JP2015502551A - Ａβ凝集体の選択的定量化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、基体上への抗Ａβ抗体の固定化、試験すべきサンプルの基体への施与、Ａβ凝集体への特異的な結合によりこのＡβ凝集体をマークする、検出用に標識されたプローブの添加、及びマークされた凝集体の検出を含む、Ａβ凝集体の選択的定量化方法に関する。

Description

本発明は、基体上へのＡβキャプチャー分子の固定化、試験すべきサンプルの基体への施与、Ａβ凝集体への特異的な結合によりこのＡβ凝集体をマークする、検出用に標識されたプローブの添加、及びマークされた凝集体の検出を含む、Ａβ凝集体の選択的定量化方法に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ、アルツハイマー型認知症、ラテン語ではMorbus Alzheimer）ではＡβ凝集体が生じる。これらは、例えばパーキンソン病と共に、多くの場合に（しかしながらこれに限定されるものではないが）、それぞれ特異的なタンパク質が大抵はβ折り畳みシート構造の規則的な形態で細胞外、全身又は局所的に堆積することをその共通の診断基準とする臨床症状の異質の群に属している。現代社会では加齢性の認知症がますます大きな問題となっており、それというのも、平均余命が延びているためにますます多くの人が加齢性の認知症を患っており、この疾患が社会保障システムやその財務上の実現可能性に影響を及ぼしているためである。

多くの神経変性疾患において、例えばオリゴマー又はフィブリルのような生体固有のタンパク質からの病理学的な凝集体が生じる。例えば、アルツハイマー型認知症の場合には脳にアミロイドβペプチド堆積物（Ａβペプチド堆積物）が認められ、パーキンソン病の場合にはシヌクレイン堆積物が認められる。しかしながら、アミロイドβペプチド堆積物（又はペプチドフィブリル）は、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）からのモノマーアミロイドβペプチドの分解を以て開始し、次いで神経毒性アミロイドβペプチドオリゴマーを形成し、最後に、又はそれとは別に、プラーク状に堆積しているアミロイドβペプチドフィブリルを以て終了するというプロセスの最終段階に過ぎない。ＡＤの主な病理学的特徴は、Ａβペプチドからなる老人斑又はアミロイドプラークの形成と、さらには、タウタンパク質からの神経原繊維の堆積である。Ａβペプチドの前駆体タンパク質であるＡＰＰは、神経細胞の細胞壁に局在している。タンパク質の分解と場合によりそれに続く変性により、これから、例えばＡβ１−４０、Ａβ１−４２、又はｐＧｌｕＡβ３−４２といった、長さや性質の異なるＡβフラグメントが生じる。モノマーＡβペプチドは、健康な生体においても生涯にわたって生じる。１９９０年代からのアミロイド・カスケード仮説によれば、プラークの形態のＡβ堆積物が疾患症状のトリガである。しかしながら近年、様々な研究によって、特に自由に拡散する小さなＡβオリゴマーは、全てのＡβ種のうちで最も毒性が高く、ＡＤの発症及び進行の原因であることが指摘されている。従って、Ａβペプチドの凝集体はＡＤの病因と直接結びついている。

現在、ＡＤの確実な診断は、顕著な臨床症状が発現した後になって初めて可能であり、その際、信頼性は最高でも９０％と考えられている。従来の唯一の確実な診断は、目下、患者の死亡後に、脳内での様々な変化の組織学的証拠によって初めて可能である。

従って、Ａβ凝集体、特に自由に拡散する小さなＡβオリゴマー又は凝集体を同定し、かつ定量的に把握するための方法が求められている。

組織や体液における病原性の凝集体又はオリゴマーの特性決定及び定量化のための方法は、これまでごくわずかにしか記載されていない。

Ａβに結合してその凝集を阻害する化合物は、例えばChafekar et al.(ChemBioChem 2007, 8, 1857-1864)から公知である。これらの物質はＡβペプチドの一部（ＫＬＶＦＦ配列）から構成されており、治療目的で使用されているため、組織や体液における病原性の凝集体又はオリゴマーの特性決定及び定量化は行われていない。

目下、ＡＤに対して、一般に認められている診断基準及び／又は指標、いわゆるバイオマーカーはまだ存在していない。従来、そのようなバイオマーカーに対するアプローチの一つが、イメージング法へのＰＥＴ放射性トレーサーの使用であった。これは、放射性物質でマークされた物質がアミロイドプラークを捕捉するため、検出後にプラーク堆積の目安となり得るという仮定に基づくものである。ＰＥＴシグナルと疾患とは明らかに関連しているのにもかかわらず、それにより確実な診断ができることはこれまでに示され得なかった。それというのも、認知症を患っていない多くの人も高いトレーサー保持を示すためである。この方法についての欠点は、コストが高いことや、どこでも入手可能であるというわけではない機器に対する必要な技術的経費である。

さらなるアプローチとして、目下、患者の血液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中の種々の物質の量についての研究が行われ、そのバイオマーカーとしての有用性が分析されている。これらの物質のうちの一つがＡβペプチドである。従来、患者の脳脊髄液中のモノマーＡβの含分の測定に、場合によりタウ濃度の測定を組み合わせたものが、最も信頼性が高いと考えられてきた。しかしながら、値にばらつきが多いため、そのようなバイオマーカーを用いて個人に対して信頼性のある診断を行うことは不可能である。そのような方法を用いることは、ＤＥ６９５３３６２３Ｔ２号から公知である。これらの様々なアプローチにもかかわらず、信頼性のあるバイオマーカーはこれまでに何ら認められ得なかった。

さらなる問題点は、Ａβモノマーと区別したＡβ凝集体の特定の定量化、及び／又はＡβ全含分の特定の定量化について、これまでに存在している利用可能な検証系がごくわずかであることである。考えられる検証系として現在用いられているものは、抗体によりＡβオリゴマーを検出するＥＬＩＳＡである。ここで使用される抗体は、極めて特定の種類のＡβオリゴマーのみか、又はＡβペプチドからではなく全く別のタンパク質から構成されている非特異的な他のオリゴマーのいずれかを認識し、これは評価にマイナスの影響を及ぼす。コンフォーマー特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ支援法の利用は、例えばＷＯ２００５／０１８４２４Ａ２号から公知である。

さらなる検証法として、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定法が用いられている。ここでは、Ａβ特異的抗体を用いることによりＡβ分子の固定化が行われる。同一の抗体が、引き続き検出にも用いられる。この方法によればモノマーはシグナルを生じず、それというのも、抗体結合部位はすでにキャプチャー分子により占有されているためである。従って、二量体か又はそれより大きいオリゴマーによってのみ特定のシグナルが生じる。しかしながら、評価の際に、そのような方法ではサンプル中に存在する全ての凝集体の合計の定量化のみが可能であるに過ぎず、個々の凝集体の特性決定は可能でない。また、ＥＬＩＳＡ支援法は、個々のＡβ凝集体の信頼性のある検出及び定量化を行うのに必要な感度をも有していない。そのようなサンドイッチＥＬＩＳＡ法の利用は、ＷＯ２００８／０７０２２９Ａ２号から公知である。

本発明の課題は、タンパク質凝集性疾患、特にＡＤのためのバイオマーカー、並びに、Ａβ凝集体の定量化及び特性決定のための超高感度の方法を提供することであった。バイオマーカーの特性決定によって、即ち、生体固有の液体又は組織中のこの物質（バイオマーカー）の数、量及び／又はサイズの測定によって、疾患及び／又は疾患の経過に関する情報、並びに患者の状態を正確に診断できるようになることが望まれていた。

本発明のさらなる課題は、タンパク質凝集性疾患を引き起こし、かつ／又は特徴付ける病原性の凝集体、特にいずれかのサイズ及び組成のＡβ凝集体、Ａβオリゴマー、及びそれと同時に自由に拡散する小さなＡβオリゴマーの選択的定量化のための方法を提供することであった。

