JP2015186487A - 拡張されたダイナミックレンジにわたる核酸配列の定量的検出のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】拡張されたダイナミックレンジにわたる核酸配列の定量的検出のための方法および組成物の提供。
【解決手段】単一槽内の単一増幅システムを使用して、等しい比の弁別可能な単位複製配列種を作製するための組成物および方法を開示する。弁別可能な単位複製配列の数およびその互いの比は、増幅反応に必要とされる直線ダイナミックレンジにわたるように、および、生成される単位複製配列の量を決定するために使用される測定システムの限界に対応するように選択される。不均等量の１つ以上の増幅反応成分（例えば、区別可能な増幅オリゴマー、ＮＴＰ混合物内の天然および非天然ＮＴＰ等）を提供することにより、不均等量の弁別可能な単位複製配列種が生成される。試験試料中の標的核酸の量は、検出のダイナミックレンジ内の量を有する１つ以上の単位複製配列種の検出から得られる直線検出範囲を使用して決定される。
【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２００９年７月２１日出願の米国仮特許出願第６１／２２７，３３９号、および２００９年８月３日出願の米国仮特許出願第６１／２３０，９３８号の優先権を主張する。これらの出願は共に、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。

本出願は、試験試料中に存在し得る核酸配列を増幅および検出するための組成物および方法に関し、より具体的には、標的核酸配列が試料中に存在し得る広いダイナミックレンジにわたり核酸配列を増幅および定量的に検出するための組成物および方法に関する。

核酸配列の正確な検出および定量化を可能にする方法は、広範な疾患の診断および処置のための非常に有益なツールである。例えば、病原体の核酸配列の検出および定量化は、診断または予後の情報を提供することができ、またはそれによって医師は治療に対する患者の応答を監視することができる。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＣ型肝炎ウイルス等の伝染病における低レベルのウイルス血の正確な検出は、ウイルス拡散の防止、予後および治療に対する応答の推定、ならびに処置された個人における薬物耐性ウイルスの発生の検出を助ける。また、初期感染レベルを確立するために、治療を受けていない患者における高レベルのウイルス血を正確に測定することも、等しく重要である。

試験試料中に存在し得る標的核酸配列を増幅するための方法が知られており、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば特許文献７および特許文献８）；転写媒介増幅法（ＴＭＡ；例えば、特許文献９、特許文献１０および７，３７４，８８５）；リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ；例えば米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）；鎖置換増幅法（ＳＤＡ；例えば米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号および米国特許第５，６４８，２１１号）；ローリングサークル増幅反応法（ＲＣＡ；例えば米国特許第５，６４８，２４５号および米国特許第５，８５４，０３３号）；ヘリカーゼ依存性増幅反応（ＨＤＡ；例えば米国特許第７，２８２，３２８号および米国特許第７，６６２，５９４号）；ならびに核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ；例えば米国特許第５，１３０，２３８号）等の方法を含む。

試験試料中に存在し得る非増幅または増幅標的核酸配列を検出するための方法もまた知られている。いくつかの検出方法は、標的核酸に関連しない検出剤から標的核酸に関連した検出剤を分離することを必要としない「同成分系」の方法である。そのような方法は、挿入染料の使用（例えば米国特許第５，３１２，９２１号、米国特許第５，８１４，４４７号、米国特許第６，０６３，５７２号、米国特許第６，５４１，２０５号および６，５６９，６２７号）、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ；例えば米国特許第５，２８３，１７４号）、および分子指標プローブの使用（例えば米国特許第５，９２５，５１７号）または分子トーチプローブの使用（例えば米国特許第６，３６１，９４５号）を含む。他の方法は、「異成分系」であり、標的核酸に関連しない検出剤から標的核酸に関連した検出剤を物理的に分離することを必要とする。最も一般的な異成分系の方法の１つは、固体担体上への標的核酸の捕捉、標識化検出プローブのハイブリダイゼーション、および非特異的に結合したプローブを除去するための適切にストリンジェントな条件下での洗浄を含む。次いで、担体への結合を維持した標識（例えば放射性同位体）を測定する。

現在利用可能な増幅技術は、いくつかの用途においては十分な感度を提供し得るが、いくつかの診断および治療現場では、これらの可能な方法から得ることができる感度より高い感度を必要とする。さらに、ある特定の状況下では、核酸配列が高いまたは低い濃度レベルで存在するか否かを決定することが望ましい。したがって、単一の実験において、比較的広いダイナミックレンジにわたり試験試料中の標的核酸を正確に検出および定量化する方法が必要とされている。

被検査物からの対象核酸検体は、慣習的方法により検出され得る濃度より低い濃度で存在し得る。この問題は、多くの場合、検出前に、いくつかの核酸増幅技術（上記参照）を実行することにより回避される。被検査物からの対象核酸検体はまた、非常に少ない数（例えば、１個、７個、２９個等、もしくは非感染被検査物の場合はゼロ個）で、または数百万、数十億もしくはそれ以上に上る範囲の、より多くの数で存在し得る。したがって、定量化には、核酸検体がその初期数を正確に反映するように比例して増幅されることが重要である。核酸増幅法を使用したダイナミックレンジにわたる核酸の再現性のある定量化を達成する試みは困難な取り組みであり、例えば、増幅内部標準、および内部標準の（非常に僅かではあるが）異なる増幅効率の必要性（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０（４）：６３０−６３６（１９９４）；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１（８）：１０６５−１０６７（１９９５）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２１９（２）：４９３−４９８（１９９４）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５（１）：１３４−１３９（１９９３）；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６５（６）：１１１９−１１２３（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（２４）：９７１７−９７２１（１９８９））を含む多くの問題が見られる。これらの問題を解決するために２つの基本的アプローチが使用されており、様々な成功が得られている。

第１の基本的アプローチにおいて、試験試料中に存在する標的核酸配列の濃度は、単位複製配列が経時的に生成される速度に基づき決定される。このアプローチの例は、「リアルタイムＰＣＲ」として知られ、増加する単位複製配列濃度に応じて蛍光特性が変化するプローブを用いて、増加する単位複製配列レベルが測定される。単位複製配列が所定のレベルに達するのに要する時間は、実験的に検出された単位複製配列の結果を、一連の既知量の標的核酸配列を含有する標準からの結果と比較することにより、試料中に存在する標的核酸配列の濃度に関連付けられる。多くの場合、未知濃度の検体からの推定される応答の低端部から高端部までの範囲の、複数の標準が使用され得る。ＰＣＲまたはＬＣＲ等の、反応が周期に分けられる増幅システムにおいては、各周期内に生じる増幅量により精度が制限され、ＰＣＲの場合、その量は理論的には周期毎に２倍の増加である。しかしながら、ＴＭＡまたはＳＤＡ等の、別個の増幅周期を有さない増幅システムにおいては、単位複製配列濃度が非常に短期間で急激に変化し得るため、速度変化を正確に測定するのは困難となり得る。時間および単位複製配列濃度の測定の正確性は、任意の精度で測定結果を初期標的核酸濃度に関連付ける能力に大きく影響する。

第２の基本的アプローチにおいては、増幅反応が固定時間の間実行され、生成される単位複製配列の量が、試験試料中に存在する標的核酸配列の濃度に関連付けられる。そのような方法は、単位複製配列が増幅反応中の複数の点ではなく、反応の終わりの単一点で測定されるため、「エンドポイント」法と呼ばれることがある。これらの方法は、典型的には、ハイブリダイズしたプローブの量が、存在する標的の量と直接関連し、「標的飽和」と呼ばれる過剰の標的に起因する信号の飽和を回避するように、過剰の核酸プローブの使用を必要とする（例えば、米国特許第４，８５１，３３０号）。標的飽和が生じた場合、プローブ信号はプラトーに達し、ダイナミックレンジの上端部が切り捨てられる。大量の単位複製配列が生成される場合、さらに多くのプローブを使用してダイナミックレンジを拡張しなければならず、単位複製配列−プローブハイブリダイゼーション信号は、正確な検出のための検出器の能力を超える可能性がある。さらに、プローブ濃度が増加するにつれてバックグラウンド信号も増大することが多く、これはダイナミックレンジの下端部の検出感度を制限する。プローブの特定の活性の低下を使用して、バックグラウンド信号を低減することができるが、多くの場合、低い標的レベルでの検出感度もまた低下する。したがって、端点検出の最適化は、ダイナミックレンジの一方または両方の端点の正確性を低減し得る。

