JP6144280B2 - 高分解能３ｄ蛍光顕微鏡法のための顕微鏡および方法 - Google Patents

Description

本発明は、高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法に関する。この方法では、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路を備えた顕微鏡を用いて試料の単一画像を生成する。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。隔離された蛍光発光体の画像から成る生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度でこれらの蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成する。顕微鏡の撮像光路において非点収差素子を使用する。この非点収差素子が単一画像の生成の際に非点収差を生じさせることによって、焦点面の上方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、焦点面の下方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像を撮影する。この回転非対称性から蛍光発光体に関する深さ位置データを導出する。

さらに、本発明は、光学的分解能を上回る位置分解能で試料を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡に関する。この顕微鏡は、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置と、光学的分解能を用いて試料の単一画像を生成するように形成された撮像装置を含む、光学的分解能を備えた撮像光路と、試料の複数の単一画像が生成されるように照射装置および撮像装置を制御するように形成された制御装置とを備えている。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。制御装置は、生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度で、隔離されて蛍光を発する蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されている。撮像装置（５、１０、Ｋ１）は非点収差素子を備えている。この非点収差素子が単一画像の生成の際に非点収差を生じさせることによって、焦点面の上方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、焦点面の下方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像を撮影する。制御装置は、この回転非対称性から蛍光発光体に関する深さ位置データを導出するように形成されている。

従来技術では、顕微鏡法における回折限界を克服するための様々な方法が開発されている。特許文献１または特許文献２より、ＰＡＬＭと略される方法（ｐｈｏｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；光活性化光学顕微鏡法）が知られている。この方法では、試料を撮像するために、例えば光学的放射を用いて活性化可能なマーカ物質が用いられる。マーカ物質は、活性化された状態でのみ特定の蛍光放射線を放出することができる。マーカ物質の活性化されていない分子は、励起放射線の放射の後であっても蛍光放射線を全く発しない、または少なくとも顕著には発しない。そのため、活性化放射線は、一般に切替信号と呼ばれている。ＰＡＬＭ法では、活性化されたマーカ分子の少なくとも一部が、隣接する活性化された分子から、これらのマーカ分子が顕微鏡の光学的分解能を尺度として分離されている、または後ほど画像処理法によって分離可能であるように、間隔を置くようにこの切替信号が印加される。これを蛍光発光体の部分集合が隔離されるという。蛍光放射線の吸収後、この隔離された発光体について、分解能によって制限されたその放射分布の中心が特定される。この中心から、光学的分解能が本来可能とする精度より高い精度で、計算によって分子の位置を決定することができる。この工程は、局在化と呼ばれる。回折分布の計算による重心決定によって向上した分解能は、英語の専門書では「ｓｕｐｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ；超分解能」とも呼ばれている。この向上した分解能には、試料内で活性化されたマーカ分子の少なくとも１つの部分集合が光学的分解能を用いて区別可能である、つまり隔離されていることが要求される。そうすれば、これらのマーカ分子の位置をより高い精度で決定する、つまり、これらを局在化することができる。

個々のマーカ分子を隔離するために、ＰＡＬＭ原理では統計効果が利用される。所与の強度の切替信号の受信後に蛍光放射線を放出するように励起可能なマーカ分子の場合、切替信号の強度を設定することによって、光学的分解能内で区別可能なマーカ分子のみが蛍光放射線を放出する部分領域が十分にあるように、試料の所与の表面領域において存在するマーカ分子を活性化する可能性を低くすることができる。

ＰＡＬＭ原理は、捕捉対象の分子の活性化の点で発展した。したがって、例えば、蛍光を発しない長寿命の状態と、蛍光を発する短寿命の状態とを備えた分子の場合、励起放射線とスペクトルが異なる活性化放射線を用いた別途の活性化が全く必要ではない。むしろ、蛍光を発することができない長寿命の状態（例えば、三重項状態）に分子の大部分が移行するように、試料がまずは高強度の照射放射線によって活性化される。それによって、残りの、その後まだ蛍光を発している分子が光学的分解能の観点から隔離される。

なお、ＰＡＬＭ原理はやがて専門書において例えばＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；確率的光学再構築顕微鏡法）の他の略称でも呼ばれるようになった。本明細書では、蛍光分子をまずは隔離した後に局在化することによって、使用される装置の光学的分解能を超える位置分解能を達成する全ての顕微鏡撮影に対して略称ＰＡＬＭを使用する。ＰＡＬＭ法には、照射に高い位置分解能が必要にならないという利点がある。容易な広範囲照射が可能である。