上記の課題は、Ａβ凝集体の選択的定量化及び／又は特性決定のための方法において、以下の工程：
ａ）試験すべきサンプルを基体に施与する工程、
ｂ）Ａβ凝集体への特異的な結合によりこのＡβ凝集体をマークする、検出用に標識されたプローブを添加する工程、及び
ｃ）マークされたＡβ凝集体を検出する工程
を含み、ここで、工程ａ）を工程ｂ）の前に行うことができることを特徴とする方法により解決される。

Ａβ凝集体ないしＡβオリゴマーの特性決定とは、形態、サイズ及び／又は組成の決定を意味する。

本発明の意味で、Ａβモノマーという概念は、Ａβという名称で知られているアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰの一部であるペプチド分子を表す。由来の種（ヒト及び／又は動物）及び処理に応じて、Ａβモノマーの厳密なアミノ酸配列は長さ及び種類の点で変化し得る。

本発明の意味で、Ａβオリゴマーという概念は、Ａβ凝集体、Ａβオリゴマー、並びに、自由に拡散する小さなＡβオリゴマーを表す。本発明の意味でのオリゴマーとは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のモノマー又はその多量体からなるポリマーである。ここで、Ａβオリゴマーにおける全てのＡβモノマーは互いに同一であってよいが、同一でなくともよい。従って、Ａβ凝集体とは、Ａβオリゴマーと、自由に拡散する小さなＡβオリゴマーとの双方と解釈されるべきである。これには、例えばフィブリルのフラグメント、「プロトフィブリル」、「ＡＤＤＬｓ」、及びＡβ５６^＊と称される凝集体も含まれる。本発明に関して重要な点は、ＡＤＤＬｓ凝集体が、サイズに関して、体内に移動し得るものの、そのサイズのために体内でＡβペプチドプラーク堆積物の形態で固定化されることのない凝集体又はポリマーであるということである。

本発明によれば、基体として、特にＡβオリゴマーに関して非特異的結合能が可能な限り低い材料が選択される。本発明の一実施態様において、ガラス製の基体が選択される。基体を、親水性物質、好ましくはポリ−Ｄ−リシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はデキストランで被覆することができる。

本発明の一実施態様において、ガラス表面はヒドロキシル化され、次いでアミノ基で活性化される。基体の被覆の準備のために、以下の工程のうち１つ以上が実施される：
・ 超音波浴又はプラズマ洗浄装置におけるガラス製の基体又はガラス支持体の洗浄、またこれに代えて、５Ｍ ＮａＯＨ中での少なくとも３時間にわたるインキュベーション。
・ 水でのすすぎ、次いで窒素下での乾燥、
・ ヒドロキシル基の活性化のための、３：１の比の濃硫酸及び過酸化水素からの溶液中への浸漬、
・ 中性ｐＨとなるまでの水でのすすぎ、次いでエタノールでのすすぎ、及び窒素雰囲気下での乾燥、
・ 無水トルエン中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（１〜７％）を含有する溶液中か、又はエタノールアミンの溶液中への浸漬、
・ アセトン又はＤＭＳＯ及び水でのすすぎ、及び窒素雰囲気下での乾燥。

デキストラン、好ましくはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）での被覆のために、基体は、ＣＭＤ（１０ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌの濃度で）、及び場合によりＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）の水溶液でインキュベートされ、次いで洗浄される。

一変法において、上記の通り、最初にヒドロキシル化され、次いでアミン基で活性化されたガラス表面に、カルボキシメチルデキストランが共有結合する。

基体として、好ましくはガラス底を有するマイクロタイタープレートを使用することもできる。ポリスチレンフレームを使用した場合には濃硫酸が使用できなくなるため、ガラス表面の活性化は本発明の一実施変法において、Janissen et al. (Colloids Surf B Biointerfaces, 2009, 71 (2), 200-207)に類似して行われる。

本発明の一別法において、Ａβ凝集体を捕捉及び固定化するために、キャプチャー分子が基体上に固定化される。好ましくは、抗Ａβ抗体がキャプチャー分子として使用される。一別法において、キャプチャー分子は基体に共有結合している。さらなる一別法において、キャプチャー分子は、被覆、好ましくはデキストラン層に共有結合している。

抗Ａβ抗体は、Ａβ凝集体のエピトープに特異的に結合する。本発明の一別法において、エピトープは、サブセグメントＡβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）から選択されたＡβペプチドのアミノ末端部分のアミノ酸配列、例えば（以下の配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１−１１、配列番号３）を有する）ヒトＮ末端エピトープのアミノ酸配列を有している。

本発明の一実施態様において、キャプチャー分子（抗体）は、ＣＭＤで被覆された支持体を場合により活性化した後に、ＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ないし５０ｍＭ）からの混合物により基体上に固定化される。キャプチャー分子が結合していない残りのカルボキシラート末端基を失活化させることができる。ＣＭＤスペーサー上のこういったカルボキシラート末端基の失活化のためには、ＤＭＳＯ中のエタノールアミンが使用される。サンプルの施与前に、基体又は支持体はＰＢＳですすがれる。

このようにして準備された基体上で、アッセイすべきサンプルがインキュベートされる。

本発明の一実施態様において、サンプルの施与は、基体（未被覆の基体）に直接、場合により、基体の場合により活性化された表面への共有結合により行われる。本発明の一変法において、サンプルの前処理が以下の方法のうち１つ以上により行われる：
− （サンプルの沸点までの温度への）加熱、
− １回以上の凍結・融解サイクル、
− 水又はバッファーでの希釈、
− 例えばプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼといった酵素での処理、
− 遠心分離処理、
− 沈殿処理、
− 存在し得る抗Ａβ抗体を排除するための、プローブによる競合。

もう１つの工程において、Ａβ凝集体は、後の検出用に標識されているプローブによりマークされる。

本発明の一変法において、プローブとして抗Ａβ抗体が用いられる。キャプチャー分子とプローブとは同一であってよい。本発明の一実施態様において、キャプチャー分子とプローブとは異なっている。従って、例えば異なる抗Ａβ抗体をキャプチャー分子及びプローブとして使用することができる。本発明のもう１つの一実施態様において、存在し得る染料マーキング以外は互いに同一であるキャプチャー分子及びプローブが使用される。本発明の一別法において、存在し得る染料マーキング以外は互いに同一である種々のプローブが使用される。本発明のさらなる別法において、異なる抗Ａβ抗体からのものであり、かつ場合により異なる染料マーキングをも有している、少なくとも２つ以上の異なるキャプチャー分子及び／又はプローブが使用される。しかしながら、異なる分子、例えば異なる抗Ａβ抗体をキャプチャー分子として使用することもできる。キャプチャー分子は、Ａβペプチドの特定のアミノ酸配列、例えばＡβ１−４０／４２、ｐｙｒｏＧｌｕ３−４０／４２、又はｐｙｒｏＧｌｕ１１−４０／４２であってよい。同様に、複数の異なる分子、例えば異なる抗Ａβ抗体をプローブとして使用することができる。

表面を事後的に品質制御するために、例えばキャプチャー分子を伴う被覆の均一性を制御するために、蛍光染料で標識されたキャプチャー分子を用いることができる。このために、好ましくは、検出を妨害しない染料が使用される。それにより、構造の事後的な制御、並びに測定結果の標準化が可能となる。

本発明の一実施態様において、プローブとして、ＡβペプチドのＮ末端エピトープに特異的に結合する抗Ａβ抗体が用いられる。

検出のために、プローブは、蛍光発光、生物発光及び化学発光及び吸収からなる群から選択された光学的に検出可能なシグナルを生じるように標識される。一別法において、プローブは染料で標識されている。これは、好ましくは蛍光染料である。