一般に、知られている増幅システムは、広いダイナミックレンジにわたりに単位複製配列を定量的に生成するように最適化されているが、検出システムは、その同じ広範囲にわたり正確に機能することはできなかった。この制限は、非特異的なバックグラウンド信号を低減し、ダイナミックレンジ全体にわたり単位複製配列を測定するために、プロセスにおいて、単位複製配列の連続希釈または物理的分離ステップ等の追加のステップを必要とする。物理的分離または希釈ステップは、試験手順の複雑性および長さを増加させる。単位複製配列生成物の操作は、試料または増幅反応混合物の２次汚染の危険性を増加させ、これは偽陽性結果をもたらし得る。さらに、単位複製配列の操作は、偽陰性結果を含む、定量化における誤差の可能性を増加させる。理想的には、核酸検出および定量化システムは、測定可能な量の１つ以上の単位複製配列を再現性をもって広いダイナミックレンジにわたり比例的に生成する増幅反応、および同じダイナミックレンジにわたり単位複製配列を定量化することができる検出システムを含むべきである。

ある特定の既知の方法において、核酸ハイブリダイゼーション反応を使用して、ハイブリダイゼーションの速度またはハイブリダイゼーションの程度を、存在する単位複製配列の量に関連付けることにより単位複製配列の量を決定する。しかしながら、ハイブリダイゼーションの反応速度測定は、増幅反応の反応速度測定の同じ欠点の多くをもたらし、したがって好ましくない。

既知の生体外核酸増幅手順のいくつかの変形例において、研究者は、各標的核酸の反応条件を最適化することで１つ以上の標的配列の増幅の効率を個々に調節することにより、拡張されたダイナミックレンジを達成することを試みている。しかしながら、そのような最適化は、一般に複雑で大規模な実験を必要とし、試料間の僅かな差異、反応混合物中の阻害剤の存在、個々の反応混合物中の試験試薬および／もしくはその量の変動、または反応が行われる条件により、再現性のある結果をもたらさない可能性がある。したがって、過度の実験を必要とせず、広いダイナミックレンジを有する安定なシステムを提供する、定量的端点アッセイのダイナミックレンジを拡張する必要性が依然として存在する。

この必要性に対応する組成物および方法は、核酸増幅および拡張されたダイナミックレンジにわたる増幅産物の検出を使用することにより、試料中の所望の標的核酸の定量的測定を可能にする。本明細書に記載の組成物および方法は、従来の定量的核酸増幅および検出方法に関連した問題に対する簡単な解決策を提供する。

米国特許第４，６８３，１９５号明細書 米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第４，９６５，１８８号明細書 米国特許第６，０４０，１６６号明細書 米国特許第６，１９７，５６３号明細書 米国特許第６，５１４，７３６号明細書 米国特許第５，３１０，６５２号明細書 米国特許第５，３２２，７７０号明細書 米国特許第５，３９９，４９１号明細書 米国特許第５，８２４，５１８号明細書

本出願は、単一槽内の単一増幅システムを使用して、等しい比の複数の弁別可能な単位複製配列種を作製するための組成物および方法を提供する。弁別可能な単位複製配列種の数およびその互いの比は、増幅反応に必要とされる直線ダイナミックレンジにわたるように、および、生成されるいずれか１つの単位複製配列の量を決定するために使用される測定システムの限界に対応するように選択される。不均等量の１つ以上の増幅反応成分（例えば、不均等量の区別可能な増幅オリゴマー、ＮＴＰ混合物内の不均等量の天然および非天然ＮＴＰ等）を提供することにより、不均等量の弁別可能な単位複製配列種が生成される。試料中に少量の標的核酸が存在する場合は、直線ダイナミックレンジ内でより豊富な単位複製配列種が検出可能であり、より豊富でない単位複製配列種は、検出閾値を下回る。試料中により多量の標的核酸が存在する場合は、直線ダイナミックレンジ内でより豊富でない単位複製配列種が検出可能となる。ここで、標的量の検出は、２つ以上の単位複製配列種から生成された検出範囲を使用して決定することができる。試料中に存在する標的核酸がより多量である場合、より豊富な単位複製配列種が検出システムを飽和させ得るが、より豊富でない単位複製配列種はまだその直線ダイナミックレンジ内で検出可能である。したがって、２つの単位複製配列に対して、試験試料中に大量の標的核酸が存在する場合、大量の単位複製配列１が生成されるが、少量の単位複製配列２もまた作製される。単位複製配列１の量が検出システムのダイナミックレンジから外れる場合は、単位複製配列２の量はダイナミックレンジ内にあることができ、測定可能である。次いで、単位複製配列２の量から、元の標的核酸配列の量が計算され得る。ダイナミックレンジをさらに拡張するために、追加の単位複製配列を作製することができる（単位複製配列３等）。

本出願は、試料中の標的核酸を検出する方法であって、標的核酸を含有すると思われる試料を提供するステップと、標的核酸から、規定比の少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成するステップであって、単一槽内で実行される生成するステップと、各生成された単位複製配列種の存在および量を検出するステップであって、第１の単位複製配列種は、標的核酸の試料中の第２の濃度に対する標的核酸の試料中の第１の濃度を表す第１の直線範囲において検出可能であり、第２の単位複製配列種は、標的核酸の試料中の第４の濃度に対する標的核酸の試料中の第３の濃度を表す第２の直線範囲において検出可能であり、前記第１および第２の直線範囲が重複して、標的核酸の試料中の存在および量を決定するための拡張されたダイナミックレンジを提供するように、第１の濃度は第３の濃度より低く、第３の濃度は第２の濃度より低く、第２の濃度は第４の濃度より低く、単一槽内で実行される検出するステップと、を含む方法を提供する。好ましくは、増幅するステップにおいて使用される単一ウェルおよび槽内で使用される単一槽は、同じ槽である。したがって、増幅および検出反応は、同じ槽内で生じる。

方法のいくつかの態様において、第３の弁別可能な単位複製配列種が生成される。第３の弁別可能な単位複製配列種は、第１および第２の直線範囲とは異なる第３の直線範囲を提供し、それにより、標的核酸の試料中の存在および量を決定するためのダイナミックレンジをさらに拡張する。いくつかの態様において、第３の単位複製配列は、標的核酸の試料中の第６の濃度に対する標的核酸の試料中の第５の濃度を表す直線範囲において検出可能であり、第１、第２および第３の直線範囲が重複して、前記標的核酸の前記試料中の存在および量を決定するための拡張されたダイナミックレンジを提供するように、第１の濃度は第３の濃度より低く、第３の濃度は第２の濃度より低く、第２の濃度は第５の濃度より低く、第５の濃度は第４の濃度より低く、第４の濃度は第６の濃度より低い。いくつかの態様において、ｎ個の弁別可能な単位複製配列種が生成され、ｎ個の重複直線範囲を提供して拡張されたダイナミックレンジを提供し、ｎは正の自然数に等しい。

方法のいくつかの態様において、少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種は、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一の増幅オリゴマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用して生成され、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、等しい量で提供される。いくつかの態様において、単一の増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、単一の増幅オリゴマーは、プロモーター供与物である。いくつかの態様において、単一の増幅オリゴマーは、プロモータープライマーである。いくつかの態様において、単一の増幅オリゴマーは、プライマーである。いくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモータープライマーである。いくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーター供与物である。いくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種は、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一のプロモーターベースの増幅オリゴマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つのプライマーを使用して生成される。方法のいくつかの態様において、単一のプロモーターベースの増幅オリゴマーは、プロモーター供与物である。方法のいくつかの態様において、単一のプロモーターベースの増幅オリゴマーは、プロモータープライマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種は、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一のプライマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つのプロモーターベースの増幅オリゴマーを使用して生成される。方法のいくつかの態様において、少なくとも２つのプロモーターベースの増幅オリゴマーは、プロモーター供与物である。方法のいくつかの態様において、少なくとも２つのプロモーターベースの増幅オリゴマーは、プロモータープライマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種は、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一のプライマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つのプライマーを使用して生成される。

少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種が、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一の増幅オリゴマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする不均等量の少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用して生成される、方法のいくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、前記標的核酸の異なる配列にハイブリダイズし、それにより、標的核酸から、規定比の長さの異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーがハイブリダイズする標的核酸の異なる配列は、非重複配列である。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーがハイブリダイズする標的核酸の異なる配列は、重複配列である。

少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種が、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一の増幅オリゴマー、および標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする不均等量の少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用して生成される、方法のいくつかの態様において、標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、異なる核酸配列を有し、それにより、規定比の核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、ヌクレオチド配列が実質的に同一であるが、ただし、１つの増幅オリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチ、少なくとも１つのヌクレオチド挿入、少なくとも１つのヌクレオチド欠失およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を有し、それにより、前記標的核酸から、規定比の核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する点を除く。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、それぞれ少なくとも１つの挿入を含有し、少なくとも２つの増幅オリゴマーのうちの１つにおける少なくとも１つの挿入は、他の少なくとも１つの増幅オリゴマーの少なくとも１つの挿入とは異なる。いくつかの態様において、少なくとも１つの増幅オリゴマーのそれぞれは、少なくとも１つの核酸塩基の長さであり、増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ領域の５’末端に結合する、一意のハイブリダイズされていないヌクレオチド配列を含む。

