含む)は、;脊髄腫瘍;ブラウンセカール症候群;カナバン病;手根管症候群;灼熱;中枢性疼痛症候群;橋中央ミエリン溶解;頭部障害;脳動脈瘤;脳動脈硬化症;脳萎縮;脳性巨人症;脳性麻痺;シャルコー・マリー・トゥース病;化学療法誘発性神経障害および神経障害性疼痛;キアリ奇形;舞踏病;慢性炎症性脱髄性多発神経障害;慢性疼痛; 慢性局所疼痛症候群;コフィンローリー症候群;遷延性植物状態を含む昏睡;先天性顔面両側麻痺;大脳皮質基底変性;頭蓋動脈炎;頭蓋骨癒合症;クロイツフェルト・ヤコブ病;蓄積外傷疾患;クッシング症候群;サイトメガロ封入体病;サイトメガロウイルス感染;ダンス目ダンスの足症候群;ダンディ・ウォーカー症候群;ドーソン病;DeMorsier症候群;デジェリン−クルンプケ麻痺;認知症;皮膚筋炎;糖尿病性神経障害;びまん性硬化症;自律神経障害;書字障害;失読症;ジストニア;早期乳児てんかん性脳症;エンプティセラ症候群;脳炎;脳ヘルニア;脳三叉神経領域血管腫症;てんかん;エルブ麻痺;本態性振戦;ファブリー病;ファール症候群;失神;家族性痙性麻痺;熱性けいれん;フィッシャー症候群;フリードライヒ失調症;前頭側頭型認知症および他の「タウオパチー」;ゴーシェ病;ゲルストマン症候群;巨細胞性動脈炎;巨細胞性封入体病;グロボイド細胞白質ジストロフィー;ギラン・バレー症候群;HTLV−1−関連脊髄症;ハレルフォルデン・スパッツ病;頭部外傷;頭痛;片側顔面痙攣;遺伝性痙性対麻痺;遺伝性多発神経炎性失調;耳ヘルペス;帯状疱疹;平山症候群;HIV関連認知症および神経障害(AIDSの神経学的症状も);全前脳症;ハンチントン病及び他のポリグルタミンリピート疾患; 水無脳症;水頭症;副腎皮質ホルモン過剰症;低酸素症;免疫介在性脳脊髄炎;封入体筋炎;色素失調症;乳児フィタン酸蓄積症;乳児レフサム病;乳児痙攣;炎症性筋疾患;頭蓋内嚢胞;頭蓋内圧亢進;ジュベール症候群;カーンズ−セイヤー症候群;ケネディ病キンスボーン症候群;クリッペル・ファイル症候群;クラッベ病;クーゲルベルク・ヴェランダー病;クールー;ラフォラ病;ランバート・イートン筋無力症候群;ランドウ・クレフナー症候群;延髄外側(バレンベリー)症候群;学習障害;リー病;レノックス・ガストー症候群;レッシュ・ナイハン症候群;白質ジストロフィー;レビー小体型認知症;脳回欠損;ロックイン症候群;ルー・ゲーリック病(すなわち、運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症);腰椎椎間板疾患;ライム病−神経学的後遺症;マシャド・ジョセフ病;小脳髄症;巨大脳髄症;メルカーソン−ローゼンタール症候群;メニエール病;髄膜炎;メンケス病;異染性白質ジストロフィー;小頭症;片頭痛;ミラーフィッシャー症候群;ミニストローク;ミトコンドリア性筋症;メビウス症候群;単量体筋萎縮症;運動ニューロン疾患;モヤモヤ病;ムコ多糖症;多発脳梗塞性認知症;多巣性運動ニューロパチー;多発性硬化症および他の脱髄性疾患;起立性低血圧と多系統萎縮症;P筋ジストロフィー;重症筋無力症;ミエリン破壊性拡散硬化症;乳児ミオクローヌス脳症;ミオクローヌス;筋症;先天性筋緊張症;ナルコレプシー;神経線維腫症;神経遮断薬悪性症候群; AIDSの神経学的症状;狼瘡の神経学的後遺症;神経性筋緊張病;神経セロイドリポフスチン症;ニューロン遊走障害;ニーマン・ピック病;オサリバン・マクラウド症候群;後頭神経痛;オカルト脊椎癒合不全配列;大田原症候群;オリーブ橋小脳萎縮症;眼球クローヌスミオクローヌス;視神経炎;起立性低血圧;酷使症候群;知覚異常;パーキンソン病;先天性パラミオトニア;腫瘍随伴疾患;発作性発作;パリーロンバーグ症候群;ペリツェウス・メルツバッハー病;周期性麻痺;末梢神経障害;痛みを伴う神経障害および神経障害性疼痛;遷延性植物状態;広汎性発達障害;光くしゃみ反射;フィタン酸蓄積症;ピック病;ピンチ神経;下垂体腫瘍;多発性筋炎;孔脳;ポリオ後症候群;帯状疱疹後神経痛;感染後脳脊髄炎;起立性低血圧;プラダー・ウィリー症候群;原発性側索硬化症;プリオン病;進行性片側顔面萎縮;進行性多巣性白質脳症;進行性硬化性ポリオジストロフィー;進行性核上性麻痺;偽脳腫瘍;ラムゼイ・ハント症候群(I型およびII型);ラスムッセン脳炎;交感神経性ジストロフィー症候群。レフサム病;反復運動障害;反復性ストレス障害;下肢静止不能症候群;レトロウイルス関連脊髄症;レット症候群;ライ症候群;聖ヴィートのダンス;サンドホフ病;シルダー病;裂脳症; 中隔視神経異形成症;揺さぶられっ子症候群;帯状疱疹;シャイ・ドレーガー症候群;シェーグレン症候群;睡眠時無呼吸;ソト症候群;痙縮;二分脊椎;脊髄損傷;脊髄腫瘍;脊髄性筋萎縮症;スティッフ・パーソン症候群;脳卒中;スタージ・ウェーバー症候群;亜急性硬化性全脳炎;皮質下動脈硬化性脳症;シデナム舞踏病;失神;脊髄空洞症;遅発性ジスキネジー;テイ・サックス病;側頭動脈炎;繋留脊髄症候群;トムセン病;胸郭出口症候群;疼痛性チック;トッドの麻痺;トゥレット症候群;一過性脳虚血発作;伝染性海綿状脳症;横断性脊髄炎;外傷性脳損傷;振戦;三叉神経痛;熱帯性痙性対麻痺;結節性硬化症;血管性認知症(多発梗塞性認知症);側頭動脈炎を含む血管炎;フォン・ヒッペル・リンドウ病;ヴァレンベルク症候群;ウェルドニッヒホフマン病;ウェスト症候群;むち打ち症;ウィリアムズ症候群;ウィルソン病;およびツェルヴェーガー症候群。
別の好ましい実施形態では、ALCAT1修飾物質の投与が、自己免疫疾患を患っている患者を防止または処置する。自己免疫疾患の例には、以下を含む:慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患(IBDs)、ここに炎症性腸疾患(IBDs)は多因性易罹患性の慢性炎症状態であるクローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)を含む。
別の好ましい実施形態では、ALCAT1修飾物質の投与が糖尿病性腎症および関連障害に罹患している患者を防止または処置する。そのような障害の例は、糖尿病性心臓線維症である。他の例としては、精巣における糖尿病誘発アポトーシスおよびヌアージュ形成である。
別の好ましい実施形態では、ALCAT1は、代謝性疾患またはミトコンドリア機能障害に関連する任意の疾患または障害に対する、疾患の進行または予後もしくは応答または耐性についての予後徴候マーカーである。
ALCATl修飾物質:
好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の修飾物質を同定する方法は、試験薬剤と生体試料を接触させるステップと、および生体試料中のマイトフュージン分子の発現、機能または活性を測定するステップとを有する。好ましい実施形態において、試験薬剤が、マイトフュージン分子、例えばMFN2の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増大させる場合、試験薬剤はALCATlの阻害剤として同定される。
好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の修飾物質を同定する方法は、試験薬剤と生体試料を接触させるステップと、および生体試料中のマイトフュージン分子の発現、機能または活性を測定するステップとを有する。好ましい実施形態において、試験薬剤が、マイトフュージン分子、例えばMFN2の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増大させる場合、試験薬剤はALCATlの阻害剤として同定される。
別の好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の修飾物質を同定する方法は、試験薬と生体試料を接触させるステップと、心筋症を示す以下の肥大マーカーの発現を測定するステップを含む:BNP、β−MHC、ANFまたはACTA1。好ましい実施形態では、試験薬剤が心筋症を示す肥大マーカーの発現をベースライン対照と比較して減少させる場合、その試験剤はALCATlの阻害剤として同定される。
別の好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法は、試験剤と生体試料を接触させるステップと;糖尿病性腎症を示す以下の核酸マーカーまたはそのコードされた産物の発現を測定するステップとを有する:FAS、TNF、TGF−β、DGATl、CHREBP1、またはSREBPl。好ましい実施形態では、試験薬剤がFAS、TNF、TGF−β、DGATl、およびSREBPlの発現をベースライン対照と比較して修飾する場合、その試験剤はALCATlの阻害剤として同定される。
別の好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法は、試験剤と生体試料を接触させるステップと;脂肪肝疾患を示す以下の核酸マーカーまたはそのコードされた産物の発現を測定するステップとを有する:PPARα、Srebplc、FAS、ACC1、DGATl、またはCPTlα。好ましい実施形態において、試験薬剤がPPARα、Srebplc、FAS、ACCl、DGATl、またはCPTlαの発現をベースライン対照と比較して修飾する場合、その試験剤は、ALCATlの阻害剤として同定される。
脂肪肝疾患の例としては、NAFLD、アラジール症候群、α−1−アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、慢性肝炎、肝癌、肝硬変、肝嚢胞、脂肪肝、ガラクトース血症、ギルバート症候群、原発性胆汁性肝硬変、肝炎A、肝炎B、肝炎C、原発性硬化性胆管炎、ライ症候群、サルコイドーシス、チロシン血症、糖原病I型、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、および新生児肝炎を含む。
他の好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の発現、機能または活性の修飾物質は本明細書に示される実施形態により同定される。
他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ここで実施された方法によって同定されたアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害剤を含む。
生体試料は、患者例えば細胞、体液などから得ることができる。その試料はまた、合成された、例えばペプチド、オリゴヌクレオチド等でありうる。その試料はまた形質転換細胞、所望の分子を発現するベクターを形質導入された細胞であってもよい。したがって実施形態では、生体試料は:体液、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含む。
多種多様な薬がALCATlおよび関連する分子を標的とするために使用可能である。例えば、関連する分子は、ALCATlのメカニズムに関与する任意の分子であり得、また、経路の上流または下流でよい。例えば、薬剤は、例えばcDNAまたは調節領域に基づいて、アンチセンス阻害剤およびリボザイムのようなDNAベース薬剤を使用して、分子を調節することができ、それらはRNAレベルにおいてのみならず、標的分子の遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を標的とするために使用できる。
あるいは、薬剤は、標的分子の三次元タンパク質構造を含むアミノ酸配列に基づいて分子を標的とすることができる。例えば、ヒト抗体、非ヒトモノクローナル抗体およびヒト化抗体などのタンパク質ベースの薬剤を、ALCAT1上の異なるエピトープを特異的に標的とするために使用することができる。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えばALCATl発現を阻害する、ALCATlのプロモーター部位に特異的に結合するための高親和性阻害剤として機能することができる。薬剤は、適している薬剤を同定するための所望の結果を用いて、例えば、MFN2、肥大マーカーまたはPTEN誘導性推定上キナーゼ1(PiNKl)発現を修飾する薬剤を用いて、さまざまな手段により識別することができる。また、ALCATl発現、機能または活性は、当技術分野で公知の任意の検定法によって判定することができる。詳細はまた、下記の実施例の節に記載されている。
標識化分子:
別の好ましい実施形態では、ALCATl分子、ALCATl修飾物質等は、放射性の標識化をすることができる。用途には、診断および予後目的のための治療およびイメージングが含まれる。標識は、放射性原子、酵素又は発色団基であってもよい。抗体を標識するための方法は、例えば、ハンターとグリーンウッド著、ネイチャー、144:945(1962)およびデビッドら著、生化学13:1014−1021(1974)に記載されている。抗体を標識するためのさらなる方法は、米国特許第3,940,475と3,645,090に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブを標識化するための方法は、例えばリアリーら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:4045;レンツとクルツ著、Nucl.Acids Res.(1984)12:3435;リチャードソンとグムポート著、Nucl.Acids Res.(1983)11:6167;スミスら著、Nucl.Acids Res.(1985)13:2399;および Meinkothおよびウォール著、Anal.Biochem.(1984)138:267に記載されている。
別の好ましい実施形態では、ALCATl分子、ALCATl修飾物質等は、放射性の標識化をすることができる。用途には、診断および予後目的のための治療およびイメージングが含まれる。標識は、放射性原子、酵素又は発色団基であってもよい。抗体を標識するための方法は、例えば、ハンターとグリーンウッド著、ネイチャー、144:945(1962)およびデビッドら著、生化学13:1014−1021(1974)に記載されている。抗体を標識するためのさらなる方法は、米国特許第3,940,475と3,645,090に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブを標識化するための方法は、例えばリアリーら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:4045;レンツとクルツ著、Nucl.Acids Res.(1984)12:3435;リチャードソンとグムポート著、Nucl.Acids Res.(1983)11:6167;スミスら著、Nucl.Acids Res.(1985)13:2399;および Meinkothおよびウォール著、Anal.Biochem.(1984)138:267に記載されている。
標識は、放射性であってもよい。有用な放射性標識のいくつかの例としては、32P、 125 I、l31I、および 3 Hが含まれる。放射性標識の使用は、英国特許第2,034.323、米国特許第4,358,535、および米国特許第4,302,204に記載されている。
非放射性標識のいくつかの例としては、電子顕微鏡により検出可能な酵素、発色団、原子や分子と、磁気特性により検出可能な金属イオンが挙げられる。
いくつかの有用な酵素標識は、基質内で検出可能な変化を引き起こす酵素を含む。いくつかの有用な酵素およびその基質としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ピロガロール及びo−フェニレンジアミン)、β−ガラクトシダーゼ(フルオレセインβ−D−ガラクトピラノシド)、およびアルカリホスファターゼ(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾ)。酵素標識の使用は、英国特許第2,019,404、ヨーロッパ特許第63,879、およびロットマン著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,47,1981−1991(1961)に記載されている。
有用な発色団としては、例えば、蛍光、化学発光、および生物発光分子、ならびに色素を含む。本発明において有用ないくつかの特定の発色団は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノールが挙げられる。
標識は、当該技術分野でよく知られている方法によって、抗体またはヌクレオチドプローブに結合させることができる。標識はプローブ上の官能基を介して直接結合していてもよい。プローブはそのような官能基を、含むか、または含むようにさせられるかのいずれかである。適切な官能基のいくつかの例としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネートが挙げられる。あるいは、酵素及び発色団のような標識は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのようなカップリング剤を用いて抗体又はヌクレオチドに結合させることができる。
標識はまた、上述の方法によりプローブに付着したリガンドおよび標識に結合したリガンドに対する受容体によってプローブに結合させることができる。任意の既知のリガンド−受容体の組み合わせが適合する。好適なリガンド−受容体ペアには、例えば、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、および抗体−抗原を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明のキメラ融合分子は、イメージングに使用できる。イメージングでの使用においては、複合体は体外で検知可能なために標識付けされる。典型的な標識は、放射性同位体であり、通常は半減期の短いものである。123Ι、124I、125I、l31I、99mTC、186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、67Ga,90Y,111In,18F,3H,14C,35S,または32Pのような通常のイメージング放射性同位元素が使用できる。ガドリニウム153などの核磁気共鳴(NMR)イメージング・エンハンサーもまた、NMRによる検出のために複合体を標識するのに使用することができる。ポリヌクレオチドまたはタンパク質部分のいずれかで、標識化を行うための方法および試験薬は、当技術分野で公知と考えられている。
小分子:
薬剤の別の例は、小分子である。 ALCATlの修飾物質として、小分子を同定するために、小分子試験化合物は、最初は有機又は無機の化学ライブラリの構成物であってよい。本明細書で使用する「小分子」は、分子量約3,000ダルトンを下回る小さな有機または無機分子を指す。小分子は、天然物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリの構成物でもよい。多様な分子の1組が、電荷、芳香族性、水素結合、柔軟性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、及び剛性などのさまざまな機能をカバーするために使用されるべきである。小分子を合成するのに適したコンビナトリアル技術は、当該技術分野で知られており、例えばObrechtとVillalgordo著、小分子重量化合物ライブラリの固体支持コンビナトリアルおよびパラレル合成、ペルガモン・エルゼビア・サイエンス社(1998)で例示され、「スプリットプール」または「パラレル」合成技術、固相および溶液相技術、および符号化技術を含む(Czarnik著、Curr.Opin.Chem.Bio.,1:60(1997)参照)。また、多くの小分子ライブラリは、市販されている。
薬剤の別の例は、小分子である。 ALCATlの修飾物質として、小分子を同定するために、小分子試験化合物は、最初は有機又は無機の化学ライブラリの構成物であってよい。本明細書で使用する「小分子」は、分子量約3,000ダルトンを下回る小さな有機または無機分子を指す。小分子は、天然物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリの構成物でもよい。多様な分子の1組が、電荷、芳香族性、水素結合、柔軟性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、及び剛性などのさまざまな機能をカバーするために使用されるべきである。小分子を合成するのに適したコンビナトリアル技術は、当該技術分野で知られており、例えばObrechtとVillalgordo著、小分子重量化合物ライブラリの固体支持コンビナトリアルおよびパラレル合成、ペルガモン・エルゼビア・サイエンス社(1998)で例示され、「スプリットプール」または「パラレル」合成技術、固相および溶液相技術、および符号化技術を含む(Czarnik著、Curr.Opin.Chem.Bio.,1:60(1997)参照)。また、多くの小分子ライブラリは、市販されている。
小分子は、1以上の上記官能基で置換された、環状炭素または複素環構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。小分子として対象となるのは、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む生体分子の中に見出される構造である。そのような化合物は、対象物を同定するためにスクリーニングすることができ、ここで多様な異なるスクリーニングプロトコルが既存技術分野において知られている。
小分子は、合成または天然化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から得ることができる、自然発生のまたは合成の化合物に由来できる。例えば、多数の手段が、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの調製を含む、多種多様の有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリが利用可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然または合成的に作製されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾可能であり、またコンビナトリアルライブラリを生成するのに用いることができる。既知の小分子は、構造的類似体の生成のため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような指向性またはランダムな化学修飾に供してもよい。
このように、小分子は、コンビナトリアル手段を経て生成された化合物のライブラリ、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリを含む、自然発生または合成分子のライブラリから得ることができる。コンビナトリアルライブラリ、ならびに生産およびスクリーニングする方法は、当技術分野で公知である。