本発明の一実施態様において、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、又はそれを上回る種々のプローブが用いられる。これらのプローブは、Ａβ凝集体へのその特異的な結合に関してのみならず、例えば蛍光染料によるその種々の標識に関しても相違していてよい。検出としてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の使用が適当であるプローブを、互いに組み合わせることもできる。

異なる蛍光染料により標識されている複数の異なるプローブを使用することによって、測定の際に得られる相関シグナルの特異性が増す。さらに、それによって、Ａβモノマーのマスキングも可能になる。プローブとキャプチャー分子とが同一であるか、又は双方が重複したエピトープを認識する場合には、Ａβモノマーの検出は特に排除され得る。

本発明の一実施態様において、例えばＡβ（ｘ−４０）、Ａβ（ｘ−４２）又はピログルタメートＡβ（３−ｘ）、ピログルタメートＡβ（１１−ｘ）といった所定のＡβ凝集体種に特異的なプローブが用いられる。ｘは１〜４０ないし４２の全ての自然数であり、その際、当業者は、Ａβペプチド配列に関する自身の知識に基づいて、使用すべき配列の長さを決定する。さらなる一別法において、所定のＡβ凝集体形に特異的なプローブ、例えば市販の抗体「Ａ−１１」又は「Ｉ−１１」を使用することができる。従って、Ａβ凝集体特異的プローブ又はＡβオリゴマー特異的プローブの利用又は使用も、本発明の対象である。これらは、所定のＡβ凝集体又はＡβオリゴマーに、好ましくは上記の種に対して特異的に結合する。所定のＡβ凝集体又はＡβオリゴマーへの特異的な結合により、Ａβ凝集体又はＡβオリゴマーの性質及び／又はサイズ並びに構造を決定することができる。従って、Ａβ凝集体特異的プローブ又はＡβオリゴマー特異的プローブも、本発明のさらなる対象である。

さらなる一別法において、蛍光染料で標識されたＡβペプチドをプローブとして使用することができる。

試験すべきサンプルとして、生体固有の流体又は組織を用いることができる。本発明の一実施態様において、サンプルは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿及び尿から選択される。サンプルを、当業者に公知の種々の調製工程下におくことができる。本発明の利点は、未処理のサンプル、好ましくはＣＳＦにおけるＡβ凝集体の測定が可能であることである。

従って、Ａβ凝集体の組成、サイズ及び／又は形態を測定するための方法も、本発明の対象である。この方法では、上に挙げ、かつ記載された方法工程が用いられる。

マークされた凝集体の検出は、走査又は他の種類の面撮像により行われる。検出は、好ましくは、特に相互相関及び単一粒子イムノソルベントレーザー走査式アッセイ及び／又はレーザー走査型顕微鏡法（ＬＳＭ）と組み合わせた、共焦点蛍光顕微鏡法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により行われる。

本発明の一別法では、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて検出が行われる。本発明の一実施態様において、例えばレーザー走査型顕微鏡法において使用されるようなレーザー集束か、又はＦＣＳ（蛍光相関分光法系）がこれに使用され、さらに、相応する超解像改変体、例えばＳＴＥＤ又はＳＩＭが使用される。これとは別に、検出を、ＴＩＲＦ顕微鏡、並びにその相応する超解像改変体、例えばＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭにより行うこともできる。それに応じて、本発明の実施態様において、空間的に分解されないシグナルに基づく方法、例えばＥＬＩＳＡ又はサンドイッチＥＬＩＳＡは排除される。

検出の際には、高空間分解能が好ましい。その際、本発明による方法の一実施態様において、例えば機器特有のノイズ、他の不特定のシグナル、又は非特異的に結合したプローブにより生じるバックグラウンドシグナルに対する凝集体の検出が可能となるような数のデータ点が収集される。このようにして、空間的に分解される事象、例えばピクセルの存在数と同じ数の値が読取られる（読取り値）。空間分解能により各事象がそれぞれのバックグラウンドに対して測定され、これは、空間的に分解されるシグナルのないＥＬＩＳＡ法に対する利点である。

一別法において、本発明による方法において、複数の異なるプローブが使用される。それによって、情報、即ち読取り値が増える。それというのも、各点について、各凝集体について、又は各検出事象について、シグナルを生じるそれぞれのプローブに応じて別個の情報が得られるためである。従って、各事象についてシグナルの特異性が増す。それにより、検出された各凝集体について、その組成、即ち凝集体の性質、即ちＡβ種、例えばＡβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）、ピログルタメートＡβ（３−４０／４２、１１−４０／４２）又はそれらからの混合物からの組成も測定可能である。その際、種々のプローブの数は、使用すべき蛍光染料の干渉によってのみ制限される。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを上回る種々のプローブと染料の組み合わせを使用することができる。

空間分解情報は、上記の方法による評価にとって重要である。これは、例えば蛍光の性質及び／又は強度であることができる。使用され、かつ検出される全てのプローブについてのこうしたデータの評価の際に、本発明によれば、凝集体の数、その形態、サイズ及び／又はその組成が測定される。ここで、オリゴマーのサイズについての情報は、直接、又は間接的に、粒子が、使用されたイメージング法の空間分解能よりも小さいか大きいかに依存して得ることができ、一実施態様において、バックグラウンド最小化のためのアルゴリズムを用い、かつ／又は、強度閾値を適用することができる。

蛍光染料として、当業者に公知の染料を使用することができる。また、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、その複合体及び／又は融合タンパク質、並びに量子ドットを使用することもできる。

内部標準物質又は外部標準物質を使用することによって試験結果を互いに客観的に比較することができるため、有意義である。本発明の一実施態様において、Ａβ凝集体の定量化に内部標準物質又は外部標準物質が用いられる。

蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ 蛍光強度分布解析法）に依拠して、本発明による方法はいわゆるサーフェスＦＩＤＡ（Ｓｕｒｆａｃｅ−ＦＩＤＡ）である。

キャプチャー分子及びプローブ分子の選択により、検出（シグナル）に寄与し得るためにオリゴマーが有しなければならないサイズを決定することができる。

さらに、本発明による方法により、自由に拡散する小さなＡβ凝集体の厳密な解析も可能である。このような小さなＡβオリゴマーは、そのサイズが光学顕微鏡法の解像度を下回っているため、（例えば、結合していない抗体により生じる）バックグラウンド蛍光との区別が困難であった。

極めて高い選択性と並んで、本発明による方法は、広い範囲にわたるＡβ凝集体の数に関する線形性をも示す。

本発明のさらなる対象は、タンパク質凝集性疾患、特にＡＤを検出し、かつ診断するためのバイオマーカーとしての、自由に拡散する小さなＡβ凝集体の使用である。本発明は、患者の体液、特にＣＳＦのサンプルを本発明による上記の方法により解析することを特徴とする、タンパク質凝集性疾患、特にＡＤを診断及び／又は検出するための方法にも関する。

本発明の一変法において、内部標準物質又は外部標準物質が用いられる。タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付けるオリゴマー又は病原性の凝集体を定量化するためのそのような標準物質は、ポリマーがポリペプチド配列から構成され、このポリペプチド配列が、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、このポリマーが凝集しないことを特徴とする。

本発明の意味での標準物質とは、特性及び／又は量の比較及び測定に、特に生体固有のタンパク質からの病原性凝集体のサイズ及び量の測定に用いられる、一般に有効であり受け入れられる固定の参照量を表す。本発明の意味での標準物質は、機器のキャリブレーション及び／又は測定に使用可能である。

