CN115414875B - 一种具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球及其制备方法与应用，属于食品结构调控与功能定制技术领域。本发明的具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球制备方法，所述方法包括将蛋白粉分散于超纯水中，调节pH至10.0～12.0，离心、取上层分散液；然后采用阳离子交换树脂对上清液调控pH值至中性，再加入丁香酚对其内核进行纳米雕刻，透析、离心、冷冻干燥，即得具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球。该方法绿色、简单、高效，无需添加有机溶剂、并可按需调整其结构大小，从而控制降解率、营养物/药物负载率及营养物/药物释放率，在营养物/药物载体领域有潜在应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球及其制备方法与应用，属于食品结构调控与功能定制技术领域。
背景技术
中空纳米颗粒由于具有高比表面积、高载物量及可控释放特性在食品、化妆品、药品领域具有重要而广泛的应用。尤其是中空蛋白纳米颗粒具有良好的生物相容性和生物降解性而受到特别地关注。
但目前中空纳米颗粒的构筑手段相对比较单一，即牺牲模板法，该法操作复杂，且模板去除过程需要借助刺激性化学物质，如具有腐蚀性、毒性和强酸强碱性助剂，所以难以在食品及生物医药领域得以推广应用。
发明内容
针对目前对空心蛋白纳米颗粒的需求，以及现有空心蛋白结构制备存在的方法复杂，毒性、腐蚀性等技术缺陷；本发明提供了一种具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒的制备方法。该方法绿色、简单、高效，无需有机溶剂的添加使用、且制备得到的空心纳米颗粒具有较好的生物相容性，并可按需调整其结构大小，从而控制降解率、营养物/药物负载率及营养物/药物释放率，在营养物/药物载体领域有潜在应用。
本发明基于阳离子交换树脂制备得到的具有疏水核心、亲水外壳的蛋白纳米颗粒，借助疏水驱动的蛋白-配基结合反应，构建由蛋白纳米颗粒与丁香酚组成的非对称交互扩散偶，诱导丁香酚相对于蛋白纳米颗粒的向心扩散，并借此构筑形成具有丁香酚内核、蛋白外壳的核-壳纳米结构。最后，借助渗透作用，利用透析移除丁香酚，即形成具有中空结构的蛋白纳米颗粒。此外，利用盐析效应事先诱导蛋白的疏水聚集，形成内部致密度不一的增维结构，再进行基于柯肯达尔效应的纳米雕刻及丁香酚移除，即可获得具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球，包括：全空心、半空心和类实心纳米颗粒微球。
本发明的目的是提供一种有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将蛋白粉分散于水中，调节pH至10.0～12.0，搅拌、离心，取上层分散液；
(2)采用阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上层分散液调至中性，离心，即得蛋白纳米颗粒分散液；
(3)向步骤(2)得到的蛋白纳米颗粒分散液中加入丁香酚，搅拌，离心，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、蛋白外壳的核-壳纳米结构的蛋白分散液；
(4)将步骤(3)所得核-壳结构蛋白分散液于超纯水中透析，离心，取上层分散液冷冻干燥，即可获得可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球。
在一种实施方式中，步骤(1)所述蛋白粉包括大米蛋白粉、酪蛋白粉、大豆蛋白粉中的一种或多种。
在一种实施方式中，步骤(1)所述蛋白粉与水的质量体积比为1：50～100,g/ml。
在一种实施方式中，步骤(1)所述调节pH是采用1～5mol/L的NaOH溶液进行调节。
在一种实施方式中，步骤(1)所述离心条件为：10,000～15,000g离心10～15min。
在一种实施方式中，步骤(2)所述阳离子交换树脂包括大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂一种或多种。
在一种实施方式中，步骤(2)所述离心得条件为：10,000～15,000g离心10～15min。
在一种实施方式中，在加入丁香酚之前还包括向步骤(2)所得蛋白纳米颗粒分散液中加入氯化钠，诱导蛋白纳米颗粒聚集；然后将聚集后的溶液离心，弃去沉淀，即获得增维蛋白纳米颗粒分散液。
在一种实施方式中，所述氯化钠在分散液中的终浓度为5～10μmol/L。
在一种实施方式中，所述离心的条件为：10,000～15,000g离心10～15min。
在一种实施方式中，所述增维大米蛋白纳米颗粒的平均粒度为30～60nm。
在一种实施方式中，步骤(3)所述丁香酚的添加量体积分数为1％的蛋白纳米颗粒分散液。
在一种实施方式中，所述蛋白粉与丁香酚的质量体积比为0.1:100,g/μl。
在一种实施方式中，步骤(3)所述离心的条件为：4,000～5,000g离心10～15min。
在一种实施方式中，步骤(4)所述透析时间为12～24h。
在一种实施方式中，步骤(4)当透析时间为24h时，获得为全空心蛋白纳米颗粒微球；当透析时间为18h时，获得为半空心蛋白纳米颗粒微球；当透析时间为12h时，获得为类实心的蛋白纳米颗粒微球。
本发明的另一目的是提供一种由上述所述制备方法制备得到的蛋白纳米颗粒微球，所述蛋白纳米颗粒微球包括空心蛋白纳米颗粒微球、半空心蛋白纳米颗粒微球或类实心蛋白纳米颗粒微球。
本发明的第三个目的在于提供一种由上述所述制备方法或所述的蛋白纳米颗粒微球在制备营养物、药物载体中的应用。
本发明有益的技术效果：
(1)本发明绿色、简单、高效，无需有机溶剂的添加使用、且制备得到的空心结构具有较好的生物相容性，并可按需调整其结构大小，从而控制降解率、营养物/药物负载率及营养物/药物释放率，在营养物/药物载体领域有潜在应用。
(2)鉴于尚未有关于利用“天然纳米雕刻术”进行空心蛋白结构制备的研究与报道，本发明首次通过丁香酚，利用丁香酚与蛋白纳米颗粒组成的非对称交互扩散偶，诱导丁香酚相对于蛋白纳米颗粒的向心扩散，并借此构筑形成具有丁香酚内核、蛋白外壳的核-壳纳米结构；再借助渗透作用，利用透析移除丁香酚，即形成具有中空结构的蛋白纳米纳米颗粒——纳米雕刻。
(3)此外，利用盐析效应事先诱导蛋白的疏水聚集，形成内部致密度不一的增维结构，来对蛋白的颗粒进行调控，最终制备出可控空心结构和颗粒大小的蛋白纳米颗粒微球，扩大了其应用范围和价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中大米蛋白纳米颗粒分散液的结构与粒径分布图；