方法のいくつかの態様において、２つの弁別可能な単位複製配列種は、増幅方法を使用して生成され、前記増幅方法は、ＲＮＡ単位複製配列種およびＤＮＡ単位複製配列種を生成して、リボース糖組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列を提供する。いくつかの態様において、増幅方法は、少なくとも１つのプロモーターベースの増幅オリゴマーを使用して、ＤＮＡ単位複製配列種の量よりも多いＲＮＡ単位複製配列種を生成する、等温増幅法である。

方法のいくつかの態様において、２つの弁別可能な単位複製配列種は、ｄＮＴＰ混合物を使用して生成され、前記混合物中の前記ｄＮＴＰ種の少なくとも１つは、天然型および類似体型の両方で、一方の型が他方の型より過剰に提供され、核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列を提供する。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ混合物は、天然ｄＡＴＰおよびｄＡＴＰの類似体を含有する。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ混合物は、天然ｄＣＴＰおよびｄＣＴＰの類似体を含有する。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ混合物は、天然ｄＴＴＰおよびｄＴＴＰの類似体を含有する。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ混合物は、天然ｄＧＴＰおよびｄＧＴＰの類似体を含有する。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ混合物は、天然ｄＵＴＰおよびｄＵＴＰの類似体を含有する。

いくつかの態様において、増幅ステップは、等温増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、循環増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、ＴＭＡ増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、ＮＡＳＢＡ増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、ＰＣＲ増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、リアルタイム増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、ローリングサークル増幅反応法により行われる。いくつかの態様において、増幅ステップは、ヘリカーゼ依存性増幅反応法により行われる。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することと、を含み、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つのプライマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる方法を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を定量化するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することであって、生成される単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、供することと、（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、検出範囲内で検出可能であり、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、少なくとも２つのプローブのそれぞれに対する検出範囲の和は、各プローブに対する検出範囲よりも大きく、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、ハイブリダイズすることと、（ｄ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、（ｅ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、試験試料中の核酸を定量化するための方法であって、（ａ）量Ｔ_１の標的核酸を含有すると思われる試験試料を提供することと、（ｂ）試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各プライマーは、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各プライマーは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、を含む方法を提供する。一態様において、各Ｐ_ｘは、少なくとも２桁異なり、ｘは、１から混合物中のプライマーの数の間の整数である。（ｃ）少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、混合物中に存在するプライマーに対する各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘは、少なくとも２桁異なる。（ｄ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズし、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成し、（ｅ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出し、（ｆ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本発明は、さらに、少なくとも２つのプライマーを含む、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物であって、（ａ）少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在し、（ｂ）増幅条件下で、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つのプライマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なり、単位複製配列は、広いダイナミックレンジにわたり検出可能である組成物を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物であって、（ａ）少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各プライマーは、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各プライマーは、異なる量Ｐ_ｘで反応混合物中に存在し、ｘは、１から混合物中のプライマーの数の間の整数であり、（ｂ）増幅条件下で、各プライマーは、標的核酸配列から少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、少なくとも２つのプライマーの各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる、核酸増幅反応混合物を提供する。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘの差異は、少なくとも２桁である。（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列は、少なくとも２つのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出可能であり、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する。

いくつかの態様において、少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することと、を含み、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる方法を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を定量化するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することであって、生成される単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、供することと、（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、検出範囲内で検出可能であり、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、少なくとも２つのプローブのそれぞれに対する検出範囲の和は、各プローブに対する検出範囲よりも大きく、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、ハイブリダイズすることと、（ｄ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、（ｅ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む方法を提供する。

一態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、試験試料中の核酸を定量化するための方法であって、（ａ）量Ｔ_１の標的核酸を含有すると思われる試験試料を提供することと、（ｂ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各増幅オリゴマーは、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各増幅オリゴマーは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、を含む方法を提供する。一態様において、各Ｐ_ｘは、少なくとも２桁異なり、ｘは、１から混合物中の増幅オリゴマーの数の間の整数である。（ｃ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、混合物中に存在する標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーに対する各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘは、少なくとも２桁異なる。（ｄ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズし、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成し、（ｅ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出し、（ｆ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物であって、（ａ）少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在し、（ｂ）増幅条件下で、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なり、単位複製配列は、広いダイナミックレンジにわたり検出可能である組成物を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物であって、（ａ）少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各増幅オリゴマーは、鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各プライマーは、異なる量Ｐ_ｘで反応混合物中に存在し、ｘは、１から混合物中のプライマーの数の間の整数であり、（ｂ）増幅条件下で、各プライマーは、標的核酸配列から少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーの各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる、核酸増幅反応混合物を提供する。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘの差異は、少なくとも２桁であり、（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列は、少なくとも２つのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出可能であり、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、さらに、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なり、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することと、を含み、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる方法を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。

本出願は、試験試料中の標的核酸配列を定量化するための方法であって、（ａ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なり、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、（ｂ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供することであって、生成される単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、供することと、（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、検出範囲内で検出可能であり、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、少なくとも２つのプローブのそれぞれに対する検出範囲の和は、各プローブに対する検出範囲よりも大きく、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、ハイブリダイズすることと、（ｄ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、（ｅ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む方法を提供する。

一態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。

本出願は、さらに、試験試料中の核酸を定量化するための方法であって、（ａ）量Ｔ_１の標的核酸を含有すると思われる試験試料を提供することと、（ｂ）試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なり、各増幅オリゴマーは、異なる量で反応混合物中に存在する、接触させることと、を含む方法を提供する。一態様において、各Ｐ_ｘは、少なくとも２桁異なり、ｘは、１から混合物中の増幅オリゴマーの数の間の整数である。（ｃ）少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、反応混合物を供し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、混合物中に存在する標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーに対する各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘは、少なくとも２桁異なる。（ｄ）少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズし、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成し、（ｅ）少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出し、（ｆ）試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。

本出願は、さらに、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物であって、（ａ）少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なり、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在し、（ｂ）増幅条件下で、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、生成される各単位複製配列の複製の数は、反応混合物中の少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なり、単位複製配列は、広いダイナミックレンジにわたり検出可能である組成物を提供する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。

本出願は、さらに、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物であって、（ａ）少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なり、各プライマーは、異なる量Ｐ_ｘで反応混合物中に存在し、ｘは、１から混合物中のプライマーの数の間の整数であり、（ｂ）増幅条件下で、各プライマーは、標的核酸配列から少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、各単位複製配列に対して、複製の数Ａ_ｘが生成され、各Ａ_ｘは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーの各Ｐ_ｘの差異の量と大体同じ量異なる、核酸増幅反応混合物を提供する。一態様において、各単位複製配列に対するＡ_ｘの差異は、少なくとも２桁である。（ｃ）少なくとも２つの単位複製配列は、少なくとも２つのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出可能であり、少なくとも２つのプローブのそれぞれは、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、各プローブは、直線検出範囲Ｃ_ｘ（ａ）〜Ｃ_ｘ（ｂ）内で検出可能であり、プローブｘに対して、Ｃ_ｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃ_ｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}は、Ｃ_ｘ（ａ）よりも大きく、Ｃ_{ｘ＋１（ｂ）}は、Ｃ_ｘ（ｂ）よりも大きく、各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａ_ｘは、Ｃ_ｘ（ａ）からＣ_ｘ（ｂ）の間であり、少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する。

いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、プライマーである。

本出願は、さらに、少なくとも３つの増幅オリゴマーを含む反応混合物であって、２つ以上の弁別可能な単位複製配列を生成するために、増幅オリゴマーのうちの１つが標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズし、増幅オリゴマーの第２および第３は標的核酸の他の鎖にハイブリダイズする、反応混合物を提供する。弁別可能な単位複製配列の各種は、共通の第１の増幅オリゴマーにより、一端上に画定される。同じ鎖にハイブリダイズする２つの増幅オリゴマーは、その各単位複製配列種の反対の端部を画定する。いくつかの態様において、少なくとも３つの増幅オリゴマーは、少なくとも３つのプライマーである。いくつかの態様において、少なくとも３つの増幅オリゴマーは、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズするプライマー、および標的核酸の他の鎖にハイブリダイズする２つのプロモーターベースの増幅オリゴマーである。いくつかの態様において、少なくとも３つの増幅オリゴマーは、標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズするプロモーターベースの増幅オリゴマー、および標的核酸の他の鎖にハイブリダイズする２つのプライマーである。いくつかの態様において、標的核酸の同じ鎖にハイブリダイズする増幅オリゴマーの第２および第３は、標的核酸上の異なる配列にハイブリダイズすることにより異なる。いくつかの態様において、標的核酸の同じ鎖にハイブリダイズする増幅オリゴマーの第２および第３は、（ｉ）増幅オリゴマーの一方は改質された標的ハイブリダイズ配列を有し、他方は有さない点、および／または（ｉｉ）増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる一意の不対５’配列を有する点の１つ以上を有することにより、互いに異なる。

