JP2015505620A - 高分解能３ｄ蛍光顕微鏡法のための顕微鏡および方法 - Google Patents

Abstract

高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法であって、試料（２）内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路（４）を備えた顕微鏡（１）を用いて試料（２）の単一画像（１０）を生成し、蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像（１０）において、蛍光発光体の画像（１１）が光学的分解能の限界内で単一画像（１０）に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、隔離された蛍光発光体の画像から成る生成された単一画像（１０）において、光学的分解能を超える位置精度でこの蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成し、分割要素（７）を用いて各単一画像を第１および第２の部分画像（１２、１３）に分割し、第１の部分画像（１２）が試料（２）内の第１の焦点面を撮像し、第２の部分画像（１３）が試料（２）内の第２の焦点面を撮像し、両方の部分画像（１２、１３）を別々に撮像する、方法において、分割要素として、基本的に撮像光路（４）の瞳に配置される適応ミラー（７）を使用し、適応ミラー（７）が２つの部分画像（１２、１３）を時間的または位置的に別々に撮像するように、適応ミラー（７）を設定し、適応ミラー（７）が両方の部分画像（１２、１３）について２つの異なる焦点距離を生じさせるように、適応ミラー（７）を設定することを特徴とする、方法。

Description

本発明は、高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法に関する。この方法では、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路を備えた顕微鏡を用いて試料の単一画像を生成する。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。隔離された蛍光発光体の画像から成る生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度でこの蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成する。分割要素を用いて各単一画像を第１および第２の部分画像に分割し、第１の部分画像が試料内の第１の焦点面を撮像し、第２の部分画像が試料内の第２の焦点面を撮像し、両方の部分画像がカメラ上に隣接して撮像される。

さらに、本発明は、光学的分解能を上回る位置分解能で試料を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡に関する。この顕微鏡は、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置と、光学的分解能を用いて試料の単一画像を生成するように形成された撮像装置を含む、光学的分解能を備えた撮像光路と、試料の複数の単一画像が生成されるように照射装置および撮像装置を制御するように形成された制御装置とを備えている。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。制御装置は、生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度で隔離された蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されている。撮像光路は、各単一画像を第１および第２の部分画像に分割する分割要素を備えており、第１の部分画像が試料内の第１の焦点面を撮像し、第２の部分画像が試料内の第２の焦点面を撮像し、撮像装置は、両方の部分画像が隣接して撮像されるカメラを含んでいる。

従来技術では、顕微鏡法における回折限界を克服するための様々な方法が開発されている。特許文献１または特許文献２より、ＰＡＬＭと略される方法（ｐｈｏｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；光活性化光学顕微鏡法）が知られている。この方法では、試料を撮像するために、例えば光学的放射を用いて活性化可能なマーカ物質が用いられる。マーカ物質は、活性化された状態でのみ特定の蛍光放射線を放出することができる。マーカ物質の活性化されていない分子は、励起放射線の放射の後であっても蛍光放射線を全く発しない、または少なくとも顕著には発しない。そのため、活性化放射線は、一般に切替信号と呼ばれている。ＰＡＬＭ法では、活性化されたマーカ分子の少なくとも一部が、隣接する活性化された分子から、これらのマーカ分子が顕微鏡の光学的分解能を尺度として分離されている、または後ほど画像処理法によって分離可能であるように、間隔を置くようにこの切替信号が印加される。これを蛍光発光体の部分集合が隔離されるという。蛍光放射線の吸収後、この隔離された発光体について、分解能によって制限されたその放射分布の中心が特定される。この中心から、光学的分解能が本来可能とする精度より高い精度で、計算によって分子の位置を決定することができる。この工程は、局在化と呼ばれる。回折分布の計算による重心決定によって向上した分解能は、英語の専門書では「ｓｕｐｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ；超分解能」とも呼ばれている。この向上した分解能には、試料内で活性化されたマーカ分子の少なくとも１つの部分集合が光学的分解能を用いて区別可能である、つまり隔離されていることが要求される。そうすれば、これらのマーカ分子の位置をより高い精度で決定する、つまり、これらを局在化することができる。

個々のマーカ分子を隔離するために、ＰＡＬＭ原理では統計効果が利用される。所与の強度の切替信号の受信後に蛍光放射線を放出するように励起可能なマーカ分子の場合、切替信号の強度を設定することによって、光学的分解能内で区別可能なマーカ分子のみが蛍光放射線を放出する部分領域が十分にあるように、試料の所与の表面領域において存在するマーカ分子を活性化する可能性を低くすることができる。