本発明の意味で、アミロイド変性及びタンパク質ミスフォールディング疾患も「タンパク質凝集性疾患」という概念で一括りにすることができる。そのような疾患と、それに関連する生体固有のタンパク質の例は、ＡＤに関してはＡβタンパク質及びタウタンパク質であり、パーキンソン病に関してはα−シヌクレインであり、またプリオン病、例えばヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、羊のスクレイピー及び牛海綿状脳症（ＢＳＥ）に関してはプリオンタンパク質である。

「相同な配列」とは、本発明の意味で、あるアミノ酸配列が、タンパク質凝集性疾患を引き起こす生体固有の病原性の凝集体又はオリゴマーからのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を示すことを意味する。本願明細書では、「同一性」という概念に代えて、「相同な」又は「相同性」という概念を同義で用いる。２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S(Adv. Appl. Math. 2: 482-489(1981))のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：８、及びギャップエクステンションペナルティー：２に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：５０、及びギャップエクステンションペナルティー：３に設定して算出される。好ましくは、２つの核酸配列又はポリペプチド配列間の同一性は、それぞれの全配列長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定義され、例えばこれは、Needleman, S.B.及びWunsch, C.D.(J. Mol. Biol. 48: 443-453)のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを用いた比較により、アミノ酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：８、及びギャップエクステンションペナルティー：２に設定し、核酸に関するパラメータを、ギャップクリエーションペナルティー：５０、及びギャップエクステンションペナルティー：３に設定して算出される。

２つのアミノ酸配列が同一のアミノ酸配列を有している場合、これら２つのアミノ酸配列は本発明の意味で同一である。

生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」という概念は、本発明による定義に従って、本発明による標準物質を構成しているモノマーの、同一の、又は、示されているパーセンテージで相同なペプチド配列を有しているペプチド配列と解釈されるべきである。

本発明による標準物質について重要な点は、好ましくは凝集しないモノマー配列を用いることによって標準物質が凝集しないという点であり、それというのも、生体固有のタンパク質の「相応するサブセグメント」は凝集の原因でないか、もしくは、凝集の原因となる群がブロッキングのために凝集しないためである。

本発明の意味での凝集体とは、以下のものである：
− 互いに共有結合していない、複数の、好ましくは同一の構成単位からなる粒子、及び／又は、
− 複数のモノマーの、共有結合していない集合体。

本発明の一実施態様において、標準物質は厳密に定義された数のエピトープを有しており、このエピトープは、相応するプローブの結合のために、（直接、又は、アミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を介して）互いに共有結合している。本発明の意味でのプローブとは、以下のものからなる群から選択される：抗体、ナノボディ及びアフィボディ。さらに、検出すべき凝集体に対して十分な結合特異性を有している分子はいずれもプローブであり、例えば染料（チオフラビンＴ、コンゴーレッド等）である。

エピトープの数は、ポリペプチド配列であって、その配列に関して、エピトープを形成している生体固有のタンパク質のサブセグメントと同一であるか、又はこのサブセグメントと少なくとも５０％の相同性を示し、かつその際、このエピトープの生物学的活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより決定される。そのようにして選択されたポリペプチド配列は、所望の数で、本発明による標準物質の合成の際に組み込まれ、かつ／又は、一緒に本発明により結合される。

本発明による標準物質は、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープから構成されており、場合により他の要素を含むポリマーである。本発明のもう一つの実施態様において、上記のポリペプチド配列、好ましくはエピトープ、及び／又は、相応するエピトープの生物学的活性を有するその相同体は、それぞれ標準物質の残りのモノマー種のうちの１種の数に対して、及び／又は、他の全てのモノマーの数に対して、同じか又はそれよりも大きい数のモノマーを表す。

本発明のもう一つの実施態様において、エピトープは、サブセグメントＡβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）から選択されたＡβペプチドのエピトープ、例えば（以下の配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１−１１；配列番号３に相当）を有する）ヒトＮ末端エピトープである。ｐｙｒｏＧｌｕとは、Ａβペプチドの３位及び／又は１１位に存在し、好ましくはＮ末端グルタミン酸の環化に基づくピログルタミン酸の略称である。

本発明による標準物質は、上で定義したポリペプチド配列からのポリマーである。本発明の意味でのオリゴマーとは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のモノマー（モノマーとは、上に挙げたポリペプチド配列と解釈されるべきである。）から形成されているポリマー又はその多量体であり、好ましくは２〜１６個、４〜１６個、８〜１６個、特に好ましくは８個又は１６個のモノマーから形成されているポリマー又はその多量体である。従って、本発明による標準物質は本発明によるオリゴマーないしポリマーである。

本発明の一別法において、標準物質は水溶性である。

本発明の一別法において、本発明による標準物質は同一のポリペプチド配列から構成されている。本発明の一別法において、本発明による標準物質は異なるポリペプチド配列から構成されている。

本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列は直鎖状構造で連結している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による分岐鎖オリゴマーを形成している。本発明の一別法において、上で定義したようなポリペプチド配列が連結して、本発明による架橋オリゴマーを形成している。本発明による分岐鎖もしくは架橋オリゴマーは、リシンを用いて、又はクリックケミストリーを用いて、個々の構成単位を結合することによって製造可能である。上記の通り、本発明による標準物質、即ち本発明によるオリゴマーないしポリマーは、厳密に定義された数で存在するポリペプチド配列、好ましくはエピトープに加え、さらに、付加的なアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基を含むことができ、これらを介して、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープが互いに共有結合している。一別法において、特にシステインによるジスルフィド架橋を用いた、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープとシステインとの直接結合は、（還元剤による解架橋を回避するために）排除される。同様に、もう一つの変法において、スペーサーと、一方ではポリペプチド配列との、及び他方ではシステインとの直接結合は排除される。

本発明は、一別法において、サブセグメントＡβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）から選択されたＡβペプチドのアミノ末端部分、例えば（以下の配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ（１−１１）を有する）ヒトＮ末端エピトープのコピーを含むか又はこれから構成されている標準物質分子に関する。

個々の構成単位の合成の前又は後に、官能基によるエピトープのコピーを行うことができる。本発明による標準物質の特徴は、ポリペプチド配列の共有結合である。

本発明により使用可能なポリペプチド配列は、フルレングスのＡβペプチドの配列と同一のものであってもよいし、フルレングスのＡβペプチドの配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を示すものであってもよい。

また、フルレングスのＡβペプチドのサブセグメントと同一であるか、又は、フルレングスのＡβペプチドのサブセグメントと５０％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の相同性を示すポリペプチド配列は、本発明による標準物質分子の合成にも用いられる。本発明により使用される配列について重要な点は、凝集しない（又は条件により制御されてのみ凝集する）というその特性、及び／又はエピトープとしてのその活性である。

本発明のもう一つの実施態様において、標準物質はデンドリマーとして構成されている。本発明によるデンドリマーは、本発明により使用され得る上記のポリペプチド配列から構成されており、かつ中心骨格分子を含むことができる。好ましくは、この骨格分子はストレプトアビジンモノマー、特に好ましくはポリマー、特に四量体である。

本発明によるデンドリマーは、一変法において、Ａβペプチドのサブセグメントと同一であるか又は相応するサブセグメントに対して少なくとも５０％の相同性を示す配列を有するポリペプチド配列を含んでいる。

本発明によれば、少なくとも５０％の相同性という概念は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％からなる群から選択された高い相同性と解釈されるべきである。

好ましくは生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーよりも水性物質中での溶解度が高い標準物質が、本発明の一実施態様において、ＡβペプチドのＮ末端領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも５０％の相同性を示すポリペプチド配列から形成されている。本発明によれば、ＡβポリペプチドのＮ末端領域とは、アミノ酸配列Ａβ１−８（配列番号２）、Ａβ１−１１（配列番号３）、Ａβ１−１６（配列番号４）、Ａβ３−１１（配列番号５）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ３−１１（配列番号６）、Ａβ１１−１６（配列番号７）及びｐｙｒｏＧｌｕＡβ１１−１６（配列番号８）と解釈されるべきである。