本出願は、さらに、少なくとも３つの増幅オリゴマーを使用して生成された２つ以上の弁別可能な単位複製配列のうちの１つにそれぞれハイブリダイズする、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む反応混合物であって、増幅オリゴマーのうちの１つが標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズし、増幅オリゴマーの第２および第３は標的核酸の他の鎖にハイブリダイズする、反応混合物を提供する。いくつかの態様において、検出可能プローブオリゴマーは、異なる化学発光標識で標識化される。いくつかの態様において、検出可能プローブオリゴマーは、異なる蛍光標識で標識化される。いくつかの態様において、検出可能プローブオリゴマーは、異なる蛍光標識および／または異なる化学発光標識で標識化される。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
試験試料中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
（ａ）上記試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、上記少なくとも２つのプライマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、上記接触させることと、
（ｂ）上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、上記標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することと、を含み、
生成される各単位複製配列の複製の数は、上記反応混合物中の上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記方法。
（項目２）
上記少なくとも２つのプライマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目１に記載の方法。
（項目５）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目１に記載の方法。
（項目６）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目１に記載の方法。
（項目７）
試験試料中の標的核酸配列を定量化するための方法であって、
（ａ）上記試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、上記少なくとも２つのプライマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、上記接触させることと、
（ｂ）上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することであって、生成される単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記供することと、
（ｃ）上記少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲内で検出可能であり、
上記少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、上記少なくとも２つのプローブのそれぞれに対する検出範囲の和は、各プローブに対する検出範囲よりも大きく、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記ハイブリダイズすることと、
（ｄ）上記少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、
（ｅ）上記試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む、上記方法。
（項目８）
上記少なくとも２つのプライマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目７に記載の方法。
（項目１１）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目７に記載の方法。
（項目１２）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目７に記載の方法。
（項目１３）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目７に記載の方法。
（項目１４）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目７に記載の方法。
（項目１５）
上記ダイナミックレンジは、約１０３から１０７までである、項目７に記載の方法。
（項目１６）
上記ダイナミックレンジは、約１０４から１０６までである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
試験試料中の核酸を定量化するための方法であって、
（ａ）量Ｔ１の標的核酸を含有すると思われる試験試料を提供することと、
（ｂ）上記試験試料を、少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、
上記少なくとも２つのプライマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各プライマーは、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、
各プライマーは、異なる量Ｐｘで上記反応混合物中に存在し、
各Ｐｘは、少なくとも２桁異なり、
ｘは、１から上記混合物中のプライマーの数の間の整数である、上記接触させることと、
（ｃ）上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することであって、
各単位複製配列に対して、複製の数Ａｘが生成され、
各Ａｘは、少なくとも２桁異なる、上記供することと、
（ｄ）上記少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲Ｃｘ（ａ）〜Ｃｘ（ｂ）内で検出可能であり、
プローブｘに対して、Ｃｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、
各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃｘ＋１（ａ）は、Ｃｘ（ａ）よりも大きく、Ｃｘ＋１（ｂ）は、Ｃｘ（ｂ）よりも大きく、
各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａｘは、Ｃｘ（ａ）からＣｘ（ｂ）の間であり、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記ハイブリダイズすることと、
（ｅ）上記少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、
（ｆ）上記試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む、上記方法。
（項目１８）
上記少なくとも２つのプライマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目１７に記載の方法。
（項目２５）
上記ダイナミックレンジは、約１０３から１０７までである、項目１７に記載の方法。
（項目２６）
上記ダイナミックレンジは、約１０４から１０６までである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
少なくとも２つのプライマーを含む、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物であって、
（ａ）上記少なくとも２つのプライマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在し、
（ｂ）増幅条件下で、上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれは、上記標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、
生成される各単位複製配列の複製の数は、上記反応混合物中の上記少なくとも２つのプライマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記組成物。
（項目２８）
上記少なくとも２つのプライマーは、第２７のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目２７に記載の組成物。
（項目３１）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
少なくとも２つのプライマーを含む核酸増幅反応混合物であって、
（ａ）上記少なくとも２つのプライマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各プライマーは、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各プライマーは、異なる量Ｐｘで上記反応混合物中に存在し、
ｘは、１から上記混合物中のプライマーの数の間の整数であり、
（ｂ）増幅条件下で、各プライマーは、上記標的核酸配列から少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、
各単位複製配列に対して、複製の数Ａｘが生成され、
各Ａｘは、少なくとも２桁異なり、
（ｃ）上記少なくとも２つの単位複製配列は、少なくとも２つのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出可能であり、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲Ｃｘ（ａ）〜Ｃｘ（ｂ）内で検出可能であり、
プローブｘに対して、Ｃｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、
各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃｘ＋１（ａ）は、Ｃｘ（ａ）よりも大きく、Ｃｘ＋１（ｂ）は、Ｃｘ（ｂ）よりも大きく、
各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａｘは、Ｃｘ（ａ）からＣｘ（ｂ）の間であり、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記核酸増幅反応混合物。
（項目３４）
上記少なくとも２つのプライマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
上記ダイナミックレンジは、約１０３から１０７までである、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
上記ダイナミックレンジは、約１０４から１０６までである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
試料中の標的核酸を検出する方法であって、
ａ．標的核酸を含有すると思われる試料を提供するステップと、
ｂ．上記標的核酸から、所定の比の少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成するステップであって、単一槽内で実行される上記生成するステップと、
ｃ．各生成された単位複製配列種の存在および量を検出するステップであって、第１の単位複製配列種は、標的核酸の上記試料中の第２の濃度に対する標的核酸の上記試料中の第１の濃度を表す第１の直線範囲において検出可能であり、第２の単位複製配列種は、標的核酸の上記試料中の第４の濃度に対する標的核酸の上記試料中の第３の濃度を表す第２の直線範囲において検出可能であり、上記第１および第２の直線範囲が重複して、上記標的核酸の上記試料中の上記存在および量を決定するための拡張されたダイナミックレンジを提供するように、上記第１の濃度＜上記第３の濃度＜上記第２の濃度＜上記第４の濃度であり、単一槽内で実行される上記検出するステップと、を含む方法。
（項目４４）
第３の弁別可能な単位複製配列種が生成される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記第３の単位複製配列は、標的核酸の上記試料中の第６の濃度に対する標的核酸の上記試料中の第５の濃度を表す直線範囲において検出可能である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記第１、第２および第３の直線範囲が重複して、上記標的核酸の上記試料中の上記存在および量を決定するための拡張されたダイナミックレンジを提供するように、上記第１の濃度＜上記第３の濃度＜上記第２の濃度＜上記第５の濃度＜上記第４の濃度＜上記第６の濃度である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種は、上記標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズする単一の増幅オリゴマー、および上記標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用して生成され、上記標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、少なくとも１桁異なる量で提供される、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
上記標的核酸の上記相補鎖にハイブリダイズする上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、上記標的核酸の異なる配列にハイブリダイズし、それにより、上記標的核酸から、規定比の長さの異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記標的核酸の上記相補鎖にハイブリダイズする上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、異なる拡散配列を有し、それにより、上記標的核酸から、規定比の核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
上記標的核酸の上記相補鎖にハイブリダイズする上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、上記標的核酸の同じ配列にハイブリダイズし、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチ、少なくとも１つのヌクレオチド挿入、少なくとも１つのヌクレオチド欠失およびこれらの組み合わせからなる群から選択される異なる拡散配列を有し、それにより、上記標的核酸から、規定比の核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列種を生成する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記２つの弁別可能な単位複製配列種は、増幅方法を使用して生成され、上記増幅方法は、ＲＮＡ単位複製配列種およびＤＮＡ単位複製配列種を生成して、リボース糖組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列を提供する、項目４３に記載の方法。
（項目５２）
上記増幅方法は、少なくとも１つのプロモーターベースの増幅オリゴマーを使用して、ＤＮＡ単位複製配列種の量よりも多いＲＮＡ単位複製配列種を提供する、等温増幅法である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記２つの弁別可能な単位複製配列種は、ｄＮＴＰ混合物を使用して生成され、上記混合物中の上記ｄＮＴＰ種の少なくとも１つは、天然型および類似体型の両方で、一方の型が他方の型より過剰に提供され、核酸組成の異なる少なくとも２つの弁別可能な単位複製配列を提供する、項目４３に記載の方法。
（項目５４）
ステップｂを実行するための上記単一槽およびステップｃを実行するための上記単一槽は、同じ槽である、項目４３に記載の方法。
（項目５５）
上記増幅ステップは、等温増幅反応法、循環増幅法、ＴＭＡ増幅反応法、ＮＡＳＢＡ増幅反応法、ＰＣＲ増幅反応法、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅反応法、リアルタイム増幅反応法、ローリングサークル増幅反応法、およびヘリカーゼ依存性増幅反応法からなる群から選択される増幅法である、項目４３に記載の方法。
（項目５６）
試験試料中の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
（ａ）上記試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、上記接触させることと、
（ｂ）上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、上記標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することと、を含み、
生成される各単位複製配列の複製の数は、上記反応混合物中の上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記方法。
（項目５７）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
上記反応混合物は、上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーとは反対の方向に機能するプライマーをさらに含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーは、共にプロモータープライマーであるか、または共にプロモーター供与物である、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目５６に記載の方法。
（項目６３）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目５６に記載の方法。
（項目６４）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目５６に記載の方法。
（項目６５）
試験試料中の標的核酸配列を定量化するための方法であって、
（ａ）上記試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在する、上記接触させることと、
（ｂ）上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することであって、生成される単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記供することと、
（ｃ）上記少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲内で検出可能であり、
上記少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、上記少なくとも２つのプローブのそれぞれに対する検出範囲の和は、各プローブに対する検出範囲よりも大きく、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記ハイブリダイズすることと、
（ｄ）上記少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、
（ｅ）上記試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む、上記方法。
（項目６６）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目６５に記載の方法。
（項目６９）
上記反応混合物は、上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーとは反対の方向に機能するプライマーをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーは、共にプロモータープライマーであるか、または共にプロモーター供与物である、項目６８に記載の方法。
（項目７１）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目６５に記載の方法。
（項目７２）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目６５に記載の方法。
（項目７３）
少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目６５に記載の方法。
（項目７４）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目６５に記載の方法。
（項目７５）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目６５に記載の方法。
（項目７６）
上記ダイナミックレンジは、約１０３から１０７までである、項目６５に記載の方法。
（項目７７）
上記ダイナミックレンジは、約１０４から１０６までである、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
試験試料中の核酸を定量化するための方法であって、
（ａ）量Ｔ１の標的核酸を含有すると思われる試験試料を提供することと、
（ｂ）上記試験試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物に接触させることであって、
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、上記標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各増幅オリゴマーは、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、
各増幅オリゴマーは、異なる量Ｐｘで上記反応混合物中に存在し、
各Ｐｘは、少なくとも２桁異なり、
ｘは、１から上記混合物中のプライマーの数の間の整数である、上記接触させることと、
（ｃ）上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれが、少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成する増幅条件に、上記反応混合物を供することであって、各単位複製配列に対して、複製の数Ａｘが生成され、
各Ａｘは、少なくとも２桁異なる、上記供することと、
（ｄ）上記少なくとも２つの単位複製配列を、少なくとも２つのプローブとハイブリダイズすることであって、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲Ｃｘ（ａ）〜Ｃｘ（ｂ）内で検出可能であり、
プローブｘに対して、Ｃｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃｘ＋１（ａ）は、Ｃｘ（ａ）よりも大きく、Ｃｘ＋１（ｂ）は、Ｃｘ（ｂ）よりも大きく、
各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａｘは、Ｃｘ（ａ）からＣｘ（ｂ）の間であり、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記ハイブリダイズすることと、
（ｅ）上記少なくとも２つのプローブの少なくとも１つを検出することと、
（ｆ）上記試験試料中の標的核酸配列の初期量を決定することと、を含む、上記方法。
（項目７９）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目７９に記載の方法。（項目８１）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
上記反応混合物は、上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーとは反対の方向に機能するプライマーをさらに含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーは、共にプロモータープライマーであるか、または共にプロモーター供与物である、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも３桁異なる、項目７８に記載の方法。
（項目８５）
生成される各単位複製配列の上記複製の数は、少なくとも４桁異なる、項目７８に記載の方法。
（項目８６）
各プライマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目７８に記載の方法。
（項目８７）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目７８に記載の方法。
（項目８８）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目７８に記載の方法。
（項目８９）
上記ダイナミックレンジは、約１０３から１０７までである、項目７８に記載の方法。
（項目９０）
上記ダイナミックレンジは、約１０４から１０６までである、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、試験試料中の標的核酸配列を増幅するための組成物であって、
（ａ）上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、異なる量で反応混合物中に存在し、
（ｂ）増幅条件下で、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれは、上記標的核酸配列から２つの区別可能な各単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、生成される各単位複製配列の複製の数は、上記反応混合物中の上記少なくとも２つの増幅オリゴマーのそれぞれの量に依存し、生成される各単位複製配列の複製の数は、少なくとも２桁異なる、上記組成物。
（項目９２）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目９２に記載の組成物。
（項目９４）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目９１に記載の組成物。
（項目９５）
上記反応混合物は、上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーとは反対の方向に機能するプライマーをさらに含む、項目９４に記載の組成物。
（項目９６）
上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーは、共にプロモータープライマーであるか、または共にプロモーター供与物である、項目９４に記載の組成物。
（項目９７）
各増幅オリゴマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目９１に記載の組成物。
（項目９８）
少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む核酸増幅反応混合物であって、
（ａ）上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列の同じ鎖にハイブリダイズするが、各プライマーは、上記鎖上の異なるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、各増幅オリゴマーは、異なる量Ｐｘで上記反応混合物中に存在し、
ｘは、１から上記混合物中の増幅オリゴマーの数の間の整数であり、
（ｂ）増幅条件下で、各増幅オリゴマーは、上記標的核酸配列から少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つを同時および独立して生成し、
各単位複製配列に対して、複製の数Ａｘが生成され、
各Ａｘは、少なくとも２桁異なり、
（ｃ）上記少なくとも２つの単位複製配列は、少なくとも２つのプローブとのハイブリダイゼーションにより検出可能であり、
上記少なくとも２つのプローブのそれぞれは、上記少なくとも２つの単位複製配列のうちの１つに特異的であり、
各プローブは、検出範囲Ｃｘ（ａ）〜Ｃｘ（ｂ）内で検出可能であり、
プローブｘに対して、Ｃｘ（ａ）は、単位複製配列の複製の最低検出可能数であり、Ｃｘ（ｂ）は、単位複製配列の複製の最高検出可能数であり、
各プローブに対して、少なくとも２つのプローブが一緒になって、広いダイナミックレンジにわたり検出可能となるように、Ｃｘ＋１（ａ）は、Ｃｘ（ａ）よりも大きく、Ｃｘ＋１（ｂ）は、Ｃｘ（ｂ）よりも大きく、
各単位複製配列−プローブの組み合わせに対して、Ａｘは、Ｃｘ（ａ）からＣｘ（ｂ）の間であり、
上記少なくとも２つのプローブは、区別可能な検出信号を生成する、上記核酸増幅反応混合物。
（項目９９）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目９８に記載の反応混合物。
（項目１００）
上記反応混合物は、上記第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーとは反対の方向に機能するプロモータープライマーをさらに含む、項目９９に記載の反応混合物。
（項目１０１）
上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーを含み、上記少なくとも２つの単位複製配列は、上記第１のインナープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第１の単位複製配列および上記第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーから生成される第２の単位複製配列を含み、上記第１の単位複製配列は、上記第２の単位複製配列より短い、項目９８に記載の反応混合物。
（項目１０２）
上記反応混合物は、上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーとは反対の方向に機能するプライマーをさらに含む、項目１０１に記載の反応混合物。
（項目１０３）
上記第１のインナープロモーターベースおよび第２のアウタープロモーターベースの増幅オリゴマーは、共にプロモータープライマーであるか、または共にプロモーター供与物である、項目１０１に記載の反応混合物。
（項目１０４）
各増幅オリゴマーの上記量は、少なくとも２桁異なる、項目９８に記載の反応混合物。
（項目１０５）
上記少なくとも２つのプローブは、アクリジニウムエステルプローブである、項目９８
に記載の反応混合物。
（項目１０６）
上記少なくとも２つのプローブは、ＨＩＣＳプローブである、項目９８に記載の反応混合物。