ＰＡＬＭ原理では、それぞれが隔離された分子から成る部分集合を含んだ、試料の多くの単一画像を撮影する必要がある。試料全体を撮像するためには、多数の単一画像の全てにおいて、可能な限り全ての分子が少なくとも１度は部分集合に含まれなければならない。そのため、通常、ＰＡＬＭ法には多数の単一画像が必要であり、それによって全体画像の撮影の所要時間が決まる。各単一画像において多数の分子を計算によって局在化しなければならないので、これには相当な計算コストが伴う。また、大量のデータが生じる。

この局在化精度は、単一画像における横方向のみの局在化によって、つまり、カメラの画像面に割り当てられた平面上での局在化によって達成される。つまり、この方法は、この点では二次元的な試料分析に制限されている。そのため、一般にＰＡＬＭ原理は、試料の薄い層からの蛍光体のみが放射することを確実にするＴＩＲＦ（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；全反射照明蛍光）励起と組み合わされる。

試料の撮像に対して深さ方向である、第３の空間方向において発光性マーカ分子を局在化するための手法が、同様に従来技術より知られている。これに関して、「深さ方向」とは、光入射に沿った方向、つまり光軸に沿った方向として理解される。

非特許文献１は、空間的位相変調器によって、点画像退色関数を撮像時に二重らせん構造に変更することを提案している。その場合、個々の発光性マーカ分子の点画像が二重点になり、その深さ位置が二重点の共通の軸の角度方向に符号化される。

非特許文献２によれば、発光性マーカ分子によって放出された光子同士が干渉させられる。このために、発光性マーカ分子を同時に観察する、４π構成で取り付けられた２つの対物レンズが使用される。このようにして得られる部分光路が、特殊な三方向分光器を用いて干渉させられる。それによって得られる三点画像のそれぞれが、カメラで検出される。この三点画像の強度比から、深さ位置を知ることができる。

非特許文献３および非特許文献４に記載された手法では、試料の像を２つの部分画像に分割する５０／５０分光器が撮像光路に設置されている。この２つの画像は独立して検出される。追加的に、これによって得られる部分光路の１つには、ｚ、つまり深さ方向に光学的最小分解能（例えば、７００ｎｍ）の例えば半分または全体のサイズ分だけ互いに間隔を置いて位置する、２つの対物面が両方の部分光路から生じる程度まで、光路長差が設けられる。これらの２つの平面の間に位置するマーカ分子の深さ位置は、同一のマーカ分子の２つの部分画像の減算によって、または三次元の点画像退色関数の相応のフィッティングによって得ることができる。特許文献３は、３Ｄ高分解能のさらなる関係書類を挙げているが、同様にこの手法に従っている。両方の部分画像をサブピクセル精度で重ね合わせるために、この方法には、２つの高解像度の部分画像、光路の精密な調整、および較正測定が必要である。さらに、撮像するシステムの点画像退色関数の横方向の広がりが、観察される対物面の位置に応じて変化するので、概してマーカ分子の両方の部分画像の形状が異なる。

非特許文献５には、冒頭で言及した種類の方法および顕微鏡が開示されている。撮像光路には、狙った非点収差歪を生じさせる弱い円柱レンズが配置されている。これにより、分子が焦点面、つまり点画像退色関数（Ｐｕｎｋｔｂｉｌｄｖｅｒｗａｓｃｈｕｎｇｓｆｕｎｋｔｉｏｎ）の対称点の上方または下方に位置すると同時に、分子の画像がカメラ上で楕円形に歪む。この歪みの方向および強度から、発光性マーカ分子の深さ位置に関する情報を得ることができる。この方法の欠点は、深さ位置と関係のない分子双極子の局所環境および方向によっても、発光性マーカ分子の画像の歪みが生じ得ることである。そうすれば、このような発光性マーカ分子には、その方向に応じて誤った深度値が割り当てられることになる。