ＰＡＬＭ原理は、捕捉対象の分子の活性化の点で発展した。したがって、例えば、蛍光を発しない長寿命の状態と、蛍光を発する短寿命の状態とを備えた分子の場合、励起放射線とスペクトルが異なる活性化放射線を用いた別途の活性化が全く必要ではない。むしろ、蛍光を発することができない長寿命の状態（例えば、三重項状態）に分子の大部分が移行するように、試料がまずは高強度の照射放射線によって活性化される。それによって、残りの、その後まだ蛍光を発している分子が光学的分解能の観点から隔離される。

なお、ＰＡＬＭ原理はやがて専門書において例えばＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；確率的光学再構築顕微鏡法）等の他の略称でも呼ばれるようになった。本明細書では、蛍光分子をまずは隔離した後に局在化することによって、使用される装置の光学的分解能を超える位置分解能を達成する全ての顕微鏡撮影に対して略称ＰＡＬＭを使用する。ＰＡＬＭ法には、照射に高い位置分解能が必要にならないという利点がある。容易な広範囲照射が可能である。

ＰＡＬＭ原理では、それぞれが隔離された分子から成る部分集合を含んだ、試料の多くの単一画像を撮影する必要がある。試料全体を撮像するためには、多数の単一画像の全てにおいて、可能な限り全ての分子が少なくとも１度は部分集合に含まれなければならない。そのため、通常、ＰＡＬＭ法には多数の単一画像が必要であり、それによって全体画像の撮影の所要時間が決まる。各単一画像において多数の分子を計算によって局在化しなければならないので、これには相当な計算コストが伴う。また、大量のデータが生じる。

この局在化精度は、単一画像における横方向のみの局在化によって、つまり、カメラの画像面に割り当てられた平面上での局在化によって達成される。つまり、この方法は、この点では二次元的な試料分析に制限されている。そのため、一般にＰＡＬＭ原理は、試料の薄い層からの蛍光体のみが放射することを確実にするＴＩＲＦ（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；全反射照明蛍光）励起と組み合わされる。

試料の撮像に対して深さ方向である、第３の空間方向において発光性マーカ分子を局在化するための手法が、同様に従来技術より知られている。これに関して、「深さ方向」とは、光入射に沿った方向、つまり光軸に沿った方向として理解される。

非特許文献１には、ＰＡＬＭ原理のための、狙った非点収差歪を生じさせる弱い円柱レンズが配置された撮像光路が記載されている。これにより、分子が焦点面、つまり点画像退色関数（Ｐｕｎｋｔｖｅｒｗａｓｃｈｕｎｇｓｆｕｎｋｔｉｏｎ）の対称点の上方または下方に位置すると同時に、分子の画像がカメラ上で楕円形に歪む。この歪みの方向および強度から、発光性マーカ分子の深さ位置に関する情報を得ることができる。この方法の欠点は、深さ位置と関係のない分子双極子の局所環境および方向によっても、発光性マーカ分子の画像の歪みが生じ得ることである。そうすれば、このような発光性のマーカ分子には、その方向に応じて誤った深度値が割り当てられることになる。

非特許文献２は、空間的位相変調器によって、点画像退色関数を撮像時に二重らせん構造に変更することを提案している。その場合、個々の発光性マーカ分子の点画像が二重点になり、その深さ位置が二重点の共通の軸の角度方向に符号化される。

非特許文献３によれば、発光性マーカ分子によって放出された光子同士が干渉させられる。このために、発光性マーカ分子を同時に観察する、４π構成で取り付けられた２つの対物レンズが使用される。このようにして得られる部分光路が、特殊な三方向分光器を用いて干渉させられる。それによって得られる三点画像のそれぞれが、カメラで検出される。この三点画像の強度比から、深さ位置を知ることができる。

非特許文献４および非特許文献５に記載された手法では、試料の像を２つの部分画像に分割する５０／５０分光器が撮像光路に設置されている。この２つの画像は独立して検出される。追加的に、これによって得られる部分光路の１つには、ｚ方向、つまり深さ方向に光学的最小分解能（例えば、７００ｎｍ）の例えば半分または全体のサイズ分だけ互いに間隔を置いて位置する、２つの対物面が両方の部分光路から生じる程度まで、光路長差が設けられる。これらの２つの平面の間に位置するマーカ分子の深さ位置は、同一のマーカ分子の２つの部分画像の分析によって（例えば、一種の減算によって行うことが可能な、点退色画像の幅の観点からの分析）、または三次元の点画像退色関数の相応のフィッティングによって得ることができる。両方の部分画像をサブピクセル精度で重ね合わせるために、この方法には、２つの高解像度の部分画像、光路の精密な調整、および較正測定が必要である。さらに、撮像するシステムの点画像退色関数の横方向の広がりが、観察される対物面の位置に応じて変化するので、概してマーカ分子の両方の部分画像の形状が異なる。