実施例１に記載の生体外増幅反応の成分を示す図である。図１Ａは、標的ＲＮＡ転写産物（配列番号４）に対する、プロモータープライマー（Ｐｒ−プライマー；配列番号１）、プライマー１（配列番号２）、およびプライマー２（配列番号３）の場所を示す（実施例の「増幅組成物」の項に記載されている）。図１Ｂは、それぞれ（ａ）Ｐｒ−プライマーとプライマー１および（ｂ）Ｐｒ−プライマーとプライマー２の反応から得られる、より短い単位複製配列（配列番号９）およびより長い単位複製配列（配列番号１０）、ならびに、図１Ａにおける配列に対する２つの単位複製配列の場所を示す。図１Ｃは、図１Ｂの単位複製配列に対する、配列番号５および６の標識化検出プローブの位置を示す（実施例の「検出組成物」の項に記載されている）。 実施例１に記載のような、１０^２〜１０^９ 入力標的ＲＮＡ複製（ｘ軸）にわたる、標的ＲＮＡの単位複製配列にハイブリダイズした直線ＡＥ標識化プローブを使用して検出されたバックグラウンド除去後の比活性度調節した平均信号出力（ｙ軸、約１０^４〜約１０^９ＲＬＵ（「相対発光強度」）で報告される）を示すグラフである。結果は、（ａ）非標識化オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ；配列番号５）と混合した標識化プローブ（１ｎＭ；配列番号５）（黒丸）；（ｂ）非標識化オリゴヌクレオチド（２００ｎＭ；配列番号６）と混合した標識化プローブ（１ｎＭ；配列番号６）（黒四角）；ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）からの検出信号の合計（白三角）に対して示されている。 １０^２〜１０^９入力標的ＲＮＡ複製（ｘ軸）にわたる、標的ＲＮＡの単位複製配列にハイブリダイズした直線ＡＥ標識化プローブを使用して検出されたバックグラウンド除去後の比活性度調節した平均信号出力（ｙ軸、約１０^４〜約１０^１１ＲＬＵで報告される）を示すグラフである。この図において、実施例１で配列番号６の標識化および非標識化プローブの反応に対して得られた値に、４６．６の係数「ｋ」を乗じ（結果は黒四角として示される）、これらの結果と、配列番号５の標識化および非標識化プローブの反応から得られた結果（黒丸）とを目視比較することができるようにしている。２組の検出信号の和（白三角）は、反応系が、少なくとも１０^３〜１０^９入力複製の連続的な直線ダイナミックレンジを形成することを実証している。 実施例２、３および５において使用された、ＲＮＡ転写産物に対するプライマーの相対的配置、得られた単位複製配列、および単位複製配列に対するプローブの相対的配置を示す図である。図１のように、図４Ａは、標的ＲＮＡ転写産物（配列番号４）に対するプロモータープライマー（Ｐｒ−プライマー；配列番号１）、プライマー１（配列番号２）、およびプライマー２（配列番号３）の場所を示し、図４Ｂは、（ａ）Ｐｒ−プライマーとプライマー１および（ｂ）Ｐｒ−プライマーとプライマー２の反応から得られる２つの単位複製配列（配列番号９および１０）、ならびに図４Ａにおける配列に対する２つの単位複製配列の場所を示す。図４Ｃは、図４Ｂの単位複製配列に対する、標識化および非標識化検出プローブ配列番号７および８の位置を示す（実施例の「検出組成物」の項に記載されている）。 （ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（黒丸）ならびに（ｂ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（白丸）に対する、実施例２において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ１（短波長）ＲＬＵ出力を示すグラフである。 実施例２において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ２（長波長）ＲＬＵ出力を示すグラフである。結果は、（ａ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（黒三角）ならびに（ｂ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブおよび配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（白三角）に対して示されている。 実施例２において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ１ＲＬＵ（白丸）、ならびに（ｂ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ２ＲＬＵ（白三角）である。 実施例３において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ１ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（黒丸）ならびに（ｂ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（白三角）に対するものである。 実施例３において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ２ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（黒三角）ならびに（ｂ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブおよび配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（白三角）からのものである。 実施例３において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ１ＲＬＵ（白丸）、ならびに（ｂ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブおよび配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ２ＲＬＵ（白三角）である。 実施例５において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ１ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（黒丸）ならびに（ｂ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（白丸）である。 実施例５において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＰＭＴ２ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブ（黒三角）ならびに（ｂ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブおよび配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブ（白三角）である。 実施例５において得られるような指定範囲の複製入力での、自己消光ＡＥプローブとＲＮＡ転写産物の単位複製配列との反応からの、バックグラウンド除去後の平均ＲＬＵ出力を示すグラフである。示されている結果は、（ａ）配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブおよび配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ１ＲＬＵ（白丸）、ならびに（ｂ）配列番号８の１００ｎＭ標識化プローブおよび配列番号７の１０ｎＭ標識化プローブのＰＭＴ２ＲＬＵ（白三角）である。

