JP2015509936A - 植物性疎水性タンパク質および水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなるナノ粒子ならびにその使用 - Google Patents

植物性疎水性タンパク質および水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなるナノ粒子ならびにその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、化合物をカプセル化するためのナノ粒子、その調製および使用に関し、前記ナノ粒子は植物性疎水性タンパク質、特にゼインと、水混和性非揮発性有機溶媒、特にプロピレングリコールとを主成分とする。前記ナノ粒子は、農業、化粧品、食品または医薬品分野に使用される意図する製品をカプセル化または配合することができる。

Description

本発明は、植物性疎水性タンパク質、特にゼインと、高粘膜性生物学的接着能を有する水混和性非揮発性有機溶媒とを主成分とするナノ粒子を含んでなる、生体適合性ナノ粒子送達システムに関する。また、本発明は、前記ナノ粒子の自然形成が可能であるインサイチュ自己組織化法、およびその使用および用途に関する。
生体適合性、生分解性および非毒性ポリマーを用いて構成した生分解性ナノ粒子またはミクロ粒子系（ポリマー粒子系：ＰＰＳ）は、制御された放出送達ビヒクルとして数多くの産業においてよく使用されてきた［１−６］。ナノ系、ミクロ系フィルムまたはインプラント、例えば、ポリエステル類、ポリ無水物、タンパク質および多糖類など［７−１４］を得るのに用いられる多種のポリマーが存在する。
ポリマー粒状系（ＰＰＳ）の製造に最も問題となる一つには、これらの系の商業化のための重要かつ決定的な要因として工業的スケールアッププロセスが複雑になることが挙げられる。多くの方法は、乳化法または溶媒蒸発法などとして、薬品の送達のためのＰＰＳを調製するために開発された。これらの方法は、有機毒性揮発性溶媒（例えば、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン、エタノールなど）を使用し、特殊で複雑な装置、例えば、高剪断ホモジナイザー、超臨界流体技術または噴霧乾燥機を用いる。大規模製造でこれらの技術を実施するのは未だ困難が伴う。それは、質の高い製品の開発のため、そして薬品の濃縮およびポリマーの濃縮、処理操作、粒子サイズ、薬品安定性または取り込み効率を含む製造工程のための合理的な方法を提供するには、プロセスの実現可能性、製剤化の最適化、プロセスの最適化、スケールアップおよびバリデーションを含む工程を定める必要があるからである。さらに、食品用途に好適な食用物送達システムを開発するためには、規則があり、溶媒および成分が一般的に安全であると認識されているか、または加工助剤として食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によりあげられていることが必要であるからである。
ゼインは、多量の疎水性アミノ酸、例えば、プロリン、グルタミンおよびアスパラギンからなるプロラミンに属するコーンまたはトウモロコシから単離された植物タンパク質である。ゼインは、無色、透明、非毒性、生分解性および水不溶性植物性タンパク質である。ゼインは、医薬、医療、食品、化粧品、接着剤および包装産業におけるポリマーとして調査され，使用されてきた［１５］。
食品および医薬産業において、ゼインは、例えば、材料を膜コーティングしたり［１６−１７］、ナノ粒子［１８−２０］、ミクロ粒子［２１−２６］またはポリマー系徐放インプラント薬品送達［２７］などの薬品送達ストラテジーのためにＰＰＳを形成するために使用されてきた。ゼイン粒子を得るために、種々の方法が提案されてきた。粒状系を調製するために適用した方法の大部分は、ゼインを溶解するために揮発性有機溶媒−水溶液混合物、例えば、エタノールまたはアセトン−水系を使用することに基づいている。次に、ゼイン溶液を他の混和性溶媒に添加してゼイン（溶媒置換−蒸発法）形成コロイド粒子を沈殿させる。これに関連して、ナノ粒子は、ゼインを８５％エタノールに溶解させて調製した原液を脱イオン水に添加することにより調製した［２８］。同様の方法で、肝臓を標的とするための５−フルオロウラシルが充填されたゼインナノ粒子は、超音波を用いて、５−フルオロウラシルおよびゼインの両方を７０％エタノール（ｗ／ｗ）に溶解することにより調製した。得られた溶液を、直ちに蒸留水に添加した［２９］。同様の方法で、ナノカプセル含有揮発油を、シリコーン液０．０１％を含有する水４０ｍＬに高速混合することにより分散したゼインの８５％エタノール溶液から調製した［２０］。超臨界逆溶媒プロセスを適用して、生物活性化合物の食用物送達システム用ゼインのミクロおよびナノ粒子を合成した［３０］。
米国特許第５，３２４，３５１号は、水と、エタノール、アセトンおよびそれらの混合物からなる群から選択された揮発性有機溶媒約６０〜約９０％とを含んでなる、ゼインを溶解するための溶媒混合物を開示している。前記ゼインの溶液を流れとして、連続攪拌下で水相に注ぎ、ゼインがコロイド分散液に微粒子として沈殿するようにして、ゼインを沈殿させ、最後に、有機溶媒を除去してゼイン約０．１〜約１０ｗ／ｖ％を含んでなる水性分散液を得た［３１］。
米国特許出願第２０１１／００９１５６５号は、ゼインなどの疎水性水不溶性タンパク質を含んでなる非免疫原性ナノ粒子の製造方法であって、前記タンパク質を含水アルコール溶媒（エタノールと水との混合物）に溶解して第１水相溶液を提供することによる方法を開示している。次に、緩衝剤を、界面活性剤およびリン脂質の存在下で第１水相溶液に添加して、ｐＨ約６．８〜約７．４を有する第２水相溶液を製造する。その後、前記第２水相溶液を、超音波剪断、高圧均一化またはそれらの組み合わせにより処理して溶液内の粒子直径を減少させ、最後に、残留溶媒を蒸発させて、直径が約４００ｎｍ未満であるナノ粒子を製造する。また、前記方法では、一定の超音波エネルギーと蒸発技術を適用して揮発性溶媒エタノールを除去することも必要である。
全ての場合において、ゼインナノ粒子を得るための上記方法の主要な欠点は、減圧下、凍結乾燥または噴霧乾燥下での蒸発など、揮発性有機溶媒を除去するある方法を適用する必要がある。
したがって、生体適合性および生分解性植物性疎水性タンパク質、特にゼインを用いて構成したナノ粒子を自然に形成することができる簡単なインサイチュ自己組織化法を開発する必要がある。この方法は、揮発性有機溶媒や高剪断均一化、超臨界流体技術または噴霧乾燥機などの複雑な方法を使用しなくてもよく、かつ大規模でカチオン性またはアニオン性ナノ粒子に分子を効果的にカプセル化することができるものである。
今般、驚くべきことに、植物性疎水性タンパク質、特にゼインを含有する、薬学的に、美容的にまたは食品級の許容される水混和性非揮発性有機溶媒、例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコール）、または前記水混和性非揮発性有機溶媒と他の水混和性非揮発性有機溶媒、例えば、グリセロールまたはポリエステル（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）：ポリオキシルグリセリドまたはマクロゴールグリセリド）との溶媒混合物を、場合によって賦形剤の存在下でゼイン非溶媒として作用する水溶液などの植物性疎水性タンパク質非溶媒と混合することにより、極めて均一な小サイズ（約１２０〜５００ｎｍ）および高ナノ粒子収率（約９８％）のナノ粒子を自然形成させることができることが見いだされた。例として、前記物理化学的特性を示す本発明による空マトリックスナノ球状物（実施例１および２）、ロードされたマトリックスナノ球状物（実施例３〜８）およびロードされたコアシェル水疱性ナノカプセル（実施例９〜１０）が挙げられる。
この方法によれば、通常ゼインナノ系を得るために適用される揮発性有機溶媒（例えば、アセトン、イソプロパノール、エタノール）または共溶媒（例えば、ＣＤ）を使用する必要なく、大親水性分子および小親水性分子（ＢＳＡ、ローダミンＢ、クロルヘキシジンなど）ならびに疎水性分子（クルクミン、脂溶性蛍光プローブなど）の両方の高カプセル化効率を有するナノ粒子を得ることができる。具体的には、実施例３は、本発明のインサイチュ自己組織化法により得られるナノ粒子は、大親水性分子、例えば、タンパク質において、揮発性溶媒を用いた従来法により得られるナノ粒子より１．５倍高いカプセル化効率を有することを示す。また、実施例４は、ローダミンＢなどの小親水性分子についてのカプセル化効率は、本発明によるナノ粒子において，従来法により得られるナノ粒子よりも高いことを示す。
同様のナノ粒子が、ゼインについての二元溶媒系から得ることができる（実施例２参照）。非毒性または食品等級の挙げられた物質である水混和性非揮発性二元有機溶媒混合物を使用することは、種々の産業および用途について、ゼインにさらにカプセル化するための種々の種類の分子を組み込むのに魅力的なものとなる。
さらに、本発明の製造方法によれば、水混和性非揮発性有機溶媒および目的物質（a product of interest:ＰＯＩ）が体液と混合されると、体液においてインサイチュ自己組織化カチオン性ナノ粒子（ＺＳＮＰ）およびナノカプセル（ＺＳＮＣ）を形成することができ、その結果、ＰＯＩが充填されたナノ粒子を、体液（水性媒体）と接触した状態でインサイチュ自然形成すこることができる。
一方、本発明によれば、ナノ粒子にポリアニオンを適格に塗布することによりアニオン性ゼイン系ＰＰＳを得ることができる。実施例１は、アラビアゴムを空マトリックスナノ球状物に塗布または複合化して高収率でアニオン性ナノ粒子を製造することを示す。実施例９および１０は、アラビアゴムを塗布または含有し、カプセル化効率が７５〜８４％である、エッセンシャルオイルが充填されたコアシェルナノカプセルを示す。
この方法の他の重要な利点は、ナノ粒子の製造方法を単純化することに関する。これは、本発明による方法では、特殊な装置、高剪断ホモジナイザー、超音波処理法、またはエタノールやアセトンなどの揮発性有機溶媒の蒸発を使用することなく工業的規模での製造が容易になるからである。得られたナノ粒子は、化粧品産業、医薬産業、農業産業または食品産業に広く使用される、溶液、懸濁液、ゲルおよび半固体または固体物などの数多くの剤型に容易に組み込むことができる。これに関連して、本発明の製造方法のスケールアップ法の１Ｌ〜５０Ｌのパッチは、実施例１に示すように、得られたゼインナノ系の物理化学的性質に影響を及ぼさないことが認められた。
さらに、本発明によるナノ粒子の種々のマトリックス特性から、疑似腸液または疑似唾液をそれぞれ実施例４および８に示すように使用したときの両方で、ナノ粒子は、従来法により得られるナノ粒子と比較して、カプセル化親水性分子の放出が高まることが分かる。具体的には、従来法により得られるナノ粒子と比較して、本発明のナノ粒子は、カプセル化親水性分子の放出を約１．４倍および２倍増加する。
さらに、本発明によるナノ粒子は、揮発性有機溶媒を用いた従来法により得られた他のナノ粒子について観察されるより高い、ブタ口腔粘膜モデル表面に対する高生体接着親和性を示す。この生物学的接着より、目的物質の制御放出を効果的に高めることができる。具体的には、実施例８は、本発明の種々のナノ粒子製剤の生体接着能は、エタノールを用いる従来法により調製したナノ粒子の生体接着能よりも約２〜４倍高いことを示す。
要約すると、本発明のインサイチュ自然自己組織化法により得られるゼインナノ粒子は、とりわけ以下の性質を示す：（ｉ）小スケールおよび大スケールでの均一サイズでの分布；（ｉｉ）プロピレングリコールなどの非揮発性有機溶媒を使用することにより、揮発性有機溶媒を蒸発させる必要なく油を含有するマトリックスナノ球状物およびコアシェル水疱性ナノカプセルを形成することができる；（ｉｉｉ）共溶媒または複合化剤を必要とすることなく親水性、疎水性分子および油をカプセル化する高い効果；（ｉｖ）このナノ粒子製造法では、水混和性非揮発性有機溶媒にゼインを含有する溶液および目的物質（ＰＯＩ）が体液と混合する（すなわち、皮下注射または経口投与により）と、体液内でインサイチュ自己組織化ナノ粒子（ＺＳＮＰ）を形成することができる；（ｖ）従来法により調製されたゼインナノ粒子よりも、粘膜表面に対する生体接着親和性が高い；（ｖｉ）数多くの剤型、例えば、液体、固体または半固体、例えば、懸濁液、ゲルなどに取り込むことが非常に容易；（ｖｉｉ）従来法により調製されたゼインナノ粒子と比較して、体液におけるカプセル化物の高放出率。上記した性質の全てにより、前記ナノ粒子が種々の分野、例えば、農業、食品など、とりわけ化粧品および医薬品分野において、とりわけ毛髪、皮膚などを含む種々の表面への制御された放出送達システムとして、またはとりわけ、口腔、経鼻、経口、直腸、膣、経皮または非経口経路による投与が都合がよい。
したがって、本発明の目的は、植物性疎水性タンパク質および水混和性非揮発性有機溶媒を主成分とするナノ粒子の製造および使用にある。
したがって、本発明の一態様によれば、
ａ）マトリックスを含んでなるマトリックスナノ球状物であって、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスナノ球状物と；
ｂ）コアとシェルとを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルであって、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルと、
からなる群から選択されるものである、ナノ粒子が提供される。
本発明の別の態様によれば、ナノ粒子であって、前記ナノ粒子がマトリックスナノ球状物であり、前記マトリックスナノ球状物がマトリックスを含んでなり、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる、ナノ粒子の製造方法であって、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒中の前記植物性疎水性タンパク質の溶液を、水性媒体などの植物性疎水性タンパク質非溶媒と接触させて前記ナノ粒子を形成することを含んでなり、前記植物性疎水性タンパク質の溶液が揮発性有機溶媒を含まない方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、
ａ）目的物質を含んでなるマトリックスナノ球状物であって、前記マトリックスナノ球状物がマトリックスを含んでなり、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる、マトリックスナノ球状物と；
ｂ）目的物質を含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルであって、前記コアシェル水疱性ナノカプセルがコアとシェルとを含んでなり、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルと、
からなる群から選択されるナノ粒子の製造方法であって、
前記植物性疎水性タンパク質と前記目的物質を少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒に添加して含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、水性媒体などの植物性疎水性タンパク質非溶媒と接触させて前記ナノ粒子を形成することを含んでなり、
前記植物性疎水性タンパク質と前記目的物質を含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まないものである、
方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明の方法により得ることができるナノ粒子が提供される。
本発明の別の態様によれば、媒体中に植物性疎水性タンパク質を含有してなる溶液であって、前記媒体は少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と場合によって水性媒体を含んでなり、前記水性媒体の量がナノ粒子を形成するための水性媒体の必要量より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる前記媒体は揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）であるが、但し、前記植物性疎水性タンパク質がグリアジンであるとき、植物性疎水性タンパク質の量が０．１％より多い、溶液が提供される。
本発明の別の態様によれば、媒体中に植物性疎水性タンパク質と目的物質を溶解、懸濁または乳化して含有してなる溶液、懸濁液またはエマルジョンであって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と、場合によって界面活性剤と、場合によって水性媒体を含んでなり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するのに必要な量の水性媒体より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる前記媒体が揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）である、溶液、懸濁液またはエマルジョンが提供される。
本発明の特定の実施態様によれば、本発明により提供される前記ナノ粒子または本発明により提供される前記溶液は、さらに目的物質、例えば、農業、化粧品、食品または薬剤産業における目的物質を含んでなる。
本発明の別の態様によれば、媒体中の本発明によるナノ粒子の懸濁液であって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と植物性疎水性タンパク質非溶媒とを含んでなり、揮発性有機溶媒を含まないものである、懸濁液が提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明により提供される少なくとも１種のナノ粒子、または溶液、懸濁液もしくはエマルジョンと、キャリアとを含んでなる組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明により提供されるナノ粒子を含んでなる食品が提供される。
本発明の別の態様によれば、前記目的物質が食品添加物として使用される抗酸化剤クルクミンであるか、前記目的物質が口腔もしくは体外感染の処置および/または予防に使用される前記抗菌薬クロルヘキシジンであるか、前記目的物質が栄養補助食品として使用されるタラ肝油およびリノレン酸から選択される油であるナノ粒子が提供される。
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により得られる自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ−１０）の写真である。 プロピレングリコール（ＰＧ）を一次溶媒として用いた種々の溶媒の二元混合物へのゼインの溶解度を示す。終点範囲（濁度増加の開始点から増加１００％により表される）は、ゼインが沈殿し始め、濁度変化１００％（沈殿が生じなくなる点）により表される総ゼイン沈殿が得られるまでのＰＧにおける溶媒（ｖ／ｖ）の割合（％）を示す。矢印は、例として、ゼインが沈殿をはじめ完全に沈殿するまでのゼインを含有するＰＧ溶液におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の割合（ｖ／ｖ）を示す。 種々の時間間隔について、疑似胃液（ＳＧＦ）および疑似腸液（ＳＩＦ）における、種々のゼイン溶媒、例えば、プロピレングリコール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）、プロピレングリコール：グリセロール混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）およびプロピレングリコール：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）から調整したＲＢ−自己組織化ゼインナノ粒子；ならびに疑似胃液（ＳＧＦ）および疑似腸液（ＳＩＦ）において従来法（ＲＢ−従来ＮＰ）により調製したＲＢ−ゼインナノ粒子のインキュベーション後のナノ粒子製剤から放出されたローダミンＢ（ＲＢ）の累積割合。 疑似唾液における、種々のゼイン溶媒、例えば、プロピレングリコール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）、プロピレングリコール：グリセロール混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）およびプロピレングリコール：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）から調整したＲＢ−自己組織化ゼインナノ粒子；ならびに疑似唾液における、従来法により調製されたＲＢ−ゼインナノ粒子から調製されたＲＢ−自己組織化ゼインナノ粒子のインキュベーション後のナノ粒子製剤から放出されたローダミンＢ（ＲＢ）の累積割合。 種々の時間でのブタ口腔粘膜組織におけるナノ粒子製剤の付着量（ｍｇ／ｃｍ２）のアッセイ。蛍光標識ＲＢ自己組織化ゼインナノ粒子製剤を、種々のゼイン溶媒、例えば、プロピレングリコール単独（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）、プロピレングリコール：グリセロール混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）およびプロピレングリコール：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）ならびに従来の溶媒蒸発法により調製された従来の蛍光標識ゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔ）から調製した。各値は、平均（ｎ＝３；全ての場合においてＳＤは平均の２０％未満であった）により表された。 自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＣ）における種々の油のカプセル化効率ならびにゼインなしで同じエッセンシャルオイルとプロピレングリコール （ＰＧ）溶液から調製された対照製剤におけるカプセル化効率。対照Ｐ、Ｔ、ＣおよびＥは、それぞれセイヨウハッカ、タイム、シナモンおよびオイゲノール油対照。 具体例として表１１から選択され、光学顕微鏡法により得られる、試料１、４、７および１０の写真である。 光学顕微鏡法により得られる、レモン油が充填された、カチオン性自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＣ−Ｌ１）およびカチオン性自己組織化ゼインミクロ粒子（ＺＳＭＣ−Ｌ１）の写真である。 レモン油が充填されたカチオン性自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＣ−Ｌ１）についての透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。
本発明によれば、植物性疎水性タンパク質、特にゼインおよび水混和性非揮発性有機溶媒に基づく自己組織化技術により得られる、カチオン性およびアニオン性ナノ粒子、具体的にはマトリックスナノ球状物およびコアシェル水疱性ナノカプセルが提供される。また、本発明によれば、前記ナノ粒子の製造方法および前記ナノ粒子の用途も提供される。
定義
本発明の理解を容易にするために、本発明に関連して使用されるいくつかの用語および表現の意味を以下に述べる。
本明細書において使用される用語「植物性疎水性タンパク質」は、多量の疎水性アミノ酸、例えば、プロリン、グルタミンおよびアスパラギンからなる、植物に通常みられるタンパク質に関する。これらの疎水性アミノ酸は、非変性状態においてタンパク質を水不溶性とする。本明細書の植物性疎水性タンパク質は、英国薬局方（ＢＰ）により実質的に不溶性であるとみなされている（すなわち、１５℃〜２５℃の間の温度範囲で溶質（ｇ）の１部について溶媒（ｍＬ）の１０．０００部超を必要とする）タンパク質である。前記植物性疎水性タンパク質は、植物性源から直接得ることができる、または遺伝子工学技術により得られるタンパク質でありうる。特定の種類の植物性疎水性タンパク質は、プロラミンに属するものである。プロラミンは、種々の穀類、例えば、コーン、コムギ、オオムギ、雑穀、米およびソルガムにみられることがある。本発明において使用するのに好適なプロラミンのいくつかの例を挙げると、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンなどがあるが、本発明の用途はこれらには必ずしも限定されない。特に、ゼインは、本発明において、コーンの副産物であるコーングルテンミール由来の植物性疎水性タンパク質のモデルとして本発明で使用され、各々異なるアミノ酸配列、分子量および溶解度を有するα-、β-、γ-およびδ-ゼインの少なくとも４種のタンパク質の混合物である
本明細書で使用される「平均サイズ」または「平均値サイズ」は、水性媒体において一緒に動くナノ粒子の集団の平均直径に関する。これらの系の平均サイズは、当業者により知られており、以下の実施例における実験の部分において実例として記載されている標準的な方法により測定できる。粒子の平均サイズは、主に、本発明のナノ粒子に存在する植物性疎水性タンパク質の量により、および目的物質（もしあれば）の性質および量により（ここで、一般的に、前記成分の量が多いほど、ナノ粒子の平均サイズが大きい）ならびにある種のパラメータ、例えば、粘度、植物性疎水性タンパク質の濃度および他の溶媒または界面活性剤の存在などにより影響されることがある。
本明細書で使用される用語「平均ゼータ電位」または「平均値ゼータ電位」は、水性媒体において一緒に動くナノ粒子の集団の平均表面電荷に関する。これらの系の平均ゼータ電位は、当業者により知られており、以下の実施例における実験の部分において例として記載されている標準的な方法により測定できる。粒子の平均ゼータ電位は、主に、本発明のナノ粒子に存在する目的物質（もしあるならば）の性質および量により影響されることがある。一般的に、ナノ粒子の平均ゼータ電位は、前記成分へのアニオン性分子もしくはポリマーの添加またはｐＨ変化により、およびいくつかのパラメータもしくは他の溶媒または界面活性剤の存在によりより負になる。