特許文献３は、その他の点で３Ｄ高分解能に関するさらなる参考文献を挙げているが、この発明も同様に、試料の像を２つの部分画像に分割するという非特許文献４による汎用的手法を採用している。

国際公開第２００６／１２７６９２号 独国特許出願公開第１０２００６０２１３１７号明細書 独国特許出願公開第１０２００９０６０４９０号明細書

ビー・ホワンら（Ｂ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９，Ｓｅｉｔｅ ８１０，２００８ パヴァーニら（Ｐａｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ １０６，Ｓｅｉｔｅ ２９９５，２００９ シュテンゲルら（Ｓｈｔｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ １０６，Ｓｅｉｔｅ ３１２５，２００９ トプラクら（Ｔｏｐｒａｋ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｎｏｌｅｔ．７，Ｓｅｉｔｅｎ ３２８５−３２９０，２００７ ジュエッテら（Ｊｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，Ｓｅｉｔｅ ５２７，２００８

本発明の基礎となる課題は、構造が簡略化され、調節の要求を容易に満たすことができるという点で、このような方法を改良することである。

この課題は、高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法によって解決される。この方法では、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路を備えた顕微鏡を用いて試料の単一画像を生成する。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。隔離された蛍光発光体の画像から成る生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度でこの蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成する。分割要素を用いて各単一画像を第１および第２の部分画像に分割し、第１の部分画像が試料内の第１の焦点面を撮像し、第２の部分画像が試料内の第２の焦点面を撮像し、両方の部分画像が少なくとも１つのカメラ上に撮像される。この方法では、分割要素として適応ミラーを使用し、この適応ミラーを基本的に撮像光路の瞳に配置する。適応ミラーが２つの部分画像を時間的または位置的に別々に撮像するように、適応ミラーを設定し、また、適応ミラーが両方の部分画像について２つの異なる焦点距離を生じさせるように、適応ミラーを設定する。

この課題は同様に、光学的分解能を上回る位置分解能で試料を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡によっても解決される。この顕微鏡は、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置と、光学的分解能を用いて試料の単一画像を生成するように形成された撮像装置を含む、光学的分解能を備えた撮像光路と、試料の複数の単一画像が生成されるように照射装置および撮像装置を制御するように形成された制御装置とを備えている。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。制御装置は、生成された単一画像において、隔離された蛍光を発する蛍光発光体の位置を光学的分解能を超える位置精度で局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されている。撮像光路は、各単一画像を第１および第２の部分画像に分割する分割要素を備えており、第１の部分画像が試料内の第１の焦点面を撮像し、第２の部分画像が試料内の第２の焦点面を撮像し、撮像装置は、両方の部分画像が撮像される少なくとも１つのカメラを含んでいる。分割要素は、基本的に撮像光路の瞳に配置される適応ミラーとして形成されており、制御装置は、適応ミラーが２つの部分画像を時間的または位置的に別々に撮像するように、適応ミラーを設定するように形成されており、また、制御装置は、適応ミラーが両方の部分画像について２つの異なる焦点距離を生じさせるように、適応ミラーを設定するように形成されている。

本発明によれば、分光要素として適応ミラーが使用される。適応ミラーは二重の機能を備えており、部分画像を空間的に分離するとともにこれらの部分画像を異なる焦点面に割り当てる。これにより、従来技術では本発明が使用する原理の特徴であった調節コストが低減される。

その理由は、各単一画像について、試料内の異なる焦点面に割り当てられた少なくとも２つの部分画像が生成されることにある。そうすれば、部分画像には、隔離された蛍光体の点画像が、この蛍光体の深さ位置に応じたサイズで現れる。例えば蛍光体が部分画像の焦点面上に位置していれば、この蛍光体の点画像は、回析限界によって可能である程度に小さくなる。焦点面までの距離が増すほど、その他の点では等しい形状で点画像が大きくなる。蛍光発光体の点画像のサイズは、焦点面までの距離を符号化する。しかし、この蛍光発光体が焦点面の上方または下方のどちらに位置しているかが不明である。そのため、本発明が従う原理では、試料内の２つの異なる焦点面について少なくとも２つの部分画像を生成することによって、焦点面までの距離だけでなく焦点面に対する絶対位置をも決定することが可能になる。この２つの部分画像は、画像撮影領域上に同時に、またはカメラ上に隣接して撮像することができる。