图2为本发明实施例4中增维纳米颗粒的粒径分布图；
图3为本发明实施例1中大米蛋白核-壳纳米结构图分散图；
图4为本发明实施例1～3制备的可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球图；图中1和4分别为实施例1制备的全空心大米蛋白颗粒微球的SEM图和TEM图；2和5分别为实施例2制备的半空心大米蛋白纳米颗粒微球的SEM图和TEM图；3和6分别为实施例3制备的类实心大米蛋白纳米颗粒微球的SEM图和TEM图；
图5为本发明实施例6不同丁香酚浓度形成的大米蛋白核壳结构分散液；图a为原始蛋白形成的图；图b为0.4％丁香酚浓度形成的图；图c为0.6％丁香酚浓度形成的图；图d为1％丁香酚浓度形成的图；
图6为本发明实施例6不同丁香酚浓度制备的大米蛋白大米颗粒微球图；图a为0.4％丁香酚浓度形成的大米蛋白颗粒微球图；图b为0.6％丁香酚浓度形成的大米蛋白颗粒微球图；图c为1％丁香酚浓度形成的大米蛋白颗粒微球图；
图7为对比例1制备的大米蛋白结构图；
图8为对比例2制备的大米蛋白结构图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例种涉及的氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂具体是指打孔结构的丙烯酸共联高分子基体上带有羧酸基(-COOH)的离子交换树脂；购买于生工生物工程股份有限公司。
丁香酚购买于sigma公司。
实施例1
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)蛋白结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液(见图1所示)；
(3)内核雕刻：向步骤(2)所得的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入体积分数为1％的丁香酚(以分散液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构分散液(见图3所示)；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳纳米结构分散液于超纯水(超纯水淹没过分散液，使其悬浮即可)中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得全空心大米蛋白纳米颗粒微球；全空心大米颗粒微球的平均粒径为100nm左右(见图4中1和4)。
实施例2
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)蛋白结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)内核雕刻：向步骤(2)所得的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入体积分数为1％的丁香酚(以分散液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构分散液；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳结构溶液于超纯水中透析18h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得半空心大米蛋白纳米颗粒微球；半空心大米蛋白纳米颗粒微球的平均粒径为100nm左右(见图4中2和5)。
实施例3
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)蛋白结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调回至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)内核雕刻：向步骤(2)所得的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入体积分数为1％的丁香酚(以分散液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构分散液；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳结构溶液于超纯水中透析12h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得类实心大米蛋白纳米颗粒微球；类实心大米蛋白纳米颗粒微球的平均粒径为100nm左右(见图4中3和6)。
实施例4
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调回至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)纳米颗粒增维：向步骤(2)制备得到的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入氯化钠(NaCl)得到氯化钠浓度为5μmol/L大米蛋白纳米分散液，诱导大米蛋白纳米颗粒聚集，即增维作用，其后于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为50nm左右的增维纳米颗粒溶液(见图2所示)；
(4)内核雕刻：向步骤(3)得到的增维纳米颗粒溶液中加入体积分数为1％的丁香酚(以增维纳米颗粒溶液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构的分散液；
(5)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳结构溶液于超纯水中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得全空心大米蛋白纳米颗粒微球。
实施例5
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调回至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)纳米颗粒增维：向步骤(2)制备得到的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入氯化钠(NaCl)得到氯化钠浓度为10μmol/L大米蛋白纳米分散液，诱导大米蛋白纳米颗粒聚集，即增维作用，其后于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为70nm左右的增维纳米颗粒溶液；