本明細書で使用される用語「ナノ粒子」は、植物性疎水性タンパク質により形成され、その組成物中に水混和性非揮発性有機溶媒を含む、平均サイズが概算で１マイクロメータ（μｍ）未満、典型的には１〜９９９ナノメータ（ｎｍ）、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、さらにより好ましくは１２０〜２００ｎｍ、さらにより好ましくは１２０〜１６０ｎｍである固体粒子のコロイド系を指す。他の事柄のうちで、それらの製造方法に応じて、ナノ粒子は、マトリックスナノ球状物および「コアシェル水疱性ナノカプセル」［３２−３４］にさらに細かく分けることができる。「マトリックスナノ球状物」は、三次元ネットワークにより形成されたマトリックス形態であり、ナノ球状物が目的物質、例えば、薬品をロードするとき、この目的物質は、前記三次元ネットワークに物理的および均一に分散できる。本発明のマトリックスナノ球状物のマトリックスまたは三次元ネットワークは、植物性疎水性タンパク質および１種以上の水混和性非揮発性有機溶媒を含有している。「コアシェル水疱性ナノカプセル」は、壁または膜により取り巻かれている（「シェル」として知られている）目的物質を含有する内部空洞（「コア」として知られている）により形成された水疱系である。すなわち、本発明のコアシェル水疱性ナノカプセルは、典型的なコアシェル構造を示すナノ水疱系であり、目的物質は、１種以上の水混和性非揮発性有機溶媒も含む植物性疎水性タンパク質の壁または膜（「シェル」）により取り巻かれている溜または空洞（「コア」）内に閉じ込められている、。当業者は、コアシェル水疱性ナノカプセルのコアが賦形剤のみを含有することができ、以下で定義するような意図するいずれかの製品（例えば、賦形剤を有するかまたは有しない、農業、化粧品、食品もしくは医薬活性を有する化合物またはそれらの混合物）を含有することができ、または賦形剤および以下で定義する前記目的物質を含有してもよい。
両方の場合において、これらの系の大きな比表面積のため、目的物質の分子は、ナノ粒子の表面に捕獲されるかまたは吸着されてもよい。
本明細書で使用される「目的物質」または「ＰＯＩ」は、いずれの種類の産業、例えば、農業、化粧品、食品または医薬産業において使用されることのできるいずれかの化合物を指す。いずれの種類の産業においても使用されることのできる実質的にいずれの化合物も、本発明によるＰＯＩと考えることができる。本発明によるＰＯＩの具体例としては、小または大の水溶性または脂溶性、親水性、疎水性または両親媒性の有機または無機化合物、例えば、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、油、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、小有機化学化合物などが挙げられるが、これらには限定されない。ＰＯＩはいずれかの形態または状態、例えば、液体、半固体または固体状態でもよく、すなわち、ＰＯＩは水性または有機媒体に溶解、分散または不混和性であることができ（エマルジョンの場合において）、したがって、油状溶液またはエマルジョンを含む水性または有機溶液または懸濁液を形成することができるか、または別法として、ＰＯＩは固体生成物として不溶解または不分散であることができる。ＰＯＩは、第一ＰＯＩに溶解、分散または乳化できる他のＰＯＩなどを含有していてもよい。
特定の実施態様によれば、ＰＯＩは、完全または分画微生物、例えば、溶液、懸濁液またはエマルジョンに分散されたウイルス、バクテリアもしくは酵母またはそれらの混合物である。より特定の実施態様によれば、微生物は、プロバイオティック、特にプロバイオティックバクテリアである。プロバイオティックバクテリアとしては、例えば、乳酸菌およびビフィズス菌が挙げられるが、これらには限定されない。
特定の実施態様によれば、ＰＯＩは、農業活性を有する化合物、すなわち、農業産業において使用されることのできるもの、例えば、害虫および病原体を防除するための植物検疫製品、植物成長促進剤、例えば、除草剤（例えば、グリホサートなど）、殺虫剤（例えば、ラムダ−シハロトリンなど）、殺カビ剤（例えば、マンコゼブまたはエッセンシャルオイル）または蒸散抑制剤などである。
別の特定の実施態様によれば、ＰＯＩは化粧品活性を有する化合物、すなわち、ヒトまたは動物体の外観または匂いを高めるのに使用される物質である。化粧品には、スキンケアクリーム、ローション、粉末剤、香料、口紅、指の爪および足指爪艶出し剤、目および顔メーキャップ、ウェットペーパータオル、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアーカラー、ヘアースプレーおよびジェル、デオドラント、手の除菌用ローション、ベビー用品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、バターおよび数多くの他の種類の製品などがある。化粧品産業において使用されるＰＯＩの具体例としては、例えば、アンチエイジング製品（例えば、レチノイド）、抗ニキビ製品（例えば、エリスロマイシン、過酸化ベンゾイルなど）、フェイシャルケア製品 （例えば、洗顔クレンザーにおけるＧＨＫ銅など）、着色化粧品（例えば、ルージュ、ファンデーション、カバーアップ、粉末剤などにおいて使用される着色顔料）、化粧品 （例えば、Ｃｏ−Ｑ１０など）、パーソナルケア製品（例えば、デオドラントなどにおける香料の湿分制御放出）、日焼け止め／サンケア（例えば、ＵＶ遮断）用製品、トゥースクリーナー用製品、練り歯磨き、またはリンス（例えば、トリクロサン／殺菌剤の除放、フレーバー、香水、口内ドライマウス防止活剤など）、シャンプー用製品（例えば、ふけ防止／保湿活性剤など）、香料（例えば、香料粒子など）、ヘア製品 （例えば、固定剤、容積ヘアスタイリング製品など）などが挙げられるが、これらには限定されない。
別の特定の実施態様によれば、ＰＯＩは栄養活性を有する化合物、すなわち、食品工業において使用されることのできる栄養活性を有する化合物、例えば、葉酸、４− アミノ安息香酸、ナイアシンもしくはビタミンＢ３、パントテン酸もしくはビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロホスフェート、チアミントリホスフェート、アスコルビン酸、プテロイルグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、クマリン酸、コーヒー酸、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ群およびそれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド（例えば、カロテン、リコピン、ルテイン、カプサンシン、ゼアキサンチンなど）、脂肪酸、オメガ−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸類（例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリン）、フィトスタノールもしくはフィトステロール（例えば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール類（フェノール酸、スチルベン、フラボノイド、アントシアニン、フラボノール、フラバノール、フラバノン、カルコン、イソフラボンなど、リグナンなど；例えば、ケルセチン、ルチン、レスベラトロル、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチン、ルテオリン、カテキン、縮合型タンニン、マルビジン、シアニジン、デルフィニジン、ぺオニジン、没食子酸、クマリン酸、コーヒー酸など）、食品の誘導体、例えば、酵母および酵母成分、ワイン成分、チーズ成分、微生物および微生物成分、食品アロマなどである。製品は、ヒトまたは動物食品におけるその使用が、国または組織の国際食品規格、例えば、国際連合または世界保健機関（ＷＨＯ）の食糧農業機関（ＦＡＯ）に従って安全であるとき、「食品等級」と言われており；その結果、「食品等級」製品は、「食品においてその使用が好適である」非毒性製品であり、したがって、両方の表現は同義語であり、この明細書においては区別を明確にしていない。
別の特定の実施態様によれば、ＰＯＩは、治療活性を有する化合物（すなわち、対象体に投与したときに、作用部位においてその受容体と相互作用し、一定の効果を示す物質）であり；この種の製品は、製薬業において使用されることができる。治療活性を有するＰＯＩとしては、例えば、抗体もしくはそれらの断片、細菌、真菌もしくはウイルスタンパク質または抗原、細胞受容体、凝固因子、サイトカイン、酵素、エリスロポエチン、成長因子、ホルモン、インスリン、インターロイキン、インターフェロン、リガンド、核酸（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、シグナル伝達剤、小有機化学化合物、トキシンなどが挙げられるが、これらには限定されない。特定の実施態様によれば、ＰＯＩとして、鎮痛（麻酔）剤（例えば、コデイン、モルヒネなど）、鎮痛（非麻酔）剤（例えば、アセチルサリチル酸、フルフェナム酸など）、脱毛防止剤（例えば、フィナステライド、ミノキシジルなど）、抗狭心症薬（例えば、アテノロール、ニカルジピンなど）、抗菌剤（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、セファクロル、シプロフロキサシン、ネオマイシン、テトラサイクリンなど）、抗鬱剤（例えば、フルオキセチン、パロキセチンなど）、抗真菌薬（例えば、イソコナゾール、ケトコナゾールなど）、抗高血圧薬（例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、カルベジロール、エナラプリル、ロサルタン、ミノキシジルなど）、抗炎症薬（例えば、ニフルム酸、セレコクシブ、イブプロフェンなど）、抗腫瘍薬（例えば、アレムツズマブ、シスプラチン、ドセタキセル、トラスツズマブなど）、解熱薬（例えば、アセトアミノフェン、インドメタシンなど）、抗精神病薬（例えば、リスペリドンなど）、抗不安薬（例えば、アルプラゾラム、ロラゼパムなど）、気管支拡張剤（例えば、カルブテロール、エピネフリンなど）、グルココルチコイド（例えば、ブデソニド、プレドニゾロンなど）、免疫抑制剤（例えば、アレムツズマブ、タクロリムスなど）などが挙げられる。さらに特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、アセチルサリチル酸、アルファ−心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルギニンバソプレシン、アトロピン、オーグメロセン、アトルバスタチン、アバスチン、カルシトニン類、絨毛性ゴナドトロピン類、副腎皮質刺激ホルモン、デスモプレシン、エピバチジン、エルビタックス、エグゼナチド、ハーセプチン、ヒュミラ、フムリン、ケトコナゾール、ランレオチド、ルトロピンアルファ、メトプロロール、ミノキシジル、ネシリチド、オクトレオチド、パクリタキセル、パラセタモール、ペガプタニブ、組み換え卵胞刺激ホルモン、組み換え成長因子、レミケード、リチュキサン、セルモレリン、ソマトトロピン、タキサン誘導体、タクソール、テリパラチドアセテート、サイロトロピン、トリクロサン、ウロホリトロピン、ゾーレアなどからなる群から選択される。別の実施態様によれば、ＰＯＩは、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カンプトセシン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリンＡ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオールグルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン類、フェキソフェナジン、フルオロキノロン類、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンペロール、レボフロキサジン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾル、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、ミダゾラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、パクリタキセル、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクロン、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
別の実施態様によれば、ＰＯＩは賦形剤、すなわち、組成物の活性成分用媒体またはキャリアとして使用される液体、固体または半固体であることができる水不混和性または不溶性不活性物質である。賦形剤として作用するＰＯＩの具体例としては、液体パラフィンまたは溶融脂質、例えば、ワックス、綿実油、コーン油、水素添加植物油、菜種油、ヤシ油などが挙げられるが、これらには限定されない。前記ＰＯＩは、コアシェル水疱性ナノカプセルの製造に特に有用であり、前記ナノカプセルのコアに存在してもよい。
好ましい実施態様によれば、ＰＯＩは、除草剤、殺虫剤、殺カビ剤、アンチエイジング製品、抗ニキビ製品、フェイシャルケア製品、着色化粧品、化粧品、パーソナルケア製品、日焼け防止／サンケア製品、トゥースクリーナー用製品、練り歯磨きもしくはリンス、シャンプー用製品、香料、ヘア製品、食品添加物、エッセンシャルオイル、セイヨウハッカオイル、タイム油、桂皮油、オイゲノール、レモン油、クルクミン、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンもしくはビタミンＢ３、パントテン酸もしくはビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロホスフェート、チアミントリホスフェート、アスコルビン酸、プテロイルグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマリン酸、コーヒー酸、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド、脂肪酸、オメガ−３脂肪酸、タラ肝油、リノレン酸、アミノ酸、フィトスタノール、フィトステロール、ポリフェノール、クロルヘキシジン、牛血清アルブミン、鎮痛薬、脱毛防止剤、抗狭心症薬、抗菌剤、抗鬱剤、抗真菌薬、抗高血圧薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、解熱薬、抗精神病薬、抗不安薬、気管支拡張剤、グルココルチコイド、免疫抑制剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されたものである。
本明細書で使用される用語「揮発性有機溶媒」は、室温で容易に気化／蒸発する液体有機化合物であり；揮発性有機溶媒は、通常高蒸気圧を有し、水よりも低い沸点を有している（すなわち、揮発性有機溶媒は、２０℃で２３．３ｈＰａより高い蒸気圧および１００℃より低い沸点を有する）。揮発性有機溶媒としては、例えば、ＵＳＰ等級エタノール（初期沸点および沸点範囲７８．０〜８０．０℃ならびに２０℃での蒸気圧５９．５ｈＰａ）、メタノール（沸点６４．７℃および２０℃での蒸気圧１３０．３ｈＰａ）およびアセトン（沸点５６℃および２０℃での蒸気圧２４５．３ｈＰａ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
同様に、本明細書で使用される用語「非揮発性有機溶媒」は、水よりも低い蒸気圧および高い沸点を有する、室温で蒸発しないかまたは極めてゆっくりと蒸発する液体有機化合物を指す。非揮発性有機溶媒としては、例えば、ＵＳＰ等級グリコール類、例えば、プロピレングリコール（沸点１８７℃および２０℃の蒸気圧０．１１ｈＰａ）、ポリグリコール類、例えば、平均分子量４００ｇ／ｍｏｌｅの液体ポリ（エチレングリコール）（沸点２５０℃および２０℃の蒸気圧＜０．０１ｈＰａ）またはポリオール類、例えば、グリセロール（沸点２９０℃および２０℃の蒸気圧＜０．０１ｈＰａ）が挙げられるが、これらには限定されない。ただ１種の非揮発性有機溶媒を本発明に関連して使用するとき、前記溶媒は、植物性疎水性タンパク質が溶解する一次溶媒である必要がある。したがって、前記非揮発性有機溶媒は、使用される植物性疎水性タンパク質に応じて異なることができる。種々の非揮発性有機溶媒の混合物を使用するとき、前記溶媒の少なくとも１種は一次溶媒である必要がある。混合物の他の溶媒形成部分は、異なる一次溶媒または二次溶媒であることができる。使用される溶媒の数に応じて、混合物は、２種の溶媒を用いたとき二元であってもよく、３種の溶媒混合物を用いたとき三元であってもよい。
「水混和性」溶媒または液体は、水に完全に溶解し、水から分離するのが困難である溶媒または液体、例えば、グリセロール、プロピレングリコールなどである。
本明細書で使用される用語「植物性疎水性タンパク質非溶媒」は、使用される非揮発性有機溶媒に溶解するかまたは混和するが、植物性疎水性タンパク質が部分的または全体的に沈殿する、液体、半固体または固体状態における溶媒である。好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒は、水性媒体である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒は、グリセロールである。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒は、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒は、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）である。
本明細書で使用される用語「水性媒体」は、水を含んでなる媒体または水からなる媒体である。前記水性媒体は、水と水混和性溶媒を含んでなることができる。特定の実施態様によれば、水性媒体は、体液である。
本明細書で使用される用語「生体適合性」は、本発明の方法により製造されるナノ粒子が、対象体に生体内投与するとき顕著な副作用を生じたり誘発したりしないことを意味する。可能性のある副作用としては、例えば、過剰の炎症および／または過剰もしくは不都合な免疫反応や、毒性などが挙げられるが、これらには限定されない。
本明細書で使用される用語「ポリオール」または「ポリオール類」は、有機反応に利用できる複数のヒドロキシル官能基を有する化合物を指す。例えば、２個のヒドロキシル基を有する分子はジオールであり、３個のヒドロキシル基を有する分子はトリオールであり、４個のヒドロキシル基を有する分子はテトラオールである。本発明に有用なポリオール類としては、例えば、とりわけ単純なポリオール化合物であるグリセロール（グリセリンとも称される）、グリコール、例えば、プロピレングリコール（ＰＧ）（１，２−プロパンジオールまたはプロパン−１，２−ジオールとも称される）が挙げられる。
本明細書で使用される用語「従来法」は、共通して揮発性有機溶媒、とりわけエタノール−水混合物を使用する一群の方法に関する、ナノ粒子の製造方法を指す。
本発明によるナノ粒子
一態様によれば、
ａ）マトリックスを含んでなるマトリックスナノ球状物であって、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスナノ球状物と；
ｂ）コアとシェルとを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルであって、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルと、
からなる群から選択されるナノ粒子（以下、「本発明によるナノ粒子」と称する）が提供される。
用語「ナノ粒子」は、前記で定義した通りであり、この特定の場合において、植物性疎水性タンパク質および少なくとも１種の前記タンパク質の水混和性非揮発性有機溶媒により形成される、平均サイズが１μｍ未満、典型的には１〜９９９ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍ、より好ましくは１２０〜１６０ｎｍ、さらにより好ましくはほぼ１３０〜１４０ｎｍである固体粒子のコロイド系を指す。用語「ナノ粒子」は、特記のない限りは、マトリックスナノ球状物とコアシェル水疱性ナノカプセルとを含んでなる。両方の場合において、これらの系の大きな比表面積のため、ＰＯＩの分子（もし存在するならば）、ナノ粒子の表面に捕捉または吸着されてもよい。
特定の実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、本発明のナノ粒子は、マトリックスを含んでなり、前記マトリックスは植物性疎水性タンパク質と前記タンパク質の少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる、マトリックスナノ球状物である。この実施態様によれば、ナノ球状物のマトリックスは、植物性疎水性タンパク質および前記タンパク質の１種以上の水混和性非揮発性有機溶媒により形成された三次元ネットワークである。この実施態様によれば、目的物質はナノ球状物内に捕捉されても、カプセル化されていてもよいし、または目的物質はナノ球状物の表面に吸着されてもいいし、または接合されてもよい。
別の特定の実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、コアとシェルとを含んでなるコアシェルナノ水疱性構造（コアシェル水疱性ナノカプセル）であって、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と、少なくとも１種の前記タンパク質の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる、コアシェルナノ水疱性構造である。空洞（コアまたは溜）は、液体、半固体もしくは固体形態でＰＯＩを含有するか、または分子分散体としてＰＯＩを含有し；溜は、調製方法および使用される原料に従って脂溶性または疎水性であることができる。これは、液体、半固体もしくは固体状態、例えば、ＰＯＩを含んでなる油、水不混和性液体、有機溶液もしくは懸濁液、例えば、油状溶液もしくは懸濁液、ＰＯＩを含んでなる水溶液または懸濁液の形態でＰＯＩを担持するために特に有用である。この実施態様によれば、ＰＯＩは、ナノカプセルのコア内であるか、またはナノカプセルの表面に吸着されることができる。
別の特定の実施態様によれば、本発明によれば、少なくとも１種の本発明によるマトリックスナノ球状物と、少なくとも本発明によるコアシェル水疱性ナノカプセルとの組み合わせが提供される。
用語「植物性疎水性タンパク質」は、上記で定義した通りである。特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、穀物用植物由来のタンパク質であり、好ましくはコーン、コムギ、オオムギ、米、雑穀およびソルガムから選択される植物からのタンパク質であり、より好ましくはコーンからのタンパク質である。別の好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、穀物においてみられるタンパク質である。
プロラミンは、穀物においてみられ、デンプンと関連した植物性疎水性タンパク質に属し、以下のような具体的な名前を有するが、これらには限定されない：コムギ（グリアジン）、オオムギ （ホルデイン）、ライ麦（セカリン）、コーン（ゼイン）、ソルガム（カフィリン）、雑穀（パニシン）、米（オルゼニン）およびオート麦（アベニン）。前記タンパク質は、グルテンの一部分を構成している。したがって、好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、プロラミン、好ましくはグリアジン、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニンから選択されるプロラミン；より好ましくはプロラミンはグリアジン、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されたものであり；さらにより好ましくはゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンから選択されたものであり；最も好ましくはゼインである。
ゼインタンパク質は、コーングルテンミールの溶媒抽出により得ることができる。ゼインの抽出法は、当業者により知られている（［１５］参照）。また、ゼインは市販もされている。生物学的見地から、ゼインは、分子の大きさや溶解度が異なるタンパク質の混合物である。これらのタンパク質は、異なる溶解度およびそれらの関連する構造により４種類に分離できる：α、β、γおよびδ［１５］。α−ゼインが非常に多く存在し、全体の約７０％を占め、分子量が約２２ｋＤａである［３５］。これらの種類のゼイン：α、β、γおよびδは、トウモロコシにおいて順次表され、安定であるために互いに相互作用することが判明している。コーンからのゼインは、α−ゼインが約３５％であり、２２および２４ｋＤａの顕著なバンドを有することが報告されている。β−ゼインは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは還元が必要である。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、β−ゼインが２４、２２および１４ｋＤａの３つの主要なバンドを有することを示す［３６］。本発明において有用なゼインは、４種類のゼイン（α、β、γおよびδ）またそれらの混合物のいずれであってもよい。好ましい実施態様によれば、ゼインは、４種類のゼインの混合物、より好ましくはα−ゼインから主になる４種類のゼインの混合物である。より好ましい実施態様によれば、ゼインは市販のゼインである。
ゼインの溶解度は、レビューにおいて報告された［１５］。ゼインは、ｐＨ１１．５以上の水性アルコール、グリコール、エチルアルコール、フルフリルアルコール、テトラヒドロフルフリルアルコールおよびアルカリ性水溶液に溶解する。ゼインは、水、アセトンおよび無水アルコール（メタノールを除く）に不溶である。一次溶媒の全てがグリコール、グリコールエーテル、アミノアルコール、ニトロアルコール酸、アミドおよびアミンであることは興味深い。グリコールは、それらの対応する一価アルコールよりもかなり大きな溶媒力を有している。プロピレングリコールは、ゼインには良溶媒であるが、無水プロパノールはそうではない。さらなるヒドロキシル基を追加すると、溶媒力が低下すると思われる。プロピレングリコールは室温でゼインを溶解することができるが、一方、グリセロールは１５０℃に加熱する必要があり、分子量が３，０００を超えるポリプロピレングリコールはゼインを全く溶解しない［１５］。
ゼイン、コーン胚乳におけるプロラミンは、リボンまたはプリズムを形成している互いに平行に整列しているアルファヘリックスセグメントのタンデムリピートからなる独特の空間的配置に配置されている非極性アミノ酸５０％超を含む。この構造は、タンパク質表面によく確定された疎水性および親水性ドメインを生じる。目的は、脂肪酸、フレーバー、含油樹脂、ビタミンおよびペプチド［３７］のためのミクロカプセル化物質として有用な制御された形状のナノ構造を製造することである。