適応ミラーは、従来技術で使用されていた概念に対して、光効率が高いというさらなる利点を有している。本発明による解決法は、分光器等において従来技術で生じていた損失とは無縁である。さらに、両方の部分画像の焦点面の間隔を、広い領域にわたって調節することができ、その際光路を偏向させる要素等の煩雑な機械操作が必要とならない。また、焦点距離の素早い変更が実現されるので、ミラーによって部分画像をカメラ上に間断なく撮像することが可能になる。

両方の部分画像を同時に生成するために、例えば、適応ミラーのミラー面の部分を、少し異なる焦点距離および残りの要素に対して傾いた角度に設定する。後者の設定によって、横方向の所望のずれが生じ、カメラ上で両方の部分画像が隣接して撮像される。

追加的に、ミラー面の部分を選定することによって、両方の部分画像をどのような強度比で生成するかを設定することができる。
両方の（同時に生成される）部分画像の空間的分離、すなわちこれらの部分画像の光軸の分岐、さらには異なる焦点距離が、適応ミラーの適切な制御のみによってもたらされるので、両方の部分画像の相互の調節位置を確定または規定することが容易になる。既に述べたように、深さデータとともに所望の高分解能を達成できるように、両方の部分画像をサブピクセル精度で互いに対して調節しなければならない。

部分画像を調節するための特に容易な方法は、これらの画像をまずは同じ焦点距離で生成することである。そうすれば、２つの同一の部分画像がカメラ上に隣接することになる。すなわち、単一画像がカメラ上に２度隣接して撮像される。この状態では、２つの部分画像の参照座標を得ることが容易に可能である。このためには、試料内の構造を、必要な高分解能で両方の部分画像内に捕捉するだけでよい。これにより、高解像度で特定された蛍光発光体の座標から、カメラ上の両方の部分画像の相対位置を容易に知ることができる。このように調節が行われた後、異なる焦点距離が生じるようにミラーが制御される。その際、部分画像の調節位置は変化しないので、予め特定された両方の部分画像内の座標の相対データが引き続き有効である。

調節のために、代替的または追加的に、両方の部分画像をまずはカメラ上で重畳するように撮像し、この状態で位置を調節することも可能である。その後、両方の部分画像が隣接して位置するようにミラーが調節される。その際、場合によっては構造要素が再び分析される。

「位置調節」として、ここでは、第１の部分画像および第２の部分画像においても点を見つけることを可能にする座標データを特定することと理解される。最も単純な場合には、このデータは相対座標であってもよい。

適応ミラーを使用することによって、焦点距離の差を容易に変化させることができるので、深さ分解能または捕捉された深さ範囲を容易に設定することができる。
部分画像の強度比を設定するために、単に第１の部分画像の撮像を行う適応ミラーのミラー面部分が縮小され、この寸法分だけ、第２の部分画像を撮像するミラー面部分が拡大される。

適応ミラーによって、撮像光路の撮像誤差の補正が特に容易になる。このために、ミラーに当たって反射する放射線を波面センサで（も）捕捉することが目的にかなっている。
適応ミラーとして、当業者には、例えば、ｗｗｗ．ｂｏｓｔｏｎｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ．ｃｏｍ／ｌｉｇｈｔ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍ、またはｗｗｗ．ｉｍａｇｉｎｅ−ｏｐｔｉｃ．ｃｏｍから知られているように、特にセグメント化された表面を有するミラー、または連続的な、いわゆる薄膜ミラーが考慮の対象となる。さらに、適応ミラーの概説がｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ＿ｍｉｒｒｏｒに記載されている。

好ましくは、適応ミラーは、ミラーに当たって反射する放射線の波面を捕捉する波面センサと組み合わされる。それにより、顕微鏡の撮像誤差、または試料に起因する誤差を任意で補正することができる。さらに、顕微鏡対物レンズの調節を必要とせずに、焦点面をある限度内で問題なく変位させることが可能である。これにより、顕微鏡対物レンズの移動による試料の機械的干渉が回避される。