化学ライブラリ:
コンビナトリアルケミストリーの発展は数百、数千の、個別の化合物の迅速かつ経済的な合成を可能にする。これらの化合物は、典型的には、効率的なスクリーニングのために設計された小分子の中規模のライブラリに配置されている。コンビナトリアル法は、新規化合物の同定に適した偏らないライブラリを生成するために使用することができる。また、以前に決定された生物学的活性を持つ単一の親の化合物由来のより小さく、多様性のより少ないライブラリを生成可能である。いずれの場合においても、重要な酵素の阻害剤のような、コンビナトリアル化学により産生される治療的に関連する生物学的分子、を特異的に標的とする効率的なスクリーニングシステムの欠如は、これらのリソースの最適な使用を妨げる。
コンビナトリアルケミストリーの発展は数百、数千の、個別の化合物の迅速かつ経済的な合成を可能にする。これらの化合物は、典型的には、効率的なスクリーニングのために設計された小分子の中規模のライブラリに配置されている。コンビナトリアル法は、新規化合物の同定に適した偏らないライブラリを生成するために使用することができる。また、以前に決定された生物学的活性を持つ単一の親の化合物由来のより小さく、多様性のより少ないライブラリを生成可能である。いずれの場合においても、重要な酵素の阻害剤のような、コンビナトリアル化学により産生される治療的に関連する生物学的分子、を特異的に標的とする効率的なスクリーニングシステムの欠如は、これらのリソースの最適な使用を妨げる。
コンビナトリアル化学ライブラリは、多くの、試験薬のような化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化合物の集合である。例えば、ポリペプチドライブラリのような線形コンビナトリアル化学ライブラリは、1組の化学的ビルディングブロック(アミノ酸)を多数の組み合わせで、そして潜在的にあらゆる可能な方法で、所定の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)に対して組み合わせることによって形成される。何百万もの化学化合物を化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合によって合成することができる。
「ライブラリ」は2−50,000,000の多様なメンバー化合物を含んでよい。
ライブラリは好ましくは、少なくとも48の多様な化合物、より好ましくは96以上の多様な化合物、さらにより好ましくは384以上の多様な化合物、より好ましくは10,000以上の多様な化合物、好ましくは100,000以上の多様なメンバーであり、最も好ましくは1,000,000以上の多様なメンバー化合物を含む。「多様な」とは、ライブラリ中の50%を超える化合物が、ライブラリの他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。好ましくは、ライブラリ中の75%以上の化合物がコレクションの他のメンバーと同一ではない化学構造を有し、より好ましくは90%、最も好ましくは約99%以上。
ライブラリは好ましくは、少なくとも48の多様な化合物、より好ましくは96以上の多様な化合物、さらにより好ましくは384以上の多様な化合物、より好ましくは10,000以上の多様な化合物、好ましくは100,000以上の多様なメンバーであり、最も好ましくは1,000,000以上の多様なメンバー化合物を含む。「多様な」とは、ライブラリ中の50%を超える化合物が、ライブラリの他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。好ましくは、ライブラリ中の75%以上の化合物がコレクションの他のメンバーと同一ではない化学構造を有し、より好ましくは90%、最も好ましくは約99%以上。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に公知である。レビューのために、トンプソンら著、小分子ライブラリの合成と適用、Chem Rev96:555−600、1996;ケナンら著、コンビナトリアル形状ライブラリで分子多様性を探る、Trends Biochem Sci19:57−64、1994;ジャンダ著、タグなし対タグ有りライブラリ:コンビナトリアル化学ライブラリの作製およびスクリーニングのための方法,Proc Natl Acad Sci USA91:10779−85,1994;Leblら著、1ビーズ1構造のコンビナトリアルライブラリ、biopolymers37:177−98、1995;アイヒラーら著、ペプチド、ペプチド模倣物、および有機合成コンビナトリアルライブラリ、Med Res Rev.15:481−96、1995;Chabala著、固相コンビナトリアルケミストリーとリードを識別するための新たなタグ付けの方法、Curr Opin Biotechnol,6:632−9、1995;Doll著、コンビナトリアルケミストリーを介した酵素阻害剤の発見、Mol Divers.2:223−36、1997; Fauchereら著、ロボットで合成された水溶性のライブラリを使用したペプチドおよび非ペプチドリードの発見、Can J.Physiol Pharmacol.75:683−9、1997;アイヒラーら著、合成コンビナトリアルライブラリの生成と活用、Mol Med Today1:174−80、1995;および,ケイら著、ファージディスプレイされたコンビナトリアルペプチドライブラリからの酵素阻害剤の同定、Comb Chem High Throughput Screen 4:535−43、2001参照。
化学的多様性ライブラリを作製するため、他の化学的性質も使用することができる。このような化学的性質としては限定されないが、ペプトイド(PCT公報WO91/19735);コード化ペプチド(PCT公報WO93/20242号);ランダムバイオオリゴマー(PCT公報WO92/00091);ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号);ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのような、ダイバーソマー(ホッブズら著、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、90:6909−6913(1993));ビニル性ポリペプチド(萩原ら著、J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992));β−D−グルコース骨格を持つ非ペプチド性ペプチド模倣物(Hirschmannら著、J.Amer.Chem.Soc.114:9217−9218(1992));小化合物ライブラリの類似有機合成(チェンら著、J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994));オリゴカルバメート(チョーら著、Science、261:1303(1993));および/またはペプチジルホスホネート(Campbellら著、J.Org.Chem.59:658(1994));核酸ライブラリ(Ausubel、バーガーおよびSambrook、すべて前掲);ペプチド核酸ライブラリ(例えば、米国特許第5,539,083);抗体ライブラリ(例えば、ヴォーンら著、ネイチャー・バイオテクノロジー、14(3):309−314(1996)およびPCT/ US96/10287);炭水化物ライブラリ(例えば、Liangら著、Science、274:1520−1522(1996)および米国特許第5,593,853);小有機分子ライブラリ(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum著C&Eニュース、1月18日、33ページ(1993);イソプレノイド(米国特許第5,569,588);チアゾリジノンおよびメタチアザノン(米国特許第5,549,974);ピロリジン(米国特許。第5,525,735および5,519,134);モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337);ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号);などが挙げられる。
コンビナトリアルライブラリの調製のためのデバイスは市販されている(例えば、357MPS、390MPS、Advanced Chem.Tech社、ケンタッキー州ルイビル;シンフォニー、レイニン社、マサチューセッツ州ウォーバーン;433A Applied Biosystems社、カリフォルニア州フォスターシティー;9050Plus、ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード)。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリ自体が市販されている(例えば、ComGenex、ニュージャージー州プリンストン;Asinex、モスクワ、ロシア;トライポス社、ミズーリ州セントルイス;ChemStar(株)、モスクワ、ロシア;3DPharmaceuticals、ペンシルベニア州エクストン;マーテクバイオサイエンス、メリーランド州コロンビア、など)。
ALCAT1および関連分子を標的とすることに加えて、結合部位または信号サイトに対し競合する薬剤もまた使用してもよい。
実施形態では、薬剤がALCAT1プロモーターの相互作用を修飾する。薬剤の例としては、限定されないが:抗体、アプタマー、RNAi、小分子、転写因子−DNA結合の組み立てを妨害し、従って、複合体形成を阻害する、特定の合成または天然のペプチドの高親和性結合。いくつかの側面では、薬剤は(例えばsiRNAによって)ALCAT1発現を阻害する。
本発明の一実施形態では、例えば、ALCAT1に結合する単離された抗体、またはこれらの抗体の断片を含む。既存技術分野で公知のように、抗体は、例えば、ポリクローナル、オリゴクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および/または完全ヒト抗体でありうる。本明細書に記載される本発明の実施形態では、これらの抗体を産生するための細胞をも提供する。
干渉RNA:
製造の詳細な方法は、当業者に公知の多数の技術を用いて得ることができる。例えば、siRNAは、Tuschiら著の米国特許出願公報2002/0086356に記載のショウジョウバエin vitroシステムのような当技術分野で公知の方法を用いて化学合成または組み換えにより生成可能であり、この公報の全体は参照により本明細書に採り入れられる。
製造の詳細な方法は、当業者に公知の多数の技術を用いて得ることができる。例えば、siRNAは、Tuschiら著の米国特許出願公報2002/0086356に記載のショウジョウバエin vitroシステムのような当技術分野で公知の方法を用いて化学合成または組み換えにより生成可能であり、この公報の全体は参照により本明細書に採り入れられる。
標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こす、所定の標的配列を含むRNAiの能力は、細胞中のRNAまたはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を使用して評価することができる。例えば、本発明のRNAは、培養細胞に送達することができ、そして標的mRNAのレベルは、ノーザンブロットまたはドットブロッティング技術または定量RT−PCRによって測定することができる。所与の標的配列を含むsiRNAによる標的mRNAのRNAi媒介性分解はまた、マウスモデルなどの動物モデルで評価することができる。標的mRNAのRNAi媒介分解は、上記のようにmRNA又はタンパク質を単離及び定量するための標準的な技術を用いて、被験者の細胞における標的mRNAまたはタンパク質のレベルを測定することにより、検出することができる。
好ましい実施形態では、siRNA分子は、所望のセンス/アンチセンス遺伝子座の重複する領域を標的とし、それによって、例えば、デンドリン(dendrin)を標的にする、センスおよびアンチセンス転写の両方を修飾する。別の好ましい実施形態において、組成物は1つまたは2つ以上のsiRNAおよび/またはsiRNAの組み合わせ、所望の標的遺伝子座が重複するsiRNA、および/またはセンスおよびアンチセンスの両方(重複またはその他)を標的とするsiRNAを含む。これらの分子は、任意の疾患または異常の、潜在的な治療が望まれる任意の標的に向けることができる。理論的にはどの分子を標的とすべきかには制限がない。さらに、本明細書で教示される技術は、治療をそれぞれの個体に対し調整することを可能にする。
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは個別の治療に合わせて調整することができる、例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、個人の対立遺伝子変異体に対し配列特異的であり得、ターゲットの上方制御または阻害は、例えば、対照と比較して10%、20%、40%、100%の発現のような、異なる度合いで操作できる。つまり、ある患者では10%の標的遺伝子の発現を増加または減少させることが効果的であり、それに対して別の患者では80%が有効であり得る。
遺伝子発現の修飾(上方制御または阻害)は、内因性標的RNAまたは標的RNAの翻訳によって産生されるタンパク質のいずれかを測定することによって定量化することができる。RNAおよびタンパク質を定量するための技術は、当業者に知られている。特定の好ましい実施形態では、遺伝子発現は少なくとも10%、好適には少なくとも33%、さらにより好適には少なくとも50%、またさらに好適には少なくとも80%、阻害される。本発明の特に好ましい実施形態では、生物中の細胞内において遺伝子発現は少なくとも90%、より好適には、少なくとも95%阻害され、また少なくとも99%から100%まで阻害される。特定の好ましい実施形態(例えばMFN2、PINK1)では、遺伝子発現は、少なくとも10%、好適には少なくとも33%、さらにより好適には少なくとも50%、またさらに好適には少なくとも80%、上方制御される。本発明の特に好ましい実施形態では、生物中の細胞内において遺伝子発現は少なくとも90%、より好適には、少なくとも95%上方制御され、また少なくとも99%から100%まで上方制御される。
適切なRNA干渉(RNAi)の選択は、自動的に核酸配列を整列させ、同一性または相同性の領域を示すコンピュータプログラムを使用することによって促進される。このようなプログラムは、例えば、GenBankのようなデータベースを検索することによって、またはPCR産生物の配列決定によって、得られた核酸配列を比較するために使用される。一定の範囲の種からの核酸配列の比較は、種間の適切な程度の同一性を表示する核酸配列の選択を可能にする。配列決定されていない遺伝子の場合には、標的種および他の種の遺伝子間の同一性の程度の決定を可能にするためにサザンブロットが行われる。当技術分野でよく知られているように、ストリンジェンシーの程度を変化させて、サザンブロットを行うことにより、同一性の近似測定値を得ることができる。これらの手順は、制御されるべき被験者の標的核酸配列に対し高度の相補性を示し、そして他の種における対応する核酸配列に対し低い相補性の程度を示す、RNAiの選択を可能にする。当業者は、本発明において使用される遺伝子の適切な領域を選択することにかなりの許容範囲があることを理解するであろう。
好ましい実施形態では、低分子干渉RNA(siRNA)は、RNAそのものとして、またはDNAとして、アプタマーまたは当該分野で公知の任意の他のタイプの送達媒体を使用して細胞に送達される。特定の実施形態では、本開示の核酸分子は個別に合成され、合成後に例えばライゲーションにより(ムーアら著、Science256:9923、1992;ドレーパーら著、PCT公開番号WO93/23569;Shabarovaら著、Nucleic AcidsRes.19:4247、1991;Beilonら著、ヌクレオシドとヌクレオチド16:951、1997;Bellonら著、biconjugate Chem.8:204、1997)、または合成または脱保護の後のハイブリダイゼーションにより、接合されてもよい。
さらなる実施形態では、干渉を媒介するオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをコードし、それらの発現を宿主細胞内に指向させるベクターによって発現される単一または複数の転写産物として生成可能である。本開示のsiRNAまたはその類似体は、さらに、アプタマーおよびsiRNAを接合する、ヌクレオチド、非ヌクレオチドまたはヌクレオチド/非ヌクレオチドが混合した、リンカーからなってもよい。ある実施形態では、ヌクレオチドリンカーは、長さが約2ヌクレオチド長から約50ヌクレオチド長までのリンカーであり得る。別の実施形態では、ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであり得る。本明細書において使用される「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここにおいて当該核酸分子は、その天然の設定において標的分子により認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が天然には核酸に結合しない、標的分子に結合する核酸分子であり得る。標的分子は対象となる任意の分子であり得る。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するために使用することができ、それによってタンパク質と天然に存在するリガンドの相互作用を防止する。これは非限定的な例であり、当業者は、一般に当該分野で公知の技術を用いて他の実施形態を容易に作ることができることを認識するであろう(例えば、Goldら著、Annu.Rev.Biochem.64:763、1995;ブロディとゴールド著、J. Biotechnol 74:5、2000;Sun著、Curr.Opin.Mol.Ther. 2:100、2000;クッサー著、J.Biotechnol.74:27、2000;ヘルマンとパテル著、サイエンス287:820、2000;およびJayasen著、Clinical Chem.45:1628、1999参照)。
本発明は、タンパク質をコードする遺伝子産物に対してだけでなく、非タンパクをコードする遺伝子産物に対しても使用することができる。非タンパク質コード遺伝子産物の例は、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、細胞質低分子RNA、テロメラーゼRNA、DNA複製、染色体再編成などに関与するRNA分子、をコードする遺伝子産物を含む。
本発明によれば、siRNAオリゴヌクレオチド療法は、遺伝子からの標的mRNAに接触(と相互作用)する、投与されたsiRNAオリゴヌクレオチドを含み、それにより遺伝子の発現が修飾される。発現のこのような修飾は、適切には対照に対し少なくとも約10%または20%の違いであることができ、より好ましくは対照に対し少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%の発現の差があってよい。特に、siRNAオリゴヌクレオチドの接触が、対照と比較して完全なまたは本質的に完全な修飾をもたらすこと、例えば対照と比較して少なくとも約95%、97%、98%、99%または100%の発現の阻害または増加をもたらすことが、特に好ましい。このような修飾を判定するための対照サンプルは、siRNAオリゴヌクレオチドと接触されていない(インビトロまたはインビボの)同等の細胞であり得る。
別の好ましい実施形態では、siRNA中の核酸塩基は、標的mRNAに対しより高い特異性と親和性を提供するように修飾されてもよい。例えば、核酸塩基はロックド核酸(LNA)モノマーと置換されてもよく、それは連続する一続きで、または異なる位置にあることができる。修飾siRNAは、好ましくは、標的配列に対し相補的配列より高い会合定数(Ka)を有する。標的配列に対する修飾または非修飾siRNAの結合は、多様なストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて以下の実施例に記載のようにインビトロで判定可能である。
キメラ/修飾RNAi:
本発明に従って、当業者は、mRNAが、翻訳開始コドンおよび停止コドンを含む、三文字遺伝子コードを用いてタンパク質をコードするための情報を伝送するコード領域のみならず、5′非翻訳領域、3′非翻訳領域、5′キャップ領域、イントロン領域および、イントロン/エクソンまたはスプライスジャンクションリボヌクレオチドとして当業者に既知の領域を形成する、関連するリボヌクレオチドを含んでいることを理解するであろう。したがってコードするリボヌクレオチドのみならず、これら関連するリボヌクレオチドを完全にまたは部分的に標的とするオリゴヌクレオチドが本発明に従って製剤化することができる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)またはコード領域内の配列、5′非翻訳領域、または3′非翻訳領域を標的とする。干渉されるべきメッセンジャーRNAの機能は、タンパク質翻訳部位へのRNAの転座、RNAからのタンパク質の実際の翻訳、RNAのスプライシングまたは成熟化、およびRNAが関わる独立した触媒活性も可能性として含む、全ての重要な機能を含む。RNA機能に対するこのような干渉の総合的効果は、タンパク質発現に対する干渉を引き起こすことである。
本発明に従って、当業者は、mRNAが、翻訳開始コドンおよび停止コドンを含む、三文字遺伝子コードを用いてタンパク質をコードするための情報を伝送するコード領域のみならず、5′非翻訳領域、3′非翻訳領域、5′キャップ領域、イントロン領域および、イントロン/エクソンまたはスプライスジャンクションリボヌクレオチドとして当業者に既知の領域を形成する、関連するリボヌクレオチドを含んでいることを理解するであろう。したがってコードするリボヌクレオチドのみならず、これら関連するリボヌクレオチドを完全にまたは部分的に標的とするオリゴヌクレオチドが本発明に従って製剤化することができる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)またはコード領域内の配列、5′非翻訳領域、または3′非翻訳領域を標的とする。干渉されるべきメッセンジャーRNAの機能は、タンパク質翻訳部位へのRNAの転座、RNAからのタンパク質の実際の翻訳、RNAのスプライシングまたは成熟化、およびRNAが関わる独立した触媒活性も可能性として含む、全ての重要な機能を含む。RNA機能に対するこのような干渉の総合的効果は、タンパク質発現に対する干渉を引き起こすことである。