また、本発明のナノ粒子は、少なくとも１種の使用される疎水性タンパク質の水混和性非揮発性有機溶媒を含有する。少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒は、前記タンパク質の一次溶媒である必要がある。したがって、水混和性非揮発性有機溶媒は、一次溶媒もしくは一次溶媒の混合物、または少なくとも１種の一次溶媒と１種以上の二次溶媒との混合物でもよい。用語「水混和性」および「非揮発性有機溶媒」は、上記で定義した通りである。前記タンパク質を溶解できなければならないことが一次溶媒の要件であることから、本発明の水混和性非揮発性有機溶媒は使用される植物性疎水性タンパク質に応じて異なることができる。タンパク質の「溶解度」は、ある温度で一定量の溶媒に完全に溶解するタンパク質の量（グラム）として定義される。タンパク質を溶解するために１５℃〜２５℃の温度範囲で溶質の１部（ｇ）について約１０〜３０部の溶媒（ｍＬ）を使用する必要がある場合、タンパク質は英国薬局方に準じて溶媒に可溶であるとみなされる。
これに関連して、用語「一次溶媒」は、タンパク質が共溶媒を使用することなく完全溶解する溶媒に使用される。ゼイン一次溶媒は、グリコール、グリコールエーテル、アミノアルコール、ニトロアルコール酸、アミドおよびアミンである［１５］。特定の実施態様によれば、一次溶媒は、酒石酸ブチル、１，３−ブチレングリコール、ジエタノールアミン、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールモノメチルアルコール、乳酸エチル、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチルアルコール、エチレン グリコールモノメチルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエタノールアミン、トリエチレンテトラアミン、トリエチレングリコール、ヒドロキシエチルエチレンジアミン、グリセロール、グリセロール−α−メチルアルコール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパノジオール、乳酸メチル、モノエタノールアミン、フェノールおよびレゾルシノールモノアセテートから選択されたものであり；好ましくはプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエタノールアミン、エチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、トリエチレンテトラアミン、トリエチレングリコール、乳酸メチル、モノエタノールアミン、エチレングリコールモノエチルアルコールおよび乳酸エチルから選択されたものであり；より好ましくはプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエタノールアミン、エチレングリコール、１，３−ブチレングリコールおよび乳酸メチルから選択されたものであり；さらにより好ましくはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールおよび乳酸エチルから選択されたものである。
したがって、用語「二次溶媒」は、本発明において、一次溶媒と混和性であり、４０℃未満の温度でタンパク質を溶解することができない溶媒に対して使用されるが、これらは、一次溶媒と適切な割合で混合したときにタンパク質を溶液で保つことができる。好適な二次溶媒としては、水、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルアルコール、カプリロカプロイルマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーなどが挙げられるが、これらには限定されない。したがって、使用される二次溶媒の割合に応じて、植物性疎水性タンパク質非溶媒としてか（植物性疎水性タンパク質を沈殿させるのに必要とされる割合において使用されるとき）、または植物性疎水性タンパク質溶媒として（ナノ粒子を形成するのに必要とするよりも少ない割合で一次溶媒と混合するとき）作用することができる。当業者は、実施例２．１に示すように、溶媒へのタンパク質の溶解度を測定するための検討を実施することにより植物性疎水性タンパク質を沈殿させたり、溶解するのに適当な二次溶媒の容積を測定できる。
したがって、用語「二元」、「三元」または「それ以上の多元」混合物は、１種、２種またはそれ以上の種類の二次溶媒と少なくとも１種の一次溶媒との混合物を称するのに使用される。
好ましい実施態様によれば、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオールである。より好ましくは実施態様によれば、ポリオールは、グリコール、好ましくはプロピレングリコールである。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、化粧品または医薬用途に好適な溶媒である。
別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコール、またはプロピレングリコールと他の一次および/または二次溶媒との混合物である。一実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコールとＬｕｔｒｏｌ（登録商標）との二元混合物である。別の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコールとグリセロールとの二元混合物である。別の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコールと水との二元混合物である。
プロラミンは、水に不溶であり、水性アルコールに可溶である特徴がある。プロラミンは、極度の酸性またはアルカリ性溶液に可溶であり、ヒドロキシル化合物 （例えば、エタノール、２−プロパノールまたはグリセロール）、ケトン類 （例えば、アセトン、メチルエチルケトン）およびアミド類（例えば、アセトアミド）に属する有機溶媒の水性混合物に可溶である。プロラミンは、水を６０重量％以下で含有する溶媒の水性混合物に溶解する。本発明の目的のために、「水混和性非揮発性有機溶媒」は、揮発性溶媒、例えば、エタノールまたはアセトンであることはできない。好ましい実施態様によれば、プロラミン用の水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコールである。
タンパク質がゼインであるとき、水混和性非揮発性有機溶媒は、［１５］において報告されている一次溶媒のうちの一つであることができる。好適な溶媒としては、例えば、酒石酸ブチル、１，３−ブチレングリコール、ジエタノールアミン、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールモノエチルアルコール、ジエチレングリコールモノメチルアルコール、乳酸エチル、プロピレングリコール、エチルアルコールトリプロピレングリコール、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチルアルコール、エチレングリコールモノメチルアルコール、グリセロール、グリセロール−α−メチルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、乳酸、トリエタノールアミン、トリエチレンテトラアミン、ジエチレントリアミン２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ヒドロキシエチルエチレンジアミン、乳酸メチル、モノエタノールアミン、フェノール、レゾルシノールモノアセテートなどが挙げられるが、これらには限定されない。
好ましい実施態様によれば、ゼイン用の水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコール（ＰＧ）である。
本発明のナノ粒子は、１種、２種または３種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなることができる。好ましい実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、溶媒の二元混合物、好ましくはプロピレングリコールと他の一次または二次水混和性非揮発性有機溶媒との混合物を含んでなる。
本発明のナノ粒子が大きな比表面積を有するため、目的物質の分子は、ナノ粒子の表面に捕捉されるか、吸着されるか、接合される。したがって、本発明のナノ粒子は、効率的に目的物質、例えば、異なる物理的状態、使用および用途を有する、大または小疎水性または親水性化合物を取り込むことができ、したがって、種々の産業（例えば、医薬、化粧品または農業用組成物において、食品においてなど）に適用されることができる。
したがって、特定の実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、さらに目的物質（ＰＯＩ）を含んでなり；この場合、本発明のナノ粒子は、本明細書において、「本発明による充填されたナノ粒子」として定義されることがある。前記ＰＯＩに関連した情報は、上記セクション（「定義」）においてみることができる。当業者は、本発明による充填されたナノ粒子は、前記ＰＯＩが互いに非相溶であることを条件として、同じナノ粒子に意図する１種以上の製品（ＰＯＩ）を取り込むことができる。
特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、抗酸化剤クルクミンまたは抗菌薬クロルヘキシジンであり、本発明のナノ粒子は、ＰＯＩがナノ球状物内に捕捉またはカプセル化される、またはＰＯＩがナノ球状物の表面に吸着されるか、もしくは接合されるマトリックスナノ球状物である。
別の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、その物理的状態とは無関係に、エッセンシャルオイル、例えば、揮発性油、例えば、とりわけＰＧ：ゼイン溶液と混和性であるアロマオイル、例えば、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、オイゲノール、桂皮油、タイム（タチジャコウソウ）油、またはＰＧ：ゼイン溶液と不混和性であるアロマ油、例えば、レモンエッセンシャルオイル；非揮発性油、例えば、タラ肝油；または脂肪酸、例えば、オレイン酸またはリノレン酸など（ＰＯＩがナノカプセル内に捕捉されるかまたはカプセル化されたコアシェル水疱性ナノカプセルである本発明のナノ粒子内に関連またはカプセル化されるか、またはこれらのナノカプセルの表面に吸着または接合される）である。好ましい実施態様によれば、エッセンシャルオイルは、ＰＧ：ゼイン溶液と混和性である揮発油、好ましくはセイヨウハッカ油、オイゲノール、桂皮油およびタチジャコウソウ油から選択されるものである。別の好ましい実施態様によれば、エッセンシャルオイルは、ＰＧ：ゼイン溶液と不混和性である揮発油、好ましくはレモンエッセンシャルオイルである。別の好ましい実施態様によれば、エッセンシャルオイルは、非揮発性油、好ましくはタラ肝油、オレイン酸およびリノレン酸から選択されたものである。
別の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、ＰＯＩがナノカプセル内に捕捉またはカプセル化されているか、またはナノカプセルの表面に吸着されるか、または付着している、コアシェル水疱性ナノカプセルである本発明のナノ粒子内で関連またはカプセル化されている溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態の油である。
本発明による充填されたナノ粒子における植物性疎水性タンパク質：ＰＯＩ重量比、好ましくは「ゼイン」：ＰＯＩ重量比は、広範囲内で異なることができる。それにもかかわらず、特定の実施態様によれば、本発明による充填されたナノ粒子における植物性疎水性タンパク質（好ましくはゼイン）：ＰＯＩ重量／重量比は、１：１０−６〜１：１０６、好ましくは１：１０−４〜１：１０３、より好ましくは１：０．００１〜１：１００でよい。
本発明のマトリックスナノ粒子およびコアシェル水疱性ナノカプセルは、主にそれぞれ正または負の平均表面電荷を有するカチオン性またはアニオン性である。
アニオン性ナノ粒子は、ナノ粒子に、アニオン性ポリマー、例えば、アラビアゴムを塗布することによるか、またはナノ粒子のマトリックスまたはシェルにアニオン性ポリマーを複合化することにより得ることができる。好ましい実施態様によれば、使用されるアニオン性またはポリアニオン性ポリマーは、アラビアゴムである。
高分子粒子系の製造方法
別の態様によれば、本発明は、マトリックスであって、植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスを含んでなるマトリックスナノ球状物の製造方法（以下、「本発明の方法［１］」）であって、前記マトリックスナノ球状物を形成するために、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒に植物性疎水性タンパク質を溶解した溶液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させることを含んでなり、植物性疎水性タンパク質の溶液が揮発性有機溶媒を含まない、方法に関する。本発明の方法［１］は、本発明の「空」ナノ粒子、すなわち、目的物質（ＰＯＩ）なしのナノ粒子、特にマトリックスが植物性疎水性タンパク質と、植物性疎水性タンパク質の少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスナノ球状物を提供する。
水混和性非揮発性有機溶媒の詳細は、「定義」の欄において定義されている。また、本発明のナノ粒子の関連で開示されている水混和性非揮発性有機溶媒に関連する実施態様は、本発明の方法［１］に適用することもできる。
有機溶媒は、植物性疎水性タンパク質が可溶化されることができるいずれかの好適な水混和性非揮発性有機溶媒、好ましくは薬学的、食品または美容上許容できる非揮発性有機溶媒であることができ、一次溶媒、または少なくとも１種の一次溶媒と１種以上の二次溶媒との適切な混合物を含んでなる。さらに、有機溶媒は、複数の一次溶媒の混合物でもよい。本発明の方法［１］に関連して使用できる有機溶媒の具体例としては、とりわけグリコール類とグリコールエーテル類が挙げられるが、これらには限定されない。
本明細書で使用される用語「グリコール」は、２つのヒドロキシル官能基（−ＯＨ）を含むいずれかの非揮発性有機化合物を指す。またグリコールは、ジオールとも称され、アルコール、例えば、プロピレングリコール（ＰＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコールなどが挙げられる。ＰＧおよびＰＥＧは、液体（ＰＧ）として、またはＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００）の分子量（Ｍｗ）に応じて固体として存在することができる非揮発性アルコールである。固体溶媒（例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００など）は、とりわけ、例えば、薬品の投与のための固体医薬形態、例えば、座薬、例えば、解熱薬を含んでなる肛門座薬、または例えば、抗真菌薬を含んでなる膣坐剤（胚珠）を製造するために使用でき、ナノ粒子は、植物性疎水性タンパク質と水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる溶液が体液、例えば、膣液または消化管液と接触するとき形成する。一次溶媒として本発明において有用なグリコールは、植物性疎水性タンパク質が溶解できるものである。したがって、植物性疎水性タンパク質が溶解できないグリコールは、二次溶媒として有用（ナノ粒子を形成するのに必要とされるよりも小さい割合で一次溶媒と混合したとき）であるか、または植物性疎水性タンパク質非溶媒として有用である。したがって、使用されるグリコールは、溶解される特定の植物性疎水性タンパク質によって決まる。ゼイン溶媒は、［１５］に開示されている。好適なゼイン溶媒は、１，３−ブチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエチレングリコールなどであるが、これらには限定されない。特定の実施態様によれば、有機溶媒は、グリコール、好ましくはプロピレングリコールである。
グリセリンとも称される用語「グリセロール」は、水に対する溶解度および吸湿性に関与する３個のヒドロキシル基を有するポリオールを指す。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、１３９℃を超える温度の一次溶媒として、および１３９℃未満の温度での二次溶媒としてのポリオール、好ましくはグリセロールである。
本明細書で使用される用語「グリコールエーテル」は、エチレングリコールのアルキルエーテルを主成分とする溶媒群を指す。本発明のための好適なグリコールエーテルは、ジエチレングリコールモノエチルアルコール、ジエチレングリコールモノメチルアルコール、エチレングリコールモノエチルアルコール、エチレングリコールモノメチルアルコールなどであるが、これらには限定されない。
特定の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒はポリグリコールである。ポリグリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール類（ＭＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール類（ＰＰＧ）およびポリブチレングリコール類（ＰＢＧ）などが挙げられるが、これらには限定されない。
別の特定の実施態様によれば、有機溶媒は、一次または二次溶媒としての２種以上の水混和性非揮発性ポリグリコール類の混合物を含んでなる。
別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオールである。用語「ポリール」は、「定義」の欄で定義されている。
本発明において有用である水混和性非揮発性有機溶媒は、複数の種類、例えば、ポリオールとグリコールであるプロピレングリコール（ＰＧ）において挙げられる。
別の実施態様によれば、非揮発性水混和性有機溶媒は、少なくとも１種のポリオール （ＰＧ）、または少なくとも１種の一次溶媒と１種以上の二次溶媒との適切な溶媒混合物、例えば、植物性疎水性タンパク質、特にゼインについての二元および三元溶媒混合物を含んでなる。例えば、ＰＧ：グリセロール混合物、ゼインを可溶に保つ一定割合の水のＰＧ：水混合物、またはＰＧ：ＰＥＧ：グリセロール混合物が挙げられるが、これらには限定されない。あるいは、有機溶媒は、ＰＧと、アルコール以外の非揮発性ＰＧ混和性溶媒とを含んでなる。ＰＧを含む二元混合物の一部分を構成することができるアルコール以外の非揮発性水混和性溶媒としては、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリロカプロイルポリオキシグリセリド、脂肪酸誘導体、例えば、それらのＰＧ、例えば、ＰＥＧ誘導体などが挙げられるが、これらには限定されない。用語「カプリロカプロイルポリオキシグリセリド」とは、脂質系表面活性剤を指す。一つの代表的なカプリロカプロイルポリオキシグリセリドは、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ社によりＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）として販売されているＰＥＧ−８カプリル／カプリングリセリドである。カプリロカプロイルポリオキシグリセリドは、「カプリロカプロイルマクロゴールグリセリド」としても知られている。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ：グリセロールの二元混合物である。別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ：Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）の二元混合物である。別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の二元混合物である。別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ：Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）の二元混合物である。別の好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ：水の二元混合物である。
好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質の溶液の一次水混和性非揮発性有機溶媒は、前記溶液における主要溶媒である。
植物性疎水性タンパク質の詳細は、「定義」の欄および本発明のナノ粒子の関連で定義されている。本発明のナノ粒子の関連で開示されている植物性疎水性タンパク質に関連した実施態様は、本発明の方法［１］にも適用できる。
特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、穀物用植物由来のタンパク質；好ましくはコーン、コムギ、オオムギ、米、雑穀およびソルガムから選択される植物から得たタンパク質、より好ましくはコーンから得たタンパク質である。別の好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、穀物にみられるタンパク質である。
別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、プロラミン、好ましくはグリアジン、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニンから選択されるプロラミン；より好ましくは、プロラミンは、グリアジン、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されるものであり；さらにより好ましくは、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンから選択されるものであり；最も好ましいものはゼインである。
溶液を形成するための水混和性非揮発性有機溶媒における前記植物性疎水性タンパク質の濃度は、広範囲で異なることができるが、特定の実施態様によれば、前記有機溶液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１％〜１０％（ｗ／ｖ）であり；特定の実施態様によれば、有機溶液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、２．５〜５％（ｗ／ｖ）である。
植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含有する有機溶液は、前記製品を有機溶媒に溶解することにより調製できる。特定の実施態様によれば、有機溶媒は、水混和性非揮発性ポリオール、例えば、ＰＧである。別の特定の実施態様によれば、有機溶媒は、少なくとも１種または２種のポリオールと、任意のアルコール以外の溶媒、例えば、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリロカプロイルマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ＵＳＰ−ＮＦ）または脂肪酸誘導体とを含有する、非揮発性水混和性二元または三元溶媒混合物である。
本発明の方法［１］によれば、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒に植物性疎水性タンパク質を含有する有機溶液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは有機溶液において使用される溶媒と混合することができる疎水性タンパク質非溶媒として作用する水性媒体と接触させる。混合物は、疎水性タンパク質沈殿を生じてナノ粒子を形成する。好ましい実施態様によれば、ＰＧにゼインを含有する有機溶液をＰＧ混和性疎水性タンパク質非溶媒として作用する水性媒体と接触させることにより、ゼインの沈殿とナノ粒子の形成を生じさせる。
特定の実施態様によれば、水性媒体は、水、好ましくは蒸留水または再蒸留水を含んでなる。この工程は、好適な温度、典型的には１℃〜１５０℃、好ましくは１０℃〜４０℃、より好ましくは１５℃〜２５℃で実施される。続いて、必要に応じて、得られたナノ粒子の懸濁液を、好適な処理に附して有機溶媒を除去する。有機溶媒を除去することは、除去される溶媒の性質に応じた、当業者に知られている従来の方法、例えば、遠心分離、透析などにより実施できる。特定の実施態様によれば、有機溶媒がＰＧであるときには、ナノ粒子懸濁液を遠心分離してポリオールを除去する。あるいは、ナノ粒子懸濁液は、種々の方法、例えば、ある種の賦形剤、例えば、糖類、塩類、多糖類または界面活性剤を用いた凍結乾燥により乾燥できる。
好ましい実施態様によれば、媒体は、界面活性剤および/またはポリアニオン性ポリマーを含んでなる。
あるいは、前記ナノ粒子は、水混和性非揮発性有機溶液に溶解した植物性疎水性タンパク質をいずれかの体液と混合することにより、インサイチュ生成できる。このために、タンパク質溶媒が植物性疎水性タンパク質を含有する非揮発性水混和性溶媒（例えば、非揮発性水混和性アルコール、例えば、ＰＧ、またはアルコール以外の非揮発性水混和性溶媒、例えば、乳酸、トリエタノールアミン）である有機溶液は、植物性疎水性タンパク質を前記有機溶媒と混合し、植物性疎水性タンパク質を含有する前記有機溶液を、水性媒体、例えば、体液、例えば、胃腸液、血液、硝子体内、皮下、膣液などと混合することにより調製され、その結果、植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼイン（ＺＳＮＰ）のインサイチュ自己組織化ナノ粒子が直接形成される。
この実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質を含有する有機溶液が、溶媒が非揮発性水混和性ポリオール、例えば、ＰＧである溶液であり、植物性疎水性タンパク質を含有する前記非揮発性ポリオール溶液を、例えば、溶液または懸濁液が体液と接触することを可能とする好適な経路、例えば、経口、非経口、直腸、膣などを介して、対象体（例えば、ヒトを含む動物）に投与した場合、ナノ粒子が、水性媒体を含んでなる前記好適な体液と接触状態で、植物性疎水性タンパク質鎖、好ましくはゼイン鎖の自己組織化によりインサイチュ形成される。