国際公開第２００６／１２７６９２号 独国特許出願公開第１０２００６０２１３１７号明細書 独国特許出願公開第１０２００９０６０４９０号明細書

パヴァーニら（Ｐａｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ １０６，Ｓｅｉｔｅ ２９９５，２００９ シュテンゲルら（Ｓｈｔｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ １０６，Ｓｅｉｔｅ ３１２５，２００９ トプラクら（Ｔｏｐｒａｋ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｎｏｌｅｔ．７，Ｓｅｉｔｅｎ ３２８５−３２９０，２００７ ジュエッテら（Ｊｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，Ｓｅｉｔｅ ５２７，２００８ ビー・ホワンら（Ｂ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９，Ｓｅｉｔｅ ８１０，２００８

本発明の基礎となる課題は、これらの誤差が回避されるこのような方法を改良することである。

本発明によれば、この課題が高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法によって解決される。この方法では、ａ）試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路を備えた顕微鏡を用いて試料の単一画像を生成し、その際、蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、ｂ）隔離された蛍光発光体の画像から成る生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度でこれらの蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成し、ｃ）顕微鏡の撮像光路において適応ミラーを使用し、適応ミラーが単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせるように、適応ミラーを設定することにより、焦点面の上方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、焦点面の下方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像を撮影し、この回転非対称性から蛍光発光体に関する深さ位置データを導出し、ｄ）非点収差のない単一画像を撮影するために、適応ミラーが単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせないようにも、適応ミラーを追加的に設定し、ｅ）非点収差のない単一画像において蛍光発光体の回転非対称な画像を検出し、非点収差のある単一画像における深さ位置データの導出の際に、これらの蛍光発光体に深さ位置補正を施すか、またはこれらの蛍光発光体を抑制する。

さらに、この課題は、光学的分解能を上回る位置分解能で試料を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡に関する。この顕微鏡は、試料内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置と、光学的分解能を用いて試料の単一画像を生成するように形成された撮像装置を含む、光学的分解能を備えた撮像光路と、試料の複数の単一画像が生成されるように照射装置および撮像装置を制御するように形成された制御装置とを備えている。蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各単一画像において、これらの蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で単一画像に分離可能に隔離されるように、蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させる。制御装置は、生成された単一画像において、光学的分解能を超える位置精度で、隔離されて蛍光を発する蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されている。撮像装置は適応ミラーを備えている。制御装置は、適応ミラーが単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせるように、適応ミラーを設定するように形成されており、それによって、焦点面の上方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、焦点面の下方に位置する蛍光発光体の画像が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像を撮影する。制御装置は、この回転非対称性から蛍光発光体に関する深さ位置データを導出するように形成されている。制御装置は、非点収差のない単一画像を撮影するために、適応ミラーが単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせないようにも、適応ミラーを追加的に設定するように形成されており、制御装置は、非点収差のない単一画像において蛍光発光体の回転非対称な画像を検出し、非点収差のある単一画像における深さ位置データの導出の際に、これらの蛍光発光体に深さ位置補正を施すか、またはこれらの蛍光発光体を抑制するように形成されている。

本発明では、ホワンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載された非点収差に基づく深さ分解の概念を発展させるために、本質的要素として適応ミラーを使用する。この適応ミラーは、そのミラー面の曲率を変更可能なミラーとして理解される。このようなミラー自体は従来技術において知られている。本発明では、この適応ミラーを用いて、深さ情報を得るための非点収差のある単一画像だけでなく、追加的に、深さデータの補正に使用される非点収差のない単一画像も生成した。双極子を形成する蛍光発光体は、元々既に歪められた点画像を有しているので、非点収差のある単一画像において誤った深さ位置に割り当てられてしまうであろう。本発明では、この発光体を深さ分析の際に抑制する、または、非点収差のない単一画像において視認可能であるこの発光体の点画像の歪みを、深さデータを得るための起点として利用する。これを行うために、非点収差のない単一画像から知られている点画像の歪められた基本形状を、非点収差のある単一画像においてゼロ点データとして利用する。これによって、非点収差のない単一画像から、焦点面（深さ位置のゼロ点）に関する蛍光発光体の画像の参照形状を入手することができる。

本発明によって達成される、それ自体が、すなわち深さ分析のために追加的に導入される非点収差に関係なく、非回転対称である点画像を有する蛍光発光体に関する誤差補正によって、動力学的過程を解明しなければならない場合には、このような蛍光発光体を追跡工程（いわゆるトラッキング）において確実に追跡することがさらに可能になる。