蛍光発光体の画像とは、蛍光発光体の概して回析限界の点画像のことである。
当然ながら、前述の特徴および以下でさらに説明する特徴は、提示された組み合わせだけでなく、本発明の枠内で他の組み合わせまたは単独でも適用することができる。本明細書において方法の特徴に言及する限り、顕微鏡の操作では相応に形成された制御装置によってこれらの特徴が実現される。制御装置の機能的特徴の開示、および対応する方法の特徴、例えば工程の説明も同様である。

以下では本発明を、例として、同様に本発明の特徴を開示するものである添付図面に基づいて、さらに詳細に説明する。

深さ分解された高解像度の蛍光顕微鏡法のための顕微鏡の概略図。 深さ分解のために顕微鏡１の操作時に生成される部分画像の図。 深さ分解のために顕微鏡１の操作時に生成される部分画像の図。 図１の顕微鏡の撮像光路における適応ミラーの作用の概略図。

図１は、蛍光顕微鏡１の概略図であり、蛍光顕微鏡１の動作が制御装置Ｃによって制御される。この制御装置は、不図示の接続部を介して顕微鏡１の要素または構成部品と接続されている。顕微鏡１は、ＰＡＬＭ原理等に従った蛍光顕微鏡法を行うように構成されている。この顕微鏡は、共通の対物レンズ５を介して試料２を照射して蛍光を発する試料を撮像する、照射光路３および撮像光路４を含んでいる。照射光路３は、撮像光路４と、通常は二色性分光器として構成される分光器６を介して結合されているので、照射光路３からの照射放射線が対物レンズ５を通って試料に落ちるとともに、試料の撮像が対物レンズ５によって行われる。照射光路３は、複数のスペクトル・チャネルを有していてもよいが、図１には例示的に１つのレーザ光源Ｌ１のみが示されている。照射光路は、試料２内で蛍光放射線が励起されるように試料を照射する。ＰＡＬＭ原理の構成によっては、追加的にもう１つの励起放射線源を照射光路３に設置してもよい。

試料２は蛍光放射線を放出し、撮像光路４では、蛍光を発する試料２の画像が高分解能カメラＫ上に導かれる。対物レンズ５、撮像光路４、およびカメラＫの分解能は、個々の蛍光発光体の回折限界の点画像が複数のピクセル上に落ちるように選定されている。これにより、冒頭で説明したＰＡＬＭ原理に要求される蛍光発光体の局在化を、顕微鏡５および撮像光路４の光学的分解能を超える横方向の位置精度で行うことが可能になる。

もちろん、顕微鏡１を複数の色チャネルで構成してもよい。その場合、撮像光路４には、適切な分光器を介して光路に連結された複数のカメラが設けられる。
もはや顕微鏡１の特徴をなさず、その他の点で当業界では常識であるので詳細には説明されていない光学的要素の他に、撮像光路４は適応ミラー７を含んでいる。適応ミラーのミラー面は湾曲されており、撮像光路４の一部となっている。適応ミラーは蛍光を発する試料２からの放射線をカメラＫの方向に収束する。このミラーの機能をさらに詳しく説明する。

適応ミラーは、ミラー面の形状を設定する制御装置Ｃによって制御される。分光器を介して撮像光路４に接続された波面センサ９は、その際、制御装置Ｃが現在のミラー作用を可能な限り正確に把握するのに役立つ。それによって精度が向上するが、この波面センサは必須ではない。

制御装置Ｃは、ＰＡＬＭ原理が実行されるように顕微鏡１を制御する。つまり、試料２内で蛍光発光体が隔離されるように、すなわち、光学的分解能内で分離可能なように、試料２が照射光路２によって照射される。多数の単一画像が撮影され、それぞれの単一画像には試料２内の蛍光発光体の異なる部分集合が隔離されて含まれている。その後、単一画像では、制御装置Ｃによって既知の数学アルゴリズムを用いて各隔離された蛍光発光体の位置が高精度に決定されるので、撮像の光学的分解能を上回る位置精度が達成される。このことは、文献ではいわゆる高分解能または超分解能と呼ばれている。

ＰＡＬＭ原理では、蛍光発光体の高精度の横方向の局在化、すなわち光軸に対して垂直な位置の検出が可能である。蛍光発光体が焦点面において焦点面のどの程度前方または後方に位置しているか、つまり蛍光発光体の深さ位置は、その他の広視野顕微鏡においてもそうであるが、ＰＡＬＭ原理によってではより高い精度で示すことができない。