したがって、媒体に植物性疎水性タンパク質を含有する溶液であって、前記媒体は少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と、場合によって水性媒体を含んでなり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するのに必要な水性媒体の量より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる媒体が揮発性有機溶媒を含まず、そして植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜４０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜２０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは ０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは０．０１％〜２．５％（ｗ／ｖ）である、溶液は、本発明のさらなる態様を構成している。好ましい実施態様によれば、前記溶液の植物性疎水性タンパク質は、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニンから選択されるものであり；より好ましくはホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されるものであり；さらにより好ましくはゼイン、ホルデインおよびカフィリンから選択されるものであり；最も好ましくはゼインである。別の実施態様によれば、前記溶液における植物性疎水性タンパク質の量は、０．１％（ｗ／ｖ）超、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、少なくとも２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも３０％（ｗ／ｖ）、少なくとも３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも４０％（ｗ／ｖ）および５０％（ｗ／ｖ）以下である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質の量は０．０１％〜５０％であるが、但し、植物性疎水性タンパク質がグリアジンであるとき、植物性疎水性タンパク質の量が０．１％超である。
前記溶液は、適切な量の植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と混合したときに、植物性疎水性タンパク質ナノ粒子を形成できなければならない。前記有機溶液は、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体、好ましくは生体液と接触させることにより、ナノ粒子、主にマトリックスナノ球状物（前記マトリックスは、植物性疎水性タンパク質および少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる）を製造するのに使用することができる。特定の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒はプロピレングリコールであり、水性媒体は水を含んでなり、好ましくは生体液である。好ましい実施態様によれば、媒体は、水混和性非揮発性有機溶媒の二元または三元混合物を含んでなる。好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、プロラミン、好ましくはゼインである。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコールである。好ましい実施態様によれば、溶液または懸濁液は、界面活性剤および／またはポリアニオン性ポリマーをさらに含んでなる。
ナノ粒子を形成するのに必要とする植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体の量は、とりわけ含水有機溶液、または前記疎水性タンパク質を含有する懸濁液における前記植物性疎水性タンパク質の濃度、および選択された植物性疎水性タンパク質非溶媒によって決まるが、特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒：水混和性非揮発性有機溶媒比は、０．０１：１（ｖ／ｖ）〜１０００：１（ｖ／ｖ）、好ましくは ０．５：１（ｖ／ｖ）〜１０：１（ｖ／ｖ）、より好ましくは約４：１（ｖ／ｖ）である。
前記タンパク質を含有する有機非揮発性水混和性溶媒溶液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は広範囲内で異なることができるが、特定の実施態様によれば、前記有機溶液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは２％〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特定の実施態様によれば、有機溶液における疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、約２〜５％（ｗ／ｖ）である。
別の態様によれば、本発明は、目的物質（ＰＯＩ）を含んでなるマトリックスナノ球状物であって、植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスを含んでなるマトリックスナノ球状物の製造方法（以下、「本発明の方法［２］」）であって、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒に溶解して、前記ＰＯＩと前記植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液または懸濁液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させて前記マトリックスナノ球状物を形成し、植物性疎水性タンパク質および目的物質を含んでなる溶液または懸濁液は揮発性有機溶媒を含まないものである、方法に関する。本発明の方法［２］により、本発明の「充填された」ナノ粒子、すなわち、少なくとも１種の目的物質（ＰＯＩ）が充填されたマトリックスナノ球状物を提供される。本発明の方法［２］によれば、ＰＯＩおよび植物性疎水性タンパク質を含んでなる水混和性非揮発性有機溶液または懸濁液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させる。ＰＯＩは、疎水性、親水性または両親媒性化合物であることができる。親水性化合物の場合において、場合によって小割合の水を、ゼイン沈殿を生じてはならない割合でゼインを含有する非揮発性水混和性有機溶媒に添加することができる。
簡単に述べると、非揮発性水混和性有機溶媒にＰＯＩおよび植物性疎水性タンパク質を含んでなる溶液または懸濁液は、当業者により知られている従来の方法、例えば、ＰＯＩと疎水性タンパク質を含んでなる非揮発性水混和性有機溶媒溶液または懸濁液（疎水性タンパク質を含有する好適な水混和性非揮発性有機溶媒にＰＯＩを溶解または懸濁することにより得られる）、あるいは前記ＰＯＩの水溶液もしくは懸濁液（水性媒体の量がナノ粒子を形成するのに必要とする量の水性媒体より少ない水性媒体、例えば、水、好ましくは水混和性タンパク質非溶媒として作用する水を含んでなる媒体にＰＯＩを溶解または懸濁することにより得ることができる）を、植物性疎水性タンパク質の有機溶液と、好適な条件下で混合してＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる前記溶液または懸濁液を得ることにより得ることができる。前記操作条件の具体例としては、例えば、室温で好適な時間、例えば、１〜３０分、典型的には１５分未満、好ましくは約５分間攪拌することが挙げられるが、これには限定されない。
ＰＯＩの詳細は、上記「定義」の欄で述べた。
植物性疎水性タンパク質の詳細、および植物性疎水性タンパク質の溶液、例えば、アルコールの詳細、濃度などは、本発明の方法［１］との関連で前記した通りである。好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質はプロラミン、好ましくはゼインである。水混和性非揮発性有機溶媒の詳細は、本発明の方法［１］との関連で前記した通りである。特定の実施態様によれば、アルコール性溶液に存在するアルコールは、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコール（ＰＧ）である。
また、本発明の方法［１］との関連で開示されている全ての実施態様は、本発明の方法［２］にも適用可能である。
本発明の方法［２］によれば、ＰＯＩを含んでなる水混和性非揮発性有機溶媒に植物性疎水性タンパク質を添加して調製した溶液または懸濁液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体、すなわち、水混和性ポリマー非溶媒として作用する水を含んでなる媒体と接触させて、前記ＰＯＩが充填されたナノ粒子（「ＰＯＩが充填された粒子」）を形成する。特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質非溶媒は、水、好ましくは蒸留水または再蒸留水を含んでなる。タンパク質溶媒（アルコール、例えば、ＰＧ）とタンパク質非溶媒（例えば、水）との間の容積比［溶媒：非溶媒］は、広範囲で異なることができ、典型的には１：０．００１（ｖ／ｖ）〜１：５０００（ｖ／ｖ）、好ましくは１：４（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）であることができる。
ＰＯＩを含んでなる水混和性非揮発性有機溶媒における植物性疎水性タンパク質溶液または懸濁液をタンパク質非溶媒媒体と接触させる工程は、好適な温度、典型的には１℃〜１５０℃、好ましくは１０℃〜４０℃、より好ましくは１５℃〜２５℃で実施される。
続いて、必要ならば、このようにして得られたＰＯＩが充填されたナノ粒子の懸濁液を好適な処理に附して水混和性非揮発性有機溶媒を除去し、ポリオールを含まない、ＰＯＩが充填されたナノ粒子のタンパク質非溶媒懸濁液、好ましくは水性懸濁液を得る。水混和性非揮発性有機溶媒（好ましくはポリオール）を除去することは、当業者により知られている従来の方法、例えば、遠心分離または透析などにより実施することができ、特定の実施態様によれば、ＰＯＩが充填されたナノ粒子懸濁液を遠心分離してＰＧを除去する。しかしながら、溶媒がＰＧであるとき，経口または非経口経路によりヒトにおいて使用できるので、ＰＧを除去する必要がない。
好ましい実施態様によれば、媒体は、界面活性剤および／またはポリアニオン性ポリマーをさらに含んでなる。
本発明の方法［２］によれば、「ＰＯＩが充填されたナノ粒子」を得るために、懸濁液または溶液の形態でＰＯＩを含んでなる非揮発性有機溶媒におけるゼインの溶液または懸濁液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体、すなわち、自然または磁気攪拌下で水混和性ゼイン非溶媒として作用する水を含んでなる媒体と接触させる。前記操作条件の具体例としては、例えば、室温で好適な時間、例えば、１〜３０分間攪拌することが挙げられるが、これには限定されない。
別法として、植物性疎水性タンパク質がインサイチュ自己組織化ナノ粒子（ＺＳＮＰ）を形成する可能性があるので、本発明では、マトリックスと目的物質（ＰＯＩ）を含んでなるマトリックスナノ球状物であって、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるものであるマトリックスナノ球状物のさらなる製造方法であって、前記ＰＯＩと前記植物性疎水性タンパク質とを含んでなる有機溶液または懸濁液であって、非揮発性水混和性溶媒を含んでなる有機溶液または懸濁液を、体液、例えば、胃腸液、血液、硝子体内液、膣内液などと接触することを含んでなり、その結果、ＰＯＩが充填された植物性疎水性タンパク質のインサイチュ自己組織化ナノ粒子（Ｌｏａｄｅｄ−ＺＳＮＰ）が直接形成される方法が提供される。この方法により、本発明の「充填された」ナノ粒子、すなわち、少なくとも１種のＰＯＩが充填されたインサイチュ自己組織化マトリックスナノ球状物が提供される。この方法によれば、少なくとも１種の非揮発性水混和性溶媒においてＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる有機溶液または懸濁液を、水性体液と接触させる。
この方法は、ＰＯＩが疎水性、親水性または両親媒性化合物であるときに有用である。簡単に述べると、非揮発性水混和性溶媒においてＰＯＩおよび植物性疎水性タンパク質を含んでなる有機溶液または懸濁液は、前記ＰＯＩの溶液または懸濁液（ＰＯＩを非揮発性水混和性溶媒、または水性媒体がナノ粒子を形成するのに必要な水性媒体の量より少ない水性媒体に溶解または分散することにより得ることができる）を、好適な条件下で、非揮発性水混和性有機溶媒に植物性疎水性タンパク質を添加して調製した溶液と混合することにより、非揮発性水混和性溶媒においてＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、特にゼインとを含んでなる前記溶液または懸濁液が得られる。
非揮発性有機溶媒においてＰＯＩ：タンパク質溶液または懸濁液を得るための前記操作条件としては、例えば、室温で好適な時間、例えば、１〜３０分間、好ましくは約２０分間、典型的には１５分間未満、好ましくは５分間攪拌することが挙げられるが、これには限定されない。前記溶液または懸濁液の溶媒（ＰＯＩの溶液または懸濁液および植物性疎水性タンパク質の溶液）は異なっていてもよいが、実際には、両方の溶液または懸濁液の溶媒が同じであることが好ましく、特定の実施態様によれば、前記溶媒はＰＧなどのポリオールである。
ＰＯＩの詳細は、「定義」の欄において述べてある。植物性疎水性タンパク質、好ましくはプロラミン、より好ましくはゼインの詳細は、本発明の方法［１］と関連して前述した。水溶性非揮発性有機溶媒の詳細は、本発明の方法［１］と関連して前述した。
上記したように、溶媒はいずれかの適当な溶媒、例えば、植物性疎水性タンパク質が可溶化されることができる非揮発性水混和性溶媒でよく、好ましくは薬学的または美容上許容できる非揮発性水混和性溶媒である。本発明の方法［２］との関連で使用することができる非揮発性水混和性一次溶媒としては、例えば、非揮発性水混和性アルコール、例えば、ＰＧなどが挙げられるが、これらには限定されない。非揮発性水混和性一次溶媒（単一または複数）は、適切な割合で、二次溶媒、例えば、アルコール以外の非揮発性水混和性溶媒、例えば、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリロカプロイルポリオキシ−グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標））、脂肪酸誘導体、例えば、それらのＰＧまたはＰＥＧ誘導体など、およびそれらの混合物、例えば、２種以上の非揮発性水混和性アルコールの混合物、アルコール以外の２種以上の非揮発性水混和性溶媒の混合物、または少なくとも１種の非揮発性水混和性アルコールと、アルコール以外の少なくとも１種の非揮発性水混和性溶媒との混合物と混合してもよい。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコールである。
前記ＰＯＩと前記非揮発性水混和性溶媒とを含んでなる溶液または懸濁液における前記植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、広範囲で異なることができるが、特定の実施態様によれば、前記溶液または懸濁液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは１％〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特定の実施態様によれば、有機溶液または懸濁液における植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインの濃度は、約２．５％（ｗ／ｖ）である。
本発明の方法［２］によれば、非揮発性水混和性溶媒におけるＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液または懸濁液を、水性体液、例えば、胃腸液と接触させて、タンパク質鎖のインサイチュ自己組織化により前記ＰＯＩが充填されたナノ粒子（「ＰＯＩが充填されたナノ粒子」）を形成する。特定の実施態様によれば、水性体液は、疑似腸液を含んでなる。この工程を、１０℃〜５０℃、より好ましくは３５℃〜３７℃の好適な温度で実施する。
媒体に溶解または懸濁した植物性疎水性タンパク質および目的物質を含有する溶液または懸濁液であって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒および場合によって界面活性剤および場合によって水性媒体を含んでなり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するために必要な水性媒体の量より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる媒体が揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜４０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜２０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは０．０１％〜２．５％（ｗ／ｖ）である溶液または懸濁液は、本発明のさらなる態様を構成する。好ましい実施態様によれば、前記溶液または懸濁液の植物性疎水性タンパク質は、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニンから選択されるものであり；より好ましくはホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されるものであり；さらにより好ましくはゼイン、ホルデインおよびカフィリンから選択されるものであり、最も好ましくはゼインである。別の実施態様によれば、前記溶液または懸濁液における植物性疎水性タンパク質の量は、０．１％（ｗ／ｖ）超、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、少なくとも２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも３０％（ｗ／ｖ）、少なくとも３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも４０％（ｗ／ｖ）および５０％（ｗ／ｖ）以下である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質の量は、０．０１％〜５０％であるが、但し、植物性疎水性タンパク質がグリアジンであるとき、植物性疎水性タンパク質の量は０．１％超である。前記溶液または懸濁液は、適切な量の植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と混合したとき、植物性疎水性タンパク質ナノ粒子を形成できなければならない。前記有機溶液または懸濁液を使用して、ＰＯＩが充填されたナノ粒子、主にマトリックスナノ球状物であって、前記マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とも含んでなるマトリックスナノ球状物を、タンパク質非溶媒媒体と、好ましくは水性媒体と、より好ましくは生体液と接触させることにより製造できる。特定の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、プロピレングリコールであり、植物性疎水性タンパク質非溶媒は水を含んでなる水性媒体、好ましくは生体液である。好ましい実施態様によれば、媒体は、水混和性非揮発性有機溶媒の二元または三元混合物を含んでなる。好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、プロラミン、好ましくはゼインである。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコールである。好ましい実施態様によれば、溶液または懸濁液は、界面活性剤および／またはポリアニオン性ポリマーをさらに含んでなる。
別の態様によれば、本発明は、コアシェルに関連して目的物質（ＰＯＩ）を含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルであって、前記コアシェル水疱性ナノカプセルがコアとシェルとを含んでなり、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルの製造方法（本発明の方法［３］）であって、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒において前記ＰＯＩおよび前記植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させて、前記コアシェル水疱性ナノカプセルを形成することを含んでなり、植物性疎水性タンパク質と目的物質を含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まない、方法に関する。ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、界面活性剤などの賦形剤の不存在下または存在下で、タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させる。特定の実施態様によれば、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインとを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、界面活性剤の存在下で水性媒体と接触させる。
本発明の方法［３］により、本発明の「充填された」ナノ粒子、すなわち、少なくとも１種のＰＯＩが充填された「コアシェル水疱性ナノカプセル」が提供される。ＰＯＩは、ナノカプセル内にあってもよいし、シェルナノカプセルの表面に吸着していてもよい。
ＰＯＩの詳細は、「定義」の欄に定義されている。
ＰＯＩは、液体、半固体または固体状態でよい。特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは油である。コアシェルナノカプセル、好ましくはゼインナノカプセル（ＺＳＮＣ）は、インサイチュナノ沈殿−表面堆積法または乳化−インサイチュ表面堆積法により得ることができる。油がＰＧと混和性であるときにインサイチュナノ沈殿−表面堆積法を使用し、油状物質がＰＧと不混和性であるとき乳化−インサイチュ表面堆積法を使用する。
別の特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質が溶解された場合、ＰＯＩを、植物性疎水性タンパク質が溶解された水混和性非揮発性有機溶媒に溶解、乳化または分散する。別の特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、水不混和性溶媒における油状溶液もしくは懸濁液の形態または溶液もしくは分散液の形態での薬品、化粧品または食品である。
別の特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、賦形剤、例えば、液体パラフィンまたは溶融脂質、例えば、ワックスである。前記賦形剤は、コアシェル水疱性ナノカプセルのコアに含有される。
本発明の方法［３］によれば、前記ＰＯＩは、例えば、（ｉ）植物性疎水性タンパク質を含んでなる非揮発性有機溶媒と混和性であり、油とタンパク質を含有する有機溶液を形成する、揮発油、例えば、エッセッシャルペパーミント油、オイゲノール、桂皮油、タイム（タチジャコウソウ）油またはそれらの化学成分（すなわち、メントール、メントンなど）、（ｉｉ）植物性疎水性タンパク質を含んでなる非揮発性有機溶媒と不混和性であり、油滴とタンパク質溶液を含有するエマルジョンを生じる、揮発油、例えば、エッセッシャルレモン油またはそれらの化学成分（すなわち、レモネン）、（ｉｉｉ）植物性疎水性タンパク質を含んでなる非揮発性有機溶媒と混和性または不混和性であり、タンパク質溶液において前記油の有機溶液またはエマルジョンを形成する、液体、半固体または固体状態における非揮発性油もしくは脂肪酸、例えば、オレイン酸またはリノール酸でよい。
水混和性非揮発性有機溶媒の詳細は、本発明の方法［１］との関連において上記で述べた。特定の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコール（ＰＧ）である。
植物性疎水性タンパク質の詳細は、本発明の方法［１］との関連で上記で述べた。特定の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質はプロラミン、好ましくは ゼインである。
本発明の方法［１］との関連で開示されている全ての実施態様は、本発明の方法［３］にも適用できる。
本発明の方法［３］によれば、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、界面活性剤の不存在下もしくは存在下または他の賦形剤の存在下で、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と接触させる。この方法は、ＰＯＩが疎水性、親水性または両親媒性化合物であるとき、特に有用である。
簡単に述べると、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンは、好適な条件下で、ＰＯＩを、水混和性非揮発性有機溶媒中植物性疎水性タンパク質の有機溶液に混合、溶解または乳化させて、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを得ることにより得られる。
特定の実施態様において、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質の溶液の両方と混合される水混和性非揮発性有機溶媒は、植物性疎水性タンパク質の溶液を形成する溶媒と同一でも、異なっていてもよい。
ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、好ましくは ゼインの両方を含有する有機溶液、懸濁液またはエマルジョンは、水混和性非揮発性ポリオール、好ましくはＰＧでよい。前記有機溶媒としては、例えば、実質的にいずれの非揮発性水混和性溶媒、好ましくは薬学的、食品または美容上許容できるアルコール、例えば、ポリオール、例えば、ＰＧなど、またはポリオールの混合物、もしくは少なくとも１種のポリオール、例えば、ＰＧと、ポリオール以外の少なくとも１種の非揮発性水混和性溶媒、例えば、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリロカプロイルポリオキシ−グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標））、脂肪酸誘導体、例えば、それらのＰＧまたはＰＥＧ誘導体との混合物などが挙げられる。特定の実施態様によれば、ＰＯＩと前記植物性疎水性タンパク質の溶液の両方と混合される水混和性非揮発性有機溶媒は、ＰＧ（ＰＯＩを含んでなる液相は非常にＰＧに高溶解性であるとき）である。