適応ミラーを用いれば、非点収差の程度を設定することによって、深さ分解の動作範囲を様々な要求または様々な対物レンズの使用に適応させることができる。また、適応ミラーが非点収差を生じさせないように適応ミラーを設定することにより、特定の用途については深さ分解を簡単に停止することができる。その上、ミラーの使用には、円柱レンズの場合に生じ得るような、考えられる色収差が回避されるという利点がある。

適応ミラーとして、当業者には、例えば、ｗｗｗ．ｂｏｓｔｏｎｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ．ｃｏｍ／ｌｉｇｈｔ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍ、またはｗｗｗ．ｉｍａｇｉｎｅ−ｏｐｔｉｃ．ｃｏｍから知られているように、特にセグメント化された表面を有するミラー、または連続的な、いわゆる薄膜ミラーが考慮の対象となる。さらに、適応ミラーの概説がｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ＿ｍｉｒｒｏｒに記載されている。

好ましくは、適応ミラーは、ミラーに当たって反射する放射線の波面を捕捉する波面センサと組み合わされる。それにより、顕微鏡の撮像誤差、または試料に起因する誤差を任意で補正することができる。さらに、顕微鏡対物レンズの調節を必要とせずに、焦点面をある限度内で問題なく変位させることが可能である。これにより、顕微鏡対物レンズの移動による試料の機械的干渉が回避される。

非点収差のない単一画像の生成を、非点収差のある単一画像の生成の間に断続的に行ってもよい。その場合、適応ミラーは、意図的に非点収差を導入する表面形状と、非点収差を生じさせない表面形状との間で切り替えられる。この方法の利点は、同一のカメラによって異なる単一画像が撮影されるので、これらの単一画像を自動的に互いに対して完璧に調節可能であることにある。

また、非点収差のない単一画像は、深さ補正に使用されるものではあるが、例えば蛍光発光体の画像の双極子に起因する歪みが予期される、または予期されない試料が用いられる場合のような使用条件によっては、生成の頻度を下げてもよい。

高速の画像撮影が望ましい、高速に進行する過程については、断続的な非点収差のない操作の代替として、適応ミラーが２つの横方向に分離された単一画像を作成するように、撮像光路において適応ミラーを分光器として使用してもよい。例えば、これらの単一画像を、同一のカメラの異なる部分領域上に撮像してもよい。これにより、非点収差のない単一画像および非点収差のある単一画像を同時に、例えばカメラの画像フィールド上に隣接するように撮像することが可能になる。その際、設定可能な適応ミラーのみが分光を行うので、正確な単一画像の正確な割り当てにかかる調節コストを依然として容易に管理することができる。適応ミラーを適切に制御することによって、所望のサブピクセル精度の設定を容易にかつ低コストで実現できる。

２つの画像フィールド領域を備えたカメラを使用すれば、両方の単一画像が同時に利用可能になる。
導入される非点収差の程度は、蛍光発光体の点画像の歪みに影響を与える。非点収差がより強ければ、強い歪みが生じる。すなわち、既に焦点面の比較的僅かに上方または下方に位置している蛍光発光体は、比較的強く歪められる。その結果が、高い深さ分解能である。これに対して、非点収差をより弱く設定した場合、焦点面までの距離が大きくならなければ点画像の同じ歪みを達成することができない。これにより、捕捉される深さ範囲が大きくなる。したがって、適応ミラーを適切に制御することによって、深さ分解能および捕捉される深さ範囲というそれ自体としては相反する要求間を容易に切り替えることができる。

蛍光発光体の画像とは、蛍光発光体の概して回析限界の点画像のことである。
当然ながら、前述の特徴および以下でさらに説明する特徴は、提示された組み合わせだけでなく、本発明の枠内で他の組み合わせまたは単独でも適用することができる。本明細書において方法の特徴に言及する限り、顕微鏡の操作では相応に形成された制御装置によってこれらの特徴が実現される。制御装置の機能的特徴の開示、および対応する方法の特徴、例えば工程の説明も同様である。

以下では本発明を、例として、同様に本発明の特徴を開示するものである添付図面に基づいて、さらに詳細に説明する。

深さ分解された高解像度の蛍光顕微鏡法のための顕微鏡の概略図。 深さ分解を説明するための、蛍光発光体の様々な点画像の概略図。 深さ分解のために図１の顕微鏡の操作時に生成される単一画像の図。 深さ分解のために図１の顕微鏡の操作時に生成される単一画像の図。 図１の顕微鏡の撮像光路の変形例の概略図。