(4)内核雕刻：向步骤(3)得到的增维纳米颗粒溶液中加入体积分数为1％的丁香酚(以增维纳米颗粒溶液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构的分散液；
(5)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳结构溶液于超纯水中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得全空心大米蛋白纳米颗粒微球。
实施例6丁香酚添加量的优化
一种具有可控空心结构的大米蛋白纳米颗粒微球的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，取上清；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调回至中性pH7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)内核雕刻：向步骤(3)得到的增维纳米颗粒溶液中加入体积分数为0.4％、0.6％、1％的丁香酚(以增维纳米颗粒溶液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、大米蛋白外壳的核-壳纳米结构分散液；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的核-壳结构溶液于超纯水中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，即可获得大米蛋白纳米颗粒微球。
结果分析：如图5所示；其中a为原始蛋白，b,c,d为丁香酚浓度依次增加的大米蛋白结构图；发现在步骤(3)内核雕刻过程中，当丁香酚添加量的较低时，丁香酚进入大米蛋白内部形成分散小液滴形式，大米蛋白不能够完全形成空腔结构，经过透析后发现，大米蛋白结构无法形成，如图6中a和b；当丁香酚浓度为1％时，在大米蛋白结构中能够观察到较大丁香酚形成的液腔，经过透析后发现，能够使大米蛋白形成完整的空腔结构，见图6c所示；而当丁香酚浓度大于1％时，对大米蛋白空腔结构的形成影响并不大。
对比例1
(1)蛋白结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)内核雕刻：向步骤(2)所得的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入体积分数为1％的香芹酚(以分散液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，获得香芹酚-大米蛋白溶液；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的香芹酚-大米蛋白溶液于超纯水中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，获得大米蛋白颗粒。
结果如图7所示，大米蛋白结构呈针状，无法形成颗粒状的结构，更没有空心结构的形成。
对比例2
(1)蛋白结构展开：将大米蛋白粉末0.1g以料液比1：100(g/ml)分散于超纯水中，用4mol/L的NaOH溶液调至大米蛋白溶液的pH值为10.0，充分搅拌使其结构展开，之后于10,000g条件下离心10min，留上清，弃沉淀；
(2)离子交换：采用氢型大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上清液调回至中性pH值7.0，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，即获得平均粒度为20nm左右、且分散均匀的大米蛋白纳米颗粒分散液；
(3)内核雕刻：向步骤(2)所得的大米蛋白纳米颗粒分散液中加入体积分数为1％的百里酚(以分散液体积计算)，充分搅拌后，于4,000g条件下离心10min，弃去沉淀，获得百里酚-大米蛋白溶液；
(4)空心调控：将步骤(3)获得的溶液于超纯水中透析24h，于10,000g条件下离心10min，弃去沉淀，将上层分散液在-20度冰箱预冷两小时，-80度冰箱冷藏过夜，冻干机冻干72h，获得大米蛋白。
结果如图8所示，无法形成颗粒状的结构，更没有空心结构的形成。
以上所述，实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种具有可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将蛋白粉分散于水中，调节pH至10.0～12.0，搅拌、离心，取上层分散液，蛋白粉与水的质量体积比为1：100，g/ml；
(2)采用阳离子交换树脂将步骤(1)得到的上层分散液调至中性，离心，即得蛋白纳米颗粒分散液；
(3)向步骤(2)得到的蛋白纳米颗粒分散液中加入丁香酚，搅拌，离心，弃去沉淀，即获得具有丁香酚内核、蛋白外壳的核-壳纳米结构的蛋白分散液；
(4)将步骤(3)所得核-壳结构蛋白分散液于超纯水中透析，离心，取上层分散液冷冻干燥，即得可控空心结构的蛋白纳米颗粒微球；
步骤(3)所述丁香酚的添加量为蛋白纳米颗粒分散液体积的1％；
所述蛋白粉与丁香酚的质量体积比为0.1:100,g/μl；
步骤(4)透析时间为12～24h，当透析时间为24h时，获得为全空心蛋白纳米颗粒微球；当透析时间为18h时，获得为半空心蛋白纳米颗粒微球；当透析时间为12h时，获得为类实心的蛋白纳米颗粒微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在加入丁香酚之前还包括向步骤(2)所得蛋白纳米颗粒分散液中加入氯化钠，诱导蛋白纳米颗粒聚集；然后将聚集后得溶液离心，弃去沉淀，即获得增维蛋白纳米颗粒分散液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氯化钠在分散液中的终浓度为5～10μmol/L。
4.由权利要求1～3任一项所述方法制备得到的蛋白纳米颗粒微球，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒微球包括全空心蛋白纳米颗粒微球、半空心蛋白纳米颗粒微球或类实心蛋白纳米颗粒微球。
5.权利要求1～3任一项所述的方法在制备营养物、药物载体中的应用。
6.权利要求4所述的蛋白纳米颗粒微球在制备营养物、药物载体中的应用。
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