本明細書で使用される場合、「含む」、「含有する」および「備える」という用語は、非排他的な限定されない意味で使用される。

本明細書で使用される場合、「１つ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。

本明細書で使用される任意の量的表現において、量は、実際の値を指すように意図すると共に、所与の値の実験および／または測定条件に起因する近似値を含む、当業者により推測される値の近似値を指すように意図することが理解される。この推測は、量と共に「約」という用語が明示的に使用されているか否かに関係なく意図される。

本方法および組成物のための標的核酸は、二本鎖および一本鎖標的を含む。標的核酸は、完全長配列またはその断片であってもよく、またＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。その最も広い使用において、標的核酸という用語は、生物学的試料およびその増幅された複製に存在する核酸を指す。増幅された複製は、本明細書において、「増幅された複製」、「増幅された鎖」、「ｃＤＮＡ」、「合成相補配列」、「ＲＮＡ転写産物」、または参照される鎖が生物学的試料からのものではないことを示す他の同様の用語で呼ばれる可能性がある。本方法において、試験試料中の標的核酸は、０から約１０^１２複製の範囲の量で検出および定量化され得る。

「ダイナミックレンジ」という用語は、本明細書で使用される場合、検出され得る標的核酸の最低濃度と最高濃度または最小複製数と最大複製数との間の比を指す。そのような場合において、ダイナミックレンジは、いかなる指定単位も有さずに使用される。いくつかの状況において、「ダイナミックレンジ」は、検出の限界値（例えば、検出の上限および下限）を指すように使用され、その場合、適切な単位量、例えばμＭまたは複製等が指定される。本発明における「広い」または「ブロードな」ダイナミックレンジは、検出可能な複製数の場合約１０^２から１０^１０であり、または、比の場合１０^３から１０^７の範囲であってもよい。例えば、本発明による検出方法は、約１０^３から１０^１０入力標的核酸複製の範囲（約１０^７のダイナミックレンジ）の量、約１０^４から１０^１０入力配列複製の範囲（１０^６のダイナミックレンジ）の量、１０^３から１０^９入力配列複製の範囲（１０^６のダイナミックレンジ）の量、または１０^６から１０^１０入力配列複製の範囲（１０^４のダイナミックレンジ）の量を正確に検出することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、約１０^３から１０^７または約１０^４から１０^６の検出範囲を可能とする。範囲は、列挙された値およびその間の全てまたは部分的値であることが理解される（例えば、１０^２から１０^１０は、列挙された値およびその間の値、例えば１０^５、２．５ｘ１０^６、１０^４．５、１０^８．３等を含む．）。

「区別可能な」という用語は、本明細書で使用される場合、別の核酸配列から区別する様式で検出され得るようにする核酸配列の特徴を指す。例えば、２つの単位複製配列は、２つの選択的プローブにより独立して検出され得る場合、区別可能である。２つのプローブは、例えば異なる波長、異なる放射性リガンドもしくは異なる化学的に検出可能なデバイス（例えばフルオロフォアおよび化学発光プローブ）により、またはそのような信号生成メカニズムの混合により、個々に、およびその間で大きな干渉なしに検出可能である信号を生成する。

特に、「区別可能な検出信号」という用語は、２つ以上のプローブにより生成される信号を指す。「区別可能」であるために、個々のプローブにより生成される信号は、標準的検出デバイスにより弁別可能である。信号は、信号間の不当干渉または重複なしに、検出機器により容易に定量化可能である。例えば、区別可能な検出信号を生成するプローブは、検出機器により正確に検出および定量化されるように十分に分離された波長で信号を生成するプローブである。

「増幅オリゴマー」という用語は、標的核酸の増幅に有用なオリゴヌクレオチド配列を指す。増幅オリゴマーは、プライマー、プロモーターベースの増幅オリゴマー、プロモータープライマー、プロモーター供与物等を含む。