他の薬剤:
これらには、任意の合成または天然のペプチド、糖タンパク質、酵素、シグナル伝達の修飾物質、転写または翻訳因子複合体、有機または無機分子等の形成の阻害剤、を含むことができる。
これらには、任意の合成または天然のペプチド、糖タンパク質、酵素、シグナル伝達の修飾物質、転写または翻訳因子複合体、有機または無機分子等の形成の阻害剤、を含むことができる。
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載される任意の、標的化バインダー、抗体またはそれらのフラグメントをコードする単離核酸分子、単離核酸分子を有するベクター、またはこれら任意の核酸分子により形質転換された宿主細胞を含む。本発明の実施形態はまた、抗体産生のために宿主細胞に形質導入されたときに、抗体またはその断片の収量を増加させるために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体またはその断片をコードする任意の核酸分子を含む、ことを理解する必要がある。
マイクロアレイ:
ALCAT1および関連分子に結合することができる核酸配列の同定は、それぞれのユニークな核酸が規定された位置に配置されて1つの配列を形成するように、基板表面上に核酸の1つのライブラリを固定化することによって達成することができる。一般に、固定化された核酸のライブラリは、核酸への生体分子の結合に有利な条件下で、生体分子または候補薬剤に曝露される。非特異的に結合する生体分子は、所望の結合特異性のレベルに応じて、軽度からストリンジェントな緩衝液条件を使用して洗い流される。核酸配列は、次いで、どの核酸配列が生体分子に結合しているかを判定するために分析される。好ましくは、生体分子は、結合した核酸の位置の検出に使用するための蛍光タグを有している。
ALCAT1および関連分子に結合することができる核酸配列の同定は、それぞれのユニークな核酸が規定された位置に配置されて1つの配列を形成するように、基板表面上に核酸の1つのライブラリを固定化することによって達成することができる。一般に、固定化された核酸のライブラリは、核酸への生体分子の結合に有利な条件下で、生体分子または候補薬剤に曝露される。非特異的に結合する生体分子は、所望の結合特異性のレベルに応じて、軽度からストリンジェントな緩衝液条件を使用して洗い流される。核酸配列は、次いで、どの核酸配列が生体分子に結合しているかを判定するために分析される。好ましくは、生体分子は、結合した核酸の位置の検出に使用するための蛍光タグを有している。
固定化された核酸配列を用いる検定法は、未知の核酸の配列の決定;一塩基多型(SNP)分析;特定の種、組織、細胞型、遺伝子同定からの遺伝子発現パターンの解析;その他に使用できる。
所望の遺伝子発現産物をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断的使用はPCRの使用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成され、酵素的に生成され、またはin vitroで産生することができる。オリゴマーは、好ましくは、遺伝子発現産物をコードするポリヌクレオチドの断片、またはそのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子の同定のために最適化された条件下で使用される。オリゴマーはまた、密接に関連するDNAまたはRNA配列の検出または定量のため、低ストリンジェント条件下で使用されてもよい。
さらなる実施形態では、任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはそれより長い断片は、マイクロアレイ内の標的として使用することができる。マイクロアレイは、多数の遺伝子および遺伝子転写物の同一性および/または発現レベルを同時にモニターし、同時に標的遺伝子またはその産物が相互作用する遺伝子を同定し、および/または例えば神経障害を媒介する、候補治療薬の遺伝子発現産物の調節における有効性を評価するために使用され得る。この情報は、遺伝子機能を決定するために、そして治療剤の活性を発現させそして監視するために使用することができる。
マイクロアレイは公知の方法を使用して準備され、使用され、そして分析できる(例えば、Brennanら、1995、米国特許第5,474,796;Schenaら著、1996、Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10614−10619;Baldeschweilerら、1995、PCT出願W095/251116;シャロンら、1995、PCT出願WO95/35505;ヘラーら、1997、Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.94:2150−2155;およびヘラーら、1997、米国特許第5,605,662参照)。他の実施形態では、マイクロアレイは、ペプチド、又は候補薬剤を同定するために検定することができる他の所望の分子を含む。
薬物スクリーニングのための別の技術は、対象タンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物の高生産性スクリーニングを提供する(例えば、Geysenら、1984、PCT出願WO84/03564参照)。この方法では、多数の異なる小型の試験化合物が固体基質上で合成される。試験化合物は、同定された遺伝子、またはその断片と反応させられ、洗浄される。結合した分子は、その後、当技術分野で周知の方法によって検出される。あるいは、非中和抗体が、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するために使用することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、多様な分子のライブラリから、所望の活性を有する1つまたは複数の化合物を同定するためのスクリーニング検定法を使用するステップを含む。「スクリーニング検定法」は、予め選択された活性を有する1つのコレクション内の化合物を同定、単離、および/またはその構造を決定するように設計される、選択的検定法である。「同定」とは、所望の活性を有する化合物が単離され、その化学構造が決定され(限定されないが、核酸およびポリペプチドのそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列を判定することを含む)、そして、追加的または代替的に、スクリーニングされた活性を有する化合物を精製することを意味する。生化学的および生物学的検定法は、タンパク質−タンパク質相互作用から、酵素触媒、小分子−タンパク質結合、細胞機能に至るまでの広範囲のシステムにおける活性を試験するように設計されている。
このような検定法には自動化、半自動化検定法およびHTS(ハイスループットスクリーニング)検定法が含まれる。
このような検定法には自動化、半自動化検定法およびHTS(ハイスループットスクリーニング)検定法が含まれる。
HTS法では、大量の試験化合物が同時に又はほぼ同時に所望の活性についてスクリーニングされるように、多くの個別の化合物が好ましくはロボット化、自動または半自動の方法によって並行して試験される。本発明の統合されたシステムを使用して、1日に約6,000−20,000、そして約100,000−1,000,000までもの異なる化合物をスクリーニングすることが可能である。
典型的にHTSでは、標的分子は、投与されるか、適切な対照を含む修飾された受容体と単離された細胞を用いて培養される。
ある実施形態では、スクリーニングするステップは、ターゲットとリガンドとの間の複合体が形成できる条件の下で、各細胞培養を多様なライブラリのメンバー化合物、このうちのいくつかはターゲットのリガンドであるが、と接触させるステップと、そして、ライブラリのどのメンバーがこのような複合体に存在するかを同定するステップと、を有する。別の非制限的な様式では、スクリーニングは、酵素によって触媒される反応の産物または反応物が検知可能な信号を生成する条件下で、標的酵素を多様なライブラリのメンバー化合物、そのうちのいくつかはターゲットの阻害薬(又は賦活剤)であるが、に接触させるステップを有する。後者の様式では、標的酵素の阻害剤は、検出可能生成物からの信号を減少させるか、検出可能反応物からの信号を増加させる(又は賦活剤についてその逆)。
ある実施形態では、本発明は本明細書に実施形態として示された任意の分子(例えばALCATl、または、ALCATl、MFN2、PTENの修飾物質)のいずれか、またはこれらの分子タンパク質のいずれかを発現する、天然に存在するか組換えの細胞もしくは組織を使用した、可溶性検定法を提供する。別の実施形態では、本発明は、例えば、ALCATl分子またはその断片が固相基質に付着した、ハイスループット形式の固相ベースのインビトロ検定法を提供する。本明細書に記載の任意の検定法はハイスループットスクリーニング、例えば、リガンド結合、細胞増殖、細胞表面マーカーフラックス、放射性標識されたGTP結合、セカンドメッセンジャーのフラックス、例えばCa2+、IP3、cGMP、またはcAMP、サイトカイン産生、などに適合させることができる。可溶性又は固体のいずれかの本発明のハイスループット検定法においては、一日に数千の異なる修飾物質またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。
この方法は、in vitroでALCATlのタンパク質に対し使用可能であり、またはALCATlタンパク質を含む細胞ベースまたは膜ベースの検定法のために使用できる。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的修飾物質に対して別々の検定を実行するために使用することができ、または、濃度またはインキュベーション時間の効果が観察されるべきであれば、5−10ウェルごとに単一の修飾物質を試験することができる。このように、単一の標準マイクロタイタープレートは、約100(例えば、96)の修飾物質を検定することができる。1536ウェルプレートが使用される場合、単一のプレートは簡単に約100−約1500の異なる化合物を検定することができる。一日あたり多くのプレートを検定することが可能である;約6,000、20,000、50,000または100,000以上の異なる化合物のためのアッセイスクリーンが本発明の統合システムを用いて可能である。
固相反応に対しては、対象タンパク質またはその断片、例えば、対象タンパク質またはその断片を融合タンパク質の一部として含む細胞外ドメイン、または細胞もしくは膜は、直接または間接的に、共有結合または非共有結合、例えばタグを介して固体相構成要素に結合することができる。タグは多様な構成要素のいずれかでよい。一般に、タグと結合する分子(タグバインダー)は、固体支持体に固定され、対象のタグ付き分子は、タグおよびタグバインダーの相互作用によって固体支持体に付着される。
多くのタグおよびタグバインダーが、文献に記載された公知の分子相互作用に基づいて使用できる。例えば、タグが、例えばビオチン、プロテインA、またはプロテインGの天然のバインダーを有する場合、適切なタグバインダー(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域など)と併せて使用することができる。ビオチンなどの天然のバインダーを有する分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグバインダーである;SIGMA免疫化学、1998カタログ(SIGMA、ミズーリ州セントルイス)を参照。
同様に、任意のハプテン性または抗原性の化合物が、適切な抗体と組み合わせてタグ/タグバインダーペアを形成するのに使用することができる。数千の特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第一抗体であり、タグバインダーは第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまた、タグ−タグバインダーペアとして適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト(例えば、トランスフェリン、c−kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクションファミリー等のような細胞受容体−リガンド相互作用;例えば、ピゴット&パワー著、接着分子の事実ブックI(1993)参照)。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン(例えば、アヘン剤、ステロイドなど)、細胞内受容体(例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンDを含むさまざまな小リガンドの効果を媒介する;ペプチド)、薬物、レクチン、糖、核酸(線状および環状ポリマー構成の両方)、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、すべて、さまざまな細胞受容体と相互作用することができる。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成ポリマーもまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成することができる。この開示を見た当業者には明らかであるように、多くの他のタグ/タグバインダー対はまた、本明細書に記載の検定システムにおいて有用である。
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして機能することができ、そして約5−200アミノ酸のポリグリシン配列などのポリペプチド配列を含む。このような柔軟なリンカーは当業者に知られている。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーは、シェアウォーターポリマーズ社、アラバマ州ハンツビルから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能基結合を有する。
タグバインダーは、現在利用可能な多様な方法のいずれかを使用して固体基板に固定されている。固体基板は、一般にタグバインダーの一部と反応する化学基を表面に固定する化学試験薬に、基板の全部または一部を露出させることによって誘導体化されもしくは官能性を持たされる。例えば、長鎖部分への付着に適した基には、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基を含む。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス表面のようなさまざまな表面に官能性を持たせるために使用することができる。そのような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に十分に記載されている。例えば、メリフィールド著、J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154(1963)(例えば、ペプチドの固相合成を記載);Geysenら、J.Immun.Meth.102:259−274(1987)(ピン上での固相成分の合成を記載する);フランク&Doring、テトラヘドロン44:6031−6040(1988)(セルロースディスク上のさまざまなペプチド配列の合成を記載する);フォーダーら、Science、251:767−777(1991);シェルドンら。臨床化学39(4):718−719(1993); およびKozalら、Nature Medicine 2(7):753−759(1996)(これらは全て固体基板に固定されたバイオポリマーのアレイを記載)を参照。基質にタグバインダーを固定する非化学的アプローチは、熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法を含む。
患者への組成物の投与:
本明細書に記載の方法によって同定された組成物または薬剤は、任意の適切な製剤においてヒトを含む動物に投与することができる。例えば、タンパク質分解を修飾するための組成物は、生理食塩水又は緩衝塩溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤において製剤化することができる。適切な担体および希釈剤は、投与様式および投与経路および標準的薬務に基づいて選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体及び希釈剤および医薬製剤の説明は、レミントンの薬学、この分野の標準的テキスト、およびUSP/NFに記載されている。組成物を安定化および/または保存するために他の物質が組成物に添加されてもよい。
本明細書に記載の方法によって同定された組成物または薬剤は、任意の適切な製剤においてヒトを含む動物に投与することができる。例えば、タンパク質分解を修飾するための組成物は、生理食塩水又は緩衝塩溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤において製剤化することができる。適切な担体および希釈剤は、投与様式および投与経路および標準的薬務に基づいて選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体及び希釈剤および医薬製剤の説明は、レミントンの薬学、この分野の標準的テキスト、およびUSP/NFに記載されている。組成物を安定化および/または保存するために他の物質が組成物に添加されてもよい。
本発明の組成物は、任意の従来技術により動物に投与されてもよい。組成物は、例えば、内部または外部標的部位への外科的送達により、または血管によってアクセス可能な部位にカテーテルによって、標的部位に直接投与することもできる。他の送達方法、例えば、リポソーム送達または組成物を含浸させた装置からの拡散は、当技術分野で知られている。組成物は、単回ボーラス、複数回の注射、または連続注入(例えば、静脈内注射)によって投与されてもよい。非経口投与の場合、組成物は、好ましくは、滅菌されたパイロジェンフリーの形態で製剤化される。
薬剤または化合物は、1つ以上の療法と共に投与することができる。化学療法剤は、メトロノーム的投薬計画で投与されてもよい。本明細書で用いる「メトロノーム」療法は、治療剤の連続的な低用量の投与を指す。
そのような化合物の用量、毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的薬学手順、例えば、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効な用量)に対して決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって、副作用を低減するために、このような化合物を罹患組織の部位へ向ける送達系を設計するように注意を払うべきである。
細胞培養検定および動物研究から得られたデータは、ヒトに使用される用量範囲を処方するのに用いることができる。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物に対して、治療上有効な用量は、細胞培養検定から最初に推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定されるIC50(すなわち、最大半量の症状の阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
化合物の治療有効量(すなわち、有効投薬量)は、治療上(例えば、臨床的に)望ましい結果をもたらすのに十分な量を意味する。組成物は、1日1回または複数回から1週間に1回または複数回まで投与することができ;1日おきに1回を含む。当業者は、一定の要因が被験者を有効に治療するために必要な用量およびタイミングに影響しうることを理解しよう。それは、限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験者の全般的健康および/または年齢、および現在の他の疾病、を含む。また、本発明の化合物の治療有効量による被験者の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。
製剤:
組成物は単独で投与することは可能であるが、医薬製剤として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与に対し、0.001−10重量%、例えば、薬剤の重量に対し1%−2%含んでいてもよい。10%程度を含んでもよいが、好適には5%を超えない、より好ましくは薬剤重量0.1%−1%である。本発明の局所製剤は、活性成分と共に一つまたはそれ以上の許容される担体および、必要に応じて任意の他の治療成分を含む。担体は、製剤の他の成分と両立でき、その受容者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
組成物は単独で投与することは可能であるが、医薬製剤として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与に対し、0.001−10重量%、例えば、薬剤の重量に対し1%−2%含んでいてもよい。10%程度を含んでもよいが、好適には5%を超えない、より好ましくは薬剤重量0.1%−1%である。本発明の局所製剤は、活性成分と共に一つまたはそれ以上の許容される担体および、必要に応じて任意の他の治療成分を含む。担体は、製剤の他の成分と両立でき、その受容者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
局所投与に適した製剤は、眼、耳、または鼻への投与に適したリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および点滴薬などの、皮膚を通して治療が必要とされる部位への浸透に適した液体または半液体製剤を含む。本発明に係る点滴薬は、無菌の水性または油性溶液または懸濁液を含んでもよく、そして活性成分を、殺菌および/または殺真菌剤及び/又は任意の他の適切な防腐剤、そして好適には界面活性剤を含む、適切な水溶液中に溶解することによって調製することができる。次いで、得られた溶液を清澄化し、濾過により滅菌し、そして無菌性技術により容器に移してもよい。点滴薬に含めるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀(0.002%)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。