他の特性の中でも、植物性疎水性タンパク質を含有する水混和性非揮発性有機溶媒におけるＰＯＩの溶解度または混和性によって、溶液、懸濁液またはエマルジョン（「１０〜９９９ｎｍの範囲における油滴サイズ」）は、界面活性剤の存在下または不存在下で得ることができる。
特定の実施態様によれば、界面活性剤の不存在下または存在下においてＰＯＩと植物性疎水性タンパク質とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と、界面活性剤の不存在下もしくは存在下または他の賦形剤の不存在下もしくは存在下で接触させてコアシェル水疱性ナノカプセルを形成させる。
水混和性非揮発性有機溶媒、特にＰＧにおいてＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを得るための操作条件の具体例としては、例えば、室温で好適な時間、例えば、１〜３０分間、典型的には１５分間未満、好ましくは約５分間（攪拌をする必要がある場合）の超音波処理、高剪断均一化または攪拌などが挙げられるが、これらには限定されない。
コアシェルナノカプセルを得るための操作条件としては、例えば、水混和性非揮発性有機溶媒、特にＰＧにおいて、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンを、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体と、穏やかな攪拌下、室温で好適な時間、例えば、１〜３０分間、典型的には１５分間未満、好ましくは約５分間（攪拌する必要がある場合）混合することが挙げられるが、これらには限定されない。
ＰＯＩ：非揮発性水混和性溶媒比（容積当たりの重量）（ｍｇ／ｍＬ）は広範囲で異なることができるが、特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩ：非揮発性水混和性溶媒比は、０．００１：１〜１０４：１、好ましくは０．０１：１〜５０：１である。
ＰＯＩの詳細は、「定義」の欄において上記したが、この場合、ＰＯＩは、植物性疎水性タンパク質を含有する水混和性非揮発性溶媒において水不混和特性を有し、溶液、懸濁液またはエマルジョンを形成することができる必要がある。したがって、特定の実施態様によれば、ＰＯＩは、油または固体状脂肪、例えば、エッセンシャルオイル、鉱油、固形脂肪（すなわち、ワックス）である。別の特定の実施態様によれば、ＰＯＩを、水混和性溶媒、例えば、ポリオール、例えば、ＰＧに溶解、懸濁または乳化することにより１相溶液または２相エマルジョンなどを形成する。したがって、植物性疎水性タンパク質を含んでなる水混和性非揮発性溶媒に溶解、分散または乳化されることができる実質的にいずれのＰＯＩも、本発明の方法［３］に関連して使用することができる。
特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、ＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインとを含んでなる水混和性非揮発性溶媒に溶解、分散または乳化されている薬品または化粧品または食品である。
特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは、別のＰＯＩに溶解、分散または乳化されている薬品または化粧品または食品を含んでなることができる。
本発明の方法［３］によれば、溶液または懸濁液またはエマルジョンの形態のＰＯＩと植物性疎水性タンパク質、例えば、油状溶液、懸濁液またはエマルジョンとを含んでなる非揮発性水混和性有機溶媒を、場合によって界面活性剤の存在下で、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体、すなわち、水、非溶媒を含んでなる媒体と接触させて、ＰＯＩが充填されたコアシェル水疱性ナノカプセル（「ＰＯＩが充填されたシェルコアシェル水疱性ナノカプセル」）を形成する。特定の実施態様によれば、タンパク質非溶媒は、水、好ましくは、蒸留水または再蒸留水を含んでなる。（ＰＯＩおよび植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含んでなる溶液または懸濁液またはエマルジョン）：タンパク質非溶媒相容積比は、広範囲、例えば、１：０．５〜１：１０６（ｖ／ｖ）、好ましくは１：０．５〜１：１０００（ｖ／ｖ）、より好ましくは１：５０〜１：１００およびさらにより好ましくは１：２〜１：１０で異なることができる。
好ましい実施態様によれば、媒体は、界面活性剤および／またはポリアニオン性ポリマーをさらに含んでなる。
本発明により提供されるコアシェル水疱性ナノカプセルを製造するために界面活性剤を使用する必要はないけれど、実際には、界面活性剤、例えば、親水性、疎水性またはそれらの混合物を使用して好適なＨＬＢを得るのがよい場合もある。本発明に関連して使用することができる界面活性剤の具体例としては、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（すなわち、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などでエステル化したペグソルビタン由来の油状液体であり、プレーン（非ＰＥＧ化）ソルビタンの脂肪酸とのエステルは、通常「Ｓｐａｎ」という名前で称される）、ソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ソルビタンオレエートのポリオキシエチレン誘導体（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）など、アニオン性界面活性剤、例えば、ソジウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）など、ＢＡＳＦによりＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）として市販されているエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドを主成分とするブロックコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが挙げられるが、これらには限定されない。特定の実施態様によれば、界面活性剤は、ＴＰＧＳ（ＰＥＧ１０００にエステル結合しているアルファ−トコフェニルスクシネート）である。界面活性剤の量は、広範に異なっていてもよいが、特定の実施態様によれば、界面活性剤の濃度は、０．００１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％〜５％（ｗ／ｖ）である。
この工程は、好適な温度、典型的には１℃〜１００℃、好ましくは１５℃〜５０℃で実施される。
媒体中に溶解、懸濁または乳化した植物性疎水性タンパク質および目的物質を含有する溶液、懸濁液またはエマルジョンであって、前記媒体は少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と、場合によって界面活性剤および場合によって水性媒体を含んでなり、水性媒体の量はナノ粒子を形成するのに必要な量より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる媒体は揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量は０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜４０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜２０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）であり、最も好ましくは０．０１％〜２．５％（ｗ／ｖ）である、溶液、懸濁液またはエマルジョンは、本発明のさらなる対応を構成する。好ましい実施態様によれば、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンの植物性疎水性タンパク質は、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニン；より好ましくはホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されるものであり；さらにより好ましくはゼイン、ホルデインおよびカフィリンから選択されるものであり；最も好ましくはゼインである。別の実施態様によれば、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンにおける植物性疎水性タンパク質の量は、０．１％（ｗ／ｖ）超、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、少なくとも２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも３０％（ｗ／ｖ）、少なくとも３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも４０％（ｗ／ｖ） および５０％（ｗ／ｖ）以下である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質の量は、０．０１％〜５０％であるが、但し、植物性疎水性タンパク質はグリアジンであり、このときの植物性疎水性タンパク質の量は０．１％超である。前記溶液、懸濁液またはエマルジョンは、適切な量の植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水と混合したときに植物性疎水性タンパク質ナノ粒子を形成することができるものでなければならない。前記有機溶液、懸濁液またはエマルジョンは、ＰＯＩが充填されたナノ粒子、主にコアシェルナノカプセルであって、前記シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる、ＰＯＩが充填されたナノ粒子を、植物性疎水性タンパク質非溶媒、好ましくは水性媒体、好ましくは生体液と接触させることにより製造するのに使用することができる。特定の実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒はプロピレングリコールであり、タンパク質非溶媒は水を含んでなり、好ましくは生体液である。好ましい実施態様によれば、媒体は、水混和性非揮発性有機溶媒の二元または三元混合物を含んでなる。好ましい実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質は、プロラミン、好ましくはゼインである。好ましい実施態様によれば、水混和性非揮発性有機溶媒は、ポリオール、好ましくはグリコール、より好ましくはプロピレングリコールである。好ましい実施態様によれば、溶液または懸濁液は、さらに界面活性剤および／またはポリアニオン性ポリマーを含んでなる。
必要ならば、本発明のナノ粒子、ＰＯＩが充填されたもの（ＰＯＩが充填されたナノ粒子）と充填されていないもの（「空」ナノ粒子）の両方は、温度および酸化に関してそれらの安定性を増加することを目的として、それらの形成において、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などを取り込むことができる。この場合において、前記抗酸化剤は、ＰＯＩ（必要に応じて）で共カプセル化または本発明のナノ粒子の塗膜で共カプセル化することができる。このために、前記本発明の方法［１］〜［３］は、例えば、抗酸化剤をタンパク質非溶媒媒体、好ましくはナノ粒子を製造するのに使用される水性媒体に添加することにより、ナノ粒子の形成において抗酸化剤を組み込むのに好適に適応される。
さらに、必要に応じて、本発明の方法［１］、［２］および［３］は、本発明のナノ粒子に会合してアニオン性ナノ粒子を得ることができる、アニオン性分子もしくはポリマー、例えば、アニオン性多糖類（例えば、ペクチン、アラビアゴム）またはポリアニオン性塩を含むことができる。前記アニオン性ナノ粒子は、ナノ粒子に前記アニオン性分子またはポリマーを塗布することによるか、またはナノ粒子のマトリックスまたはシェルにアニオン性分子またはポリマーを複合化することにより得ることができる。
さらに、必要に応じて、本発明の方法［１］、［２］および［３］は、粉末の形態において、本発明のナノ粒子、すなわち、ＰＯＩが充填されたナノ粒子および「空」ナノ粒子の両方を得るために、形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥する乾燥工程を含んでなる。特定の実施態様によれば、前記乾燥工程は、凍結乾燥により実施される。前記ナノ粒子の表現形式は、それらの安定性に寄与し、さらに、固形食、例えば、小麦粉、パン、ペストリー製品、穀類、粉ミルクなど、ならびに化粧品および／または医薬組成物および製品において最終的な用途に特に有用である。
ナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥するのに好適な実質的にはいずれの従来の技術または方法も、この乾燥工程を実施するのに使用できるが、特定の実施態様によれば、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥は、噴霧乾燥によるか、または凍結乾燥により実施される。この処理は、一般的に、前記ナノ粒子の好適な保護剤、例えば、糖、例えば、ラクトース、トレハロース、マンニトール、スクロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなどおよびそれらの混合物をナノ粒子の懸濁液に添加することにより実施される。前記保護剤は、本発明のナノ粒子を熱分解、および乾燥過程での酸化から防止する。
「植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼイン：糖」重量比は、広範井で異なることができるが、特定の実施態様によれば、「植物性疎水性タンパク質、好ましくは ゼイン：糖」重量比は、１：１〜１：１０００、好ましくは約１：１〜５である。
同様に、特定の実施態様によれば、糖を含有する溶液は、さらに抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などを含有することができ、この場合、「植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼイン：糖：抗酸化剤」重量比は、１：０．０１〜１０００：０．００１〜１００、好ましくは約１：１〜５：０．２である。
上記したように、当業者は、本発明による充填されたナノ粒子は同じナノ粒子に１種以上のＰＯＩを組み込むことができるが、但し、前記ＰＯＩは互いに非相溶ではないことが理解できるであろう。このため、方法［１］、［２］ および［３］を適切に修正して、植物性疎水性タンパク質を含んでなる水混和性非揮発性有機溶媒の同じ溶液に、あるいは植物性疎水性タンパク質と他のＰＯＩを含んでなる同じ溶液、懸濁液またはエマルジョンに、あるいは異なる製剤にＰＯＩを組み込む。
本発明の方法［１］、［２］または［３］により得られた本発明のナノ粒子は、本発明の追加の態様を構成する。
本発明のさらなる態様によれば、媒体であって、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と植物性疎水性タンパク質非溶媒媒体、好ましくは水性媒体を含んでなり、揮発性有機溶媒を含まない媒体に、本発明によるナノ粒子を添加して調製した懸濁液が提供される。
用途
本発明のナノ粒子は、多種多様な産業、例えば、医薬、化粧品、農業または食品産業において、種々の表面、例えば、口腔、胃腸管、髪、鼻、経口、直腸、皮膚、膣などへの目的物質の送達のためのシステムとして潜在的に有用な多くの性質を有している。
インサイチュ自己組織化による植物性疎水性タンパク質を主成分とするナノ粒子の自然形成という重要な利点があると考えられる。これにより、種々の用途について目的物質を送達するためのナノ粒子を産業的に大量に生産することができるであろう。
本発明のナノ粒子の性質の具体例としては、例えば、疎水性タンパク質を溶解するための揮発性有機溶媒および超音波処理を使用することなく、またはこれらの溶媒を除去するのに適用される蒸発法を使用することなく、ナノ粒子を得るための設備などが挙げられるが、これらには限定されない。これにより、新たに調製したナノ系をいずれかの最終製品に直接添加することができる。さらに、自己組織化ゼインナノ粒子は、目的物質、例えば、小さいまたは大きい親水性、疎水性もしくは両親媒性化合物の高カプセル化効率を含む種々の物理化学的性質を有する種々の分子の組み込み能が高い。ゼインおよび他の植物性疎水性タンパク質について高い溶解力を有する１種の水混和性非揮発性有機溶媒またはそれらの混合物は、可塑剤として作用して粘膜表面への生体接着能を高めることができ、したがって、効果的に粘膜へ薬品送達ができる。さらに、興味深い用途として、ＰＯＩを含有する植物性疎水性タンパク質溶液、懸濁液またはエマルジョンを体液に直接投与して、ナノ粒子のインサイチュ形成と、続いての分子の捕捉、例えば、植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含有する生体適合性水混和性非揮発性有機溶媒の皮下注射をできる可能性があり、送達のための治療分子により、ナノインプラントのインサイチュ形成が可能である。
特定の実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、農業、化粧品、食品または医薬組成物にＰＯＩを直接組み込むことができる。
本発明のナノ粒子は、懸濁液の形態、好ましくは水性媒体で提供することができるし、あるいは乾燥粉末の形態で提供して、ＰＯＩを安定した条件で維持し、長期間の保存（特に、固形食品への組み込み）が可能である。
したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の少なくとも１種のナノ粒子、または本発明による溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、または本発明によるナノ粒子の懸濁液と、キャリア、特に農業上、美容上または薬学的に許容されるキャリアまたは食品に好適なキャリアとを含んでなる組成物（以下、「本発明の組成物」）が提供される。
好ましい実施態様によれば、組成物は、医薬組成物、化粧品組成物、農業組成物および食品組成物から選択される。
特定の実施態様によれば、本発明の粒子は、本発明の「空」ナノ粒子、すなわち、ＰＯＩなしの本発明のナノ粒子、例えば、
ｉ）マトリックスであって、植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含んでなるマトリックスと、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスナノ球状物である。別の特定の実施態様によれば、本発明の粒子は、コアシェル水疱性ナノカプセルであってコアとシェルを含んでなるものであり、前記シェルは植物性疎水性タンパク質と、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなるものであり、前記コアシェル水疱性ナノカプセルはコアを含んでなり、前記コアが固体、半固体または液体状態における賦形剤を含んでなるものである、コアシェル水疱性ナノカプセルである。
別の特定の実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、本発明の「充填された」ナノ粒子、すなわち、ＰＯＩが充填された本発明のナノ粒子、例えば、（ｉ）ＰＯＩと、植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインを含んでなるマトリックスと、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるマトリックスナノ球状物、（ｉｉ）コアにおけるＰＯＩと、シェルを含んでなり、前記シェルは植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインと少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるものである、コアシェル水疱性ナノカプセル、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせである。特定の実施態様によれば、前記ＰＯＩは農業的、美容的、栄養的および／または治療的活性を有するＰＯＩである。ＰＯＩの詳細は、「定義」の欄に述べられている。
別の特定の実施態様によれば、本発明の組成物は、農業組成物である。このために、前記組成物は、広い意味において農業分野、例えば、害虫および病原菌を防除するための植物衛生的製品、植物成長促進剤など、例えば、除草剤（グリホサートなど）、殺虫剤（例えば、ラムダ−シハロトリンなど）、殺カビ剤（例えば、マンコゼブ）など、または「空」ナノ粒子の場合には蒸散抑制剤に使用されることのできるＰＯＩを含んでなる本発明の「充填された」ナノ粒子と、その用途に好適な１種以上の賦形剤を含んでなる農業的に許容できるキャリアとを含んでなり、農業組成物は、当業者により知られているキャリアを用いることにより、ゲル、懸濁液などの形態で製剤化できる。
別の特定の実施態様によれば、本発明の組成物は、化粧品組成物である。このため、前記組成物は、本発明の「空」ナノ粒子、例えば、ヘアスタイリング剤、例えば、毛髪固定剤、整髪などに使用するための空ナノ粒子であるか、または美容活性を有するかまたは美容目的で使用されることのできるＰＯＩを含んでなる本発明の「充填された」ナノ粒子であるか、またはそれらの混合物と、好適な経路、例えば、局所経路により投与するのが好適である１種以上の賦形剤を含んでなる美容上許容できるキャリアとを含んでなり、化粧品組成物は、スキンケアクリーム、ローション、粉末剤、香料、口紅、指の爪および足指マニキュア、アイメイクおよび顔メイク、ティッシュ、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアカラー、ヘアスプレーおよびジェル、デオドラント、手の除菌用ローション、ベビー用品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、懸濁液、バターおよび数多くの他の種類の製品の形態に調製できる。化粧品組成物の処方に好適な賦形剤および前記化粧品組成物の製造についての情報は、書籍「Ｍａｎｕａｌ ｄｅ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉａ」、Ｏｃｔａｖｉｏ Ｄｉｅｚ Ｓａｌｅｓ、第１版、１９９８年、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｖｉｄｅｏｃｉｎｃｏ、Ｓ．Ａ．でみることができる。化粧品産業において使用されるＰＯＩとしては、例えば、「定義」の欄ですでに述べた製品が挙げられるが、これらには限定されない。
別の特定の実施態様によれば、本発明の組成物は、食品組成物、例えば、固体、液体または半固体製剤であり、このため、前記組成物は、栄養活性を有するＰＯＩを含んでなる本発明の「充填された」ナノ粒子と、食品に使用されるキャリアとを含んでなる。別法として、本発明の組成物を、食品に組み込むことができ、したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の組成物、すなわち、本発明の「充填された」ナノ粒子であって、前記ナノ粒子は栄養活性を有するＰＯＩと食品に使用されるキャリアとを含んでなる、組成物を含んでなる食品が提供される。食品は、液体、半固体または固体であることができる。本発明の組成物を強化するか、または高めた食品の具体例としては、ミルクおよびそれらの誘導体（ヨーグルト、チーズ、凝乳など）、ジュース、ジャム、ベーカリーおよびペストリー製品、パン、発酵肉、ソースなどが挙げられる。同様に、本発明の組成物を、動物食品、例えば、飼料に組み込むことができる。特定の実施態様によれば、食品は、栄養補給食品（すなわち、食品にみられる基本的栄養価の他に、追加の健康上の効果を提供する食料源由来の製品）、特に機能性食品、すなわち、新しい成分または既存の成分を添加してしばしば健康促進または疾病予防に関連した新しい機能を有する新しい製品を得る、食品である。
別の特定の実施態様によれば、本発明の組成物は、医薬組成物である。このため、前記組成物は、治療活性を有するか、または治療目的で使用されることができるＰＯＩを含んでなる本発明の「充填された」ナノ粒子と、１種以上の賦形剤またはビヒクルを含んでなる薬学的に許容できるキャリアとを含んでなる。本発明の「充填された」ナノ粒子に存在するＰＯＩは、ナノ粒子（すなわち、ナノ球状物またはナノカプセル）内に捕捉するかカプセル化してもよいし、あるいは目的物質をナノ粒子の表面に吸着または接合することができる。
医薬組成物としては、例えば、液体、固体または半固体組成物などが挙げられる。
医薬組成物は、各処方に好適な賦形剤を含んでなり、当業者に知られている方法により通常調製される。賦形剤は、選択された医薬剤型にしたがって選択される。薬品およびそれらの製剤の種々の医薬剤型およびそれらの調製が、書籍「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ． Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ、第１０版、１９９３年、Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ． ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓで検討されている。
ＰＯＩによる処置が必要な対象体に投与される本発明の「充填された」ナノ粒子の投与量は、広範囲に異なることができ、とりわけ、ＰＯＩの性質、その活性または効力、ナノ粒子当たりのＰＯＩの量などに応じて決定され、単に説明の目的であるが、対象体に投与する「充填された」ナノ粒子の投与量は、例えば、約０．０１〜約１００ｍｇ/体重ｋｇ／日、好ましくは０．１〜２ｍｇ／体重ｋｇ／日であることができる。
特定の実施態様によれば、前記医薬組成物は、いずれかの好適な経路、例えば、口腔、歯科、鼻、眼球、経口、非経口、直腸、局所または膣内経路により、投与に好適な医薬剤型として製剤化される。前記医薬剤型としては、例えば、固体（例えば、軟質または硬質ゼラチンおよび非ゼラチンカプセル、接着フィルム、歯科用接着パッチ、座薬、錠剤、顆粒、微粒子など）、半固体（例えば、クリーム、ゲル、ローション、軟膏など）、液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョンなど）が挙げられるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、本発明のナノ粒子の生体接着性のため、医薬組成物は、粘膜へのアクセスの経路による投与のための組成物の形態に製剤化される。