「プロモーターベースの増幅オリゴマー」という用語は、プロモータープライマーおよびプロモーター供与物を含む。「プロモーター供与物」または「供与物」は、第１および第２の領域を備えるオリゴヌクレオチドを指し、その３’−末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように改質される。プロモーター供与物オリゴヌクレオチドの「第１の領域」または「標的ハイブリッド領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を備え、ハイブリダイズ配列は３’に位置するが、必ずしもプロモーター領域に隣接する必要はない。プロモーターベースのオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域は、典型的には、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであるが、５０以上のヌクレオチドの長さまで延長し得る。「第２の領域」または「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を備える。プロモーター供与物は、好ましくは上述のようなその３’−末端にブロック部分を備える、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素により延長され得ないように操作されている。本明細書において言及される場合、「Ｔ７供与物」またはＴ７プロモータープロバイダーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供する、ブロックされたプロモーター供与物オリゴヌクレオチドである。３’−末端への改質を有さない同様のオリゴマーは、「プロモータープライマー」と呼ばれる。Ｔ７または他のプロモーター配列は、プロモーターベースの増幅オリゴマーに有用である。本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）により、核酸に結合して特定部位でＲＮＡの転写を開始するための信号として認識される特定の核酸配列である。

本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、標的核酸にハイブリダイズしてそこから単位複製配列を生成するオリゴヌクレオチドを指す。

本開示の方法および組成物のいくつかの実施形態において、少なくとも３つの増幅オリゴマーが共に使用され、１つの増幅オリゴマーが１つの鎖にハイブリダイズし、２つの増幅オリゴマーが他の鎖にハイブリダイズする。所与の方法または組成物において、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸を同じ方向で読み出し、すなわち、全て順方向の増幅オリゴマーまたは全て逆方向の増幅オリゴマーである。したがって、少なくとも３つの増幅オリゴマーは、それぞれ、順方向または逆方向増幅オリゴマー、および少なくとも２つの逆方向または順方向増幅オリゴマーを含む。標的核酸の同じ鎖に（すなわち同じ方向で）ハイブリダイズする少なくとも２つの増幅オリゴマーは、標的核酸配列内の２つの異なる配列にハイブリダイズすることにより、標的核酸配列内の同じ配列にハイブリダイズするが、同時に弁別可能な配列（改質および非改質配列、一意の非ハイブリダイズ５’配列等）を提供することにより、弁別可能な単位複製配列を生成する。同じ方向の増幅オリゴマーにおいて、標的核酸上のその標的配列は、異なる場合、重複してもよい。少なくとも２つの増幅オリゴマーは、不均等量で提供され、それにより、ほぼ同一の不均等量でそれぞれの弁別可能な単位複製配列が生成される。

本開示の方法および組成物のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの増幅オリゴマーが共に使用され、１つの増幅オリゴマーが１つの鎖にハイブリダイズし、１つの増幅オリゴマーが他の鎖にハイブリダイズする。この実施形態を使用して、これらの増幅オリゴマーにより生成された弁別可能な単位複製配列は、そのヌクレオチド組成が異なる。例えば、不均等な比の類似体ｄＮＴＰに対する天然ｄＮＴＰでｄＮＴＰの１つを提供するｄＮＴＰ混合物を使用することにより、天然または類似体残基を有する不均等単位複製配列種が生成される。さらなる例として、ＲＮＡ単位複製配列種およびＤＮＡ単位複製配列種を生成する増幅反応を使用することによっても、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む不均等単位複製配列種が生成される。

本明細書で使用される場合、「単位複製配列」は、増幅条件下での増幅オリゴマーのその標的配列とのハイブリダイゼーションから生成される生成物を指す。単位複製配列は、ＰＣＲ増幅反応法および等温増幅反応法のいくつかのステップで生成されるような二本鎖ＤＮＡ、ＲＴ−ＰＣＲのいくつかのステップおよび等温増幅反応法のいくつかのステップにおいて生成されるようなＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、または等温増幅法のいくつかのステップで生成されるような一本鎖ＲＮＡを含み得る。

本明細書において使用される場合、「増幅オリゴマー−単位複製配列の組み合わせ」または「増幅オリゴマー−単位複製配列系」という用語は、増幅オリゴマーおよびそれから生成される特定の単位複製配列を指す。いくつかの実施形態において言及される増幅オリゴマーは、弁別可能な単位複製配列を生成するための、本明細書に記載の弁別可能な同方向の増幅オリゴマーの１つである。

本明細書において使用される場合、「プローブ」という用語は、プローブ内の配列と相補的な特定のヌクレオチド配列の存在を検出することができる、ＤＮＡもしくはＲＮＡ断片、オリゴヌクレオチドまたは転写産物を指す。プローブは、好適には、検出機器により検出可能な分子マーカーでタグ化または標識化されている。好適なプローブおよび機器は、当技術分野において知られている。本明細書に記載の方法および組成物において有用なプローブは、核酸生成物の定量的検出を可能とする任意のプローブであってもよい。好適なプローブは、化学発光プローブ（自己消光型を含む）、フルオロフォア系プローブ、波長検出可能プローブ、放射性標識プローブ等を含む。特に有用なプローブは、化学発光標識で標識化されたプローブを含む。アクリジニウムエステル（ＡＥ）、ハイブリダイゼーション誘導化学発光信号（ＨＩＣＳ）標識、フルオロフォア−ＡＥハイブリッド標識等を含む。特に、ＨＩＣＳプローブは、例えば、米国特許第７，１６９，５５４号に記載されている。ＨＩＣＳプローブは、発光波長が自己消光プローブ形式でＡＥから近接フルオロフォア側にシフトした波長シフトＨＩＣＳ（ｗｓＨＩＣＳ）プローブを含み得る（例えば、米国特許第６，１６５，８００号）。したがって、自己消光エネルギー移動プローブは、本方法における使用に好適なプローブの例である。特に好適なプローブは、アクリジニウムエステルプローブまたはＨＩＣＳプローブを含む。

好適な増幅条件は、本明細書に記載の増幅法を含む。例えば、等温増幅法または循環増幅法は、本明細書に記載の方法における使用、および本明細書に記載の組成物との使用に適切である。

本明細書に記載の方法および組成物は、既知の割合の異なる量の区別可能かつ検出可能な単位複製配列生成物を生成する様々な手段を使用することにより、試験試料中に存在し得る標的核酸配列の定量的増幅を提供する。記載される方法および組成物は、複数の弁別可能な単位複製配列を、互いに対する比、および標的核酸配列の量に対する比で生成する。単一対の増幅オリゴマーを用いた標的核酸配列の増幅は、プローブまたは検出機器の正確な検出範囲外の濃度の単位複製配列を生成し得る。対照的に、本発明によれば、複数の増幅オリゴマー−単位複製配列系を使用して、複数の弁別可能な単位複製配列が異なる単位複製配列濃度で同時に生成される。したがって、本方法は、１つの狭い正確な検出ウィンドウではなく、それぞれが特定種の単位複製配列生成物に対して正確である複数の重複した検出範囲を形成する。本発明は、好ましくは単一槽内で実行される単一増幅システムにおいて、複数の弁別可能な単位複製配列を生成する。弁別可能な単位複製配列は、長さが異なってもよく、単位複製配列種は、共通の配列を共有するが、より長い単位複製配列種にはそれぞれ、より短いものと比較して、より長い種に一意の追加の配列が加わる。弁別可能な単位複製配列は、組成が異なってもよく、１つ以上の改質核酸塩基が単位複製配列の１つの種内に組み込まれるが、その他（複数を含む）には組み込まれない。同様に、弁別可能な単位複製配列は、組成が異なってもよく、独立して一意の５’配列が、５’非ハイブリダイズ配列を有する増幅オリゴマーを使用して、単位複製配列の各種内に組み込まれる。弁別可能な単位複製配列は、組成が異なってもよく、単位複製配列のサブセット（例えば、ある比のｄＡＴＰおよび改質ｄＡＴＰまたはｄＡＴＰの代替物を含むｄＮＴＰ混合物）内に組み込まれるように、改質核酸塩基が非改質核酸塩基と組み合わせられる。

これらの方法において、弁別可能な単位複製配列の数およびその互いに対する固定比は、増幅反応に必要とされるダイナミックレンジにわたるように、および、増幅反応において生成される単位複製配列の量を検出する測定システムの限界に対応するように選択される。本質的に、単位複製配列は、標的核酸配列に対する代理マーカーであり、単一量の標的配列ではなく、広範な量で出現する（したがって検出可能である）。例えば、組成および条件は、単一の反応混合物において、大量の単位複製配列１および比較的少量の単位複製配列２（および、任意選択で、さらに少量の単位複製配列３等、および検出のダイナミックレンジを拡張するために作製される各単位複製配列種に対するもの等）を生成するように選択される。増幅反応において生成される単位複製配列１の量が検出システムのダイナミックレンジを超える場合、生成される単位複製配列２（および／または単位複製配列３）の濃度がシステムのダイナミックレンジ内に収まる場合、それらの量が代わりに検出され得る。いくつかの実施形態において、各単位複製配列種の複製の数は、２桁、３桁、４桁またはそれ以上異なる。