本発明に係るローションは、皮膚または眼への適用に適したものが挙げられる。眼用ローションは、所望により殺菌剤を含む無菌水溶液を含むことができ、点滴剤の調製と同様の方法により調製することができる。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤はまた、例えばアルコールまたはアセトンのような皮膚の乾燥を促進させ冷却する薬剤、および/またはグリセロールまたは、ヒマシ油もしくは落花生油などの油、などの保湿剤、を含んでもよい。
本発明に係るクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための活性成分の半固体製剤である。それらは微粉または粉末形態の活性成分を、単独でまたは水性または非水性流体中の溶液または懸濁液中において、適切な機械の助けを借りて、グリース状または非グリース状ベースと混合することによって製造することができる。ベースは硬質、軟質または流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸などの炭化水素;粘液;アーモンド、トウモロコシ、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然由来の油;羊毛脂もしくはその誘導体、またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸、およびプロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールである。製剤は、アニオン性、カチオン性、又はソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体のような非イオン性界面活性剤などの任意の適切な界面活性剤を組み込むことができる。天然ゴム、セルロース誘導体、または珪質シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分のような、懸濁剤もまた含まれてもよい。
本発明のさまざまな実施形態を上述したが、これらは例示のためだけであり、限定を目的とせずに提示されていることを理解すべきである。開示された実施形態に対する多くの変更は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく本明細書の開示に従って作製することができる。したがって、本発明の範囲は上述の実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
本書に記載のすべての文書は、ここに参照され本明細書に組み込まれる。各個別の刊行物または特許文書は個別にそのように示されたように、本出願で引用された全ての刊行物および特許文献は同程度に全ての目的のために参考として援用される。この文書に記載されているさまざまな参考文献のそれらの引用により、出願人は、任意の特定の参照がその発明に対する「先行技術」であることを認めていない。本発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例に例示されている。
(実施例)
以下の限定されない実施例は本発明の選ばれた実施形態を説明するのに役立つ。比率の変化や組成物の要素の変更は当業者にとって自明であり、それらは本発明の実施形態の範囲内にあることを理解されたい。
以下の限定されない実施例は本発明の選ばれた実施形態を説明するのに役立つ。比率の変化や組成物の要素の変更は当業者にとって自明であり、それらは本発明の実施形態の範囲内にあることを理解されたい。
(実施例1:ALCAT1によるカルジオリピンリモデリングはMFN2発現の修飾を介してミトコンドリア生合成およびmtDNA忠実性を制御する)
本研究はALCAT1が、酸化ストレスに伴うミトコンドリア機能不全を調節する分子メカニズムの理解を深めることを目的としている。プロセスのなかでミトコンドリアの融合およびmtDNAの忠実性の調節における予期せぬALCAT1の役割、それは年齢関連疾病において、MFN2不足およびミトコンドリア分裂におけるALCAT1の重大な役割を意味する、が確認された。
本研究はALCAT1が、酸化ストレスに伴うミトコンドリア機能不全を調節する分子メカニズムの理解を深めることを目的としている。プロセスのなかでミトコンドリアの融合およびmtDNAの忠実性の調節における予期せぬALCAT1の役割、それは年齢関連疾病において、MFN2不足およびミトコンドリア分裂におけるALCAT1の重大な役割を意味する、が確認された。
(材料と方法)
ALCAT1ノックアウトマウス:
ALCAT1ノックアウトマウスの生成および酸素消費速度(OCR)の測定は以前に記載されている通りであった(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。全ての実験は適合した年齢と性別の同腹子の対照を使用し、そして動物愛護機関の承認に従い、また国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
ALCAT1ノックアウトマウスの生成および酸素消費速度(OCR)の測定は以前に記載されている通りであった(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。全ての実験は適合した年齢と性別の同腹子の対照を使用し、そして動物愛護機関の承認に従い、また国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
試験薬:
本研究に使用される抗体はプロヒビチンおよびカルネキシンに対するモノクローナル抗体を含み、それらはSanta Cruz Biotechnology社(カリフォルニア州サンタクルズ)より購入した。MNF1,MNF2,OPA1に対するモノクローナル抗体はAbcam社より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウスIgGホースラディッシュペルオキシダーゼ接合抗体はGEヘルスケア(ニュージャージー州、Piscataway)より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウス フルオレセインイソチオシアネート(FITC)接合抗体はSanta Cruz Biotechnology社より購入した。カルボニルシアニドp−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、ロテノン、アンチマイシン、オリゴマイシン、およびジフェニレンヨードニウムサルフェート(DPI)はInvitrogenより購入した。
本研究に使用される抗体はプロヒビチンおよびカルネキシンに対するモノクローナル抗体を含み、それらはSanta Cruz Biotechnology社(カリフォルニア州サンタクルズ)より購入した。MNF1,MNF2,OPA1に対するモノクローナル抗体はAbcam社より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウスIgGホースラディッシュペルオキシダーゼ接合抗体はGEヘルスケア(ニュージャージー州、Piscataway)より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウス フルオレセインイソチオシアネート(FITC)接合抗体はSanta Cruz Biotechnology社より購入した。カルボニルシアニドp−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、ロテノン、アンチマイシン、オリゴマイシン、およびジフェニレンヨードニウムサルフェート(DPI)はInvitrogenより購入した。
動物飼育:
生後4−6週間のオスおよびメスのC57BL/6Jマウスをジャクソン・ラボラトリ(メイン州、Bar Harbor)より購入した。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)か、Research Diets社(ニュージャージー州、New Brunswick;Cat. #D12492)からの高脂肪食餌を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
生後4−6週間のオスおよびメスのC57BL/6Jマウスをジャクソン・ラボラトリ(メイン州、Bar Harbor)より購入した。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)か、Research Diets社(ニュージャージー州、New Brunswick;Cat. #D12492)からの高脂肪食餌を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
免疫蛍光共焦点顕微鏡法および画像分析:
免疫蛍光染色のため、細胞は4%パラホルムアルデヒドで10分間固定され、PBSで2度洗浄され、0.1%トリトンX−100で10分間透過処理された。固定された細胞は5%ウシ血清アルブミンを含むPBS内で室温でプリインキュベートされた。細胞は1次抗体(抗Mycモノクローナル抗体、1:500希釈)で3時間室温で染色され、その後FITC(1:1000希釈、Santa Cruz)と接合した2次抗体でインキュベートされた。ミトコンドリアの染色のため、細胞はミトトラッカーレッド(最終濃度100nM)で5分間37℃のインキュベーター内で染色され、PBSで3度、各洗浄5分で洗浄された。細胞はその後バイポーラー温度制御装置を備える共焦点顕微鏡法(ライカ TCS SP2 AOBS)で分析された。画像はアドビフォトショップ(登録商標)7.0を使用して処理され、そして定量分析がImageJ(国立衛生研究所)を使用して実施された。全ての実験は少なくとも3回行われ、類似の結果を得た。
免疫蛍光染色のため、細胞は4%パラホルムアルデヒドで10分間固定され、PBSで2度洗浄され、0.1%トリトンX−100で10分間透過処理された。固定された細胞は5%ウシ血清アルブミンを含むPBS内で室温でプリインキュベートされた。細胞は1次抗体(抗Mycモノクローナル抗体、1:500希釈)で3時間室温で染色され、その後FITC(1:1000希釈、Santa Cruz)と接合した2次抗体でインキュベートされた。ミトコンドリアの染色のため、細胞はミトトラッカーレッド(最終濃度100nM)で5分間37℃のインキュベーター内で染色され、PBSで3度、各洗浄5分で洗浄された。細胞はその後バイポーラー温度制御装置を備える共焦点顕微鏡法(ライカ TCS SP2 AOBS)で分析された。画像はアドビフォトショップ(登録商標)7.0を使用して処理され、そして定量分析がImageJ(国立衛生研究所)を使用して実施された。全ての実験は少なくとも3回行われ、類似の結果を得た。
電子顕微鏡(EM)分析:
細胞は4%パラホルムアルデヒドおよび5%グルタルアルデヒドで固定され、2%OsO4と1%酢酸ウラニルで逐次染色され、連続的なエタノール洗浄で脱水され、そして切片作成と分析のためEmbed−812レジンに埋め込まれた。サンプルはJEOL 1200EX 透過型電子顕微鏡を使用して分析された。
細胞は4%パラホルムアルデヒドおよび5%グルタルアルデヒドで固定され、2%OsO4と1%酢酸ウラニルで逐次染色され、連続的なエタノール洗浄で脱水され、そして切片作成と分析のためEmbed−812レジンに埋め込まれた。サンプルはJEOL 1200EX 透過型電子顕微鏡を使用して分析された。
mtDNA変異検定法:
mtDNAの単離のため、MEFおよびC2C12細胞がホモジナイズされ、そしてミトコンドリア部分が前述のように(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)単離された。その後ミトコンドリアは0.5%SDSと10mMトリスHCl、0.15M NaCl、および0.005M EDTA内の0.2mg/mlプロテイナーゼKの存在のもとで溶解された。mtDNAはその後フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製された。ランダム変異捕獲検定法が以前に記載したように(Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)実施された。簡単に言うと、mtDNAはTaqIで5時間消化され、その後96穴フォーマット内で希釈され、TaqI制限サイトに変異を含むmtDNAゲノムを検知するためTaqI制限サイトに隣接するプライマーでプローブされた。プライマーの対照ペアが調査されるmtDNAの量を検知するために使用された。PCRがABI STEPONEPLUS(登録商標)および95℃ SYBR(登録商標)GREEN PCR Mster Mixを使用して20μl反応において実施された。量的PCR増幅が以下のプログラムを使用して実施された:ステップ1、95℃で10分;ステップ2、15秒;ステップ3、60℃で1分;ステップ4、ステップ2に40回戻る;ステップ5、65℃から95℃までのメルトカーブ。
mtDNAの単離のため、MEFおよびC2C12細胞がホモジナイズされ、そしてミトコンドリア部分が前述のように(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)単離された。その後ミトコンドリアは0.5%SDSと10mMトリスHCl、0.15M NaCl、および0.005M EDTA内の0.2mg/mlプロテイナーゼKの存在のもとで溶解された。mtDNAはその後フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製された。ランダム変異捕獲検定法が以前に記載したように(Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)実施された。簡単に言うと、mtDNAはTaqIで5時間消化され、その後96穴フォーマット内で希釈され、TaqI制限サイトに変異を含むmtDNAゲノムを検知するためTaqI制限サイトに隣接するプライマーでプローブされた。プライマーの対照ペアが調査されるmtDNAの量を検知するために使用された。PCRがABI STEPONEPLUS(登録商標)および95℃ SYBR(登録商標)GREEN PCR Mster Mixを使用して20μl反応において実施された。量的PCR増幅が以下のプログラムを使用して実施された:ステップ1、95℃で10分;ステップ2、15秒;ステップ3、60℃で1分;ステップ4、ステップ2に40回戻る;ステップ5、65℃から95℃までのメルトカーブ。
ミトコンドリア融合検定法:
ALCAT1またはベクター対照を安定して発現するC1C12細胞が6cm2 プレート当たり5x105で播かれ、そしてミトコンドリア標的緑色蛍光タンパク質(mtEGFP)またはミトコンドリア標的dsRED2(mtDsred2)をそれぞれ形質移入された。30時間後、それぞれmtEGFPとmtDsred2を発現する個々の細胞プールは1:1の比率で混合され13mm丸形カバースリップの上に一緒に蒔かれた。融合は6時間後、PBS内の50%(重量/容積)PEG−1500溶液(Sigma)での60秒の処置により誘導され、その後10%ウシ胎児血清(FCS)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)内で広範に洗浄された。タンパク質合成を阻害するため、シクロヘキシミド(20μg/ml)が融合30分前に添加され、すべてが溶液とその後使用される細胞培養媒体で保存され、その後細胞はPBS内の氷温度の4%フォルムアルデヒドで10分間固定された。PBSで3回洗浄したのちカバースリップはスライドに搭載され、そして暗箱内において4℃で一昼夜保管された。
ALCAT1またはベクター対照を安定して発現するC1C12細胞が6cm2 プレート当たり5x105で播かれ、そしてミトコンドリア標的緑色蛍光タンパク質(mtEGFP)またはミトコンドリア標的dsRED2(mtDsred2)をそれぞれ形質移入された。30時間後、それぞれmtEGFPとmtDsred2を発現する個々の細胞プールは1:1の比率で混合され13mm丸形カバースリップの上に一緒に蒔かれた。融合は6時間後、PBS内の50%(重量/容積)PEG−1500溶液(Sigma)での60秒の処置により誘導され、その後10%ウシ胎児血清(FCS)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)内で広範に洗浄された。タンパク質合成を阻害するため、シクロヘキシミド(20μg/ml)が融合30分前に添加され、すべてが溶液とその後使用される細胞培養媒体で保存され、その後細胞はPBS内の氷温度の4%フォルムアルデヒドで10分間固定された。PBSで3回洗浄したのちカバースリップはスライドに搭載され、そして暗箱内において4℃で一昼夜保管された。
マウス胚性線維芽細胞(MEF)調製:
12.5胎生期のメスのマウスを安楽死させた。胎仔が切除されハンクス液(HBSS)と共に皿にのせられた。頭、手足、および内臓は取り除かれた。残りの胎仔はメスまたは剃刀の刃で分割され、そして4mlのコラゲナーゼ溶液の入った15ml管に送入され、その後4mlで皿を洗浄し全ての胚性部材を得た。管は37℃のインキュベーターの中で全ての組織塊がなくなるまで30−60分回転された。消化された溶液は100ミクロンメッシュで濾過されて冷たいDMEM(30ml)で満たされた50ml管に移された。サンプルは1200rpmで5分間遠心分離され、そして細胞ペレットは再び25mlのDMEMで洗浄された。その後細胞は完全培地で播種された。
12.5胎生期のメスのマウスを安楽死させた。胎仔が切除されハンクス液(HBSS)と共に皿にのせられた。頭、手足、および内臓は取り除かれた。残りの胎仔はメスまたは剃刀の刃で分割され、そして4mlのコラゲナーゼ溶液の入った15ml管に送入され、その後4mlで皿を洗浄し全ての胚性部材を得た。管は37℃のインキュベーターの中で全ての組織塊がなくなるまで30−60分回転された。消化された溶液は100ミクロンメッシュで濾過されて冷たいDMEM(30ml)で満たされた50ml管に移された。サンプルは1200rpmで5分間遠心分離され、そして細胞ペレットは再び25mlのDMEMで洗浄された。その後細胞は完全培地で播種された。
XF24生体エネルギー検定法:
酸素消費速度(OCR)がシーホースXF24分析器(Seahorse Bioscience)を使用して既に記載(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)のように測定された。平衡の後、検査薬は酸素センサーカートリッジの試験薬送達室に事前導入され、そしてXF呼吸測定器が基礎酸素消費速度を読んだ後にウェルに注入された。酸素消費速度(pmol/分)が得られた。ベースラインの測定の後、検定媒体中に調製された70μlの試験薬がそれぞれのウェルに注入され、所望の濃度に達した。その後化合物の細胞タンパク質に対する露出を促進するため2分間混合され、そしてOCR測定が実施された。
酸素消費速度(OCR)がシーホースXF24分析器(Seahorse Bioscience)を使用して既に記載(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)のように測定された。平衡の後、検査薬は酸素センサーカートリッジの試験薬送達室に事前導入され、そしてXF呼吸測定器が基礎酸素消費速度を読んだ後にウェルに注入された。酸素消費速度(pmol/分)が得られた。ベースラインの測定の後、検定媒体中に調製された70μlの試験薬がそれぞれのウェルに注入され、所望の濃度に達した。その後化合物の細胞タンパク質に対する露出を促進するため2分間混合され、そしてOCR測定が実施された。
統計分析:
統計的比較が、2つのC2C12細胞の間およびALCAT1−/−と野生型マウスの差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。データは平均±SEMで表示され、p<0.05は統計的に有意であるとみなされた。
統計的比較が、2つのC2C12細胞の間およびALCAT1−/−と野生型マウスの差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。データは平均±SEMで表示され、p<0.05は統計的に有意であるとみなされた。
結果:
C2C12細胞において、ALCAT1はミトコンドリア分裂およびmtDNAの不安定性の原因となる:
ALCAT1はリゾカルジオリピン・アシル基転移酵素であって、病理学的にカルジオリピンのリモデリングを触媒し、それは糖尿病および肥満における活性酸素種(ROS)の生成およびミトコンドリア機能不全に繋がる。ROSはミトコンドリア分裂の原因となり、それは加齢に関連する疾病と考えられてきた。ここではALCAT1の過剰発現の役割が、フラッグタグ付けされたALCAT1cDNA(C2C12−A1)またはベクター対照(C2C12−V)を安定的に形質移入されたC2C12細胞系におけるミトコンドリアおよび小胞体(ER)形態の調節において研究された。C2C12−A1細胞におけるALCAT1のmRNA発現レベルがC2C12−V細胞より3倍だけ大きく(図8)、そして糖尿病または肥満の発症により誘導されたALCAT1発現レベルに適合する。図1A−1Iに示されるように(図1Cで定量化)、ALCAT1過剰発現はミトコンドリア分裂を引き起こし、それはC2C12−A1細胞における95%超の分裂したミトコンドリアにより証明される。さらにALCAT1過剰発現は、電子顕微鏡分析で分析されたように、C2C12−A1細胞において短小化したミトコンドリアおよびミトコンドリア膨化をもたらした(図1E、拡大図1G)。さらに、ALCAT1過剰発現はまた、ベクター対照と比較して小胞体拡大をもたらしたが(図1D、拡大図1F)、このことは以前報告されたALCAT1のミトコンドリア関連の膜(MAM)での局在に符合する。
ALCAT1はリゾカルジオリピン・アシル基転移酵素であって、病理学的にカルジオリピンのリモデリングを触媒し、それは糖尿病および肥満における活性酸素種(ROS)の生成およびミトコンドリア機能不全に繋がる。ROSはミトコンドリア分裂の原因となり、それは加齢に関連する疾病と考えられてきた。ここではALCAT1の過剰発現の役割が、フラッグタグ付けされたALCAT1cDNA(C2C12−A1)またはベクター対照(C2C12−V)を安定的に形質移入されたC2C12細胞系におけるミトコンドリアおよび小胞体(ER)形態の調節において研究された。C2C12−A1細胞におけるALCAT1のmRNA発現レベルがC2C12−V細胞より3倍だけ大きく(図8)、そして糖尿病または肥満の発症により誘導されたALCAT1発現レベルに適合する。図1A−1Iに示されるように(図1Cで定量化)、ALCAT1過剰発現はミトコンドリア分裂を引き起こし、それはC2C12−A1細胞における95%超の分裂したミトコンドリアにより証明される。さらにALCAT1過剰発現は、電子顕微鏡分析で分析されたように、C2C12−A1細胞において短小化したミトコンドリアおよびミトコンドリア膨化をもたらした(図1E、拡大図1G)。さらに、ALCAT1過剰発現はまた、ベクター対照と比較して小胞体拡大をもたらしたが(図1D、拡大図1F)、このことは以前報告されたALCAT1のミトコンドリア関連の膜(MAM)での局在に符合する。