本発明による標準物質分子は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれを上回る種々のプローブに対するエピトープを含むことができる。

Ａβペプチドの種々の領域と同一であるか又はこれに対して少なくとも５０％の相同性を示すものの、相応するエピトープの活性を有しているポリペプチド配列を用いることにより、種々のプローブに対して固有のエピトープを本発明による標準物質に組み込むことができる。一実施態様において、このために、ＡβポリペプチドのＮ末端領域と同一であるか又は５０％の相同性を示すポリペプチド配列、並びに、ＡβポリペプチドのＣ末端と同一であるか又は少なくとも５０％の相同性を示すポリペプチド配列が用いられる。

本発明の一実施態様において、標準物質分子はいわゆるスペーサーを含んでいる。スペーサーとは、共有結合を介して標準物質分子に組み込まれており、所定の物理的及び／又は化学的特性を有しており、それによって標準物質分子の特性が変化するような分子と解釈されるべきである。本発明による標準物質の一実施態様において、親水性又は疎水性、好ましくは親水性のスペーサーが用いられる。親水性のスペーサーは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−Ｌ−リシン又はβ−アラニンから形成される分子群から選択される。

本発明による標準物質は、本発明の一実施態様において、（さらなる）官能基を含んでいる。官能基とは、標準物質に共有結合している分子と解釈されるべきである。一変法において、官能基はビオチン基を含んでいる。それにより、ストレプトアビジンとの強力な共有結合が可能となる。そのようにして、ビオチン基を含む標準物質分子はストレプトアビジン基を含む分子に結合できる。本発明による標準物質分子がビオチン基及び／又はストレプトアビジン基を含んでいる場合、比較的大きな標準物質を合成することもできるし、複数の、場合により種々の標準物質分子を骨格に結合させることもできる。

本発明のもう一つの別法において、標準物質分子は、分光光度定量のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含んでいる。芳香族アミノ酸は、例えばトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンであるか、又はこの群から選択されたものである。トリプトファンを組み込むことによって、溶液中での標準物質の濃度の分光光度定量が可能となる。

本発明のさらなる対象は、ポリペプチドを含むデンドリマーであり、このポリペプチドは、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示すものである。

本発明によるデンドリマーは、標準物質の上記の特徴の各々か、又はその各々の任意の組み合わせを有することができる。

本発明の一別法において、以下のものが該当する：
プローブの共有結合のための厳密に定義された数のエピトープを含むデンドリマー、
Ａβペプチドのエピトープを含むデンドリマー、
タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体よりも水性物質中での溶解度が高いことを特徴とするデンドリマー、
官能基を含むデンドリマー、
少なくとも１つのスペーサー分子を含むデンドリマー、及び／又は
分光光度定量のための染料及び／又は芳香族アミノ酸を含むデンドリマー。

本発明によれば、デンドリマーは放射対称性を有している。一変法において、デンドリマーの第１世代の分岐は、リシン、特に３つのリシンアミノ酸を介して行われる。

本発明のもう１つの別法において、標準物質、特にデンドリマーにおいて、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープは、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ／又はシステインを介さずに（場合によりシステインによるジスルフィド架橋を用いて）互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、スペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。同様に、もう１つの変法において、ポリペプチド配列、好ましくはエピトープと、これに結合しているスペーサーとは、スペーサー上で、硫黄原子との結合を介さずに、チオエーテル結合を介さずに、かつ／又はシステインを介さずに互いに結合しているか、又は、標準物質の他の要素、例えばアミノ酸、さらなるスペーサー及び／又は官能基及び／又は他の上記の要素と結合しており、特に共有結合している。

本発明はさらに、上記のような標準物質の製造法に関する。一実施態様において、本発明による標準物質は、当業者に公知のペプチド合成法又は組換え法により製造される。

本発明のもう１つの対象は、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための、上記の標準物質又は上記のデンドリマーの使用である。

本発明の一実施態様において、標準物質はＡβオリゴマーの定量化に用いられる。

本発明によれば、本発明によるオリゴマー又はポリマーは、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーを定量化するための方法における標準物質として使用される。

本発明の一実施態様において、本発明による標準物質は、サーフェスＦＩＤＡ法、Ｅｌｉｓａ（サンドイッチＥｌｉｓａ）又はＦＡＣＳにおけるキャリブレーションに使用される。

もう１つの実施態様において、本発明は、本発明による標準物質を含むキットに関する。本発明のキットの化合物及び／又は構成要素は、容器内に、場合によりバッファー及び／又は溶液と一緒に、あるいはバッファー及び／又は溶液中にパックされていてよい。また、いくつかの構成要素が同じ容器内にパックされていてもよい。これに加えて、又はこの代わりに、１つ以上の構成要素が、例えばガラスプレート、チップ、又はナイロンメンブレンといった固体の支持体に、又はマイクロタイタープレートのウェルに吸収されていてもよい。さらに、キットは、このキットを任意の一態様に用いるための使用説明書を含むことができる。

本発明の一別法において、標準物質は、以下のようにして生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーの定量化に用いられる：
第一の工程において、標準物質又はデンドリマーをプローブでマークして、標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を測定し、
第二の工程において、タンパク質凝集性疾患を特徴付ける生体固有のタンパク質からの病原性の凝集体又はオリゴマーをプローブでマークして、その都度病原性の凝集体又はオリゴマーに結合しているプローブの数を測定し、
第三の工程において、第一の工程からのその都度標準物質又はデンドリマーに結合しているプローブの数を、第二の工程からの数と比較し、さらに
第四の工程において、それにより体液からのオリゴマーの数及びサイズを決定する。

本発明の一変法において、本発明による標準物質、好ましくはデンドリマーは、サーフェスＦＩＤＡ法のキャリブレーションに用いられる。第一の工程において、体液からの生体固有の病原性の凝集体、例えばＡβ凝集体は、プローブによりガラス表面上に固定化される。Ａβ凝集体の場合には、このためにＮ末端キャプチャープローブを使用することができる。固定化の後、この凝集体は２つの異なるプローブによりマークされる。Ａβ凝集体の場合には、例えば、双方がＮ末端結合エピトープを介して結合するＡβ抗体が使用される。これらの検出プローブは、好ましくは異なる蛍光染料でマークされている。それにより、これらの検出プローブは例えばレーザー走査型顕微鏡のような顕微鏡下での視認が可能となる。

本発明によれば、試験系において、類似もしくは同一のエピトープに結合する３つの異なるプローブか又は３つの異なってマークされたプローブを用いることによって、生体固有のポリペプチドのモノマー検出が排除される。これに代わって、又はこれに加えて、比較的強度の低いシグナルを強度カットオフにより評価しないことによって、モノマーの検出を排除することができる。これに代わって、又はこれに加えて、比較的大きい凝集体は、異なってマークされた染料を有する２つのプローブに対して複数の結合部位を有しているため、これらのシグナルの相互相関によりモノマーの検出を排除することができる。本発明による標準物質を、測定の際に内部標準物質又は外部標準物質として使用することができる。

本発明の対象はさらに、上記の方法によりＡβ凝集体を選択的に定量化するためのキットである。そのようなキットは、以下の構成要素を１つ以上含むことができる：
・疎水性物質、好ましくはデキストラン、好ましくはカルボキシメチルデキストランで被覆されているガラス製の基体；
・標準物質；
・キャプチャー分子；
・プローブ；
・キャプチャー分子を有する基体。