図１は、蛍光顕微鏡１の概略図であり、蛍光顕微鏡１の動作が制御装置Ｃによって制御される。この制御装置は、不図示の接続部を介して顕微鏡１の要素または構成部品と接続されている。顕微鏡１は、ＰＡＬＭ原理等に従った蛍光顕微鏡法を行うように構成されている。この顕微鏡は、共通の対物レンズ５を介して試料２を照射して蛍光を発する試料を撮像する、照射光路３および撮像光路４を含んでいる。照射光路３は、撮像光路４と、通常は二色性分光器として構成される分光器６を介して結合されているので、照射光路３からの照射放射線が対物レンズ５を通って試料に落ちるとともに、試料の撮像が対物レンズ５によって行われる。照射光路３は、複数のスペクトル・チャネルを有していてもよいが、図１には例示的に１つのレーザ光源Ｌ１のみが示されている。照射光路は、試料２内で蛍光放射線が励起されるように試料を照射する。ＰＡＬＭ原理の構成によっては、追加的にもう１つの励起放射線源を照射光路３に設置してもよい。

試料２は蛍光放射線を放出し、撮像光路４では、蛍光を発する試料２の画像が高分解能カメラＫ上に導かれる。対物レンズ５、撮像光路４、およびカメラＫの分解能は、個々の蛍光発光体の回折限界の点画像が複数のピクセル上に落ちるように選定されている。これにより、冒頭で説明したＰＡＬＭ原理に要求される蛍光発光体の局在化を、顕微鏡５および撮像光路４の光学的分解能を超える横方向の位置精度で行うことが可能になる。

もちろん、顕微鏡１を複数の色チャネルで構成してもよい。その場合、撮像光路４には、適切な分光器を介して光路に連結された複数のカメラが設けられる。
もはや顕微鏡１の特徴をなさず、その他の点で当業界では常識であるので詳細には説明されていない光学的要素の他に、撮像光路４は適応ミラー７を含んでいる。適応ミラーのミラー面は湾曲されており、撮像光路４の一部となっている。適応ミラーは蛍光を発する試料２からの放射線をカメラＫの方向に収束する。

適応ミラーは、ミラー面の形状を設定する制御装置Ｃによって制御される。分光器を介して撮像光路４に接続された波面センサ９は、その際、制御装置Ｃが現在のミラー作用を可能な限り正確に把握するのに役立つ。それによって精度が向上するが、この波面センサは必須ではない。

制御装置Ｃは、ＰＡＬＭ原理が実行されるように顕微鏡１を制御する。つまり、試料２内で蛍光発光体が隔離されるように、すなわち、光学的分解能内で分離可能なように、試料２が照射光路２によって照射される。多数の単一画像が撮影され、それぞれの単一画像には試料２内の蛍光発光体の異なる部分集合が隔離されて含まれている。その後、単一画像では、制御装置Ｃによって既知の数学アルゴリズムを用いて各隔離された蛍光発光体の位置が高精度に決定されるので、撮像の光学的分解能を上回る位置精度が達成される。このことは、文献ではいわゆる高分解能または超分解能と呼ばれている。

図１に概略的に示されているように、試料２は、照射放射線の入射方向に対して垂直に、または撮像に対して垂直に延びる体積を含んでいる。隔離された蛍光発光体の深さデータを導出可能にするため、適応ミラー７が軽度の非点収差を生じさせるように、制御装置Ｃが適応ミラー７を設定する。つまり、ミラー７の面の曲率は、もはや回転放物面ではなくなり、互いに対して垂直に位置する２つの断面において異なる放物形を有している。これにより、光学的撮像の焦点面上にちょうど位置している蛍光発光体のみが、この非点収差によって歪められていないエアリー・ディスクを備えるようになる。焦点面の上方に位置する蛍光発光体が第１の方向に楕円形に歪められ、焦点面の下方に位置する蛍光発光体が第１の方向に対して垂直にある第２の方向に歪められる。

この様子が図２に示されている。図２には、単一画像のセクション１０ａ〜１０ｅが示されている。セクション１０ｃは、ちょうど焦点面上に位置している蛍光発光体に該当する。図から分かるように、その画像１１ｃは円形である。焦点面の上方に位置する蛍光発光体の画像１１ｂおよび１１ａは、楕円形に、図２の概略図では水平方向に、歪められている。蛍光発光体が焦点面から遠ざかる程、歪みの程度が増加する。これに対して、焦点面の下方に位置する蛍光発光体は、画像１１ｄおよび１１ｅに示されているように、水平方向に対して垂直にある方向に歪められている。この場合も、焦点面までの距離が大きくなる程、歪みの程度が増加する。