ミトコンドリア分裂はしばしばmtDNAの不安定性と関連する:
アブノーマルなミトコンドリア形態を前提として、mtDNAコピー数と変異率を調節するALCAT1の役割がRT−PCR分析により研究された。驚くべきことに、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1細胞において有意にmtDNAコピー数を枯渇させた(図1H)。さらにALCAT1過剰発現は有意にmtDNA変異率を増大させ(図1I)、このことがミトコンドリア質量とmtDNA安定性の調節におけるALCAT1の主要な役割の証明となった。
アブノーマルなミトコンドリア形態を前提として、mtDNAコピー数と変異率を調節するALCAT1の役割がRT−PCR分析により研究された。驚くべきことに、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1細胞において有意にmtDNAコピー数を枯渇させた(図1H)。さらにALCAT1過剰発現は有意にmtDNA変異率を増大させ(図1I)、このことがミトコンドリア質量とmtDNA安定性の調節におけるALCAT1の主要な役割の証明となった。
マウスにおいてALCAT1消失はミトコンドリア質量とmtDNA忠実性を増大させる:
ALCAT1ノックアウトマウスを使用してALCAT1欠乏の影響、ミトコンドリア形態、mtDNA質量、およびmtDNA変異率への影響が単離マウス胚性線維芽細胞(MEF)および骨格筋において電子顕微鏡で研究された。C2C12細胞での発見を支持して、ALCAT1欠乏は培養MEFにおいて有意にミトコンドリア密度を増大させた(図2B,拡大図2D)。ALCAT1消失は前脛骨筋縦断面において有意に筋肉繊維の厚みを増大させ、それはそれぞれミオシンフィラメントとアクチンフィラメントを示す拡大図の暗いAバンドと明るいIバンドにより証明されている(図2F)。この結果はALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に除脂肪質量を増大させたというデータにより指示された。さらにALCAT1消失は有意にmtDNAコピー数を増大させた(図2G)。驚くべきことに、ALCAT1欠乏はまた、有意にmtDNA忠実性を改善した、それはALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおける有意に低い変異率により証明された(図2H)。
ALCAT1ノックアウトマウスを使用してALCAT1欠乏の影響、ミトコンドリア形態、mtDNA質量、およびmtDNA変異率への影響が単離マウス胚性線維芽細胞(MEF)および骨格筋において電子顕微鏡で研究された。C2C12細胞での発見を支持して、ALCAT1欠乏は培養MEFにおいて有意にミトコンドリア密度を増大させた(図2B,拡大図2D)。ALCAT1消失は前脛骨筋縦断面において有意に筋肉繊維の厚みを増大させ、それはそれぞれミオシンフィラメントとアクチンフィラメントを示す拡大図の暗いAバンドと明るいIバンドにより証明されている(図2F)。この結果はALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に除脂肪質量を増大させたというデータにより指示された。さらにALCAT1消失は有意にmtDNAコピー数を増大させた(図2G)。驚くべきことに、ALCAT1欠乏はまた、有意にmtDNA忠実性を改善した、それはALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおける有意に低い変異率により証明された(図2H)。
MFN2発現の調節におけるALCAT1の中心的役割:
MFN2はミトコンドリアおよび小胞体の形態および繋留に機能性ブリッジとして必要である。MFN2−/−マウスからのマウス胎仔由来線維芽細胞(MEF)は分裂したミトコンドリアおよび拡張した小胞体槽を示し、それらはALCAT1過剰発現に起因する不全に似ている。つぎの疑問はALCAT1過剰発現および欠乏症がMNF2およびミトコンドリア融合プロセスの他の調節因子の発現に相反する影響を与えるかであった。図3Aに示すように、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1安定細胞系においてベクター対照に比べて70%超のMFN2 mRNAの枯渇、およびMFN1とOPA1 mRNAの両方の50%の減少を引き起こした。逆にALCAT1欠乏は、ALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおいて、劇的にMFN2 mRNAの転写と、同時にMFN1 mRNAレベルの有意な増大を示した(図3B)。しかしALCAT1欠乏はミトコンドリア内膜の融合に必要なOPA1のmRNA発現に対し、なにも影響を及ぼさなかった。
MFN2はミトコンドリアおよび小胞体の形態および繋留に機能性ブリッジとして必要である。MFN2−/−マウスからのマウス胎仔由来線維芽細胞(MEF)は分裂したミトコンドリアおよび拡張した小胞体槽を示し、それらはALCAT1過剰発現に起因する不全に似ている。つぎの疑問はALCAT1過剰発現および欠乏症がMNF2およびミトコンドリア融合プロセスの他の調節因子の発現に相反する影響を与えるかであった。図3Aに示すように、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1安定細胞系においてベクター対照に比べて70%超のMFN2 mRNAの枯渇、およびMFN1とOPA1 mRNAの両方の50%の減少を引き起こした。逆にALCAT1欠乏は、ALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおいて、劇的にMFN2 mRNAの転写と、同時にMFN1 mRNAレベルの有意な増大を示した(図3B)。しかしALCAT1欠乏はミトコンドリア内膜の融合に必要なOPA1のmRNA発現に対し、なにも影響を及ぼさなかった。
減少したmRNAレベルと符合して、3つのタンパク質全ての発現もまたALCAT1過剰発現により有意に下方制御された。詳細には、MFN2はベクター対照と比較して74.6%の劇的な減少を示し、次にMFN1(38.0%)、OPA1(12%)であった(図3C)。逆にMFN2タンパク質レベルはALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおいて、600%超上方調節された(図3D、定量分析図3E)。ALCAT1欠乏はまたMNF1およびプロヒビチン、ミトコンドリアの最適形態および呼吸に必要なミトコンドリア膜シャペロンタンパク質、の発現を有意に増大させた。対照的にALCAT1欠乏はOPA1またはカルネキシン、小胞体内に存在するタンパク質、に影響を与えなかった(図3E)。
ALCAT1はMFN2枯渇を通じてミトコンドリア融合を損なう:
ALCAT1がMFN2を枯渇させ、ミトコンドリア分裂を引き起こすことの発見は、ミトコンドリア融合を調節するALCAT1の役割に関する研究を促進させた。ミトコンドリア マトリックス標的EGFP(mtEGFP)または赤色蛍光タンパク質(mtRFP)が個別にC2C12−A1およびC2C12−V2細胞に形質移入され、その後EGFPとRFPの重複の測定による共焦点顕微鏡を使用した融合分析が行われた。図4A−4Cに示すように、ベクター対照C2C12細胞内のミトコンドリアは正常なミトコンドリア融合を示し、それは図4C(拡大図4D)の統合図において完全な融合を証明する黄色により証明された。対照的にC2C12細胞内のALCAT1過剰発現は重大な融合不全をひき起こし(図4E−4H)、それは図4Gの統合画像(拡大図4H)におけるよく分離した緑色と赤色により証明された。融合不全におけるMFN2欠乏の原因となる役割の直接的サポートとして、C2C12−A1細胞におけるMFN2の一過性発現が融合不全を完全に救済した、それは統合図4K(拡大図4L)における黄色により証明される。MFN2発現はまたミトコンドリアのスーパー融合を引き起こした、それはMFN2を過剰発現するC2C12−A細胞における厚いミトコンドリア管状ネットワーク(図4I−4K)により証明された。
ALCAT1がMFN2を枯渇させ、ミトコンドリア分裂を引き起こすことの発見は、ミトコンドリア融合を調節するALCAT1の役割に関する研究を促進させた。ミトコンドリア マトリックス標的EGFP(mtEGFP)または赤色蛍光タンパク質(mtRFP)が個別にC2C12−A1およびC2C12−V2細胞に形質移入され、その後EGFPとRFPの重複の測定による共焦点顕微鏡を使用した融合分析が行われた。図4A−4Cに示すように、ベクター対照C2C12細胞内のミトコンドリアは正常なミトコンドリア融合を示し、それは図4C(拡大図4D)の統合図において完全な融合を証明する黄色により証明された。対照的にC2C12細胞内のALCAT1過剰発現は重大な融合不全をひき起こし(図4E−4H)、それは図4Gの統合画像(拡大図4H)におけるよく分離した緑色と赤色により証明された。融合不全におけるMFN2欠乏の原因となる役割の直接的サポートとして、C2C12−A1細胞におけるMFN2の一過性発現が融合不全を完全に救済した、それは統合図4K(拡大図4L)における黄色により証明される。MFN2発現はまたミトコンドリアのスーパー融合を引き起こした、それはMFN2を過剰発現するC2C12−A細胞における厚いミトコンドリア管状ネットワーク(図4I−4K)により証明された。
MNF1/2が、しかしOPA1は違うが、ALCAT1起因のミトコンドリア分裂を救済する:
MNF2はALCAT1起因の融合不全を救済できるため、MFN1やOPA1のようなダイナミン関連ファミリーの他のメンバーが、C2C12−A1細胞内にミトコンドリアネットワークを回復することにより、融合不全を救済できるかが疑問となった。上記のように、ALCAT1過剰発現は、ベクター対照(図5A、5B)と比較した場合に、C2C12−A1細胞においてミトコンドリア分裂を引き起こした(図5C,5D)。対照的にC2C12−A1細胞における一過性MFN1発現はほとんど完全に融合不全を救済した、それは管状ミトコンドリアの回復によって示されている(図5E,5F)。繰り返すが、MFN2の一過性発現は融合不全を完全に救済し、ミトコンドリアのスーパー融合をもたらした(図5G,5H)。
MNF2はALCAT1起因の融合不全を救済できるため、MFN1やOPA1のようなダイナミン関連ファミリーの他のメンバーが、C2C12−A1細胞内にミトコンドリアネットワークを回復することにより、融合不全を救済できるかが疑問となった。上記のように、ALCAT1過剰発現は、ベクター対照(図5A、5B)と比較した場合に、C2C12−A1細胞においてミトコンドリア分裂を引き起こした(図5C,5D)。対照的にC2C12−A1細胞における一過性MFN1発現はほとんど完全に融合不全を救済した、それは管状ミトコンドリアの回復によって示されている(図5E,5F)。繰り返すが、MFN2の一過性発現は融合不全を完全に救済し、ミトコンドリアのスーパー融合をもたらした(図5G,5H)。
対照的にOPA1の一過性発現はどの融合不全をも救済しなかった(図5I,5J)。このことはALCAT1欠乏がMEF内でOPA1の発現に何の影響も与えなかったこと(図3B,3E)と符合する。この結果は、ALCAT1媒介融合不全がALCAT1が局在するミトコンドリア外膜に限定されることを証明する。
MFN2はALCAT1過剰発現に起因するミトコンドリア呼吸不全を救済する:
次にC2C12−A1細胞においてMFN2発現がまたミトコンドリア呼吸機能を回復できるかが研究された。ALCAT1はミトコンドリアのプロトン漏出を増大させることによりミトコンドリアの機能不全をひき起こす。プロトン漏出に対するMFN2の役割が、異なるミトコンドリア阻害剤による処置に応答した酸素消費速度(OCR)をC2C12−A1細胞において分析することによって調査された。Seahorse Extracellular Flux(XF−24)分析器を使用して、ALCAT1過剰発現が有意にミトコンドリア最大容量を低下させたことが示され、それはミトコンドリア脱共役剤のFCCPによる処置に応答したOCRの減少により示された(図6A)。MFN2の一過性発現がミトコンドリア呼吸能力を完全に回復し、しかしEGFPベクター対照ではそうではないが、それはベクター対照に比較したOCRの回復により証明された(図6A)。活性酸素種(ROS)生成の主要サイトとしての呼吸鎖複合体Iと符合して、ALCAT1過剰発現は、呼吸鎖複合体I阻害薬(NADH CoQI 還元酵素)ロテノンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、これはミトコンドリアのプロトン漏出の証拠を提供した。MFN2欠乏が酸化ストレスにおいて原因となる役割を果たすことのサポートとして、C2C12−A1細胞においてMNF2の一過性発現が完全にOCRを正常化させた(図6B)。さらにALCAT1過剰発現がまたミトコンドリアのアデノシン三リン酸分解酵素(ATPase)阻害薬のオリゴマイシンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、このことはさらにプロトン漏出を示唆した。不全はまた、MNF2の一過性発現により完全に正常化した(図6D)。対照的に、ALCAT1発現もMFN発現も、呼吸鎖複合体III阻害薬であるアンチマイシンでの処置に応答して複合体IIIからのOCRに何の影響も及ぼさなかった。
次にC2C12−A1細胞においてMFN2発現がまたミトコンドリア呼吸機能を回復できるかが研究された。ALCAT1はミトコンドリアのプロトン漏出を増大させることによりミトコンドリアの機能不全をひき起こす。プロトン漏出に対するMFN2の役割が、異なるミトコンドリア阻害剤による処置に応答した酸素消費速度(OCR)をC2C12−A1細胞において分析することによって調査された。Seahorse Extracellular Flux(XF−24)分析器を使用して、ALCAT1過剰発現が有意にミトコンドリア最大容量を低下させたことが示され、それはミトコンドリア脱共役剤のFCCPによる処置に応答したOCRの減少により示された(図6A)。MFN2の一過性発現がミトコンドリア呼吸能力を完全に回復し、しかしEGFPベクター対照ではそうではないが、それはベクター対照に比較したOCRの回復により証明された(図6A)。活性酸素種(ROS)生成の主要サイトとしての呼吸鎖複合体Iと符合して、ALCAT1過剰発現は、呼吸鎖複合体I阻害薬(NADH CoQI 還元酵素)ロテノンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、これはミトコンドリアのプロトン漏出の証拠を提供した。MFN2欠乏が酸化ストレスにおいて原因となる役割を果たすことのサポートとして、C2C12−A1細胞においてMNF2の一過性発現が完全にOCRを正常化させた(図6B)。さらにALCAT1過剰発現がまたミトコンドリアのアデノシン三リン酸分解酵素(ATPase)阻害薬のオリゴマイシンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、このことはさらにプロトン漏出を示唆した。不全はまた、MNF2の一過性発現により完全に正常化した(図6D)。対照的に、ALCAT1発現もMFN発現も、呼吸鎖複合体III阻害薬であるアンチマイシンでの処置に応答して複合体IIIからのOCRに何の影響も及ぼさなかった。
ALCAT1が酸化ストレスをミトコンドリア分裂とMFN2欠乏にリンクさせる:
酸化ストレスからのミトコンドリア融合不全はミトコンドリア透過性転位孔を開けることによりミトコンドリア膨化を引き起こす。損傷したミトコンドリアはしばしばより多くの活性酸素種(ROS)を生成し、それがさらにミトコンドリア機能不全を悪化させ、悪循環に至る。ALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングは酸化ストレスを引き起こすため、ALCAT1がその悪循環のなかである役割を果たすのかが疑問となり、それはALCAT1ノックアウトマウスおよび対照マウスからの単離MEFにおいてテストされた。図7A(拡大図7C)に示すように、対照マウスからのMEFはH2O2での処置に応答して激しいミトコンドリア膨化を示し、それは増大したミトコンドリアと損傷したクリステにより証明された。ALCAT1過剰発現は、ベクター対照に比べて最大のALCAT1発現を示すC2C12安定細胞系の1つにおいて激しいミトコンドリア膨化を引き起こした(図10)。この極端な特性のため、このC2C12細胞系は本発明の研究には使用されなかった。対照的にALCAT1欠乏は、単離MEFにおいてH2O2での処置に応答したミトコンドリア膨化(図7B、拡大図7D)およびミトコンドリア分裂(図9A−9D)を完全に防止した。
酸化ストレスからのミトコンドリア融合不全はミトコンドリア透過性転位孔を開けることによりミトコンドリア膨化を引き起こす。損傷したミトコンドリアはしばしばより多くの活性酸素種(ROS)を生成し、それがさらにミトコンドリア機能不全を悪化させ、悪循環に至る。ALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングは酸化ストレスを引き起こすため、ALCAT1がその悪循環のなかである役割を果たすのかが疑問となり、それはALCAT1ノックアウトマウスおよび対照マウスからの単離MEFにおいてテストされた。図7A(拡大図7C)に示すように、対照マウスからのMEFはH2O2での処置に応答して激しいミトコンドリア膨化を示し、それは増大したミトコンドリアと損傷したクリステにより証明された。ALCAT1過剰発現は、ベクター対照に比べて最大のALCAT1発現を示すC2C12安定細胞系の1つにおいて激しいミトコンドリア膨化を引き起こした(図10)。この極端な特性のため、このC2C12細胞系は本発明の研究には使用されなかった。対照的にALCAT1欠乏は、単離MEFにおいてH2O2での処置に応答したミトコンドリア膨化(図7B、拡大図7D)およびミトコンドリア分裂(図9A−9D)を完全に防止した。
酸化ストレスの主要原因としてのALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングをサポートするものとして、ALCAT1過剰発現はC2C12細胞において脂肪の過酸化を有意に増大させ、それはH2O2での処置により用量に依存して悪化し、それは脂質の過酸化生成物であるマロンジアルデヒド(MDA)の増大したレベルにより示された(図7E)。ミトコンドリアは、活性酸素種(ROS)生成の随伴性増加と共に速く分裂する。次の疑問はALCAT1が活性酸素種(ROS)生成を介してMFN2欠乏を引き起こすかであった。C2C12−A1細胞とベクター対照が図7Eで使用されたH2O2の増大する用量で処置され、その後MEN2発現の分析がウェスタンブロット法により行われた。図7Fに示すように、H2O2はベクター対照細胞において用量依存的にMFN1とMFN2発現を枯渇させた。この処置はさらにALCAT1のMFN1とMFN2枯渇に対する影響を悪化させ、C2C12−A1細胞においてMFN2発現が完全に失われた。最後にMFN枯渇の主要原因としてのALCAT1による酸化ストレスを直接サポートするものとして、抗酸化剤のジフェニレンヨードニウム(DPI)によるC2C12−A1細胞のプレインキュベーションは、図7Fに使用されたH2O2での同一の処置に応答したMFN発現の消失を、DPI用量に依存して阻害した(図7G)。
(議論)
ミトコンドリアが融合イベントを経験すると、動的なネットワークが形成され、それは関与するミトコンドリアの区画を連続したものにさせる。融合イベントは各ネットワークの構成員が溶質、代謝生成物、およびタンパク質を共有できるようにする。結果的にこのようなネットワークの破壊は酸化ストレスとミトコンドリア分裂を引き起こし、それは加齢と加齢関連疾病の原因として関連付けられてきた。しかし、根底にあるメカニズムについてはほとんど知られていない。本発明の研究は通常加齢関連代謝疾病に伴う酸化ストレスおよびミトコンドリア分裂を調節するALCAT1の役割を調査した。ミトコンドリア生合成とmtDNA忠実性の調節におけるALCAT1の最重要な役割が初めて示された。したがって、ALCAT1の過剰発現はミトコンドリア融合を激しく損ない、ミトコンドリア分裂とmtDNA枯渇につながる。逆にマウスにおけるALCAT1の標的化不活化は、有意にミトコンドリア質量を増大させ、そして活性酸素種(ROS)誘導膨化および分裂からミトコンドリアを保護する。驚くべきことに、mtDNAの忠実度を調節するALCAT1の役割が示されたが、それはmtDNA完全性を守るためにはミトコンドリア融合が必要であるという従来の研究(Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)により実証された。
ミトコンドリア融合におけるALCAT1の役割のサポートとして、本研究はMFN2をALCAT1媒介ミトコンドリア機能不全の下流ターゲットとして識別した。MFN2は哺乳類においてミトコンドリア融合、小胞体との繋留、エネルギー代謝、そしてmtDNA忠実性に必要とされる(Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289;de Brito OM& Scorrano L(2008),Nature 456:605−610)。ALCAT1の過剰発現はC2C12細胞において激しくMNF2発現を枯渇させたが、一方ALCAT1欠乏はALCAT1ノックアウトマウス(KO)から単離されたMEF細胞において劇的にMFN2発現を増大させた。対照的にALCAT1欠乏は、ミトコンドリア内膜の融合に必要なOPA1の発現に何の影響も及ぼさなかった。この結果は、ALCAT1は、ALCAT1が局在するミトコンドリア外膜の融合に関してのみ影響を与える(Li J他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)ことについて証拠を提供し、このことはさらに25%のカルジオリピン(CL)が、活性CLリモデリングが行われる外膜に局在するという従来のレポート(Gebert N氏他著(2009)Curr Biol 19(24):2133−2139)により実証されている。