この点でより良好な分解能を達成するために、つまり、横方向に局在化された蛍光発光体の深さデータを提供するために、顕微鏡１は制御装置Ｃによる制御下で、横方向の局在化が行われる各単一画像を２つの部分画像に分割し、これらを試料２内の異なる焦点面に割り当てるように操作される。図２および図３には、これらの部分画像１２および１３が示されている。その際、部分画像１２は、光入射方向すなわち光軸に対して部分画像１３よりも高い位置にある焦点面を撮像した単一画像である。

図２および図３は、部分画像１２および１３について、異なる状態ａ、ｂ、ｃを示しており、例示的に１つの蛍光発光体のみを含んでいる。その際、部分画像１２ａおよび１３ａは、部分画像１３に割り当てられた焦点面上に位置するように蛍光発光体が配置された状態を示している。したがって、部分画像１３ａ内の蛍光発光体の画像１１ａは、そのサイズが回折限界によって規定された回折限界の点である。これと同じ点が、部分画像１２ａにも見られるが、ここでは画像１１ａが、より大きく広がっている。これは、撮像された蛍光発光体が部分画像１２の焦点面に位置していないからである。そのため、画像１１ａを拡大するピンボケが生じている。部分画像１２ａおよび１３ａの画像１１ａの比較によって、蛍光発光体の深さ位置、つまり部分画像１３の焦点面の位置が明確に示される。

そこで、制御装置Ｃは、蛍光発光体の点画像のサイズ、および部分画像の比較から、対応する蛍光発光体の深さデータを導出することができる。既知のように、横方向の局在化は点画像１１ａを元に行われる。

部分画像１２ｂおよび１３ｂは、蛍光発光体が両方の部分画像の焦点面の間に位置している状態を示している。このことは、この蛍光発光体の点画像１１ｂのサイズが、回折限界の最小限度より大きく、かつ、蛍光発光体が部分画像１３の焦点面上に配置された場合に生じたであろうサイズより小さいことから分かる。

最後に、部分画像１２ｃおよび１３ｃは、状態ａを逆にした状態を示している。
異なる焦点面からの部分画像によって、画像の焦点面に対する蛍光発光体の相対位置を得るだけでなく、焦点面に対する変位の方向をも得るという概念は、冒頭で説明したように、従来技術において知られている。

蛍光顕微鏡１は、適応ミラー７を使用することによって部分画像１２および１３を生成する。この適応ミラーは、試料２の撮像を２つの部分画像１２、１３に分割するだけでなく、部分画像１２、１３に対する異なる焦点距離によってこれらの部分画像を異なる焦点位置に割り当てる。これが図４に概略的に示されている。図４は、試料２からの放射線が光軸ＯＡに沿って入射する適応ミラー７を示している。ミラー７の反射面は、セグメント１５と１６とに分割されているか、または、制御装置１０の制御によってそのようなセグメントに区分されている。適応ミラーは、撮像光路４における試料２の回折限界の単一画像を２つの部分画像１２および１３に分割する分光器として機能する。その際、レンズ等のその他の撮像要素を使用できるが、図４の図示では見やすくするために記載されていない。

適応ミラー７は、光軸ＯＡを第１の方向に偏向させるミラー面セグメント１５を備えるように設定されている。このミラー面セグメント１５に組み合わされて配置されたミラー面セグメント１６が、光軸ＯＡを第２の方向に偏向させる。その際、第１の方向が、カメラ領域Ｋａに割り当てられた第１の光軸ＯＡ１であり、第２の方向が、カメラ領域Ｋｂに割り当てられた光軸ＯＡ２に対応している。その際、第１のミラー面セグメント１５を通る撮像のための対応するエッジ光線が、光軸ＯＡ１と同様に図４に点線で示されており、ミラー面セグメント１６を通ってカメラ領域Ｋｂに導かれるエッジ光線および光軸ＯＡ２が鎖線で示されている。

さらに、ミラー面セグメント１５は、生成される部分画像１２において焦点距離の差を生じさせる。したがって、適応ミラー７は、画像を分割するだけでなく、両方の部分画像１２および１３を試料２内の異なる焦点面に割り当てるようにも設定されている。このことは、部分画像１２用のエッジ光線がカメラ画像領域Ｋａ内の光軸ＯＡに当たるのに対して、鎖線で示された部分画像１３用のエッジ光線がカメラ画像領域Ｋｂ上でなおも拡大されていることから分かる。