したがって、生成された単一画像において、適応ミラー７の非点収差が回転非対称性を生じさせるが、この回転非対称性はその程度に関して焦点面までの距離に左右され、その方向に関しては蛍光発光体が焦点面の上方または下方のいずれに位置しているかに左右される。

制御装置１０は、意図的に導入された歪みを利用して、各隔離された蛍光発光体について、その深さ位置を把握する。このために、制御装置Ｃは歪みの程度および歪みの方向を分析する。

図３は、適応ミラー７の相応の設定によって非点収差が生じた単一画像１２を例示的に示している。図から分かるように、適応ミラー７によって引き起こされた非点収差を考慮すれば、回転非対称性の方向および程度から深さ位置を容易に特定することができる。これは例えば、相応の計算、または特に容易には、既知の深さ構造を有する試料に対する較正によって行うことができる。

本明細書の概要部分で既に言及したように、歪みの程度は当然ながら、設定された非点収差の程度に左右される。したがって、適応ミラー７の制御を適切に変化させることによって、捕捉される深さ範囲および深さ分解能を簡単に設定することができ、その際、両者の大きさが互いに逆の関係にある。

双極子として形成された発光体は、双極子が光軸に対して傾いている場合に、焦点面においても回転非対称な回折限界の点画像を有し得る。制御装置Ｃがこのような蛍光体の画像を回転非対称性の観点から分析すれば、誤った深さ位置データが生じるであろう。

それ自体が非回転対称な点画像を示す蛍光発光体の誤分析を回避するために、制御装置Ｃは、撮像光路４に非点収差をもたらさないように断続的に適応ミラー７の設定を行う。その場合、図４に示されたような単一画像１３が得られる。ここで、それ自体が回転対称な点画像を有する全ての蛍光発光体が、円形のエアリー・ディスクとしても現れる。しかし、例えば説明した双極子効果または局所的干渉に起因して、非回転対称な点画像１４を有する蛍光発光体は、非点収差のない単一画像１３では非回転対称なエアリー・ディスクによって見分けることができる。

制御装置Ｃは、この点画像１４を深さ位置分析用の歪みの特定のための起点とみなす。
その際、非点収差のない単一画像１３において、その画像が回転対称性に関する要求を満たしていない蛍光発光体をフィルタにかけ、これらの蛍光発光体またはこれらの蛍光発光体の画像について、深さ位置特定の際に適切な補正を行う、またはこれらの蛍光発光体を深さ分析に関して抑制することも可能である。同様に、各蛍光発光体について、回折の影響を受けていない単一画像において生成される点画像を幾何学的形状の観点から分析し、この幾何学的形状を焦点位置の参照点（深さ位置ｚ＝０と一致する）として用いることも可能である。

上述したように、非点収差を導入する状態と、追加的な非点収差が撮像光路４にもたらされない状態との間で、制御装置Ｃが断続的に適応ミラー７を切り替える。これにより、単一画像１２および１３が断続的に撮影される。これには、単一画像が互いに対して正確に調節され、カメラＫの画像領域全体を利用できるという利点がある。

図５は、適応ミラー７およびカメラＫに関する撮像光路４の変形例の概略図である。この変形例では、適応ミラー７が、回折の影響を受けた単一画像１２を回折の影響を受けた画像１３の隣に、カメラの２つの画像領域ＫａおよびＫｂ（または２つの独立したカメラ）上に撮像する、分光器として機能する。レンズ等のその他の撮像要素もその際に使用することができるが、図５には見やすくするために記載されていない。例えば、適応ミラー７が光軸ＯＡを第１の方向に偏向させるミラー面セグメント１５を備えるように、適応ミラー７が設定されている。このミラー面セグメント１５に組み合わされて配置されたミラー面セグメント１６が、光軸ＯＡを第２の方向に偏向させる。その際、第１の方向が、カメラ画像領域Ｋａに割り当てられた光軸ＯＡ１であり、第２の方向が、カメラ画像領域Ｋｂに割り当てられた光軸ＯＡ２に対応している。その際、第１のミラー面セグメント１５による撮像のための対応するエッジ光線が、光軸ＯＡ１と同様に図５中に点線で示されており、ミラー面セグメント１６によってカメラ画像領域Ｋｂに導かれるエッジ光線および光軸ＯＡ２が鎖線で示されている。