ALCAT1媒介融合欠陥の下流ターゲットとしてのMNF2に符合して、マウスにおける標的化MFN2不活化はALCAT1過剰発現を連想させる多重のミトコンドリア欠陥をひき起こし、それらにはmtDNAの高変異率、mtDNA枯渇、分裂したミトコンドリア、およびミトコンドリアと小胞体の繋留の重度な遺失を含む。MFN2欠乏はまた骨格筋委縮症を引き起こし、それはALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に骨格重量を増大させたという発見に符合する(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165;Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)。ALCAT1の下流ターゲットとしてのMFN2の直接的サポートとして、ALCAT1起因の融合欠陥がMFN1またはMFN2の発現により救済可能であり、しかしOPA1ではそうではない。さらにMFN2の発現はまた、ミトコンドリア呼吸能力を回復し、C2C12細胞においてALCAT1過剰発現に起因するプロトン漏出を阻害した。これらの結果はMFN2欠乏が有意にプロトン漏出を増大させ(Bach D氏他著(2003)J Biol Chem278(19):17190−17197),一方MFN2過剰発現は高血糖症誘発活性酸素種(ROS)生成を阻害する(Yu T,Robotham JL,& Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(8):2653−2658)という観察と符合した。
ALCAT1媒介融合欠陥の下流ターゲットとしてのMNF2に符合して、マウスにおける標的化MFN2不活化はALCAT1過剰発現を連想させる多重のミトコンドリア欠陥をひき起こし、それらにはmtDNAの高変異率、mtDNA枯渇、分裂したミトコンドリア、およびミトコンドリアと小胞体の繋留の重度な遺失を含む。MFN2欠乏はまた骨格筋委縮症を引き起こし、それはALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に骨格重量を増大させたという発見に符合する(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165;Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)。ALCAT1の下流ターゲットとしてのMFN2の直接的サポートとして、ALCAT1起因の融合欠陥がMFN1またはMFN2の発現により救済可能であり、しかしOPA1ではそうではない。さらにMFN2の発現はまた、ミトコンドリア呼吸能力を回復し、C2C12細胞においてALCAT1過剰発現に起因するプロトン漏出を阻害した。これらの結果はMFN2欠乏が有意にプロトン漏出を増大させ(Bach D氏他著(2003)J Biol Chem278(19):17190−17197),一方MFN2過剰発現は高血糖症誘発活性酸素種(ROS)生成を阻害する(Yu T,Robotham JL,& Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(8):2653−2658)という観察と符合した。
ミトコンドリア分裂/融合機構は、高血糖症関連疾病において急性および慢性の活性酸素種(ROS)生成を制御する(Yu T,Robotham JL,& Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(8):2653−2658)。ミトコンドリアは、酸化ストレスに応答して、速い分裂と同時に活性酸素種(ROS)生成を増大させるが、これは分裂の阻害または融合プロセスの刺激により緩和される。本発明の研究により、ALCAT1が代謝疾病においてミトコンドリア融合欠陥と活性酸素種(ROS)生成との間のミッシングリンクであることがわかった。第一に、ALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングが有意にCL内のDHA含有量を増大させ、それがプロトン漏出と酸化ストレスに繋がった。哺乳類において、ミトコンドリア膜のDHA含有量は寿命と逆相関し、そしてROS生成および脂質過酸化インデックスと正相関する。従って加齢および加齢関連疾病における、脂質過酸化インデックスを増大させるカルジオリピン(CL)内の増大したDHA含有量は、ミトコンドリア機能不全と関連付けられてきた(Han X他著(2007)Biochemistry 46(21):6417−6428;Sparagna GC & Lesnefsky EJ(2009) J Cardiovasc Pharmacol 53(4):290−301;Lee H−J,(2006)Lipids Health & Dis.5:2;Paradies G他著、(2010)Free Radic Biol Med 48(10):1286−1295;Shi Y(2010) J Biomed Res24(1):6−15)。第二に、ALCAT1過剰発現は激しい脂質過酸化をC2C12細胞において引き起こし、それは酸化ストレスによりさらに悪化した。最後に、融合不全の主要原因としてのALCAT1による酸化ストレスの直接的サポートとして、ALCAT1過剰発現が有意にMFN2発現を枯渇させ、それはC2C12細胞を抗酸化薬で事前処置することにより緩和できる。総括すると、図7Hに示すように、加齢関連疾病において、MNF2の枯渇化を介してROS生成をミトコンドリア分裂に結び付けるALCAT1の重要な役割をこれらの発見が支持している。
ミトコンドリア融合におけるALCAT1の調節的役割はさらに,CL代謝に関係するミトコンドリアホスホリパーゼD(MitoPLD)に関する最近の研究(Chio SY氏他著(2006)Nat Cell Biol8(11):1255−1262)により理解される。Mito−PLDはミトコンドリア外膜に局在し、そこでCLの加水分解を触媒し、ミトコンドリア融合に必要なホスファチジン酸、融合性脂質を生成する。驚くべきことに、Mito−PLD欠乏は融合不全およびミトコンドリア分裂を含むミトコンドリア機能不全をもたらし、それはALCAT1過剰発現によるものを連想させる。しかし基底にあるメカニズムには有意の相違点がある。例えば、Mito−PLDはMFN2の下流で機能し、そしてMito−PLD発現はマイトフュージン(MFN)欠乏に起因する融合不全を救済することができる。さらに、ALCAT1と対照的に、MFN1とMFN2のタンパク質発現レベルはMito−PLD過剰発現または欠乏により変化されない。さらにまた、Mito−PLD過剰発現はスーパー融合と同時にマイルドなカルジオリピン(CL)欠乏を引き起こす。最後に、Mito−PLDは最近になってマウスにおけるpiRNA安定性および雄性不妊を調節する役割が発表されている(Huang H氏他著(2011)Dev Cell20(3):376−387)。ここに記載される発見は、ALCAT1によるCLリモデリングはホスファチジン酸生成と無関係にミトコンドリア融合を調節することを証明する。
加齢と加齢関連疾病の発症は酸化ストレスおよび増大したmtDNA変異率を伴い、それらは加齢と加齢関連疾病の主たる要因であると言われてきた。また、MFN2欠乏は加齢関連代謝疾病と関連付けられてきた。重要なことに、本研究がmtDNA忠実性とMFN2発現の制御におけるALCAT1の役割を同定した。ここに記載される発見は加齢と加齢関連疾病の発症の基礎となる分子メカニズムを解明する将来の研究において重要な意味を持つであろう。加齢と加齢関連疾病の発症におけるALCAT1の役割のサポートとして、ALCAT1発現は酸化ストレスによりまた加齢関連代謝疾病の発症により上方調節される。ALCAT1の標的化不活化は、肥満とそれに関連するミトコンドリア機能不全を防止する。従って、将来ALCAT1に対する化学的阻害薬の開発が加齢と加齢関連疾病の潜在的治療方法を提供することが想像できる。
(実施例2:ALCAT1によるカルジオリピンリモデリングが酸化ストレスおよびマイトファジーへの影響を介して心筋症を調節する)
甲状腺機能亢進症を患うマウスを酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全の齧歯(げつし)動物モデルとして使用して、本研究は甲状腺機能亢進症に伴う心筋症におけるALCAT1の役割を調査した。その結果は、酸化ストレスおよびマイトファジーを介した甲状腺ホルモン誘発心肥大におけるALCAT1の重要な役割を初めて示した。
甲状腺機能亢進症を患うマウスを酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全の齧歯(げつし)動物モデルとして使用して、本研究は甲状腺機能亢進症に伴う心筋症におけるALCAT1の役割を調査した。その結果は、酸化ストレスおよびマイトファジーを介した甲状腺ホルモン誘発心肥大におけるALCAT1の重要な役割を初めて示した。
(材料と方法)
試験薬:
本研究に使用された抗体はphospho−AKT(Thr308),AKT,Phopho−S6K1(Thr389),S6K1,phospho−S6(Ser240/244),S6,phospho−4E−BP1(Thr37/46),4E−BP1に対するポリクローナル抗体を含み、それらすべてはCell Signaling Technology社(Danvers,MA)から購入した。抗LC3抗体はNovus Biologicalsより、抗p62抗体はAmerican Research Products Inc(Belmont,MA)から購入した。PINK1ポリクローナル抗体(A01)はAbnova社より購入した。ロバ抗ラビットIgG西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体はGE Healthcare(Piscataway,NJ)より購入した。L−チロキシン(T4)および3,3‘,5−トリヨード−L−チロニン ナトリウム塩(T3)はSigmaから購入した。
本研究に使用された抗体はphospho−AKT(Thr308),AKT,Phopho−S6K1(Thr389),S6K1,phospho−S6(Ser240/244),S6,phospho−4E−BP1(Thr37/46),4E−BP1に対するポリクローナル抗体を含み、それらすべてはCell Signaling Technology社(Danvers,MA)から購入した。抗LC3抗体はNovus Biologicalsより、抗p62抗体はAmerican Research Products Inc(Belmont,MA)から購入した。PINK1ポリクローナル抗体(A01)はAbnova社より購入した。ロバ抗ラビットIgG西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体はGE Healthcare(Piscataway,NJ)より購入した。L−チロキシン(T4)および3,3‘,5−トリヨード−L−チロニン ナトリウム塩(T3)はSigmaから購入した。
H9c2安定細胞系の生成:
H9c2細胞が安定的にFLAG−タグ付きのALCAT1発現ベクターまたは対照としての空ベクターを形質移入された。安定的な形質移入体はG418(1mg/ml)により選別され、そしてダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Gibco社より)で培養され、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えられ、95%空気5%CO2 中で、温度37℃で維持された。
H9c2細胞が安定的にFLAG−タグ付きのALCAT1発現ベクターまたは対照としての空ベクターを形質移入された。安定的な形質移入体はG418(1mg/ml)により選別され、そしてダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Gibco社より)で培養され、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えられ、95%空気5%CO2 中で、温度37℃で維持された。
動物飼育:
ALCAT1遺伝子を標的化欠失したマウスが前述のとおり(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)生成された。甲状腺機能亢進性心筋症の誘発のため、雄のALCAT1ノックアウトマウスと年齢適合野生型(WT)マウス(年齢8−9週)が2つのグループに分けられた。1つのグループは0.01N NaOHと0.9%NaClの溶媒内の甲状腺ホルモンで2日間または4週間処置された(レボチロキシン、Sigma CAS51−48−9,1mg/kg体重を毎日腹腔内注射により投与)。マウスの対照グループは同一の溶媒を同一の期間注入された。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、食餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
ALCAT1遺伝子を標的化欠失したマウスが前述のとおり(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)生成された。甲状腺機能亢進性心筋症の誘発のため、雄のALCAT1ノックアウトマウスと年齢適合野生型(WT)マウス(年齢8−9週)が2つのグループに分けられた。1つのグループは0.01N NaOHと0.9%NaClの溶媒内の甲状腺ホルモンで2日間または4週間処置された(レボチロキシン、Sigma CAS51−48−9,1mg/kg体重を毎日腹腔内注射により投与)。マウスの対照グループは同一の溶媒を同一の期間注入された。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、食餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
心エコー検査:
4週間の甲状腺ホルモン処置の後、マウスはナトリウム・ペントバルビタールの腹腔内注射により軽く麻酔をかけられた(75μg/g体重)。経胸腔心エコー検査が14MHz線形変換器を備えるアキューソンセコイアモデル512心エコーシステムを使用して行われた(シーメンス、Malvern,PA)。以下のパラメータが測定された:拡張期の最後での心室間隔壁の厚み(IVSD)、左心室の拡張終末期寸法(LVEDD)、拡張期の最後での後壁の厚み(LVPWD)。
4週間の甲状腺ホルモン処置の後、マウスはナトリウム・ペントバルビタールの腹腔内注射により軽く麻酔をかけられた(75μg/g体重)。経胸腔心エコー検査が14MHz線形変換器を備えるアキューソンセコイアモデル512心エコーシステムを使用して行われた(シーメンス、Malvern,PA)。以下のパラメータが測定された:拡張期の最後での心室間隔壁の厚み(IVSD)、左心室の拡張終末期寸法(LVEDD)、拡張期の最後での後壁の厚み(LVPWD)。
定量PCR分析:
定量PCR分析が前述の通り(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)実施された。ベクターとALCAT1過剰発現H9c2細胞内のミトコンドリアコピー数の分析が、ミトコンドリアコード化NADH脱水素酵素1(ND1)をmtDNAマーカーとして、そしてシクロフィリンAを遺伝子マーカーとして使用して実施された。H9c2細胞は0.1,0.25,0.5mMのH2O2で2時間事前処理され、その後RT−PCR分析がND1に対するプライマー対(フォワード:5′−TGACCCATAGCCATAATATGATTT−3′(SEQ ID NO:1)とリバース:5′−TTCTACGTTAAACCCTGATACTAA−3′(SEQ ID NO:2))、およびシクロフィリンA(フォワード:5′−ACACGCCATAATGGCACTCC−3′(SEQ ID NO:3)とリバース:5′−CAGTCTTGGCAGTGCAGAT−3′(SEQ ID NO:4))を使用して実施された。バイオマーカーの定量PCR分析が、β−MHCに対するプライマー対(フォワード:5′−AGGGCGACCTCAACGAGAT−3′(SEQ ID NO:5)とリバース:5′−CAGCAGACTCTGGAGGCTCTT−3′(SEQ ID NO:6)),BNP(フォワード:5′−GCTGCTTTGGGCACAAGATAG−3′(SEQ ID NO:7)とリバース:5′−GGAGCTCTTCCTACAACAACTT−3′(SEQ ID NO:8)),ANP(フォワード:5′−GTGTACAGTGCGGTGTCCAA−3′(SEQ ID NO:9)とリバース:5′−ACCTCATCTTCTACCGGATC−3′(SEQ ID NO:10)),ACTA1(フォワード:5′−GTTCGCGCTCTCTCTCCTCA−3′(SEQ ID NO:11)とリバース:5′−GCAACCACAGCACGATTGTC−3′(SEQ ID NO:12)),コラーゲンI(フォワード:5′−GAGCGGAGAGTACTGGATCG−3′(SEQ ID NO:13)とリバース:5′−GTTCGGGCTGATGTACCAGT−3′(SEQ ID NO:14)),コラーゲンIII(フォワード:5′−ACCAAAAGGTGATGCTGGAC−3′(SEQ ID NO:15)とリバース:5′−GACCTCGTGCTCCACTTAGC−3′(SEQ ID NO:16)),およびGAPDH(フォワード:5′−AATGGTGAAGGTCGGTGTG−3′(SEQ ID NO:17)とリバース:5′−GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG−3′(SEQ ID NO:18))を使用して実施された。
定量PCR分析が前述の通り(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)実施された。ベクターとALCAT1過剰発現H9c2細胞内のミトコンドリアコピー数の分析が、ミトコンドリアコード化NADH脱水素酵素1(ND1)をmtDNAマーカーとして、そしてシクロフィリンAを遺伝子マーカーとして使用して実施された。H9c2細胞は0.1,0.25,0.5mMのH2O2で2時間事前処理され、その後RT−PCR分析がND1に対するプライマー対(フォワード:5′−TGACCCATAGCCATAATATGATTT−3′(SEQ ID NO:1)とリバース:5′−TTCTACGTTAAACCCTGATACTAA−3′(SEQ ID NO:2))、およびシクロフィリンA(フォワード:5′−ACACGCCATAATGGCACTCC−3′(SEQ ID NO:3)とリバース:5′−CAGTCTTGGCAGTGCAGAT−3′(SEQ ID NO:4))を使用して実施された。バイオマーカーの定量PCR分析が、β−MHCに対するプライマー対(フォワード:5′−AGGGCGACCTCAACGAGAT−3′(SEQ ID NO:5)とリバース:5′−CAGCAGACTCTGGAGGCTCTT−3′(SEQ ID NO:6)),BNP(フォワード:5′−GCTGCTTTGGGCACAAGATAG−3′(SEQ ID NO:7)とリバース:5′−GGAGCTCTTCCTACAACAACTT−3′(SEQ ID NO:8)),ANP(フォワード:5′−GTGTACAGTGCGGTGTCCAA−3′(SEQ ID NO:9)とリバース:5′−ACCTCATCTTCTACCGGATC−3′(SEQ ID NO:10)),ACTA1(フォワード:5′−GTTCGCGCTCTCTCTCCTCA−3′(SEQ ID NO:11)とリバース:5′−GCAACCACAGCACGATTGTC−3′(SEQ ID NO:12)),コラーゲンI(フォワード:5′−GAGCGGAGAGTACTGGATCG−3′(SEQ ID NO:13)とリバース:5′−GTTCGGGCTGATGTACCAGT−3′(SEQ ID NO:14)),コラーゲンIII(フォワード:5′−ACCAAAAGGTGATGCTGGAC−3′(SEQ ID NO:15)とリバース:5′−GACCTCGTGCTCCACTTAGC−3′(SEQ ID NO:16)),およびGAPDH(フォワード:5′−AATGGTGAAGGTCGGTGTG−3′(SEQ ID NO:17)とリバース:5′−GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG−3′(SEQ ID NO:18))を使用して実施された。
脂質過酸化検定法:
心室組織内の脂質過酸化物およびH9c2細胞がTBARSキット(Cayman Chemical Company,Cat No.10009055)をメーカーの指示通り使用してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)のレベルを測定することにより定量化された。
心室組織内の脂質過酸化物およびH9c2細胞がTBARSキット(Cayman Chemical Company,Cat No.10009055)をメーカーの指示通り使用してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)のレベルを測定することにより定量化された。
活性酸素種(ROS)測定:
ミトコンドリアからの細胞内活性酸素種(ROS)生成が定量的に過酸化水素(H2O2)を測定することにより間接的に検知された。
ミトコンドリアからの細胞内活性酸素種(ROS)生成が定量的に過酸化水素(H2O2)を測定することにより間接的に検知された。
ミトコンドリアの電子顕微鏡(EM)分析:
マウス心筋細胞のミトコンドリアの超微細構造が電子顕微鏡写真を使用して評価された。心臓サンプルが各グループの3匹のマウスからの左心室の同じ場所において採取された。左心室の一部は0.05%のCaCl2を含む0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)内の5%グルタルアルデヒドと4%パラホルムアルデヒドで24時間固定された。0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、組織は1%OsO4および0.1Mカコジル酸緩衝液内で一晩中、後固定され、脱水され、そしてEmbed812に埋め込まれた。切片は2%酢酸ウラニルで、次に0.4%クエン酸鉛で染色され、Philips 400電子顕微鏡で観察された。