本発明のキットの化合物及び／又は構成要素は、容器内に、場合によりバッファー及び／又は溶液と一緒に、あるいはバッファー及び／又は溶液中にパックされていてよい。また、いくつかの構成要素が同じ容器内にパックされていてもよい。これに加えて、又はこの代わりに、１つ以上の構成要素が、例えばガラスプレート、チップ、又はナイロンメンブレンといった固体の支持体に、又はマイクロタイタープレートのウェルに吸収されていてもよい。さらに、キットは、このキットを任意の一態様に用いるための使用説明書を含むことができる。

キットの他の改変体において、上記のキャプチャー分子は基体上に固定化されている。さらに、キットは溶液及び／又はバッファーを含むことができる。デキストラン表面及び／又はその上に固定化されたキャプチャー分子を保護するために、これらを溶液又はバッファーで被覆してもよい。

本発明のさらなる対象は、ＡＤの診断、早期診断及び／又は予後予測のための、本発明による方法の使用である。

本発明のさらなる対象は、ＡＤ治療のモニタリングのための、並びに、活性物質及び／又は処置の有効性のモニタリング及び／又はチェックのための、本発明による方法の使用である。これを、臨床試験、臨床研究において、並びに治療モニタリングにおいても用いることができる。このために、サンプルを本発明による方法に従ってアッセイし、結果を比較する。

本発明のさらなる対象は、臨床研究への人の受け入れを行うか否かを決定するための、本発明による方法及びバイオマーカーの使用である。このために、サンプルを本発明に従ってアッセイし、限界値を参照して決定を行う。

本発明のさらなる対象は、サンプルの結果を互いに比較して、本発明による方法を用いて活性物質及び／又は処置の有効性を決定するための方法である。サンプルは、活性物質投与の前もしくは後に、又は活性物質投与後もしくは処置実施後の種々の時点で採取された体液である。結果をもとに、Ａβ凝集体を低減させる活性物質及び／又は処置が選択される。本発明によれば、その結果が、活性物質及び／又は処置を施していない対照と比較される。

患者のＣＳＦ中のＡβ凝集体の測定結果を示す図。 図１からの結果とＭＭＳＥとの相関関係を示す図。 Ａは、トリプルリシンコアに結合した４つのＮ末端Ａβエピトープ１−１１からなる４−ＭＡＰの合成を示す図、Ｂは、ストレプトアビジン四量体への４つの４−ＭＡＰの結合を示す図、Ｃは、１６−ＭＡＰの形成を示す図。 Ａは、レーザー走査型顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製 ＬＳＭ ７１０）による、ＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定結果を示す図、Ｂは、ＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）による、ＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定結果を示す図。 Ａは、ｓＦＩＤＡによる測定結果を示す図、Ｂは、ｓＦＩＤＡによるＡβ凝集体（Ａβオリゴマー）の測定結果を示す図。 Ａβモノマー及びＡβオリゴマーに対するＦＲＥＴシグナルでのｓＦＩＤＡ測定結果を示す図。 遺伝子導入（Ｔｇ）アルツハイマーマウスモデル（ＡＰＰ／ＰＳ１）の脳脊髄液及び非遺伝子導入対照動物（Ｋ）の脳脊髄液中のＡβオリゴマーのｓＦＩＤＡによる検出結果を示す図。

Ｉ．ＣＳＦ中でのＡβオリゴマー（Ａβ凝集体）の測定
１．基体の準備
ガラス製の支持体を超音波浴中で１５分間洗浄した。表面を水で３回すすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。洗浄した支持体を、濃硫酸と過酸化水素の３：１（Ｖ／Ｖ）の混合物に少なくとも３０分間浸漬させ、それによりヒドロキシル基を活性化させた。次いで、すすぎ水のｐＨが中性になるまで水ですすいだ。第二のすすぎ工程において９９％エタノールを使用し、次いで、支持体を窒素ガス流中で乾燥させた。このガラス支持体を、無水トルエン中の１〜７％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の溶液に、１〜４時間浸漬させた。５％ＡＰＴＥＳ溶液を用い、２時間のインキュベーション時間で、良好な結果が達成された。次いで、スライドをアセトン及び水ですすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。

デキストランで被覆するために、ガラス表面をヒドロキシル化し、次いでアミノ基で活性化させた。カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解させ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）と混合した。１０分間のプレインキュベーションの後、この溶液を室温でさらに２時間インキュベートした。次いで、このガラス支持体を水で洗浄した。

２．被覆された基体上へのキャプチャー分子としての抗体の固定化
ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液（２００又は５０ｍＭ）で、表面の第二の活性化を５分間行った。抗体の溶液をこれに添加し、４℃で２時間インキュベートした。これにより、抗体を、ＣＭＤで被覆されたガラス表面に共有結合させた。次いで、ＣＭＤスペーサー上の残りの活性カルボキシル末端基を失活させるために、これをＤＭＳＯ中の１Ｍエタノールアミンで１５分間インキュベートした。次いで、基体をＰＢＳで３回洗浄した。

３．前処理された基体上へのＡβ凝集体の固定化
アッセイを行うべきサンプルを基体上で１時間インキュベートし、次いで、これをＴＢＳＴ（０．１％）（Ｗ／Ｗ）、ＴＢＳバッファー中のＴｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ：５０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で２回洗浄した。

４．標識のための、サンプルと蛍光染料との結合
Ｎａｂ ２２８、抗マウスＡｌｅｘａ ６３３、及び６Ｅ１０−Ａｌｅｘａ４８８抗体を用いた。Ｎａｂ ２２８抗体を、製造者の使用説明書に従って、キット（蛍光標識キットＡｌｅｘａ−６４７、分子プローブ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ在）で標識した。標識した抗体を、２ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で暗所で４℃で貯蔵した。

５．プローブでの凝集体のマーキング
使用した抗体の数は、所望のマーキング度合いに依存していた。プローブを添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴで５回、ＴＢＳで２回洗浄した。

６．凝集体の検出及びサンプルのアッセイ
共焦点レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、Ｊｅｎａ、ドイツ在）を用いて測定を行った。この顕微鏡は、１つのアルゴンイオンレーザーと、３つのヘリウムネオンレーザーを具備していた。レーザービームを、容量０．２５フェムトリットルの回折限界スポットに集束させた。１０００×１０００ピクセルの面の蛍光強度を測定した。種々のプローブを用いたため、共局在化解析を行った。代表値を求めるために、この面を支持体上の複数の箇所で測定した。

Ｊｅｎａ、ドイツ在のＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製ＺＥＮ ２００８ソフトウェアを用いて測定を行った。

７．ＣＳＦサンプルの解析
異なる患者のＣＳＦの２６個のサンプルを、本発明による方法で解析した。これらのサンプルは、それぞれ１４人のＡＤ患者と、（年齢の異なる、タンパク質凝集性疾患に関して健康な）１２人の対照患者とからのものである。結果を図１にまとめた。この結果から、群間で明確な区別ができることが明らかである。ＡＤ群におけるＡβオリゴマーの平均は、対照群の場合よりも著しく高かった。

８．ＭＭＳＥとの相関関係
本発明による解析の結果を、ドナーのＭＭＳＥ（Ｍｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｕｓ Ｔｅｓｔ）と比較した。この結果を図２にまとめた。この結果から、ＭＭＳＥ試験の評価と本発明による解析の評価との相関関係が明らかである。