しかし、好ましくは、カメラ画像領域ＫａおよびＫｂは、必ずしも同一のカメラＫの画像領域でなくてもよい。これには、部分画像１２および１３のサブピクセル精度の調節が容易に可能になるという利点がある。これに関して、とりわけ以下の選択肢がある。

１．実際の測定方法より上流の調節工程において、分岐する光軸ＯＡ１およびＯＡ２に沿って、ただしミラー７の同一の焦点距離で、部分画像１２および１３が生成されるように適応ミラー７を調節する。そうすれば、調節工程の間に、部分画像１２および１３が同一の焦点面から生じる。その場合、部分画像１２および１３内の１つまたは複数の構造の高分解能の横方向の局在化によって、参照データを容易に得ることができ、後の測定作業では、この参照データを用いて、部分画像１２内の構造を部分画像１３の座標系に変換、およびその逆に変換する。

２．カメラ画像領域ＫａおよびＫｂが同一のカメラである場合、部分画像１２および１３をまずは重畳する、すなわち重ね合わせて示すことができる。そのために、ミラー７を光軸ＯＡ１およびＯＡ２が一致するように、つまりミラー・セグメント１５および１６との間に角度差がなくなるように設定する。この重ね合わせられた状態では、セグメント１５および１６の焦点距離が異なっているにもかかわらず、容易に画像が上下に配置されるようにすることができる。また、画像を容易に互いに参照するができる。その後、調節工程において、ミラー・セグメント１５とミラー・セグメント１６との間に角度差が生じるようにミラーを変位させる。言い換えれば、光軸ＯＡ１およびＯＡ２の間に角度差が生じ、部分画像１２および１３が隣接して位置する。その結果生じる部分画像１２および１３の間の座標差をミラー・パラメータから容易に導出できるので、予め行われた調節によって重畳された状態で部分画像１２および１３間の相対参照が可能である。

もちろん、上述の方法工程１および２は、調節のために実際の測定原理の実行前に行われるが、任意の順序で、または組み合わせて適用することができる。

Claims (16)