マウス心筋細胞のミトコンドリアの超微細構造が電子顕微鏡写真を使用して評価された。心臓サンプルが各グループの3匹のマウスからの左心室の同じ場所において採取された。左心室の一部は0.05%のCaCl2を含む0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)内の5%グルタルアルデヒドと4%パラホルムアルデヒドで24時間固定された。0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、組織は1%OsO4および0.1Mカコジル酸緩衝液内で一晩中、後固定され、脱水され、そしてEmbed812に埋め込まれた。切片は2%酢酸ウラニルで、次に0.4%クエン酸鉛で染色され、Philips 400電子顕微鏡で観察された。
統計的分析:
データは平均±SEMで表示された。統計的比較が、2つのH9c2細胞系の間およびALCAT1ノックアウトと野生型マウスとの間の差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。より多くのグループ間の比較には、一元配置分散分析が使用され、統計的有意性はp<0.05において認められた。
データは平均±SEMで表示された。統計的比較が、2つのH9c2細胞系の間およびALCAT1ノックアウトと野生型マウスとの間の差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。より多くのグループ間の比較には、一元配置分散分析が使用され、統計的有意性はp<0.05において認められた。
結果
ALCAT1は心臓脂質過酸化およびmtDNA生合成を調節する:
心臓におけるALCAT1発現は酸化ストレスにより、また甲状腺機能亢進心筋症の発症により上方制御(発現増加)される。本願の研究はALCAT1異常発現が心筋症の発症において原因となる役割を果たすことを示している。第一に、H9c2心臓細胞系におけるALCAT1過剰発現の細胞形態およびミトコンドリア機能に対する役割が調査された。そのため安定的にフラッグタグ付きのALCAT1cDNA(ALCAT1)またはベクター対照を形質移入されたH9c2心臓細胞系が生成された。安定的H9c2心臓細胞系におけるALCAT1のmRNA発現レベルはベクター対照に比べて3倍だけしか高くなかった。それは単離された心筋細胞における、内在性ALCAT1の酸化ストレス誘発性の上方制御レベルに似ている(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。これら2つの安定的H9c2細胞系を細胞ベースモデルとして使用し、脂質過酸化およびmtDNAコピー数に対するALCAT1の影響が第一に分析された。図11Aに示すように、ベクター対照に比べて、ALCAT1過剰発現は脂質過酸化の副産物であるチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)の細胞内レベルを有意に増加させた。TBARSの生成はH2O2による処置に応答して激化し、このことは心筋症の酸化ストレスにおけるALCAT1の原因となる役割を実証した。
心臓におけるALCAT1発現は酸化ストレスにより、また甲状腺機能亢進心筋症の発症により上方制御(発現増加)される。本願の研究はALCAT1異常発現が心筋症の発症において原因となる役割を果たすことを示している。第一に、H9c2心臓細胞系におけるALCAT1過剰発現の細胞形態およびミトコンドリア機能に対する役割が調査された。そのため安定的にフラッグタグ付きのALCAT1cDNA(ALCAT1)またはベクター対照を形質移入されたH9c2心臓細胞系が生成された。安定的H9c2心臓細胞系におけるALCAT1のmRNA発現レベルはベクター対照に比べて3倍だけしか高くなかった。それは単離された心筋細胞における、内在性ALCAT1の酸化ストレス誘発性の上方制御レベルに似ている(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。これら2つの安定的H9c2細胞系を細胞ベースモデルとして使用し、脂質過酸化およびmtDNAコピー数に対するALCAT1の影響が第一に分析された。図11Aに示すように、ベクター対照に比べて、ALCAT1過剰発現は脂質過酸化の副産物であるチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)の細胞内レベルを有意に増加させた。TBARSの生成はH2O2による処置に応答して激化し、このことは心筋症の酸化ストレスにおけるALCAT1の原因となる役割を実証した。
ミトコンドリア活性酸素種(ROS)放出に対するALCAT1の直接的影響を解明するため、ミトコンドリア性活性酸素種(ROS)生成速度がALCAT1発現H9c2細胞系とベクター対照においてプロファイルされた。H9c2細胞から単離された単離ミトコンドリアにおける、検定開始から固定時点でのH2O2生成速度が分析された。結果はALCAT1過剰発現が相対的活性酸素種(ROS)生成速度を有意に3.77倍(P<0.01)増加させた(図11B)。酸化ストレスはmtDNAの不安定性を引き起こし、そのことは加齢関連代謝疾病におけるミトコンドリア機能不全に関係があるとされてきた。ALCAT1が酸化ストレスの主たる源であることの更なるサポートとして、H9c2細胞において増加用量のH2O2処置に応答してALCAT1過剰発現がmtDNA枯渇をもたらした(図11C)。またALCAT1過剰発現はまたH9c2細胞の肥大性成長を引き起こした(図18A)。さらに、ALCAT1過剰発現はH9c2細胞の心筋細胞への欠陥的分化を引き起こした(図11E,11F)。このことは分化H9c2細胞の主要インジケータであるミオゲニン発現の欠如により実証された(図18B)。
甲状腺機能亢進症は酸化ストレスおよび脂質過酸化を引き起こす。ALCAT1ノックアウトマウスを使用して、心筋症の発症に伴う症状においてALCAT1欠乏が心臓の脂質過酸化に果たす影響を分析した。報告済みの甲状腺機能亢進症の酸化ストレスに対する影響と合致して、甲状腺機能亢進症は有意に心臓における脂質過酸化レベルを増加させた(図11D)。対照的にALCAT1の標的不活化は完全に甲状腺機能亢進心筋症の発症に応答した心臓脂質過酸化を防止した。このことはさらに心筋症に伴う酸化ストレスにおけるALCAT1の原因となる役割を確認した。
ALCAT1の標的不活化は甲状腺機能亢進心筋症を防止する:
酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全は心筋症に関連付けられてきた。次にノックアウトマウスを使用して甲状腺機能亢進心筋症の発症におけるALCAT1の役割が調査された。急性または慢性甲状腺機能亢進症の、心臓肥大に伴う心機能、ミトコンドリア機能不全および信号経路に対する影響を観察するため、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスが甲状腺ホルモン(T4)で2または28日連続して処置された。心機能は末期慢性処置において実施される心エコー検査により評価された。溶媒グループの中では、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に心臓形態および、心室中隔欠損症(IVSD)、左室拡張末期径(LVEDD)および左室後壁寸法(LVPRWD)を含む心エコー検査パラメータに関して有意の差異は見られなかった。この結果はALCAT1が心臓の成長または通常心機能には必要でないことを証明する(図12A−12E)。しかし、4週間のT4処置後に野生型(WT)マウスに心臓肥大が発生した、これは心臓重量対体重比における明白な増加(図12B)、IVSD(図12C)、LVEDD(図12D)およびLVPWD(図12E)により実証されている。対照的に、ALCAT1欠乏はT4誘発心肥大およびそれに関連する心エコー検査パラメータの変化を防止した。この結果は甲状腺機能亢進症に誘発された心筋症の発症に、上方制御されたALCAT1発現が貢献することを証明する。
酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全は心筋症に関連付けられてきた。次にノックアウトマウスを使用して甲状腺機能亢進心筋症の発症におけるALCAT1の役割が調査された。急性または慢性甲状腺機能亢進症の、心臓肥大に伴う心機能、ミトコンドリア機能不全および信号経路に対する影響を観察するため、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスが甲状腺ホルモン(T4)で2または28日連続して処置された。心機能は末期慢性処置において実施される心エコー検査により評価された。溶媒グループの中では、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に心臓形態および、心室中隔欠損症(IVSD)、左室拡張末期径(LVEDD)および左室後壁寸法(LVPRWD)を含む心エコー検査パラメータに関して有意の差異は見られなかった。この結果はALCAT1が心臓の成長または通常心機能には必要でないことを証明する(図12A−12E)。しかし、4週間のT4処置後に野生型(WT)マウスに心臓肥大が発生した、これは心臓重量対体重比における明白な増加(図12B)、IVSD(図12C)、LVEDD(図12D)およびLVPWD(図12E)により実証されている。対照的に、ALCAT1欠乏はT4誘発心肥大およびそれに関連する心エコー検査パラメータの変化を防止した。この結果は甲状腺機能亢進症に誘発された心筋症の発症に、上方制御されたALCAT1発現が貢献することを証明する。
ALCAT1の消失は、T4が誘発した心筋細胞の肥大型生長を緩和する:
心肥大症は、種々の病理学的および病態生理学的な刺激に対する適応性応答としての高分化心筋細胞の増加した寸法により特徴づけられる。ALCAT1の過剰発現がH9c2細胞の肥大型成長を引き起こしたため、次にALCAT1欠乏がT4誘発の心筋細胞の肥大型生長を緩和するか否かが検証された。図13A−13Gに示すように、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に甲状腺機能が正常な状態での心筋細胞の大きさに有意の差は見られなかった。肥大生長と合致して、野生型(WT)マウスでは心筋症の発症は有意に心筋細胞の大きさを増加させた(図13B)。対照的に心筋細胞の肥大生長は、ALCAT1ノックアウトマウスでは甲状腺機能亢進症の野生型(WT)マウスと比較した場合有意に減弱された(図13D)。これらの観察結果は心筋細胞の細胞面積(図13E)、直径(図13F)および寸法分布(図13G)の定量分析の結果によりさらに支持された。
心肥大症は、種々の病理学的および病態生理学的な刺激に対する適応性応答としての高分化心筋細胞の増加した寸法により特徴づけられる。ALCAT1の過剰発現がH9c2細胞の肥大型成長を引き起こしたため、次にALCAT1欠乏がT4誘発の心筋細胞の肥大型生長を緩和するか否かが検証された。図13A−13Gに示すように、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に甲状腺機能が正常な状態での心筋細胞の大きさに有意の差は見られなかった。肥大生長と合致して、野生型(WT)マウスでは心筋症の発症は有意に心筋細胞の大きさを増加させた(図13B)。対照的に心筋細胞の肥大生長は、ALCAT1ノックアウトマウスでは甲状腺機能亢進症の野生型(WT)マウスと比較した場合有意に減弱された(図13D)。これらの観察結果は心筋細胞の細胞面積(図13E)、直径(図13F)および寸法分布(図13G)の定量分析の結果によりさらに支持された。
ALCAT1欠乏がT4誘発心室線維症の発症を防止する:
心臓肥大の発生は心筋の構造的リモデリングを引き起こし、コラーゲンタイプIおよびタイプIII繊維の過剰蓄積につながる。心室線維症はまた心不全および他の心臓合併症の発症の主要リスク要因である。心筋症の媒介物としてのALCAT1のさらなる証拠を提供するため、左心室内のコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの蓄積を調節するALCAT1の役割を検証した。心臓線維症は野生型(WT)およびノックアウト(KO)マウスからの左心室の切片のマッソン3色染色法により分析された。図14Bに示すように、野生型(WT)マウスの甲状腺ホルモンによる28日間処置は、青色染色の広い領域で示されるように、心筋症の結果として、溶媒対照(図14A)と比較して激しい心室線維症を引き起こした。対照的にALCAT1欠乏は有意に甲状腺機能亢進症に起因する線維症を減少させた(図14D)。このことは再度、甲状腺機能亢進症での心不全に対しALCAT1発現の役割を関連付けた。コラーゲン蓄積の発見と合致して、甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意にコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの両方のmRNA発現を増加させたが、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスでは増加させなかった(図14E,14F)。
心臓肥大の発生は心筋の構造的リモデリングを引き起こし、コラーゲンタイプIおよびタイプIII繊維の過剰蓄積につながる。心室線維症はまた心不全および他の心臓合併症の発症の主要リスク要因である。心筋症の媒介物としてのALCAT1のさらなる証拠を提供するため、左心室内のコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの蓄積を調節するALCAT1の役割を検証した。心臓線維症は野生型(WT)およびノックアウト(KO)マウスからの左心室の切片のマッソン3色染色法により分析された。図14Bに示すように、野生型(WT)マウスの甲状腺ホルモンによる28日間処置は、青色染色の広い領域で示されるように、心筋症の結果として、溶媒対照(図14A)と比較して激しい心室線維症を引き起こした。対照的にALCAT1欠乏は有意に甲状腺機能亢進症に起因する線維症を減少させた(図14D)。このことは再度、甲状腺機能亢進症での心不全に対しALCAT1発現の役割を関連付けた。コラーゲン蓄積の発見と合致して、甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意にコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの両方のmRNA発現を増加させたが、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスでは増加させなかった(図14E,14F)。
ALCAT1欠失が心筋症に関係するバイオマーカーの発現を正常化する:
甲状腺機能亢進症のような病理学的症状に誘発された遷延性肥大症は最終的に心不全に至り、それは工業国では死の主要原因である。増加した脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心不全を示す特異的試験である。BNPは心室容積の拡大、圧力過負荷、およびその結果としての心室隔壁応力の増加に応答して心室から特異的に分泌される心臓神経ホルモンである。肥大性心筋症の発症はまた、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),β−ミオシン重鎖(β−MHC)および骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)を含む胎児遺伝子のサブセットの誘発を伴う。心臓肥大の進行におけるALCAT1の役割を同定するため、心臓肥大および心不全の特徴のRNA発現が分析された。遷延性甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意に全ての肥大性バイオマーカーのRNA発現を増加させた(図15A−15D)。甲状腺機能亢進症はまたノックアウト(KO)マウスにおいてもバイオマーカーの発現を増加させたが、その影響は対照グループと比べて弱められた。対照的に溶媒で処置された場合は、野生型(WT)マウスとALCAT1ノックアウト(KO)マウスとの間に有意の差は無く、このことはさらに甲状腺機能亢進心筋症の病因論におけるALCAT1の役割を再確認した。
甲状腺機能亢進症のような病理学的症状に誘発された遷延性肥大症は最終的に心不全に至り、それは工業国では死の主要原因である。増加した脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心不全を示す特異的試験である。BNPは心室容積の拡大、圧力過負荷、およびその結果としての心室隔壁応力の増加に応答して心室から特異的に分泌される心臓神経ホルモンである。肥大性心筋症の発症はまた、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),β−ミオシン重鎖(β−MHC)および骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)を含む胎児遺伝子のサブセットの誘発を伴う。心臓肥大の進行におけるALCAT1の役割を同定するため、心臓肥大および心不全の特徴のRNA発現が分析された。遷延性甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意に全ての肥大性バイオマーカーのRNA発現を増加させた(図15A−15D)。甲状腺機能亢進症はまたノックアウト(KO)マウスにおいてもバイオマーカーの発現を増加させたが、その影響は対照グループと比べて弱められた。対照的に溶媒で処置された場合は、野生型(WT)マウスとALCAT1ノックアウト(KO)マウスとの間に有意の差は無く、このことはさらに甲状腺機能亢進心筋症の病因論におけるALCAT1の役割を再確認した。
ALCAT1不活化がPINK1発現を刺激することにより、ミトコンドリア膨化およびマイトファジーを防止する:
マイトファジーとも呼ばれる選択的ミトコンドリア自己貪食は、損傷したミトコンドリアを消滅させることによりミトコンドリアの品質維持に貢献している。マイトファジーはまた、ミトコンドリアの活性酸素種(ROS)生成およびミトコンドリアDNAの変異を減少させることによりミトコンドリアの量および質の維持に必須の役割を果たしている。従って心臓に特異的な自己貪食の欠乏は心筋症の原因となる。心室断面の顕微鏡分析を使用して、甲状腺機能亢進心筋症に伴うミトコンドリア機能不全および自己貪食におけるALCAT1の役割が検証された。甲状腺機能亢進症における激しい酸化ストレスに合致して、野生型(WT)マウスでは、甲状腺機能亢進心筋症の発症はミトコンドリア膨化、無秩序なクリステ、および異常なミトコンドリア構造を伴った(図16A,拡大図16B)。対照的にこれらのダメージはALCAT1欠乏により大幅に緩和された(図16C,拡大図16D)。損傷されたミトコンドリアへの補償的応答として、野生型(WT)マウスでは、心臓LC3、オートファゴソームマーカー、の発現レベルが甲状腺機能亢進症により有意に上方制御された(図16E,拡大図16F)。さらに、自己貪食と負の相関があるp62タンパク質の発現が野生型(WT)マウスでは有意に低かった。これらの観察結果を支持するものとして、甲状腺機能亢進症の発症に応答した自己貪食ミトコンドリアの数が、野生型(WT)マウスではALCAT1ノックアウト(KO)マウスに比べて有意に高かった(図20)。
マイトファジーとも呼ばれる選択的ミトコンドリア自己貪食は、損傷したミトコンドリアを消滅させることによりミトコンドリアの品質維持に貢献している。マイトファジーはまた、ミトコンドリアの活性酸素種(ROS)生成およびミトコンドリアDNAの変異を減少させることによりミトコンドリアの量および質の維持に必須の役割を果たしている。従って心臓に特異的な自己貪食の欠乏は心筋症の原因となる。心室断面の顕微鏡分析を使用して、甲状腺機能亢進心筋症に伴うミトコンドリア機能不全および自己貪食におけるALCAT1の役割が検証された。甲状腺機能亢進症における激しい酸化ストレスに合致して、野生型(WT)マウスでは、甲状腺機能亢進心筋症の発症はミトコンドリア膨化、無秩序なクリステ、および異常なミトコンドリア構造を伴った(図16A,拡大図16B)。対照的にこれらのダメージはALCAT1欠乏により大幅に緩和された(図16C,拡大図16D)。損傷されたミトコンドリアへの補償的応答として、野生型(WT)マウスでは、心臓LC3、オートファゴソームマーカー、の発現レベルが甲状腺機能亢進症により有意に上方制御された(図16E,拡大図16F)。さらに、自己貪食と負の相関があるp62タンパク質の発現が野生型(WT)マウスでは有意に低かった。これらの観察結果を支持するものとして、甲状腺機能亢進症の発症に応答した自己貪食ミトコンドリアの数が、野生型(WT)マウスではALCAT1ノックアウト(KO)マウスに比べて有意に高かった(図20)。
PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)はセリン/スレオニンタンパク質キナーゼであり、マイトファジーを介して損傷したミトコンドリアの排除を促進することにより、細胞ストレスの間のミトコンドリア機能不全を防ぐ。マウスにおいてPINK1欠乏は酸化ストレスおよびマイトファジーを引き起こし、心筋症につながる。ミトコンドリア機能不全におけるALCAT1の原因となる役割の更なるサポートとして、心臓PINK1発現はALCAT1欠乏により有意に上方制御され、このことはALCAT1ノックアウト(KO)マウスにおける酸化ストレスとマイトファジーのレベルの減少と合致する(16E,定量化図16G)。これらの発見は、ALCAT1による酸化ストレスが甲状腺機能亢進心筋症に伴うミトコンドリア機能不全およびマイトファジーにおいて主要な役割を果たすという証拠を提供する。
心筋症においてALCAT1による酸化ストレスがAkt−mTOR信号伝送経路を調節する:
甲状腺機能亢進症は心筋細胞においてタンパク質合成を刺激することにより心筋症を引き起こす。肥大型成長におけるALCAT1の役割の基礎となる分子メカニズムを同定するため、ALCAT1の過剰出現と欠乏の、Akt,Erk,S6Kおよび4E−BP1のリン酸化を含む、細胞成長と増殖にかかわる信号伝送経路に対する影響がH9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて分析された。増加した活性酸素種(ROS)レベルはインシュリン抵抗性につながり、それは心不全において原因となる役割を果たす。図17Aに示すようにベクター対照において、H9c2細胞のインシュリン処置は用量に依存してAktタンパク質と細胞外シグナル制御キナーゼ(Erk)のリン酸化を刺激した。対照的にALCAT1過剰発現はErkリン酸化の消失と同時にインシュリン刺激Aktリン酸化を有意に減少させ、このことは激しいインシュリン抵抗性の証拠を提供した(図17A)。