特定の実施態様によれば、医薬組成物を、直腸経路による投与に好適な医薬剤型（座薬）、膣内経路による投与に好適な医薬剤型（胚珠）、または経口または非経口（例えば、皮下注射または硝子体内）経路による投与に好適な医薬剤型として製剤化され、必要に応じて、この実施態様によれば、ナノ粒子は、ＰＯＩと、植物性疎水性タンパク質、好ましくはゼインと、水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンが、体液、例えば、膣液、胃腸液などと接触したときに形成できる。したがって、好ましい実施態様によれば、組成物のキャリアは、口腔、歯科、鼻、眼球、硝子体内、経口、非経口、直腸、局所または膣内経路による投与のための薬学的に許容できる賦形剤、または局所経路による投与のための美容上許容できる賦形剤を含んでなる。
特定の実施態様によれば、組成物は、化粧品組成物、または口腔、歯科、鼻、眼球、経口、非経口、直腸、局所または膣内経路による投与に好適な医薬組成物である。
別の実施態様によれば、本発明の組成物は、乾燥粉末の形態、例えば、凍結保護剤とともに凍結乾燥物として調製され、使用前に再構成剤と混合することにより再構成される。
特定の実施態様によれば、本発明により、以下の成分を含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態の医薬組成物が提供される：
成分 総容積に対する重量％
植物性疎水性タンパク質（ゼイン） ０．０１〜５０
ＰＯＩ＊ ０．００１〜９９．９８８
水混和性非揮発性有機溶媒 ０．００１〜９９．９８
植物性疎水性タンパク質非溶媒（水）０．００〜１５％
＊ＰＯＩは、賦形剤を含む「定義」の欄において定義されたいずれのＰＯＩでもよい。
前記医薬組成物は、体液との接触によりナノ粒子をインサイチュ形成するのに好適である。
本発明の別の特定の態様によれば、以下の成分を含んでなるナノ粒子の懸濁液の形態における医薬組成物が提供される。
成分 総容積に対する重量％
植物性疎水性タンパク質（ゼイン） ０．０１〜５０
ＰＯＩ＊ ０．００１〜９９．９８８
水混和性非揮発性有機溶媒 ０．００１〜７５
アニオン性ポリマー ０．００〜１０
植物性疎水性タンパク質非溶媒 １５．００〜９９．９８
＊ＰＯＩは、賦形剤を含む「定義」の欄において定義されたいずれのＰＯＩでもよい。
本発明の「充填された」ナノ粒子、特に、薬品であるＰＯＩが充填されたナノ粒子は、疾患の処置に使用されることができる。薬品は、処置すべき疾患の機能において選択される。したがって、本発明の別の態様によれば、薬剤に使用される薬品であるＰＯＩが充填された本発明のナノ粒子が提供される。したがって、本発明の別の態様によれば、疾患の予防および／または処置のための薬剤の製造における、薬品であるＰＯＩが充填された本発明のナノ粒子の使用が提供される。あるいは、薬剤としての使用のための、あるいは疾患の処置および／または予防における、薬品であるＰＯＩが充填された本発明のナノ粒子が提供される。さらに、本発明によれば、対象体における疾患の処置または予防方法であって、薬品であるＰＯＩが充填された本発明のナノ粒子を対象体に投与することを含んでなる方法が提供される。
また、本発明によれば、薬剤または疾患の処置および／または予防に使用するための、水混和性非揮発性有機溶媒中に０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）の量の植物性疎水性タンパク質とＰＯＩ、場合によって界面活性剤または／およびポリアニオン性ポリマーおよび場合によって水性媒体とからなる溶液、懸濁液またはエマルジョンであり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するために必要な水性媒体の量より少なく；ＰＯＩが薬品であり、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まないものが提供される。あるいは、換言すれば、本発明によれば、水混和性非揮発性有機溶媒中に０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）の量の植物性疎水性タンパク質とＰＯＩ、場合によって界面活性剤または／およびポリアニオン性ポリマーおよび場合によって水性媒体とからなる溶液、懸濁液またはエマルジョンであり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するために必要な水性媒体の量より少なく；ＰＯＩが薬品であり、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まないものである、薬剤または疾患の処置および／または予防に使用される薬剤の製造における使用が提供される。さらに、本発明によれば、対象体の疾患の処置または予防方法であって、水混和性非揮発性有機溶媒中に０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）の量の植物性疎水性タンパク質とＰＯＩ、場合によって界面活性剤または／およびポリアニオン性ポリマーおよび場合によって水性媒体とからなる溶液、懸濁液またはエマルジョンであり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するために必要な水性媒体の量より少なく；ＰＯＩが薬品であり、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まないものであるものを、前記対象体に投与することを含んでなる、方法が提供される。好ましい実施態様によれば、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンは、植物性疎水性タンパク質を０．０１％〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％〜２０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０１％〜５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは０．０１％〜２．５％（ｗ／ｖ）含有する。好ましい実施態様によれば、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンの植物性疎水性タンパク質は、ホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリン、パニシン、オルゼニンおよびアベニンから選択されるものであり；より好ましくはホルデイン、セカリン、ゼイン、カフィリンおよびアベニンから選択されるものであり；さらにより好ましくはゼイン、ホルデインおよびカフィリンから選択されるものであり；最も好ましくはゼインである。別の実施態様によれば、前記溶液、懸濁液またはエマルジョンにおける植物性疎水性タンパク質の量は、０．１％（ｗ／ｖ）超、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）、少なくとも２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも３０％（ｗ／ｖ）、少なくとも３５％（ｗ／ｖ）、少なくとも４０％（ｗ／ｖ）および５０％（ｗ／ｖ）以下である。別の実施態様によれば、植物性疎水性タンパク質の量は、０．０１％〜５０％であるが、但し、植物性疎水性タンパク質がグリアジンであるとき、植物性疎水性タンパク質の量は０．１％超である。
特定の実施態様によれば、薬品は抗菌性クロルヘキシジンであり、したがって、本発明によれば、クロルヘキシジンが充填された本発明のカチオン性生体接着性ナノ粒子の、口腔または体外感染の処置および予防のための薬剤の製造における使用、または換言すれば、口腔または体外感染の処置および予防に使用するためのクロルヘキシジンが充填された本発明のナノ粒子が提供される。あるいは、本発明によれば、対象体における口腔または体外感染の処置または予防の方法であって、クロルヘキシジンが充填された本発明のナノ粒子を前記対象体に投与することを含んでなる方法が提供される。
特定の実施態様によれば、分子は、機能性食品に有用であり、とりわけ抗酸化剤クルクミンであり、したがって、本発明によれば、ヒトおよび動物の健康を改善するための、食品添加物および抗酸化剤としてクルクミンが充填された本発明のナノ粒子の使用が提供される。
別の特定の実施態様によれば、分子はエッセンシャルオイル（アロマ）であり、したがって、本発明によれば、エッセンシャルオイル（アロマ）が充填された本発明のナノ粒子の、食品、化粧品、農業および医薬分野における使用が提供される。
別の特定の実施態様によれば、分子は、オメガ脂肪酸または油であり、したがって、本発明によれば、オメガ脂肪酸または油が充填された本発明のナノ粒子の栄養補助食品としての使用が提供される。
別の特定の実施態様によれば、本発明によれば、アニオン性可溶性分子、アニオン性微生物（すなわち、酵母、バクテリア、ウイルス、菌類など）、またはいずれかのアニオン性粒子に対する凝集、捕獲または付着に使用される、本発明のカチオン性ロードおよび空ナノ粒子が提供される。
以下、いくつかの実施例により本発明を説明するが、本発明の説明の目的でなされるものであり、本発明を限定するものではない。
以下、実施例では、目的物質、例えば、油またはアロマ（例えば、レモンまたはペパーミントエッセンシャルオイル、タラ肝油、オレイン酸、リノレン酸）、タンパク質（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ））、薬物（例えば、クロルヘキシジン）または食品酸化防止剤（例えば、クルクミン）を組み込むことができる植物性疎水性タンパク質ゼインを主成分とするナノ粒子（マトリックスナノ球状物およびコアシェル小胞状ナノカプセル）の製造について説明する。これらの実施例では、前記ナノ粒子が高い粘膜性生物学的接着性、工業的規模のプロセスの容易性、小もしくは高親水性、疎水性または両親媒性化合物などの目的物質の高カプセル化効率、油の高カプセル化効率を有すること、およびナノ粒子が疎水性化合物の水への溶解性を高めることを示している。
前記ナノ粒子の製造に使用される物質を、以下に示す。
材料
ゼイン、リノレン酸、クルクミン、フルオレセインイソチオシアネート標識牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）および脂溶性蛍光プローブ１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートはＳＩＧＭＡ社（スペイン）から供給されたものである。
中鎖トリグリセリド類（Ｌａｂｒａｆａｃ（登録商標）ＣＣ）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ社（Ｇｅｎｎｅｖｉｌｌｉｅｒｓ、フランス）により提供されたギフトサンプルであった。
Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）は、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ社により供給されたものであった。
アラビアゴム、クロルヘキシジン、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、桂皮油、タイム油、オイゲノール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、グリセロールおよびプロピレングリコールは、Ｆａｇｒｏｎ社により供給された。
Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４は、ＢＡＳＦ社から好意により提供されたものであった。
賦形剤などの全ての他の化学試薬は、分析グレードであり、ＳＩＧＭＡ社（スペイン）により供給されたものであった。
実施例１
小スケールおよび大スケールでの空自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の調製および特徴付け
１．１カチオン性およびアニオン性空自己組織化ゼインナノ粒子の調製
小スケールで空カチオン性ＺＳＮＰを得るために、ゼインを種々のゼイン濃度（０．５、１、２．５、５および１０％ （ｗ／ｖ））でプロピレングリコール（ＰＧ）に溶解した。次に、前記ゼイン−プロピレングリコール溶液１ｍＬと、プロピレングリコール混和性ゼイン非溶媒としての再蒸留水５ｍＬと混合することにより、ナノ粒子を形成した。このようにして、ゼインをマトリックスナノ粒子の形態で沈殿させた。
大スケールでの製造のために、ゼイン−プロピレングリコール溶液５Ｌを濃度５％（ｗ／ｖ）で、穏やかに攪拌しながら、室温で反応器中、再蒸留水２５Ｌに、一定流量２５０ｍＬ／分で注いだ。
従来の方法により調製したナノ粒子を、上記したプロトコルをわずかに変更して得た［２９］。このために、ゼイン１００ｍｇを、７０％エタノール（ｗ／ｗ）５ｍＬに超音波溶解した。得られた溶液を、蒸留水７．５ｍＬに直ちに添加した。次に、得られたナノ粒子懸濁液を、ロータベーパー（Ｂｕｃｈｉ Ｒ−１４４、スイス）を用いて減圧下で蒸発させてエタノールを除去した。
アニオン性ゼインナノ粒子を得るために、前記ゼインのプロピレングリコール溶液（５％ｗ／ｖ）１ｍＬを、ＰＧ混和性ゼイン非溶媒としての再蒸留水５ｍＬと混合した。次に、アニオン性ポリマー（アラビアゴム、０．２５％ｗ／ｖ）１ｍＬを、磁気攪拌下、ゼインナノ粒子懸濁液に添加した。その後、混合物を、室温で５分間、磁気攪拌した。同様に、直接複合体形成法を適用してゼインナノ粒子を得た。このため、上記ゼインのプロピレングリコール溶液（５％ｗ／ｖ）１ｍＬを、ＰＧ混和性ゼイン非溶媒としてのアニオン性ポリマー（アラビアゴム、０．０４％ｗ／ｖ）水溶液５ｍＬに添加した。
両方のタイプのナノ粒子において、得られたナノ粒子懸濁液を、２７，０００ ｘ ｇで２０分間、２回遠心分離後、集めてさらなる特徴付けをおこなった。
１．２空ゼインナノ粒子の特徴付け
１．２．１ナノ粒子のサイズ、ゼータ電位、収率およびモルフォロジー
ナノ粒子のサイズおよびゼータ電位を、ゼータマスターアナライザーシステム （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて、それぞれ光子相関分光法および電気泳動レーザードップラー測風学により測定した。試料を再蒸留水で希釈し、２５℃、散乱角９０°で測定した。
ナノ粒子に変換したゼインの百分率であるナノ粒子調製法の収率は、上記した凍結乾燥試料から重量測定により求めた［３８］。このため、得られたナノ粒子の水性懸濁液を、２７，０００ ｘ ｇ、２０分で２回遠心分離し（Ｓｉｇｍａ ｌａｂ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｒｏｔｏｒ ３３３６、Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｈｅｒａｅｕｓ社、ドイツ）、再び集め、Ｇｅｎｅｓｉｓ １２ＥＬ装置（Ｖｉｒｔｉｓ、米国）で凍結乾燥した。ナノ粒子（ナノ粒子に変換されたゼインの量）の収率は、凍結乾燥ナノ粒子試料と、製剤を調製するのに使用されたゼインの初期量との間の比として算出された。
ナノ粒子の形態学的特徴を、電子顕微鏡Ｚｅｉｓｓ Ｌｉｂｒａ（登録商標）１２０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）を用いて透過電子顕微鏡法 （ＴＥＭ）により可視化した。
１．３結果
１．３．１空ゼインナノ粒子の特徴付け
表１は、小スケール（ＺＳＮＰ−０．５、ＺＳＮＰ−１、ＺＳＮＰ−２．５、ＺＳＮＰ−５、ＺＳＮＰ−１０）および大スケール（ＺＳＮＰ−５大スケール）で調製した本発明のＺＳＮＰおよび従来の溶媒蒸発法（Ｚ−ＮＰ−１ＴＲＡＤ）により調製したゼインナノ粒子［２９］の両方の主要な物理化学的特性を示す。一般的に、カチオン性空自己組織化ゼインナノ粒子は、均一なサイズと正の表面電荷を示した。透過電子顕微鏡法でナノ粒子のサイズを確認した。ナノ粒子は球状であった（図１）。ゼインの濃度を増加すると、正の表面電荷が増加した。小スケールまたは大スケールで調製したＺＳＮＰについては、サイズとゼータ電位との間に有意な差はなかった。ナノ粒子の収率百分率は全ての製剤について極めて高かった（約９８％）。ＺＳＮＰの場合において、高濃度ゼインでのＺＳＮＰの場合（ＺＳＮＰ−５およびＺＳＮＰ−１０）の場合において、わずかな割合の凝集物が形成することが観察された。一方、ゼインナノ粒子にアニオン性ポリマーを塗布すること（ＺＳＮＰ−５ＡＧ）またはゼインナノ粒子のマトリックスにおいてアニオン性ポリマー（アラビアゴム）を複合化すること（ＺＳＮＰ−５ＡＧ複合体）により、非塗布または非複合化物と比較して粒子サイズがほぼ２００〜２５０ｎｍまで有意に増加した。アラビアゴム塗布ナノ粒子（ＺＳＮＰ−５ＡＧおよびＺＳＮＰ−５ＡＧ複合体）は、均一の負の表面電荷を有している。
Figure 2015509936
実施例２
種々の溶媒混合物から得られた自己組織化ゼインナノ粒子の調製および特徴付け
また、溶媒の生体適合性および生分解性非毒性混合物も使用して自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）を得た。一例として、プロピレングリコールとＰＧ混和性非揮発性溶媒（すなわち、水またはグリセロール）またはプロピレングリコールと混和性の他の液状界面活性剤、例えば、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）（カプリロカプロイルポリオキシル−８ グリセリドＮＦ）、非イオン性 ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（液体 Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ＵＳＰ−ＮＦ））またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の二元混合物を、ゼインのＰＧ可溶性を保つ濃度で使用した。
２．１水混和性非揮発性溶媒二元混合物へのゼインの溶解度の測定
ＰＧと、ＰＧと混和性である他の水混和性非揮発性有機溶媒の種々の二元混合物へのゼインの溶解度を検討した。本実施例では、必要に応じて、種々の界面活性剤または溶媒の組み込みによりＰＧへの分子の溶解度を高めることを検討する。このため、室温でＰＧ（２．５％ｗ／ｖ）中ゼイン溶液５ｍＬに、種々の量の水、グリセロール、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ ４４を添加後、ＰＧゼイン溶液の濁度変化を４０５ｎｍで監視した。ゼインをＰＧ溶液から沈殿させた終点領域を、分光光度計 （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ、フィンランド）で、４０５ｎｍでの濁度変化、すなわち、初期吸光度に対する各溶媒／界面活性剤添加後の吸光度の増加（％）を監視しながら算出した。
２．２二元混和性不揮発性溶媒混合物から得られた自己組織化ゼインナノ粒子の調製および特徴付け
ＰＧ二元溶媒混合物からＺＳＮＰを得るために、プロピレングリコールにゼインを添加した溶液（ゼインＰＧ）５ｍＬを、種々の濃度で調製した。次に、ＰＧと混和性である種々の量の二次溶媒、例えば、グリセロール（２ｍＬ）、水（０．８ｍＬ）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）（３ｍＬ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（３ｍＬ）およびＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（１．２ｍＬ）を、ゼインＰＧ溶液に添加した。最終のゼイン濃度は、通常、溶媒混合物中、２．５ｗ／ｖ％に保った。二次溶媒の容積を、ゼインＰＧとゼインが溶解できないＰＧ混和性非揮発性溶媒との間の混和性領域を測定するために実施した上記の検討に準じて選択した。次に、ナノ粒子を、ゼイン溶媒二元化合物溶液１ｍＬと、ゼイン混和性非溶媒としての再蒸留水５ｍＬとを混合することにより形成した。得られたナノ粒子を、上記実施例１において記載したようにして特徴付けした。
一方、水以外のゼインタンパク質非溶媒を添加することにより、ＰＧ二元溶媒混合物からＺＳＮＰを形成するために、ゼインのプロピレングリコール溶液（ゼインＰＧ）５ｍＬを、種々の濃度で調製した。次に、ＰＧと混和性である二次溶媒、例えば、グリセロール（２ｍＬ）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）（３ｍＬ）およびＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（１．２ｍＬ）の種々の量を、ゼインＰＧ溶液に添加した。最終のゼイン濃度を、溶媒混合物において通常２．５ｗ／ｖ％に保った。二次溶媒の容積は、ゼインＰＧと、ゼインが溶解できるＰＧ混和性非揮発性溶媒との間の混和性領域を測定するために実施した以前の検討にしたがって選択した。次に，各二次溶媒の適量を添加して最終容積２５ｍＬとすることにより、ナノ粒子を形成した。得られたナノ粒子は、上記実施例１で記載したようにして特徴付けた。
２．３結果
２．３．１ＰＧ溶媒混合物へのゼインの溶解度
図２は、ＰＧ混和性非揮発性溶媒またはゼインが溶解できない界面活性剤を種々の百分率（ｖ／ｖ）を添加した後、４０５ｎｍでＵＶ監視したときの濁度変化％を示す。図２に示す終点範囲は、ゼイン非溶媒の百分率がＰＧ溶液からゼインが沈殿し始めて沈殿が完了する領域であるとみなした。この図から、水とＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４の両方について、終点範囲（ｘ軸での各曲線の広範囲によって表される）は、それぞれ１５〜２２．５ｖ／ｖ％および２２〜２８ｖ／ｖ％であることが分かった。これにより、ゼインについて、両方の溶媒の溶解力が低いことが分かった。一方、グリセロール：ＰＧ（ｖ／ｖ）ゼイン溶液の割合（％）は、より高い終点範囲（４５〜５５ｖ／ｖ％）を示した。ＰＧ中、ゼインについてのＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の溶解能は最も高く、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の場合は約６５〜７５％（ｖ／ｖ）であり、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）の場合は７５〜８５％（ｖ／ｖ）であった。
２．３．２二元混和性不揮発性溶媒混合物から得られた自己組織化ゼインナノ粒子の特徴付け
表２は、ゼイン−ＰＧ溶液と他の溶媒、例えば、水（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｗ）、グリセロール（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌａｂ）、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｔ８０）を含んでなるゼイン用溶媒混合物から調製したＺＳＮＰの主要な物理化学的特性を示す。水以外のゼイン非溶媒（Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）、グリセロールおよびＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標））をゼイン−ＰＧ二元溶媒混合物溶液に添加して形成したＺＳＮＰは、グリセロールをゼイン−ＰＧ−グリセロール二元混合物溶液に添加（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ／Ｇ）し、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）をゼイン−ＰＧ−Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）二元混合物溶液に添加（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ／Ｌｕｔ）し、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）をゼインＰＧ−Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）二元混合物溶液に添加（ＺＮＳＰ−ＰＧ：Ｌａｂ／Ｌａｂ）して得た。
タンパク質非溶媒として水を用いて得た全てのナノ粒子製剤は、２００ｎｍ未満のサイズと均一な正の表面電荷を示した。ＰＧ：グリセロール混合物（ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）から調製したＺＳＮＰの場合、ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｗと比較してナノ粒子サイズが増加し、数パーセントの凝集物が観察された（９％）。この現象は、ＰＧ：グリセロール溶液の高粘度と関連している。ナノ粒子の収率％は、全ての製剤について極めて高かった（約９５〜９８％）。
水以外のタンパク質非溶媒を添加して得られたナノ粒子の場合、サイズと多分散指数は、水を用いて得られたＺＳＮＰについて得られたものよりも高かった。したがって、水以外のタンパク質非溶媒を添加して形成されたナノ粒子は、サイズの均一度がより小さく、そして水を用いて得られたＺＳＮＰよりも凝集物の割合が大きかった。
Figure 2015509936
実施例３
自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）における大親水性分子モデルとしての牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のカプセル化
３．１自己組織化ゼインナノ粒子におけるＢＳＡのカプセル化
蛍光標識されたタンパク質を、自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）に組み込まれる大分子薬品モデルとして使用した。このために、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、フルオレセインイソチオシアネート標識牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）の水溶液２００μＬを、ゼインＰＧ溶液２ｍＬ（２．５ ｗ／ｖ％ゼイン）に組み込んだ。従来のゼインナノ粒子を得るために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを、同様の濃度でゼインを有する７０％含水アルコール溶液に配合した。ＺＳＮＰを得るために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡを含有するゼインＰＧ溶液１ｍＬを、再蒸留水５ｍＬに添加した。従来の方法により調製されたＦＩＴＣ−ＢＳＡが充填されたナノ粒子を、同量のゼインおよびＦＩＴＣ−ＢＳＡを用いて前記実施例１の記載にしたがって得た。ＦＩＴＣ−ＢＳＡが充填されたナノ粒子の最終水性懸濁液を、遠心分離で精製し、集め、実施例１に記載のようにしてさらなる特徴付けをおこなった。