適応ミラー７の分光作用にとっては、この適応ミラー７が撮像光路の瞳の近傍または瞳内に位置していれば有利である。つまり、この場合、ミラー面をミラー面セグメント１５および１６について等しい面積割合で分割することができる。そうすれば、適応ミラー７の制御または設計が特に容易になる。

ミラーが瞳の外側（例えば、焦点距離に関して１０％より大きい偏り）に配置されている場合、所望の分光率（例えば、１：１）を達成するために、組み合わされて配置されたミラー面セグメント１５および１６を、正確な撮像に関する知識を持って空間的にミラー面上で分割しなければならない。これも可能であるが、より複雑な制御または設計が必要になる。

さらに、ミラー面セグメント１５は、生成された単一画像１２に非点収差を生じさせる。したがって、適応ミラー７が画像分割を引き起こすようにだけでなく、単一画像において非点収差がもたらされるようにも、適応ミラー７が設定されている。

このように操作される適応ミラー７の分光作用には、非点収差のある単一画像１２が非点収差のない単一画像１３と同時に存在するという利点がある。これらの画像の歪みの違いが、図３において円または楕円によって概略的に示されている。単一画像１２および１３が同時に利用可能になることによって、各蛍光発光体についてその点画像の幾何学的形状を、非点収差のある単一画像１２におけるｚ位置決定のための起点とみなすことが特に容易になる。

以上の説明は、簡略化のために、適応ミラー７が撮像光路４において意図的に非点収差を導入する唯一の素子であると仮定している。当然ながら、これによって、その他の光学的効果に起因して撮像にある程度の非点収差が生じることが除外されるわけではない。この非点収差を抑制したければ、分光器８および波面センサ９を備えた任意の発展形態が有利である。というのは、この場合、望ましくない撮像光路４の「固有の非点収差」を排除するために適応ミラーを利用することができるからである。したがって、「非点収差のない」および「非点収差のある」という概念は、深さ分解の目的に役立つ意図的に導入されたまたは抑制された非点収差のみに関するものである。当然ながら、適応ミラーを用いて、撮像システム全体の、場合によっては試料の、その他の撮像誤差の補正をさらに行うこともできる。波面センサ９は、この作業をも容易にする。

Claims (10)