1. 高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法であって、
   試料（２）内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路（４）を備えた顕微鏡（１）を用いて該試料（２）の単一画像（１０）を生成し、該蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各該単一画像（１０）において、該蛍光発光体の画像（１１）が光学的分解能の限界内で該単一画像（１０）に分離可能に隔離されるように、該蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、
   隔離された該蛍光発光体の該画像から成る生成された該単一画像（１０）において、光学的分解能を超える位置精度で該蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成し、
   分割要素（７）を用いて各該単一画像を第１および第２の部分画像（１２、１３）に分割し、該第１の部分画像（１２）が該試料（２）内の第１の焦点面を撮像し、該第２の部分画像（１３）が該試料（２）内の第２の焦点面を撮像し、
   両方の該部分画像（１２、１３）を別々に撮像する、方法において、
   該分割要素として、基本的に該撮像光路（４）の瞳に配置される適応ミラー（７）を使用し、
   該適応ミラー（７）が２つの部分画像（１２、１３）を時間的または位置的に別々に撮像するように、該適応ミラー（７）を設定し、
   該適応ミラー（７）が両方の該部分画像（１２、１３）について２つの異なる焦点距離を生じさせるように、該適応ミラー（７）を設定することを特徴とする、方法。
2. 前記適応ミラー（７）が、２つの前記部分画像（１２、１３）を、分岐する光軸（ＯＡ１、ＯＡ２）に沿って、隣接して位置する画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）上に撮像することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の部分画像（１２）の撮像を行う前記適応ミラー（７）のミラー面部分（１５）を縮小し、この寸法分だけ、前記第２の部分画像（１３）の撮像を行う前記適応ミラー（７）のミラー面部分（１６）を拡大することによって、前記部分画像（１２、１３）の強度比を調節することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 深さ分解能または捕捉される深さ範囲を設定するために、前記適応ミラー（７）を調節することによって前記焦点距離の差を変化させることを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の方法。
5. 前記適応ミラー（７）に当たって反射される放射線を波面センサ（９）で捕捉し、前記ミラー（７）を、前記撮像光路（４）の撮像誤差を補正するために調節することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 深さ位置の調節のために、両方の前記焦点距離を同期的に調節することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 深さ分解顕微鏡法を実行する前に、前記部分画像（１２、１３）の調節工程において、前記部分画像（１２、１３）をまずは等しい焦点距離で生成し、この状態で位置を調節することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 両方の画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）がカメラ（Ｋ）上に位置しており、深さ分解顕微鏡法を実行する前に、調節工程において、両方の前記部分画像（１２、１３）をまずは該カメラ（Ｋ）上に重畳するように撮像し、この状態で位置を調節し、その後、前記部分画像（１２、１３）が前記画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）上に隣接して位置するように前記適応ミラー（７）を調節することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 光学的分解能を上回る位置分解能で試料（２）を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡であって、
   該試料（２）内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置（Ｌ１、３、５）と、
   光学的分解能を用いて該試料（２）の単一画像を生成するように形成された光学的分解能を含む撮像装置（５、４、Ｋ）を備えた撮像光路（４）と、
   該試料（２）の複数の単一画像が生成されるように該照射装置（Ｌ１、３、５）および該撮像装置（５、４、Ｋ）を制御するように形成された制御装置（Ｃ）と、を備えており
   該蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各該単一画像において、該蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で該単一画像に分離可能に隔離されるように、該蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、
   該制御装置（Ｃ）が、生成された該単一画像において、光学的分解能を超える位置精度で隔離された該蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されており、
   該撮像光路（４）が、各該単一画像を第１および第２の部分画像（１２、１３）に分割する分割要素（７）を備えており、該第１の部分画像（１２）が該試料（２）内の第１の焦点面を撮像し、該第２の部分画像（１３）が該試料（２）内の第２の焦点面を撮像し、
   該撮像装置（５、４、Ｋ）が、両方の部分画像（１２、１３）が隣接して撮像される少なくとも１つのカメラ（Ｋ）を含んでいる、顕微鏡において、
   該分割要素が、基本的に該撮像光路（４）の瞳に配置される適応ミラー（７）として形成されており、
   該制御装置（Ｃ）が、該適応ミラー（７）が２つの該部分画像（１２、１３）を時間的または位置的に別々に撮像するように、該適応ミラー（７）を設定するように形成されており、
   該制御装置（Ｃ）が、該適応ミラー（７）が両方の該部分画像（１２、１３）について２つの異なる焦点距離を生じさせるように、該適応ミラー（７）を設定するように形成されていることを特徴とする、蛍光顕微鏡。
10. 前記制御装置（Ｃ）が、前記適応ミラー（７）が２つの前記部分画像（１２、１３）を分岐する光軸（ＯＡ１、ＯＡ２）に沿って前記カメラ（Ｋ）上に隣接して位置する画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）上に撮像するように、前記適応ミラー（７）を制御するように形成されていることを特徴とする、請求項９に記載の蛍光顕微鏡。
11. 前記部分画像（１２、１３）の強度比を調節するために、前記制御装置（Ｃ）が、前記第１の部分画像（１２）を撮像する前記適応ミラー（７）のミラー面部分（１５）が縮小され、この寸法分だけ、前記第２の部分画像（１３）を撮像する前記適応ミラー（７）のミラー面部分（１６）が拡大されるように、前記適応ミラー（７）を設定するように形成されていることを特徴とする、請求項１０に記載の蛍光顕微鏡。
12. 深さ分解能または捕捉される深さ範囲を設定するために、前記制御装置（Ｃ）が、前記焦点距離の差が変化するように前記適応ミラー（７）を設定するように形成されていることを特徴とする、請求項９、１０、または１１に記載の蛍光顕微鏡。
13. 前記撮像光路（４）の撮像誤差を補正するように前記適応ミラー（７）を調節するために、前記適応ミラー（７）に当たって反射される放射線を補足する波面センサ（９）が設けられていることを特徴とする、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
14. 前記制御装置（Ｃ）が、深さ位置の調節のために両方の前記焦点距離を同期的に調節するように形成されていることを特徴とする、請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
15. 前記制御装置（Ｃ）が、深さ分解の撮像前の調節のために、前記部分画像（１２、１３）をまずは等しい焦点距離で生成し、この状態で位置調節信号を生成するように、前記適応ミラー（７）を制御するように形成されていることを特徴とする、請求項９乃至１４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
16. 前記カメラ（Ｋ）の画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）が設けられ、前記制御装置（Ｃ）が、深さ分解の測定前の調節のために、前記部分画像（１２、１３）が前記カメラ（Ｋ）上に重畳するように撮像され、この状態で位置調節信号が生成されるように前記適応ミラー（７）を制御し、その後、前記部分画像（１２、１３）が前記画像撮影領域（Ｋａ、Ｋｂ）上に隣接して位置するように前記適応ミラー（７）を調節するように形成されていることを特徴とする、請求項９乃至１５のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。

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