３．２ＦＩＴＣ−ＢＳＡが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
ナノ粒子調製法でのサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載のようにして測定した。ＺＳＮＰ、およびエタノールを用いた従来法により得られたナノ粒子におけるＦＩＴＣ−ＢＳＡのカプセル化効率を算出するために、ナノ粒子懸濁液を、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。次に、ロードされたＦＩＴＣ−ＢＳＡの量は、添加された初期濃度と、遠心分離工程後に上清において測定された濃度との間の差として推定された。このため、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ標準溶液を１〜２０μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９６）の濃度範囲で用いて、検量線を作成した。４８０ｎｍ（励起波長）および５２０ｎｍ（発光波長）での蛍光分光分析（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、オーストリア）により、アッセイを実施した。
３．３結果
３．３．１ＦＩＴＣ−ＢＳＡが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
表３は、ＦＩＴＣ−ＢＳＡが充填されたＺＳＮＰ（ＺＳＮＰ−ＢＳＡ）、および溶媒置換法により調製されたゼインナノ粒子（Ｚ−ＮＰ−ＢＳＡ−Ｔ）の主要な物理化学的特性を記載している。両方の種類のナノ粒子は均一なサイズおよび正の表面電荷を示すことが分かった。自己組織化法により調製されたゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ−ＢＳＡ）におけるＦＩＴＣ−ＢＳＡのカプセル化効率は、従来法により得られたもの（Ｚ−ＮＰ−ＢＳＡ−Ｔ）よりも１．５倍大きかった。これは、エタノール相に会合したＢＳＡの沈殿によるものであろう。カプセル化効率から、自己組織化法はタンパク質などの大分子を組み込むのに大きな能力を有することが分かった。
Figure 2015509936
実施例４
自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）における小親水性分子モデルとしてのローダミンＢのカプセル化
４．１自己組織化ゼインナノ粒子におけるローダミンＢのカプセル化
ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＢ）、蛍光小分子は、生物学的接着の検討のためにＺＳＮＰに組み込まれる小親水性分子モデルとして使用した。このため、ＲＢ（１ ｍｇ／ｍＬ）の水溶液５００μＬを、実施例２に記載のようにして、ゼインＰＧ溶液、またはグリセロールもしくはＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４を含有するＰＧ二元混合物４ｍＬに配合した。最終的なゼイン濃度は、通常２．５ｗ／ｖ％に保たれた。ＲＢが充填されたＺＳＮＰナノ粒子を得るために、ＲＢを含有するゼイン溶液１ｍＬを、再蒸留水５ｍＬに添加した。ＲＢが充填されたゼインナノ粒子の最終水性懸濁液を集めて、さらに特徴付けした。製剤を、一次溶媒プロピレングリコール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）、またはＰＧと他の二次溶媒、例えば、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）またはグリセロール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）の二元混合物から調製した。二次溶媒の容積は、ゼインＰＧと、ゼインが溶解できないＰＧ混和性非揮発性溶媒との間の混和性領域を測定するために実施した以前の検討にしたがって選択した。
溶媒置換法により調製した従来のゼインナノ粒子でのＺＳＮＰのカプセル化効率を比較するために、従来法により調製したＲＢが充填されたゼインナノ粒子を、同量のゼインおよびＲＢを用いて、実施例１に記載のようにして、わずかに修正した上記のプロトコルにしたがって得た。ＲＢが充填されたゼインナノ粒子の最終水性懸濁液を集めて、実施例１に記載のようにしてさらなる特徴付けをおこなった。
４．２ＲＢが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ）の特徴付け
ナノ粒子調製法でのサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載のようにして測定した。ＺＳＮＰにおけるＲＢのカプセル化を効率を算出するために、ナノ粒子懸濁液を、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。次に、ナノ粒子に充填されたＲＢの量は、５４０ｎｍで比色分析により測定した（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ、フィンランド）。ロードされたＲＢの量は、添加された初期濃度と、遠心分離工程後の上清において測定した濃度との間の差として推定した。このために、ＲＢＩＴＣ （ローダミンＢイソチオシアネート）標準溶液を１０〜１００μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９６）の濃度範囲で用いて、検量線を作成した。
４．３疑似胃腸管液におけるＺＳＮＰからのＲＢの放出
ナノ粒子からのＲＢの生体外放出を、他の部分で記載した修正したプロトコルに従って検討した［３９］。このために、一次溶媒プロピレングリコールから調製したＲＢが充填されたＺＳＮＰ（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）５ｍＬ、またはＰＧと他の二次溶媒、例えば、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）もしくはグリセロール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）との二元混合物、およびＲＢ−従来のナノ粒子（ＲＢ−従来ＮＰ）を、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離して非カプセル化ＲＢを除去した。次に、沈殿したＲＢロードナノ粒子を、３７±１℃で疑似胃液（ＳＧＦ； ＵＳＰ ＸＸＩＩＩ、ｐＨ １．２； ぺプシン０．３２ｗ／ｖ％）２０ｍＬに分散した。次に、懸濁液１ｍＬを、２時間インキュベーションした。その後、ナノ粒子を、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を集め、酸性条件下でナノ粒子から放出されたＲＢの量を算出した。次に、得られたペレットを、３７±１℃で、疑似腸液 （ＳＩＦ；ＵＳＰＸＸＩＩＩ、ｐＨ ７．５；パンクレアチン１ｗ／ｖ％）１ｍＬに再懸濁した。上記したようにしてＳＩＦ条件下でインキュベーション後、種々の時間（１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間および８時間）で、ナノ粒子を２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を集めてナノ粒子から放出されたＲＢの量を算出し、得られたペレットは、常に各対応の時間後にＳＩＦに分散した。全ての場合において、両方の液から放出されたＲＢの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）で、蛍光分光分析（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、オーストリア）によりアッセイした。
４．４結果
４．４．１ＲＢが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ）の特徴付け
表４は、ＲＢが充填された自己組織化ナノ粒子（ＲＢＺＳＮＰ）の主要な物理化学的特性を記載している。製剤を、一次溶媒プロピレングリコール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）、またはＰＧと他の二次溶媒、例えば、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）もしくはグリセロール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）との二元混合物から調製した。従来のゼインナノ粒子を、溶媒置換法（ＲＢ−従来ＮＰ）により調製した。カプセル化効率から、自己組織化法により調製されたナノ粒子が従来法により調製されたナノ粒子よりも小親水性分子を組み込む能力が高いことが分かった。両方の場合において、ナノ粒子のサイズは均一であった。両方の場合において、ＲＢの会合は、ナノ粒子の表面電荷に影響しなかった。
Figure 2015509936
４．４．２疑似胃腸管液におけるＺＳＮＰからのＲＢの放出
図３は、全ての種類のナノ粒子製剤が酸性の疑似胃液（ＳＧＦ）において高安定性を有することを示している。この場合において、全ての種類のナノ粒子製剤から放出されたＲＢの総量は、５％未満であった。一方、ＳＩＦにおけるインキュベーション後、ＲＢ−自己組織化ゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ）の放出プロファイルは、従来法により得られたゼインナノ粒子（ＲＢ−従来ＮＰ）について記載したプロファイルとは異なるものであった。ナノ粒子マトリックスにおけるＰＧの会合により、従来のものと比較してＲＢ−ＺＳＮＰにおけるＲＢの放出が高まることが観察された。実際に、検討の終りでＳＩＦにおいて放出されたＲＢの総量は、ＲＢ−ＺＳＮＰについて、ＲＢ−従来ＮＰについてよりも１．４〜１．５倍高かった。
実施例５
ＺＳＮＰにおける小脂溶性分子モデルとしての蛍光プローブのカプセル化
５．１脂溶性小分子が充填されたＺＳＮＰの製造
ＺＳＮＰが疎水性分子を取り込む能力を調査するために、脂溶性蛍光プローブ１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート（ＴＰ）を、水不溶性疎水性分子として選択した。このために、１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート１ｍｇを、一晩、磁気攪拌下で、種々の容積のＰＧゼイン溶液（１ｗ／ｖ％）に溶解した。ゼイン：１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート比は、２．５：１、５：１および１０：１（ｗ／ｗ）であった。次に、１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートを含有するゼインＰＧ溶液１ｍＬを、再蒸留水５ｍＬに添加した。１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートが充填されたゼインナノ粒子の最終水性懸濁液を集めて、さらなる特徴付けをおこなった。
５．２ １，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
ナノ粒子調製法のサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載のようにして測定した。ＺＳＮＰにおける１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートのカプセル化効率を算出するために、ナノ粒子懸濁液を最初に３，０００ｘｇで遠心分離して、非取り込み１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの結晶の存在について調査した。次に、上清を２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。１回目の遠心分離後に沈殿した１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの結晶を、無水エタノールに再懸濁した。１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）で蛍光分光分析（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）することによりアッセイした。一方、２回目の遠心分離工程後の上清における遊離１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）での蛍光分光分析（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）によりアッセイした。１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート標準溶液を含有する無水エタノールを、１〜１０μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９６）の濃度範囲で用いて、検量線を作成した。ロードされた１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの量を、その最初の添加濃度と、１回目の遠心工程後の沈殿物および２回目の遠心分離工程後の上清で測定した遊離量との差として推定した。
５．３結果
５．３．１ １，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
表５に示す結果から、１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートのカプセル化効率は全ての製剤について高い（８０％超）と結論できる。しかしながら、ゼインとの関連での１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの初期量（％）を増加することにより、カプセル化効率は有意に減少した。これに関連して、カプセル化効率は、ゼイン：１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート重量比２．５：１から調製されたＺＳＮＰ（ＺＳＮＰ−ＴＰ−２．５：１）について８０％であり、ゼイン：１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート（ｗ／ｗ）比５：１から調製したＺＳＮＰ（ＺＳＮＰ−ＴＰ−５：１）については約９０％であった。しかしながら、製剤における １，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの初期量を増加（すなわち、ゼイン：１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート比の減少）とともに、ナノ粒子の１ｍｇ当たりのカプセル蛍光プローブの量が、同じ割合で増加する。同様に、粒子サイズは、ゼインとの関連でロードされた１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの量を増加することにより、有意に増加した。全ての製剤において、ゼインタンパク質の収率は高く、ナノ粒子を得るのに使用した初期ゼインの９８％であった。一方、ゼインタンパク質との関連で１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートの割合（％）を増加させることにより、ゼータ電位が有意に減少した。
Figure 2015509936
実施例６
ＺＳＮＰにおける脂溶性酸化防止剤クルクミンのカプセル化
６．１クルクミンが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の製造
食品酸化防止剤疎水性分子を取り込むＺＳＮＰの能力を調査するために、クルクミンを、水不溶性疎水性分子として選択した。クルクミン（ジフェルロイルメタン）は、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）の根茎から得られた天然ポリフェノールである。この目的のために、クルクミン１０ｍｇを、ゼインのＰＧ溶液（種々のゼイン濃度（２．５ｗ／ｖ％および５ｗ／ｖ％））１０ｍＬまたは１０ｖ／ｖ％のＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）を含有するＰＧ１０ｍＬ中同様の濃度のゼインに溶解した。次に、クルクミンを含有するゼインＰＧ溶液１ｍＬを、再蒸留水４ｍＬに添加した。クルクミンが充填されたゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ−Ｃ−２．５およびＺＳＮＰ−Ｃ−５）の最終水性懸濁液、またはＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）を用いて作製した製剤（ＺＳＮＰ−Ｃ−２．５ＬおよびＺＳＮＰ−Ｃ−５Ｌ）を遠心分離により精製し、集めてさらに特徴付けした。
６．２クルクミンが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ−Ｃ）の特徴付け
ナノ粒子調製法のサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載のようにして測定した。クルクミンのカプセル化効率を算出するために、新たに調製したクルクミンが充填されたＺＳＮＰ１．５ｍＬを、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を集め、エタノールで希釈し、４２５ｎｍでＵＶ分光分析することにより遊離クルクミンの量を算出するためアッセイした［４０］（Ｓｈｉｍａｄｚｕ １２０３ ＵＶ−ＶＩＳ）。ナノ粒子にロードされたクルクミンの量を、添加された初期濃度と遠心分離工程後の上清で測定した濃度との間の差として推定した。
６．３結果
６．３．１クルクミンが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
表６は、クルクミンが充填されたＺＳＮＰの主要な物理化学的特性を記載している。ＺＳＮＰ−Ｃ−２．５およびＺＳＮＰ−Ｃ−５の両方のサイズをＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）を含有する同じ製剤（ＺＳＮＰ−Ｃ−２．５ＬおよびＺＳＮＰ−Ｃ−５Ｌ）と比較した場合、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）の存在によりナノ粒子のサイズが有意に減少することが観察された。しかしながら、クルクミンの存在は、製剤の正の表面電荷に顕著に影響しなかった。全ての場合において、ナノ粒子構造に変換したゼインの初期量の約９５％である高ナノ粒子収率が得られた。一般的に、カプセル化効率から、自己組織化法により６５〜７５％の範囲で小疎水性分子 (クルクミン)を組み込む高能力があることが分かった。この場合、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）が存在すると、ゼイン−ＰＧ溶液から得られたナノ粒子製剤と比較してカプセル化効率がわずかに減少したすることが観察された。
Figure 2015509936
実施例７
口腔内送達用抗菌剤としてのＺＳＮＰにおけるクロルヘキシジンのカプセル化
７．１クロルヘキシジンが充填されたＺＳＮＰの製造
ＺＳＮＰがクロルヘキシジン（ＣＨＸ）などの抗菌剤を取り込む能力を調査するために、ＣＨＸ−グルコネート溶液（２０ｗ／ｖ％Ｅｕｒ．Ｐｈ．）０．６ｍＬを、磁気攪拌下、ゼイン（２．５ｗ／ｖ％）含有ＰＧ溶液５ｍＬと混合した。次に、ＣＨＸ−ＰＧ溶液を９４．４ｍＬまたは４４．４ｍＬの再蒸留水に注いで、それぞれ最終ＣＨＸ濃度０．１２ｗ／ｖ％および０．２４ｗ／ｖ％を用いてＣＨＸが充填されたＺＳＮＰを形成した。
７．２クロルヘキシジンが充填されたＺＳＮＰの特徴付け
ナノ粒子調製法でのサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載したようにして測定した。ＣＨＸのカプセル化効率を算出するために、新たに調製したＣＨＸが充填されたＺＳＮＰ１ｍＬを、２７，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を集め、２６０ｎｍでＵＶ分光分析することにより遊離ＣＨＸの量を算出するためアッセイした［４１］（Ｓｈｉｍａｄｚｕ１２０３ＵＶ−ＶＩＳ）。ナノ粒子にロードされたＣＨＸの量を、添加された初期濃度と遠心分離工程後の上清で測定した濃度との間の差として推定した。
７．３結果
７．３．１ＣＨＸが充填された自己組織化ゼインナノ粒子（ＺＳＮＰ）の特徴付け
表７は、ＣＨＸが充填されたＺＳＮＰの主要な物理化学的特性を記載している。両方の種類のＣＨＸが充填されたナノ粒子（ＣＨＸ−ＺＳＮＰ−０．１２およびＣＨＸ−ＺＳＮＰ−０．２４）において、ナノ粒子のサイズは均一（ほぼ１３５ｎｍ）であった。さらに、ナノ粒子は正の電荷を示した。ＣＨＸのカプセル化効率は極めて高く、初期ＣＨＸ使用量の約９０％であった。
Figure 2015509936
実施例８
ブタ頬粘膜におけるゼインナノ粒子の生体外粘膜親和性の検討
８．１疑似唾液におけるナノ粒子製剤からのローダミンＢ（ＲＢ）の放出
頬粘膜組織において測定した蛍光強度がナノ粒子マトリックスから放出された遊離ＲＢから由来しないことを確実にするために、疑似唾液におけるナノ粒子からのＲＢの生体外放出を検討した。このために、一次溶媒プロピレングリコールから調製したナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）５００μＬ、またはＰＧと他の二次溶媒、例えば、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）もしくはグリセロール（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）との二元混合物および従来法（ＲＢ−従来ＮＰ）により調製されたゼインナノ粒子（実施例４）を、疑似唾液（ＳＳＦ） ［４２］７５ｍＬで希釈した。種々の時間間隔（０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、および３時間）で、各試料（１ｍＬ）を、透析管Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）５，０００ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ、ドイツ）を用いて３，０００ｘｇで遠心分離した。透析液における遊離ＲＢの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、オーストリア）で蛍光分光分析によりアッセイした。
８．２頬粘膜における定量的生物学的接着アッセイ
生体外生物学的接着の検討を、実施例４で得られたＲＢで蛍光標識したナノ粒子製剤を用いて実施した。そのために、ブタ頭をローカル屠殺場から得て、頬粘膜を外科的に分離した。上皮を、外科用ハサミを用いて、下層の結合組織から清浄にし、切断して円形部２ｃｍ２を得た。次に、組織試料をＰＢＳに４℃で保存し、１時間以内に使用した。組織試料を、Ｆｒａｎｚ細胞コンパートメントのトウフラットフランジの間に固定し、ナノ粒子製剤を、ドナーコンパートメントに堆積させた。この場合、ナノ粒子製剤は、５００μＬの（ｉ）種々の溶媒から調製されたゼインナノ粒子４．２ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の濃度で自己組織化技術により得られたローダミンＢ−蛍光標識されたゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ、ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：ＬｕｔおよびＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）の３種の水性懸濁液および（ｉｉ）同じ濃度で従来の溶媒蒸発技術により調製されたローダミンＢ−蛍光標識されたゼインナノ粒子であった。
粘膜表面に試料を適用するために、ドナーコンパートメント（１ｃｍ２の組織）の一方の面を、乱流攪拌で３０秒間のみ、水性ナノ粒子懸濁液５００μＬに暴露して、口腔マウスウォッシュ条件をシミュレートした。次に、試料を、コンパートメントから回収し、製剤を疑似唾液［１９］［２０］７５ｍＬに、３７℃で６時間暴露した。組織試料を種々の時間間隔（０．５分間、３０分間、６０分間、１２０分間および１８０分間）で取り除き、実験で試料に暴露した１ｃｍ２部分を切断し、単離した。付着したナノ粒子の量を、以前［３８］記載されているようにして測定した。簡単に述べると、各粘膜断片を、３ＭＮａＯＨ２ｍＬで２４時間消化した。試料を、３ＭＮａＯＨを添加することにより３ｍＬまで希釈し、１０分間渦流させ、２，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。最後に、ローダミンＢの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）で、蛍光分光分析により測定して、粘膜に付着したナノ粒子の割合を推定した。生物学的接着を検討するための標準曲線を、対照組織を含むローダミンＢの３ＭＮａＯＨ溶液（０．０５−１μｇ／ｍＬ）を添加することにより作成した（ｒ＞０．９９６）。
８．３結果
８．３．１疑似唾液におけるナノ粒子製剤からのＲＢの放出
図４から、ＳＳＦにおいて３時間のインキュベーション後にナノ粒子製剤から放出されたＲＢの累積総量は、ナノ粒子製剤におけるＲＢの総カプセル化量の５％未満であることが分かる。したがって、頬粘膜における以下の定量的生物学的接着アッセイにおいて得られる蛍光強度は、粘膜の表面に付着したナノ粒子由来のものであり、したがって、粘膜に付着したナノ粒子の総量を測定することができる。
８．３．２頬粘膜における定量的生物学的接着アッセイ