さらにALCAT1による慢性酸化ストレスもまたH9c2細胞においてT3−誘発Akt,S6Kおよび4E−BP信号経路の活性化を完全に防止した(図17B)。ALCAT1過剰発現に起因するH9c2細胞の肥大型生長と合致して、S6Kおよび4E−BPの基礎リン酸化はALCAT1発現H9c2細胞において有意に高かった。H9c2細胞における発見のサポートとして、マウスに対する甲状腺ホルモンによる短期処置は、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)マウスの両方において、心臓Akt−mTORリン酸化を刺激した(図20)。しかし、慢性甲状腺機能亢進症は心筋症の発症によりAkt−mTOR信号経路の有意な下方制御を引き起こし、それはAktと4E−BPの有意に低いリン酸化により実証された(図17C)。甲状腺機能亢進症もまたGsk3、その欠乏は心筋症を引き起こすが、のリン酸化を下方制御した。心臓肥大の不存在と合致して、ALCAT1不足は、慢性甲状腺機能亢進症により誘発されたこれらシグナルタンパク質のリン酸化の下方制御を完全に防止した。
甲状腺機能亢進症は心筋細胞においてタンパク質合成を刺激することにより心筋症を引き起こす。肥大型成長におけるALCAT1の役割の基礎となる分子メカニズムを同定するため、ALCAT1の過剰出現と欠乏の、Akt,Erk,S6Kおよび4E−BP1のリン酸化を含む、細胞成長と増殖にかかわる信号伝送経路に対する影響がH9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて分析された。増加した活性酸素種(ROS)レベルはインシュリン抵抗性につながり、それは心不全において原因となる役割を果たす。図17Aに示すようにベクター対照において、H9c2細胞のインシュリン処置は用量に依存してAktタンパク質と細胞外シグナル制御キナーゼ(Erk)のリン酸化を刺激した。対照的にALCAT1過剰発現はErkリン酸化の消失と同時にインシュリン刺激Aktリン酸化を有意に減少させ、このことは激しいインシュリン抵抗性の証拠を提供した(図17A)。
さらにALCAT1による慢性酸化ストレスもまたH9c2細胞においてT3−誘発Akt,S6Kおよび4E−BP信号経路の活性化を完全に防止した(図17B)。ALCAT1過剰発現に起因するH9c2細胞の肥大型生長と合致して、S6Kおよび4E−BPの基礎リン酸化はALCAT1発現H9c2細胞において有意に高かった。H9c2細胞における発見のサポートとして、マウスに対する甲状腺ホルモンによる短期処置は、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)マウスの両方において、心臓Akt−mTORリン酸化を刺激した(図20)。しかし、慢性甲状腺機能亢進症は心筋症の発症によりAkt−mTOR信号経路の有意な下方制御を引き起こし、それはAktと4E−BPの有意に低いリン酸化により実証された(図17C)。甲状腺機能亢進症もまたGsk3、その欠乏は心筋症を引き起こすが、のリン酸化を下方制御した。心臓肥大の不存在と合致して、ALCAT1不足は、慢性甲状腺機能亢進症により誘発されたこれらシグナルタンパク質のリン酸化の下方制御を完全に防止した。
議論
カルジオリピン(CL)リモデリングは、酸化的リン酸化からの永続的な高エネルギー要求を持つ組織である心臓の機能の調節において重要な役割を果たしている。カルジオリピン(CL)の生物学的機能はその脂肪アシル鎖の構造により決定される。心臓では機能性カルジオリピン(CL)はリノール酸を豊富に含み、それはミトコンドリア酵素やタンパク質の活性をサポートするため重要である(Claypool SM & Koehler CM.Trends Biochem Sci.2012 Jan;37(1):32−41)。従って病理学的リモデリングの結果としての、心臓内のシグネチャ・カルジオリピン(CL)であるテトラリノレオイルカルジオリピン(TLCL)の喪失は、心筋症および心不全の原因と関連付けられてきた。しかし心臓疾病においてカルジオリピン(CL)の病理学的リモデリングに関わる酵素は検出できていない。ALCAT1はカルジオリピン(CL)の有害なリモデリングを触媒し、異常カルジオリピン(CL)種の生成に至るリゾカルジオリピン・アシル転位酵素である(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。ALCAT1を安定して発現するH9c2心臓細胞とALCAT1遺伝子を標的不活化されたマウスを使用して、本研究では甲状腺機能亢進症に起因する心筋症の発生におけるALCAT1過剰発現と欠乏の役割が調査された。これらの結果は肥大性心筋症におけるALCAT1の主要な役割を初めて特定した。従って、ALCAT1の過剰発現はH9c2細胞の肥大性成長をひき起こし、一方ALCAT1の消失はT4誘発心筋症および、心室肥大、心室線維症、コラーゲンI型およびIII型の発現増加、を含む関連心機能不全の発症を防止した。さらにALCAT1欠乏はまた、心筋症の発症により通常上方制御されるBNP,β―MHC,ANFおよびACTA1肥大性バイオマーカーの発現を正常化した。肥大性心筋症の病因論におけるALCAT1の原因となる潜在的役割のサポートとして、ALCAT1mRNA発現は心臓における心筋症の発症により有意に上方制御された。さらにALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングはテトラリノレオイルカルジオリピン(TLCL)の喪失を引き起こし、それはバース症候群における心筋症の主要原因として特定されている。
甲状腺機能亢進症は有意に酸化ストレスを増加させる、それはカルジオリピン(CL)過酸化および心不全の原因となることが知られている(Drummond GR他著、(2011)Nat Rev Drug Discov 10(6):453−471;Lesnefsky EJ他著、(2004)Am J Physiol−Heart&Cir Physiol 287(1):H258−267)。加齢関連疾病における病理学的カルジオリピン(CL)リモデリングは、カルジオリピン(CL)内のDHA含有量の富化を介して活性酸素種(ROS)生成を激化させると信じられている。この仮説のサポートとして、カルジオリピン(CL)内のDHA含有量が有意に脂質過酸化インデックスを増加させ、このことは加齢および加齢関連疾病においてミトコンドリア機能不全と関係づけられてきた。したがって、加齢の始まりは心臓TLCLの欠乏と同時にカルジオリピン(CL)内のDHAの富化を伴う。さらに、ミトコンドリア膜DHA含有量は寿命と負の相関があり、活性酸素種(ROS)生成および脂質過酸化インデックスと正の相関がある。したがって、増加したDHA含有量とカルジオリピン(CL)過酸化は、甲状腺機能亢進症における心臓異常、糖尿病、虚血再灌流障害、および心不全に伴う共通の欠陥として識別されてきた。ALCAT1がT4−誘発心筋症において酸化ストレスの主要な媒介物質であることのサポートとして、ALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングはカルジオリピン(CL)内のDHA含有量を増加させ、一方ALCAT1の標的化欠失はALCAT1ノックアウト(KO)マウスにおいて心臓TLCLレベルを増加させる。これらの発見と合致して、本研究からの結果は、ALCAT1過剰発現がH9c2心臓細胞系において激しい酸化ストレス、脂質過酸化、およびmtDNA欠失を引き起こし、それが心臓管状筋細胞への障害性分化をもたらすことを示した。ALCAT1が甲状腺機能亢進症における酸化ストレスの主要媒介物質であることの直接的サポートとして、ALCAT1発現の消失が甲状腺機能亢進症に起因する心臓脂質過酸化を完全に防止した。
マイトファジーは酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全および加齢に対する標的化防御である。ヒトおよび齧歯(げつし)動物において心臓マイトファジーは心臓肥大および心不全の発症により上方制御される。自己貪食の欠失はイースト菌において激しい酸化ストレスを、マウスにおいて心筋症の原因となる。PTEN誘導推定キナーゼ,PINK1タンパク質(PINK1)はマイトファジーの主要調節因子であり、変異するとパーキンソン病の原因となる。PINK1はまた正常な心臓機能において必須の役割を果たす。PINK1はマイトファジーの調節を介して損傷ミトコンドリアの除去を促進することにより、ミトコンドリア機能不全および酸化ストレスを防ぐ。従って、PINK1発現はヒト末期心不全において下方制御され、一方マウスにおけるPINK1欠乏は酸化ストレス、マイトファジーおよび心筋症の原因となる。ALCAT1が心筋症の病理学的発生において原因となる役割を果たすことの更なるサポートとして、本研究はALCAT1が心臓におけるマイトファジーとPINK1発現の主要調節因子であることを識別した。心筋症の発症が劇的にマイトファジーミトコンドリアの数を増加させたことが実証され、このことはLC3およびp62タンパク質の発現を含む自己貪食バイオマーカーの変化によりサポートされた。対照的に、ALCAT1の欠失は甲状腺機能亢進心筋症に伴う酸化ダメージからミトコンドリアを保護した。ALCAT1欠乏もまたp62タンパク質発現の増加と同時に、LC3発現を有意に下方制御した。
驚くべきことに、ALCAT1欠乏は劇的にPINK1発現を増加させ、このことはPINK1の酸化ストレスおよび心筋症に対する防御的役割と合致した。これらの発見は、バース症候群においてTLCL欠乏の原因となるTAZ遺伝子を標的欠失されたマウスにおいて、マイトファジーおよび心筋症のレベルが増加したことによりさらにサポートされた。
驚くべきことに、ALCAT1欠乏は劇的にPINK1発現を増加させ、このことはPINK1の酸化ストレスおよび心筋症に対する防御的役割と合致した。これらの発見は、バース症候群においてTLCL欠乏の原因となるTAZ遺伝子を標的欠失されたマウスにおいて、マイトファジーおよび心筋症のレベルが増加したことによりさらにサポートされた。
心筋症発症は心筋細胞においてAkt−mTORおよびErk経路を活性化することによりタンパク質合成を刺激する。Akt信号経路の活性化は細胞を酸化ストレス誘発アポトーシスから保護するが、一方mTOR活性化は心筋症の肥大性生長に必要とされる。しかし、慢性的甲状腺機能亢進症は、心不全の末期においてErk,AktおよびmTOR経路の下方制御の有意な原因となる。
したがって、ラパマイシン処置はT4−誘発心筋症を防止し、一方マウスにおけるmTORの標的化不活化はアポトーシス、マイトファジーおよびミトコンドリア膨化を特徴とする激しい膨張性心筋症を引き起こす。心筋症での酸化ストレスにおけるALCAT1の役割のさらなるサポートとして、ALCAT1過剰発現H9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて、慢性酸化ストレスがAktおよび、GSK−3β、mTORおよびS6キナーゼなどの下流信号要素、のT4−誘発リン酸化を有意に損なった。H9c2細胞におけるALCAT1による酸化ストレスもまた、心筋症において主要な役割を果たす激しいインシュリン抵抗性の原因となった。対照的に、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスにおいて、ALCAT1欠失は心筋症の発症を防止し、そしてAkt−mTOR信号経路を回復した。
したがって、ラパマイシン処置はT4−誘発心筋症を防止し、一方マウスにおけるmTORの標的化不活化はアポトーシス、マイトファジーおよびミトコンドリア膨化を特徴とする激しい膨張性心筋症を引き起こす。心筋症での酸化ストレスにおけるALCAT1の役割のさらなるサポートとして、ALCAT1過剰発現H9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて、慢性酸化ストレスがAktおよび、GSK−3β、mTORおよびS6キナーゼなどの下流信号要素、のT4−誘発リン酸化を有意に損なった。H9c2細胞におけるALCAT1による酸化ストレスもまた、心筋症において主要な役割を果たす激しいインシュリン抵抗性の原因となった。対照的に、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスにおいて、ALCAT1欠失は心筋症の発症を防止し、そしてAkt−mTOR信号経路を回復した。
重要なことに、本発明の発見は、糖尿病性心筋症、虚血再灌流および心不全などの他の形態の循環器疾患の原因に横たわる分子機構を解明する将来の研究に追加的な意味を持つ。なぜならば酸化ストレスおよび病理学的カルジオリピン(CL)リモデリングはこれらの病理的症状に関係づけられてきたからである。この仮説のサポートとして、ALCAT1は酸化ストレスおよび糖尿病と肥満の発症により上方制御された。ALCAT1の標的不活化はミトコンドリア機能不全および、2型糖尿病および循環器疾患の主要原因要素である肥満、の発症を防止する。ALCAT1の阻害薬の開発は、先進国において主要な死因である心臓肥大および他の心臓疾病に対する潜在的な治療を提供するであろう。
本開示の要約は、読者が本技術的開示の性格を迅速に獲得することを可能にしよう。この要約は以下の請求項の範囲と意味を翻訳または制限するために使用されないことを前提としている。
Claims (15)
- アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:
生体試料を試験薬と接触させるステップと、
前記生体試料内のマイトフュージン分子の発現、機能または活性を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬がマイトフュージンMFN2分子の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させ、そしてALCAT1の発現、機能または活性が、正常なベースライン対照と比較して実質的に減少する場合、当該試験薬がALCAT1の発現、機能または活性の阻害薬として同定され、
または、
前記生体試料内のALCAT1の発現、機能または活性を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬がALCAT1の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して修飾する場合、当該試験薬がALCAT1の発現、機能または活性の修飾物質として同定され、
それによりアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質を同定するステップと、
を有することを特徴とする方法。 - 前記生体試料は:体液、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- マイトフュージンMFN2またはALCAT1の発現、機能または活性を測定するための検定法は:免疫検定法、生物検定法、バイオチップ検定法、ブロット検定法、ハイブリダイゼーション検定法、細胞ベース検定法、ハイスループットスクリーニング検定法、クロマトグラフィー、化学検定法、ファージディスプレイ検定法、またはそれらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:
生体試料を試験薬と接触させるステップと;
(a)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、β−ミオシン重鎖(β−MHC)、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),または骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)からなる心筋症を示す肥大性マーカーの発現;
(b)PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性;
を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬が心筋症を示す肥大性マーカーの発現をベースライン対照と比較して減少させる場合、および/またはある試験薬がPTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させる場合、当該試験薬がALCAT1の発現、機能または活性の阻害薬として同定され、;
それによりALCAT1の修飾物質を同定するステップと;
を有することを特徴とする方法。 - ミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置する方法であって、
細胞または患者に対し治療的に有効な量の、リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能、活性またはそれらの組み合わせを修飾する薬剤を投与するステップと、
ここにおいて、リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素は、ミトコンドリア性ポリヌクレオチド、ミトコンドリア性ポリペプチド、ミトコンドリア性タンパク質、mtDNAコピー数、ミトコンドリアの質量、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリア融合およびmtDNA変異率、を調整し、;
それによりミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置するステップと;
を有することを特徴とする方法。 - ミトコンドリア性タンパク質は、マイトフュージン、マイトフュージン−1(MFN1)、マイトフュージン−2(MFN2)、プロヒビチン、ペプチド、フラグメント、バリアント、変異体またはそれらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- マイトフュージンは場合により、1つ以上のALCAT1阻害薬と共に投与される、ことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)阻害薬が、マイトフュージン−2(MFN2)の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増大させ、および/または活性酸素種(ROS)により測定される酸化ストレスを正常なベースライン対照と比較して減少させ、および/またはカルジオリピン(CL)の構造、機能、活性、発現またはそれらの組み合わせを修飾する、ことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記ミトコンドリア機能不全に伴う疾病または異常は、糖尿病、肥満、心臓疾患または障害、勃起不全、閉経、神経変性性疾患または障害、代謝性疾患または障害、2型糖尿病、糖尿病性合併症、網膜症、腎障害、心筋症、加齢に伴う疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、循環器疾患、高血圧、脳卒中、虚血再灌流障害、心臓疾患、バース症候群、癌、脂肪肝疾病、多嚢胞性卵巣、またはそれらの組み合わせ、を含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- ミトコンドリア機能不全を生体外および生体内で防止または処置する方法であって、
細胞または患者に対し治療的に有効な量の、マイトフュージン分子を投与するステップと、
ここにおいて、前記マイトフュージン分子は、マイトフュージン−1(MFN1)、マイトフュージン−2(MFN2)、フラグメント、バリアント、変異体またはそれらの組み合わせを含み、
そして、前記アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の阻害薬が選択肢として細胞または患者に投与され;
それによりミトコンドリア機能不全を生体外または生体内で防止または処置するステップと;
を有することを特徴とする方法。 - 心筋症を罹患しまたは心筋症を発症するリスクのある患者を処置する方法であって、
それを必要とする患者に対し治療的に有効な量のアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の阻害薬を投与し、そしてPTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の修飾物質が選択肢として患者に投与される、ステップと;
それにより心筋症を罹患する患者を処置するステップと;
を有することを特徴とする方法。 - 請求項1または4の方法により同定されるアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)阻害薬。
- 請求項1または4の方法により同定される前記アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)阻害薬を含む医薬組成物。
- アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:
生体試料を試験薬と接触させるステップと;
糖尿病性腎症を示唆する、FAS、TNF、TGF−β、DGAT1、CHREBP1またはSREBP1からなる核酸マーカーまたはそれらの符号化産物の発現、を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬がFAS、TNF、TGF−β、DGAT1、およびSREBP1の発現をベースライン対照と比較して修飾し、そして、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性が、正常なベースライン対照と比較して実質的に減少する場合、当該試験薬がALCAT1発現、機能または活性の阻害薬として同定され;
それによりアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の修飾物質を同定するステップと;
を有することを特徴とする方法。 - アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の修飾物質を同定する方法であって:
生体試料を試験薬と接触させるステップと;
脂肪肝を示唆する、PPARα,Srebp1c,FAS.ACC1,DGAT1,またはCPT1αからなる核酸マーカーまたはそれらの符号化産物の発現、を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬がPPARα,Srebp1c,FAS.ACC1,DGAT1,またはCPT1αの発現をベースライン対照と比較して修飾し、そして、ALCAT1の発現、機能または活性が、正常なベースライン対照と比較して実質的に減少する場合、当該試験薬がアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の阻害薬として同定され;
それによりALCAT1の修飾物質を同定するステップと;
を有することを特徴とする方法。
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