ＩＩ．凝集体標準物質の検出
１．凝集体標準物質の調製
一実施例において、Ｎ末端に結合するＡβ抗体に対する１６個のエピトープ（エピトープはＡβ（１−１１）に相当する。配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ）を有するＡβオリゴマー標準物質を調製した。まず、４つのＮ末端ＡβエピトープＡβ１−１１からなる多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を合成した。これらのエピトープは図３Ａに相応してトリプルリシンコアに結合しており、このトリプルリシンコアは、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によりＭＡＰ濃度を厳密に測定するために２つのトリプトファンを含んでいた。さらに、ビオチンタグをＮ末端につけた。これを、図３のＢに示すように、それぞれ４つの４−ＭＡＰ単位をストレプトアビジン四量体に結合するのに用いた。４−ＭＡＰ及びストレプトアビジンをインキュベーションした後に、図３のＣに示すように１６−ＭＡＰを形成させた。サイズ排除クロマトグラフィーにより、１６−ＭＡＰをインキュベーション混合物の他の成分と分離した。

次いで、ＭＡＰ−１６を順にＰＢＳで希釈し、Ａβオリゴマーの検出のためにｓＦＩＤＡ試験で使用した。

２．ガラスプレートの準備
ガラス製のマイクロタイタープレートを超音波浴中で１５分間洗浄し、次いでプラズマ洗浄装置で１０分間処理した。ガラス表面の活性化のために、ウェルを５Ｍ ＮａＯＨ中で少なくとも３時間インキュベートし、水ですすぎ、その後、窒素ガス流中で乾燥させた。デキストランで被覆するために、ガラス表面をヒドロキシル化し、次いでアミノ基で活性化させた。このために、ガラスプレートをＤＭＳＯ中の５Ｍエタノールアミンの溶液中で一晩インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水ですすぎ、窒素ガス流中で乾燥させた。カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解させ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）と混合した。１０分間のプレインキュベーションの後、この溶液を室温でさらに２時間インキュベートした。次いで、このガラスプレートを水で洗浄した。

３．被覆したガラス上へのキャプチャー分子としての抗体の固定化
ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液（２００又は５０ｍＭ）で、第二の活性化を５分間行った。抗体の溶液をこれに添加し、４℃で２時間インキュベートした。これにより、抗体を、ＣＭＤで活性化されたガラス表面に共有結合させた。次いで、ＣＭＤスペーサー上の残りの活性カルボキシル末端基を失活させるために、これをＤＭＳＯ中の１Ｍエタノールアミンで５分間インキュベートした。次いで、ガラスをＰＢＳで３回洗浄した。

４．前処理したガラス上へのＭＡＰ−１６の固定化
アッセイを行うべきＭＡＰ−１６を含むサンプルをガラス上で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴ（０．１％）（Ｗ／Ｗ）、（ＴＢＳバッファー中のＴｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳ：５０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

５．蛍光染料でのプローブの標識
６Ｅ１０−Ａｌｅｘａ４８８抗体及びＩＣ−１６抗体を使用した。ＩＣ−１６抗体を、製造者の使用説明書に従い、キット（蛍光標識キットＡｌｅｘａ−６４７、分子プローブ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ社、ドイツ在）でマーキングした。標識した抗体を、２ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で暗所で４℃で貯蔵した。

６．プローブでの凝集体のマーキング
プローブを添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳＴで５回、水で２回洗浄した。

７．凝集体標準物質の検出
共焦点レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、Ｊｅｎａ、ドイツ在）を用いて測定を行った。この顕微鏡は、１つのアルゴンイオンレーザーと３つのヘリウムネオンレーザーを具備していた。タイルスキャンモードで測定を行い、その際、１つのウェル内の隣接する面を測定して画像化した。各タイルスキャンは３×２個の各画像を含んでおり、各画像の面積は２１３×２１３μｍであった。また、倒立型顕微鏡ＤＭＩ ６０００、レーザーボックス及びＨａｍａｍａｔｓｕ−ＥＭ−ＣＣＤ Ｃ９１００カメラから構成されているＴＩＲＦ顕微鏡（ＴＩＲＦ＝total internal reflection）で測定を行った。タイルスキャンモードでは、それぞれ１０９．９×１０９．９μｍのサイズを有する３×３個の各画像が存在していた。

ソフトウェア「Ｉｍａｇｅ Ｊ」(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を用いて評価を行った。様々なプローブを用いることにより、共局在解析を実施することができた。このために、まず、個々のピクセルの強度値から、ＭＡＰ−１６を含まない陰性対照により定義されるカットオフ値を減じた。次いで、強度が０よりも大きい共局在ピクセルの数を加えた。

図４に測定結果を示す。ｓＦＩＤＡシグナル、即ち共局在ピクセルの量がＭＡＰ−１６分子の濃度と相関関係にあることが明らかに認められる。

ＩＩＩ．Ａβ凝集体（Ａβオリゴマー）とＡβモノマーとの比較
１．ｓＦＩＤＡによる測定
ｓＦＩＤＡによってＡβモノマーもが検出されてＡβオリゴマーのシグナルが変わってしまうことを排除し得るために、合成ＡβからなるＡβモノマー及びＡβオリゴマーをJohannson et al., FEBS J. 2006, 273, p.2618-2630のプロトコルに従って調製し、この系を用いて試験した。さらに、Ａβオリゴマーを順にＰＢＳで希釈し、一連の濃度で試験の線形性を確認した。すでに上に記載した通りに測定を行い、検出にＺｅｉｓｓ社製ＬＳＭ ７１０顕微鏡を使用し、それぞれサイズ２１３×２１３μｍ、１０２４×１０２４ピクセルの２×２５個の画像を撮影した。結果を図５に示す。ＡβオリゴマーはクリアなｓＦＩＤＡシグナルをもたらすが、ＡβモノマーはクリアなｓＦＩＤＡシグナルをもたらさなかった。図５Ｂから、ｓＦＩＤＡシグナルがＡβオリゴマーの濃度と相関関係にあり、さらに、ポジティブなシグナルが生じるのに必要なＡβオリゴマーは極めて少量であることが認められる。

２．ＦＲＥＴ測定
ｓＦＩＤＡについて、今までに選択した数の相互相関ピクセルとは異なるシグナルも生じ得るか否かを確認するために、ＦＲＥＴ測定を行った。ＦＲＥＴとは、フェルスター共鳴エネルギー移動を表す。ＦＲＥＴでは、励起した蛍光色素のエネルギーが第二の蛍光色素に移動する。ＦＲＥＴ強度は特にドナーとアクセプターとの間の距離に依存し、１０ｎｍまでの範囲で観測可能である。従って、ＡβモノマーとＡβオリゴマーとを区別するために、ＦＲＥＴをｓＦＩＤＡにおいて利用し得ることが望まれる。ドナー染料と結合した抗Ａβ抗体（例えば６Ｅ１０−Ａｌｅｘａ４８８）と、これに適したアクセプター染料と結合した抗Ａβ抗体（例えばＩＣ−１６−Ａｌｅｘａ６４７）とが、互いに直に接してＡβオリゴマーに結合すると、空間的な近接によりＦＲＥＴが可能となる。６Ｅ１０−Ａｌｅｘａ４８８及びＩＣ−１６−Ａｌｅｘａ６４７が、偶然にも互いに１０ｎｍ未満の距離で固定化されている２つのＡβモノマーに結合することは、統計学的にかなり考えにくい。キャプチャー抗体と重複するエピトープを有する抗体が検出に使用される場合には、この確率はゼロに低下し得る。試験のために、サイズ排除クロマトグラフィーによりＡβモノマー及びＡβオリゴマーを調製し、上記の通り、ｓＦＩＤＡ測定のために固定化した。次いでＬｅｉｃａ社製蛍光顕微鏡での測定において、蛍光色素を波長４８８ｎｍで励起させ、ＦＲＥＴ発光を波長７０５ｎｍで検出した。対照として、それぞれ蛍光染料が結合した抗体を１つだけ添加した２つのサンプルも測定した。