図５から、自己組織化法と一次溶媒としてのプロピレングリコールにより得られたＲＢが充填されたゼインナノ粒子（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ）の生体接着能は、従来法により得られたナノ粒子（ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔ）の生体接着能よりもはるかに高いことが分かる。これに関連して、ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧの初期生体接着能は、ナノ粒子製剤と頬粘膜とを接触させて０．５分後には、ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔより約４倍高かった。この現象は、１８分間の間観察された。さらに、ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧの総付着量は、ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔと比較して粘膜の表面についてより高いレベルで維持された。実際に、検討の終り（１８０分）で見られたＲＢ−ＺＳＮＰの付着割合は、ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔの初期付着割合よりも２倍高かった。これに関連して、ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔの除去速度は、ＲＢ−ＺＳＮＰよりも早かった。さらに、プロピレングリコールとグリセロールとの二元混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｇ）およびプロピレングリコールとＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４との二元混合物（ＲＢ−ＺＳＮＰ−ＰＧ：Ｌｕｔ）を用いて自己組織化法により得られたＲＢが充填されたゼインナノ粒子は、検討の最初の６０分間、従来法により得られたナノ粒子（ＲＢ−ＺＮＰ−Ｔ）の生体接着能よりも高い生体接着能を示した。
実施例９
ＰＧ混和性エッセンシャルオイルを含有するカチオン性およびアニオン性自己組織化ゼインコアシェルナノカプセル（ＺＳＮＣ）
９．１ＰＧ混和性エッセンシャルオイル（アロマ）を含有するカチオン性およびアニオン性ＺＳＮＣの調製
エッセンシャルオイルは、植物から得た揮発性アロマ化合物を含有する濃縮疎水性液体である。エッセンシャルオイルは、揮発性油、精油もしくはエーテル油、または植物から抽出された単に「オイル（油）」として知られている。
この場合、ゼインＰＧ溶液と混和性であるある種のエッセンシャルオイル、例えば、セイヨウハッカ（ペパーミント）油、オイゲノール、桂皮油およびタイム（タチジャコウソウ）油が選択された。
インサイチュナノ沈殿表面堆積法によりこれらの油が充填されたＺＳＮＣを得るために、各油１ｍＬを、磁気攪拌下、室温でゼイン−ＰＧ溶液（２．５ｗ／ｖ％）２０ｍＬに溶解した。次に、カチオン性ＺＳＮＣを、単純に前記油／ゼイン／ＰＧ溶液１ｍＬを再蒸留水４ｍＬに添加することによりインサイチュで得た。
一方、アラビアゴムなどのアニオン性ポリマーを新たに調製したナノカプセルの水性懸濁液に添加することにより、セイヨウハッカ（ペパーミント）油が充填されたアニオン性ＺＳＮＣを調製した。この場合、アラビアゴム水溶液（０．２５ｗ／ｖ％）１ｍＬを、セイヨウハッカ（ペパーミント）油が充填されたカチオン性ＺＳＮＣの水性懸濁液５ｍＬに添加することにより、アニオン性ＺＳＮＣを得た（ＺＳＮＣ−ＰＡ１）。
同様の方法で、直接複合化法を適用して、セイヨウハッカ（ペパーミント）油が充填されたアニオン性ＺＳＮＣを得た。このために、セイヨウハッカ（ペパーミント）油／ゼイン／ＰＧ溶液１ｍＬを、アラビアゴム（０．０５ｗ／ｖ％）の水溶液４ｍＬに添加してＺＳＮＣ−ＰＡ２を得た。対照試料を、ゼインタンパク質を用いることなく同様の方法により上記したようにして全ての種類の油を用いて調製した。
９．２ＰＧ混和性エッセンシャルオイル（アロマ）を含有するカチオン性およびアニオン性ＺＳＮＣの特徴付け
ナノ粒子調製法でのサイズ、ゼータ電位および収率を、実施例１に記載のようにして測定した。ＺＳＮＣおよび対照製剤の物理的側面を観察した。
ＺＳＮＣに取り込んだ種々のエッセンシャルオイルのカプセル化効率を算出するために、２５μｇ／ｍＬ油濃度で脂溶性蛍光プローブ１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートで蛍光標識された種々のエッセンシャルオイルを用いることにより、ナノカプセルを調製した。次に、ナノカプセルを、上記で説明したようにして得た。その後、ＺＳＮＣにロードしなかった遊離油を、中鎖トリグリセリド類（Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）ＣＣ）などの水不混和性油により抽出した。抽出プロセスを、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）ＣＣ１ｍＬを激しく震盪しながら新たに調製した蛍光ＺＳＮＣ１ｍＬで３回抽出することにより実施した。最後に、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）ＣＣにより抽出された遊離油を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）で蛍光分光分析（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、オーストリア）によりアッセイした。対照試料（ゼインなしでＰＧのみ）を、上記したようにして全ての種類の油を用いて調製し、同じ方法によりアッセイした。
９．３結果
９．３．１ＰＧ混和性エッセンシャルオイルを含有するＺＳＮＣの特徴付け
図６は、種々のエッセンシャルオイルが充填されたカチオン性ＺＳＮＣのカプセル化効率を示す。インサイチュ自己組織化法により得られたゼインナノカプセルに充填した４種類のエッセンシャルオイルの効果的なカプセル化が観察された。全ての種類の油について、カプセル化効率は、８５〜９５％であった。カプセル化効率のこれらの値は、従来法［２０］により得られるナノ粒子にカプセル化したエッセンシャルオイルについての文献に見られる値よりも有意に高い。ゼインの不存在下で調製した対照試料は、極めて低いカプセル化効率を示し、相分離を示す不安定なエマルジョンの形成を示し、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）ＣＣ（表８）により容易に抽出された。
表８は、種々のエッセンシャルオイルが充填されたカチオン性ＺＳＮＣの主要な物理化学的特性を記載している。エッセンシャルオイルを含有する全てのＺＳＮＣは、均一サイズ（１５０〜１８０ｎｍの範囲）および正の表面電荷を示すことが観察された。ナノカプセル懸濁液の最後の態様は、調製後の最初の６０分以内は乳白色で均一である。一方、ＰＧのみを用い、ゼインなしで調製した対照試料では、極めて大きな液滴サイズを示し、全ての場合において油が分離した。大きな液滴サイズは、調製後の最初の５分以内では６〜７μｍを有する対照試料の約８０〜９０％を構成していた。
Figure 2015509936
表９は、セイヨウハッカ（ペパーミント）油が充填されたアニオン性ナノカプセル（ＺＳＮＣ−ＰＡ１およびＺＳＮＣ−ＰＡ２）の物理化学的特性を示す。両方の種類のナノカプセルについての表面電荷は、負であった。この場合、ＺＳＮＣにアラビアゴムをコーティングすること（ＺＳＮＣ−ＰＡ１）または同じガムをＺＳＮＣのシェルに包含させること（ＺＳＮＣ−ＰＡ２）により、カチオン性ＺＳＮＣ−Ｐ（表８）と比較してナノカプセルサイズが有意に増加した。さらに、ゼインとアラビアゴムとの間の反対の電荷の相互作用により生じる凝集により、大粒子が形成された。さらに、セイヨウハッカ（ペパーミント）油が充填されたアニオン性ナノカプセル（ＺＳＮＣ−ＰＡ１およびＺＳＮＣ−ＰＡ２）は、それぞれ８４％および７５％の高カプセル化効率を示した。
Figure 2015509936
実施例１０
ＰＧ不混和性エッセンシャルオイルを含有するカチオン性およびアニオン性自己組織化ゼインコアシェルナノカプセル（ＺＳＮＣ）ならびにマイクロカプセル（ＺＳＭＣ）
レモン油は、ＰＧ／ゼイン溶液と不混和性のエッセンシャルオイルである。したがって、レモン油の水エマルジョンにおける油を、まず異なる界面活性剤および異なる油：ＰＧ−ゼイン溶液比（ｖ／ｖ）で最適化して、ｎｍまたはμｍの範囲の液滴サイズを得た。
１０．１ＰＧ−ゼイン溶液におけるレモン油を含有するエマルジョンの調製および特徴付け
ＰＧ−ゼイン溶液（ｏ／ｗ）においてレモン油の安定なエマルジョンを得るために、種々の量のレモン油を、超音波処理下、界面活性剤の存在下でＰＧ−ゼイン溶液に１分間乳化した（ＰＧ−ゼイン溶液中レモン油５ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％および１５ｖ／ｖ％）。界面活性剤は、下表（表１０）に準じて最終濃度２％または４％でＴｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用した。
Figure 2015509936
次に、ｏ／ｗエマルジョンを室温で３日間静置した。その後、全ての試料についての状態および粒子サイズを、光学顕微鏡法で監視および可視化した。
１０．２結果
下表（表１１）は、表１０に示したレモン油エマルジョン（試料１〜１２）に示したレモン油エマルジョンの巨視的特性および微視的特性を示す。一般的に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて調製した全てのエマルジョン試料は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて作製した試料と比較してより大きな液滴サイズを示し、３０〜５０μｍの範囲であった。さらに、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する試料１および４は、２μｍ未満のより小さな液滴サイズを示した。試料１および４のサイズを、実施例１に記載したようにして分析して求めた。結果から、試料１における一次エマルジョンのサイズは、室温での１カ月のインキュベーション後でも均一（４００±４．６ｎｍ）であった。しかしながら、試料４の液滴サイズは、同じ時間で２．１±０．９μｍであった。図７は、エマルジョン試料１、４、７および１０についての粒子液滴サイズを表す光学顕微鏡画像のいくつかの例を示す。
Figure 2015509936
１０．３レモン油含有カチオン性およびアニオン性自己組織化ゼインコアシェルナノカプセルならびにマイクロカプセル
この場合、ナノカプセルおよびマイクロカプセルを、乳化インサイチュ表面堆積法により調製した。ゼイン溶液におけるレモン油のｏ／ｗエマルジョンの最適化実験から得られた結果に従って、試料１および４を、それぞれコアシェル カチオン性自己組織化ゼインナノカプセル（ＺＳＮＣ−Ｌ１）およびマイクロカプセル（ＺＳＭＣ−Ｌ１）の両方を調製するために選択した。このために、ゼイン−ＰＧ溶液におけるレモン油のエマルジョン（試料１および４）を、１０．１に記載したようにして調製した。次に、前記エマルジョン１ｍＬを、再蒸留水４ｍＬに添加した。コアシェルアニオン性自己組織化ゼインナノカプセル（ＺＳＮＣ−Ｌ２）およびマイクロカプセル（ＺＳＭＣ−Ｌ２）を得るために、アラビアゴム水溶液（０．２５ｗ／ｖ％）１ｍＬを、磁気攪拌下、室温、５分間で、新たに調製したナノカプセル懸濁液およびマイクロカプセル懸濁液の両方に添加した。
サイズおよびゼータ電位を、実施例１に記載したようにして測定した。一方、カプセル化効率を算出するために、全ての製剤を、２５μｇ／ｍＬ油の濃度で、脂溶性蛍光プローブ１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレートで蛍光標識されたレモン油を用いて同じ方法により調製した。次に、カプセル化効率を、実施例９に記載したようにして算出した。カチオン性ナノカプセルの最終製剤を、光学顕微鏡法および透過電子顕微鏡法により可視化した。
１０．４結果
表１２は、新たに調製したコアシェルカチオン性およびアニオン性自己組織化ゼインナノカプセルならびにマイクロカプセル（カチオン性：ＺＳＮＣ−Ｌ１およびＺＳＭＣ−Ｌ１；アニオン性：ＺＳＮＣ−Ｌ２およびＺＳＭＣ−Ｌ２）の主要な物理化学的特性を記載している。カチオン性ナノカプセル（ＺＳＮＣ−Ｌ１）およびマイクロカプセル（ＺＳＭＣ−Ｌ１）の両方は、小多分散指数の均一サイズを示し、正電荷を有していた。一方、アニオン性ポリマーアラビアゴムが存在することで、粒子サイズが有意に増加した。カプセル化効率は、全ての製剤において極めて高かった。しかしながら、レモン油のカプセル化効率は、ナノカプセルと比較して、カチオン性およびアニオン性マイクロカプセル（ＺＳＭＣ−Ｌ１およびＺＳＭＣ−Ｌ２）の両方の場合においてより高かった。図８はＺＳＮＣ−Ｌ１およびＺＳＭＣ−Ｌ１についての光学顕微鏡画像を示し、図９はカチオン性ＺＳＮＣ−Ｌ１についての透過電子顕微鏡画像を示す。
Figure 2015509936
実施例１１
脂肪酸および不揮発性油を含有するカチオン性自己組織化ゼインコアシェルナノカプセル（ＺＳＮＣ）およびマイクロカプセル（ＺＳＭＣ）
１１．１不揮発性油としてタラ肝油およびα−リノレン酸（ＡＬＡ）を含有するカチオン性ＺＳＮＣおよびＺＳＭＣの調製および特徴付け
この場合において、オメガ−３脂肪酸としてのタラ肝油およびα−リノレン酸（ＡＬＡ）をモデルとして選択して、心臓血管の健康においていくつかの利点がある栄養補助食品としてナノカプセルおよびマイクロカプセルを得た。
タラ肝油は、タラの肝臓から得た栄養補助食品である。タラ肝油は、高レベルのオメガ−３脂肪酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を有し、極めて高レベルのビタミンＡおよびビタミンＤを有している。α−リノレン酸は、数多くの一般的な植物性油に見られるｎ−３脂肪酸であり、体内で産生させることができず、食物から得なければならないので、いわゆる必須脂肪酸（ＥＦＡ）に属するものである。Ｎ−３脂肪酸（ω−３脂肪酸またはオメガ−３脂肪酸と称される）は、炭素鎖の終りから３番目の炭素原子の後から開始する二重結合（Ｃ＝Ｃ）を有する必須不飽和脂肪酸である。
ＡＬＡを含有するナノカプセル（ＺＳＮＣ−ＡＬＡ）は、実施例９に記載のインサイチュナノ沈殿表面堆積法により得られ、タラ肝油を含有するマイクロカプセル（ＺＳＭＣ−ＣＬＯ）は、実施例１０に記載のエマルジョンインサイチュ表面堆積法により調製したが、この場合、界面活性剤はＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｌ４４であった。両方の製剤は、上記実施例９および１０で記載したようにして特徴付けした。
１１．２結果
表１３は、ＡＬＡおよびタラ肝油をそれぞれ含有するコアシェルカチオン性ＺＳＮＣおよびＺＳＭＣの物理化学的特性を示す。
Figure 2015509936
参考文献
Figure 2015509936
Figure 2015509936
Figure 2015509936
Figure 2015509936

Claims (24)

  1. ａ）マトリックスナノ球状物であって、該マトリックスナノ球状物はマトリックスを含んでなるものであり、該マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるもの；および
    ｂ）コアシェル水疱性ナノカプセルであって、該コアシェル水疱性ナノカプセルがコアとシェルとを含んでなるものであり、該シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるもの
    からなる群から選択される、ナノ粒子。
  2. 目的物質をさらに含んでなる、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. ナノ粒子の製造方法であって、
    該ナノ粒子がマトリックスナノ球状物であり、該マトリックスナノ球状物がマトリックスを含んでなるものであり、該マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるものであり、
    当該方法が、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒中の前記植物性疎水性タンパク質の溶液を、植物性疎水性タンパク質非溶媒と接触させて、前記ナノ粒子を形成することを含んでなり、
    ここで、前記植物性疎水性タンパク質の溶液が揮発性有機溶媒を含まないものである、
    方法。
  4. ナノ粒子の製造方法であって、
    当該ナノ粒子が、
    ａ）目的物質を含んでなるマトリックスナノ球状物であって、該マトリックスナノ球状物がマトリックスを含んでなるものであり、該マトリックスが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるもの、および
    ｂ）目的物質を含んでなるコアシェル水疱性ナノカプセルであって、該コアシェル水疱性ナノカプセルがコアとシェルとを含んでなるものであり、該シェルが植物性疎水性タンパク質と少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒とを含んでなるもの
    からなる群から選択されるものであり、
    当該方法が、
    少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒中の前記植物性疎水性タンパク質と前記目的物質との溶液、懸濁液またはエマルジョンを、植物性疎水性タンパク質非溶媒と接触させて、前記ナノ粒子を形成することを含んでなり、
    ここで、前記植物性疎水性タンパク質と前記目的物質を含んでなる溶液、懸濁液またはエマルジョンが揮発性有機溶媒を含まないものである、
    方法。
  5. 前記植物性疎水性タンパク質がプロラミンである、請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記プロラミンがゼインである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記植物性疎水性タンパク質非溶媒が水性媒体である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記水混和性非揮発性有機溶媒がプロピレングリコール、またはプロピレングリコールと他の一次および/または二次溶媒との混合物である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 植物性疎水性タンパク質を媒体中に含有してなる溶液であって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と場合により水性媒体とを含んでなり、前記水性媒体の量がナノ粒子を形成するための水性媒体の必要量より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる前記媒体は揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）であるが、但し、前記植物性疎水性タンパク質がグリアジンであるとき、植物性疎水性タンパク質の量が０．１％より多いとされた、溶液。
  10. 植物性疎水性タンパク質と目的物質とを媒体中に溶解、懸濁または乳化して含有してなる溶液、懸濁液またはエマルジョンであって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と、場合により界面活性剤と、場合により水性媒体とを含んでなり、水性媒体の量がナノ粒子を形成するのに必要な量の水性媒体より少なく、少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒を含んでなる前記媒体が揮発性有機溶媒を含まず、植物性疎水性タンパク質の量が０．０１％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）である、溶液、懸濁液またはエマルジョン。
  11. 媒体中の請求項１または２のいずれか一項に記載のナノ粒子の懸濁液であって、前記媒体が少なくとも１種の水混和性非揮発性有機溶媒と植物性疎水性タンパク質非溶媒とを含んでなり、揮発性有機溶媒を含まないものである、懸濁液。
  12. 前記植物性疎水性タンパク質非溶媒は水性媒体である、請求項１１に記載の懸濁液。
  13. 請求項１または２のいずれか一項に記載の少なくとも１種のナノ粒子、または請求項９に記載の溶液、または請求項１０に記載の溶液、懸濁液またはエマルジョン、または請求項１１または１２のいずれか一項に記載の懸濁液と、キャリアとを含んでなる組成物。
  14. 前記組成物が、医薬組成物、化粧品組成物、農業組成物および食品組成物から選択されたものである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 除草剤、殺虫剤、殺カビ剤、アンチエイジング製品、抗ニキビ製品、フェイシャルケア製品、着色化粧品、化粧品、パーソナルケア製品、日焼け防止／サンケア製品、トゥースクリーナー、練り歯磨きまたはリンス製品、シャンプー製品、香料、ヘア製品、食品添加物、エッセンシャルオイル、セイヨウハッカオイル、タイム油、桂皮油、オイゲノール、レモン油、クルクミン、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンまたはビタミンＢ３、パントテン酸またはビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロホスフェート、チアミントリホスフェート、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマリン酸、コーヒー酸、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ群のビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド、脂肪酸、オメガ−３脂肪酸、肝油、リノレン酸、アミノ酸、フィトスタノール、フィトステロール、ポリフェノール、クロルヘキシジン、牛血清アルブミン、鎮痛薬、脱毛防止剤、抗狭心症薬、抗菌剤、抗鬱剤、抗真菌薬、抗高血圧薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、解熱薬、抗精神病薬、抗不安薬、気管支拡張剤、グルココルチコイド、免疫抑制剤、アセチルサリチル酸、アルファ−心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルギニンバソプレシン、アトロピン、オーグメロセン、アトルバスタチン、アバスチン、カルシトニン類、クロルヘキシジン、絨毛性ゴナドトロピン類、副腎皮質刺激ホルモン、デスモプレシン、エピバチジン、エルビタックス、エグゼナチド、ハーセプチン、ヒュミラ、フムリン、ケトコナゾール、ランレオチド、ルトロピンアルファ、メトプロロール、ミノキシジル、ネシリチド、オクトレオチド、パクリタキセル、パラセタモール、ペガプタニブ、組み換え卵胞刺激ホルモン、組み換え成長因子、レミケード、リチュキサン、セルモレリン、ソマトトロピン、タキサン誘導体、タクソール、テリパラチドアセテート、サイロトロピン、トリクロサン、ウロホリトロピン、ゾーレア、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カンプトセシン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリン Ａ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオールグルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン類、フェキソフェナジン、フルオロキノロン類、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンペロール、レポフロキサシン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾル、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、ミダゾラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、パクリタキセル、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクロンおよびそれらの混合物から選択される目的物質をさらに含んでなる、請求項１３または１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 請求項１または２のいずれか一項に記載のナノ粒子を含んでなる食品。
  17. 前記目的物質が、食品添加物として使用される抗酸化剤クルクミンである、請求項２に記載のナノ粒子。
  18. 前記意図する製品が、口腔もしくは体外感染の処置および/または予防に使用される抗菌薬クロルヘキシジンである、請求項２に記載のナノ粒子。
  19. 前記意図する製品が、栄養補助食品として使用される肝油およびリノレン酸から選択される油である、請求項２に記載のナノ粒子。
  20. 前記意図する製品が口腔もしくは体外感染の処置および/または予防用薬剤の製造における、抗菌薬クロルヘキシジンである請求項２に記載のナノ粒子の使用。
  21. 対象体における口腔もしくは体外感染の処置および/または予防方法であって、抗菌薬クロルヘキシジンが含まれる請求項２に記載のナノ粒子を前記対象体に投与することを含んでなる、方法。
  22. 前記水混和性非揮発性有機溶媒が、プロピレングリコールまたはプロピレングリコールと他の一次および/または二次溶媒との混合物である、請求項１または２のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項９に記載の溶液、または請求項１０に記載の溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、または請求項１１もしくは１２のいずれか一項に記載の懸濁液、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記植物性疎水性タンパク質がプロラミンである、請求項１または２のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項９に記載の溶液、または請求項１０に記載の溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、または請求項１１もしくは１２のいずれか一項に記載の懸濁液、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記植物性疎水性タンパク質がゼインである、請求項１または２のいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項９に記載の溶液、または請求項１０に記載の溶液、懸濁液もしくはエマルジョン、または請求項１１もしくは１２のいずれか一項に記載の懸濁液、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
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