1. 高分解能３Ｄ蛍光顕微鏡法のための方法であって、
   ａ）試料（２）内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させ、光学的分解能および焦点面を有する撮像光路（４）を備えた顕微鏡（１）を用いて該試料（２）の単一画像（１０）を生成し、その際、蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各該単一画像（１０）において、該蛍光発光体の画像（１１）が光学的分解能の限界内で該単一画像（１０）に分離可能に隔離されるように、該蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、
   ｂ）隔離された該蛍光発光体の該画像から成る生成された該単一画像（１０）において、光学的分解能を超える位置精度で該蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成し、
   ｃ）該顕微鏡（１）の該撮像光路（４）において適応ミラー（７）を使用し、該適応ミラー（７）が該単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせるように該適応ミラー（７）を設定することにより、該焦点面の上方に位置する該蛍光発光体の画像（１１ａ、ｂ）が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、該焦点面の下方に位置する該蛍光発光体の画像（１１ｄ、ｅ）が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像（１２）を撮影し、回転非対称性から該蛍光発光体に関する深さ位置データを導出し、
   ｄ）非点収差のない単一画像（１３）を撮影するために、該適応ミラー（７）が該単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせないようにも、該適応ミラー（７）を追加的に設定し、
   ｅ）該非点収差のない単一画像（１３）において該蛍光発光体の回転非対称な画像（１４）を検出し、該非点収差のある単一画像（１２）における深さ位置データの導出の際に、該蛍光発光体に深さ位置補正を施すか、または該蛍光発光体を深さ分析に関して抑制する、方法。
2. 前記非点収差のある単一画像（１２）を生成する前記工程ｃ）の間に、前記非点収差のない単一画像（１３）を生成する工程（ｄ）を断続的に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記適応ミラー（７）が前記非点収差のある単一画像（１２）を第１の画像撮影領域（Ｋａ）上に、および前記非点収差のない単一画像（１３）を第２の画像撮影領域（Ｋｂ）上に同時に撮像するように、前記適応ミラー（７）を設定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 前記工程ｅ）において、深さ位置データの導出の際の深さ位置補正のために、前記非点収差のない単一画像（１３）内の前記蛍光発光体の前記画像を、前記回転非対称性の決定のための起点として利用することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記適応ミラー（７）が生じさせる前記非点収差の程度を調節することによって深さ分解能を設定することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 光学的分解能を上回る位置分解能で試料（２）を三次元的に撮像するための蛍光顕微鏡であって、
   該試料（２）内で蛍光発光体を繰り返し励起して蛍光放射線を放出させるように形成された照射装置（Ｌ１、３、５）と、
   光学的分解能を用いて該試料（２）の単一画像を生成するように形成された撮像装置（５、４、Ｋ）を含む、光学的分解能を備えた撮像光路（４）と、
   該試料（２）の複数の該単一画像が生成されるように該照射装置（Ｌ１、３、５）および該撮像装置（５、４、Ｋ）を制御するように形成された制御装置（Ｃ）とを備えており、
   該蛍光発光体の少なくとも１つの部分集合が各該単一画像において、該蛍光発光体の画像が光学的分解能の限界内で該単一画像に分離可能に隔離されるように、該蛍光発光体を励起して蛍光放射線を放出させ、
   該制御装置（Ｃ）が、生成された該単一画像において、光学的分解能を超える位置精度で、隔離されて蛍光を発する該蛍光発光体の位置を局在化し、これを元に高解像度の全体画像を生成するように形成されており、
   該撮像装置（５、４、Ｋ）が適応ミラー（７）を備えており、
   該制御装置（Ｃ）が、該適応ミラー（７）が単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせるように、該適応ミラー（７）を設定するように形成されており、それによって、焦点面の上方に位置する該蛍光発光体の画像（１１ａ、ｂ）が歪められて第１の方向に第１の回転非対称性を、該焦点面の下方に位置する該蛍光発光体の画像（１１ｄ、ｅ）が歪められて第２の方向に第２の回転非対称性を有する、非点収差のある単一画像（１２）を撮影し、該制御装置（Ｃ）が、回転非対称性から該蛍光発光体に関する深さ位置データを導出するように形成されており、
   非点収差のない単一画像（１３）を撮影するために、該制御装置（Ｃ）が、該適応ミラー（７）が該単一画像の少なくともいくつかの生成の際に非点収差を生じさせないようにも、該適応ミラー（７）を追加的に設定するように形成されており、
   該制御装置（Ｃ）が、該非点収差のない単一画像（１３）において該蛍光発光体の回転非対称な画像（１４）を検出し、該非点収差のある単一画像（１２）における深さ位置データの導出の際に、該蛍光発光体に深さ位置補正を施すか、または該蛍光発光体を深さ分析に関して抑制するように形成されている、蛍光顕微鏡。
7. 前記制御装置（Ｃ）が、前記非点収差のある単一画像（１２）の間に断続的に前記非点収差のない単一画像（１３）を生成するように、前記適応ミラー（７）を設定するように形成されていることを特徴とする、請求項６に記載の蛍光顕微鏡。
8. 前記撮像装置（５、４、Ｋ）が第１の画像撮影領域（Ｋａ）および第２の画像撮影領域（Ｋｂ）を備えており、前記制御装置（Ｃ）が、前記適応ミラー（７）が前記非点収差のある単一画像（１２）を該第１の画像撮影領域（Ｋａ）上に、および前記非点収差のない単一画像（１３）を該第２の画像撮影領域（Ｋｂ）上に同時に撮像するように、該適応ミラー（７）を設定するように形成されていることを特徴とする、請求項６に記載の蛍光顕微鏡。
9. 前記制御装置（Ｃ）が、前記非点収差のある単一画像（１２）における深さ位置データの導出の際の深さ位置補正のために、該蛍光発光体の該画像を該回転非対称性の決定のための起点として利用するように形成されていることを特徴とする、請求項６乃至８のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
10. 前記制御装置（Ｃ）が、前記適応ミラー（７）が生じさせる非点収差の程度を調節することによって深さ分解能を設定するように形成されていることを特徴とする、請求項６乃至９のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。

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