図６において明らかである通り、この測定では、ＦＲＥＴシグナルはＡβオリゴマーの場合にのみ生じ、Ａβモノマーや対照の場合には生じない。

ＩＶ．アルツハイマーマウスモデルの脳脊髄液中のＡβ凝集体の測定
さらなる試験において、ｓＦＩＤＡがアルツハイマーマウスモデルの脳脊髄液中のＡβ凝集体の検出にも適しているか否か、また、適している場合には、どのような希釈で適しているかを試験した。試験手順に関して、ＡＰＰ／Ｐｓ１マウスの脳脊髄液と、非遺伝子導入対照動物の脳脊髄液を、ＰＢＳバッファーで１：１０、１：５０及び１：２５０に希釈し、ｓＦＩＤＡによるアッセイを行った。

試験手順は上記のものに相応しているが、但しＬｅｉｃａ社製ＬＳＭで測定を行った。遺伝子導入マウスからの２つのサンプルのうち一方において、２５０倍希釈であっても、非遺伝子導入対照動物のサンプルよりも明らかに高いｓＦＩＤＡシグナルが検出可能であることが判明した。１ウェル当たり２５個の面（それぞれ２４６μｍ）を１０２４×４０２４ピクセルで、即ちウェル面の１６％でアッセイを行った。

結果を図７に示す。この結果は、ｓＦＩＤＡがヒトにおける早期診断に適しているだけでなく、例えば臨床研究における治療の有効性のモニタリングにも適していることを示す。

図の説明
図１：
患者のＣＳＦ中のＡβ凝集体の測定。

図２：
図１からの結果とＭＭＳＥとの相関関係。

図３：
Ａβの最初の１１個のアミノ酸に相応するＮ末端に結合するＡβ抗体について１６個のエピトープ（配列：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥ）を有するＡβオリゴマー標準物質の調製。Ａ）ＵＶ／ＶＩＳ分光法により濃度を測定するために２つのトリプトファンを含むトリプルリシンコアに結合した４つのＮ末端Ａβエピトープ１−１１からなる４−ＭＡＰを合成した。Ｂ及びＣ）１６−ＭＡＰを製造するために、それぞれ４つの４−ＭＡＰをストレプトアビジン四量体を介して結合させた。サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＭＡＰ−１６をインキュベーション混合物の他の成分から分離した。

図４：
ＰＢＳバッファーで希釈した種々の濃度でのＭＡＰ−１６のｓＦＩＤＡ測定。ＭＡＰ−１６を含まないＰＢＳバッファーを陰性対照として使用した。Ａ）レーザー走査型顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製 ＬＳＭ ７１０）で測定を行った。Ｂ）ＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）で測定を行った。

図５：
Ａ）ｓＦＩＤＡはＡβモノマーに対して非感受性であるが、Ｂ）Ａβオリゴマーを、濃度に依存して線形的に高感度で検出する。このＡβモノマー及びＡβオリゴマーは、合成Ａβからサイズ排除クロマトグラフィーにより調製し、ＰＢＳバッファーで希釈したものである。

図６：
Ａβモノマー及びＡβオリゴマーに対するＦＲＥＴシグナルでのｓＦＩＤＡ測定。ＰＢＳを陰性対照として使用した。さらなる対照として、それぞれ染料が結合した抗体を１つのみ添加したサンプルのアッセイを行った。ドナー染料はＡβ抗体６Ｅ１０に結合したＡｌｅｘａ ４８８であり、アクセプター染料はＡβ抗体ＩＣ−１６に結合したＡｌｅｘａ ６４７であった。

図７：
遺伝子導入（Ｔｇ）アルツハイマーマウスモデル（ＡＰＰ／ＰＳ１）の脳脊髄液及び非遺伝子導入対照動物（Ｋ）の脳脊髄液中のＡβオリゴマーのｓＦＩＤＡ検出。陰性対照として、純粋なバッファーサンプルを使用した。

Claims (27)

1. Ａβ凝集体の選択的定量化及び／又は特性決定のための方法において、以下の工程：
   ａ）試験すべきサンプルを基体に施与する工程、
   ｂ）Ａβ凝集体への特異的な結合によりこのＡβ凝集体をマークする、検出用に標識されたプローブを添加する工程、及び
   ｃ）マークされたＡβ凝集体を検出する工程
   を含み、ここで、工程ａ）を工程ｂ）の前に行うことができることを特徴とする方法。
2. 工程ａ）の前に、基体上へのキャプチャー分子の固定化を行う、請求項１に記載の方法。
3. サンプルの前処理を行う、請求項１又は２に記載の方法。
4. ガラス製の基体を使用する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
5. 基体が親水性被覆を有している、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
6. 基体がデキストランで被覆されている、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. キャプチャー分子が基体又は被覆と共有結合している、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. キャプチャー分子が蛍光染料で標識されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
9. キャプチャー分子が抗Ａβ抗体である、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
10. 抗Ａβ抗体が、Ａβ凝集体のエピトープに特異的に結合する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
11. Ａβペプチド特異的プローブを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
12. プローブが、蛍光染料で標識された抗Ａβ抗体である、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
13. ２つ以上の異なるプローブを使用する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
14. 異なって標識された蛍光染料を有する２つ以上のプローブを使用する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
15. 少なくとも１つのプローブが、ＡβペプチドのＮ末端エピトープに特異的に結合する抗Ａβ抗体である、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
16. 空間分解性の蛍光顕微鏡法により検出を行う、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
17. 任意に相互相関及び単一粒子イムノソルベントレーザー走査式アッセイ、レーザー走査型顕微鏡法（ＬＳＭ）、Ｗｅｔｆｅｌｄ顕微鏡法、及び/又はＴＩＲＦ顕微鏡法と組み合わせた、共焦点蛍光顕微鏡法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、並びに、相応する超解像改変体ＳＴＥＤ、ＳＩＭ、ＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭにより検出を行う、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
18. 検出の際に、バックグラウンドシグナルに対して単一の凝集体の検出が可能となるような数のデータ点を収集する、請求項１７に記載の方法。
19. 空間的に分解される事象の存在数と同じ数の値を読取る、請求項１８に記載の方法。
20. 測定サンプルとして、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液及び/又は尿を使用する、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法。
21. 内部標準物質又は外部標準物質をＡβ凝集体の定量化に使用する、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法。
22. Ａβ凝集体の定量化のための標準物質が、ポリペプチド配列から構成されたポリマーであって、このポリペプチド配列は、その配列に関して、相応するサブセグメントにおいて、タンパク質凝集性疾患、又はアミロイド変性、又はタンパク質ミスフォールディング疾患を引き起こす生体固有のタンパク質と同一であるか、又は、相応するサブセグメントにわたって、この生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を示し、その際、このポリマーは凝集しない、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
23. 以下の構成要素を１つ以上含む、請求項１から２２までのいずれか１項に記載のＡβ凝集体の選択的定量化のためのキット：
    ・疎水性物質で被覆されているガラス製の基体；
    ・標準物質；
    ・キャプチャー分子；
    ・プローブ；
    ・キャプチャー分子を有する基体；
    ・溶液；
    ・バッファー。
24. ＡＤを治療するための活性物質及び/又は処置の有効性を測定するための方法において、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の方法を実施し、かつ活性物質及び/又は処置を、Ａβ凝集体形成に対するその効果に関して互いに比較し、その際、対照よりも低いＡβ凝集体形成を示す活性物質及び/又は処置を選択することを特徴とする方法。
25. 臨床研究又は臨床試験への個人の受け入れを決定するための方法において、請求項１から２２までのいずれか１項に記載のＡβ凝集体の定量化及び／又は特性決定を行い、かつ測定値を閾値と比較することを特徴とする方法。
26. Ａβ凝集体特異的プローブ。
27. 所定のＡβ凝集体又はＡβオリゴマーへの特異的な結合のための、Ａβ凝集体特異的プローブ又はＡβオリゴマー特異的プローブの使用。

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