単位複製配列およびその量は、増幅反応において作製された単位複製配列の１つ以上が、検出システムにおいて正確に測定され得ることを確実とするように選択される。正確な単位複製配列測定から、試験試料中に存在する元の標的核酸配列の量が計算される。したがって、全体的に、システムは、拡張されたダイナミックレンジにわたり、標的核酸配列を正確に検出および定量化することができる。好ましい実施形態において、異なる量の区別可能な単位複製配列を生成するために、標的核酸の同じ鎖を標的化する異なる量の増幅オリゴマーが使用される。いくつかの実施形態において、各増幅オリゴマーの量は、少なくとも２桁異なる。いくつかの実施形態において、区別可能な単位複製配列は、標的核酸配列の同じ標的領域から作製される。他の実施形態において、区別可能な単位複製配列は、重複標的領域から作製される。さらに他の実施形態において、区別可能な単位複製配列は、異なる標的領域から作製される。

いくつかの実施形態において、出発標的量は、区別可能な生成物の形成をもたらす、各プライマーの濃度を含む項またはプライマーの濃度間の相対的関係、例えば比を表現する項を含む１つ以上の等式を使用して決定される。計算のための関連する変数は、様々な増幅オリゴマーの濃度およびその増幅効率を含む。

他の実施形態において、方法は、区別可能な単位複製配列を生成するように選択されるプライマーを使用し、それらのプライマーの量は、それぞれの区別可能な単位複製配列の増幅を、その単位複製配列に対する関連プライマーの量を超えることができない予め選択されたレベルで停止するように選択される。

標的核酸の同じ鎖を標的化する区別可能な増幅オリゴマーが反応に存在する実際の比は、検出システムの固有のダイナミックレンジに依存する。各プライマーにより生成される単位複製配列の量の範囲は、理想的には、間にギャップを有する分離したダイナミックレンジが所望されない限り、連続的な拡張されたダイナミックレンジを生成するように幾分重複し得る。例えば、アクリジニウムエステル標識化プローブおよび４ログの範囲にわたり単位複製配列を検出することができる照度計が、２つの区別可能な生成物が作製されるシステムにおいて使用される場合、２つの区別可能な生成物を作製するために使用されるプライマーの比は、１，０００から１０，０００の間、より好ましくは約３０００であり、対数範囲の中間点は、それら２つの限界値の間にある。

本発明の方法は、以下の例示的スキームに従い説明することができる。スキームは、２つの増幅オリゴマー−単位複製配列系のみを使用して示されているが、追加的な増幅オリゴマー−単位複製配列−プローブ系を追加して、さらにブロードなダイナミックレンジを形成し得ることが、当業者に認識される。また、２つの増幅オリゴマー−単位複製配列系を示す以下のスキームは、Ｐ１およびＰ２と連携してＡ１およびＡ２を生成する逆鎖増幅オリゴマーを示していないことに注目すべきである。変数Ｐ_ｘ、Ａ_ｘ、およびＣ_ｘは、上に定義されている。

上述のように、個々のプローブの検出範囲は、不連続的であるか（すなわち範囲間にギャップがある）または重複してもよい。上記スキームは、重複している変形例を示している。したがって、具体的実施形態において、プローブの検出範囲が重複して連続的ダイナミックレンジを形成するように、各Ｃ_ｘ（ｂ）は、Ｃ_{ｘ＋１（ａ）}より大きい。

本明細書で使用される場合、変数Ｔ_１は、試験試料中の標的核酸配列の複製の数を指す。Ｔ_１は、約Ｔ_ａからＴ_ｂの範囲内にあり、範囲は、システムのダイナミック検出範囲内に収まるある量の単位複製配列を生成する標的核酸配列の量を表す。例えば、上記スキームに従い、所与のＴ_１に対して、増幅オリゴマー１（Ｐ_１）および増幅オリゴマー２（Ｐ_２）の量は、得られる単位複製配列１（Ａ_１）および単位複製配列２（Ａ_２）の量が、システムのＣ_１（ａ）からＣ_２（ｂ）の検出範囲に収まるように選択される。

改質および非改質プライマーを使用して作製される区別可能な生成物
方法の一実施形態において、増幅オリゴマーは、改質核酸塩基の有無により一方を他方から差別化する単位複製配列種を生成する。一態様において、標的核酸の同じ鎖を標的化する増幅オリゴマーは、別の増幅オリゴマーに比べ、１つの増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列における１つ以上の改質核酸塩基を有することにより、互いに異なる。改質および非改質増幅オリゴマーは、標的核酸の同じ鎖上の同じ配列にハイブリダイズし得るが、増幅産物のいくつかへの改質核酸塩基の組み込みに基づき、弁別可能な単位複製配列を生成する。例えば、ＴＭＡ反応は、単一のプロモーターベースの増幅オリゴマーおよび２つのプライマーオリゴマーを使用して実行されるが、２つのプライマーのうちの一方は非改質プライマーであり、他方は改質プライマーである。改質プライマーは、非改質プライマーの配列から、単位複製配列内に組み込まれる区別可能な改質を含有するように誘導体化される。改質プライマーの好ましい実施形態において、非改質プライマー内の核酸塩基の１つ以上が、他の核酸塩基で置き換えられる。特に好ましい実施形態において、置換は、意図される標的核酸配列にアニールして非改質プライマーと相対的に増幅を促進する改質プライマーの能力を実質的に改変しない。次いで、非改質プライマーおよび改質プライマーの小断片、例えば１／１０００を使用して、増幅反応が実行される。したがって、増幅反応は、改質プライマーに対応する第１の単位複製配列および非改質プライマーに対応する第２の単位複製配列を生成する。改質および非改質プライマーが等しく効率的であると仮定すると、改質配列を有する第１の単位複製配列分子の数は、非改質配列を有する第２の単位複製配列分子の数の約１／１０００である。次いで、単位複製配列集団は、２つの区別可能なプローブを使用して検出および定量化される。一方のプローブは、非改質配列を含有する第２の単位複製配列分子を検出し、他方のプローブは、改質配列を含有する第１の単位複製配列分子を検出する。低い初期標的レベルに起因して単位複製配列がほとんど生成されない場合、この単位複製配列は改質単位複製配列種より過剰に生成されるため、非改質配列に相補的なプローブのみが有意なハイブリダイゼーションを示す。このハイブリダイゼーションは、約３〜４ログにわたり定量化されるはずである。しかしながら、増幅反応において生成される単位複製配列の量がはるかに多い場合、非改質配列に相補的なプローブがハイブリダイゼーション飽和に達し、改質配列に相補的なプローブにより信号が検出される。後者の信号もまた、約３〜４ログにわたり定量化可能であるが、生成された単位複製配列の量を決定するためには、その信号は、増幅反応において生成された単位複製配列分子の数の１／１０００しか示さないため、１０００（「比」因子）を乗ずる必要がある。

理想的には、区別可能な生成物は、その合成において使用されるプライマーの比に等しい量で生成されるが、異なるプライマーの正確に一致する増幅効率は困難で高価となり得ることが、当業者に認識される。本発明の他の好ましい実施形態において、区別可能な生成物の増幅の効率は、所望の程度まで一致し、効率のいかなる差異も、生成される単位複製配列の総量がそれぞれの区別可能な生成物の量から計算される差異に考慮される。改質プライマーが非改質プライマーよりも１０００分の１少ない量で存在したが、増幅効率が同じであった前述の例においては、改質単位複製配列の量に１０００を乗じた。しかしながら、改質プライマーによる増幅の効率が、非改質プライマーの効率のわずか８０％であった場合は、非改質生成物１０００分子当たり０．８分子の改質生成物しか合成されない。その場合、全増幅生成物の量は、改質生成物からの信号に、比因子（１０００）および「効率因子」（推定／実測＝１．０／０．８＝１．２５）を乗じてより低い効率を考慮することにより、計算される。

ハイブリダイゼーションが、化学発光標識から生成される相対発光強度（ＲＬＵ）の数により測定される反応において、全単位複製配列の量は、以下のように、各プローブからの信号の関数として計算される。
（１）全単位複製配列（プローブＵ信号）＝正味ＲＬＵ_{プローブＵ}×（ｐｍｏｌプローブＵ／ＲＬＵ_{プローブＵ}）；
（２）全単位複製配列（プローブＭ信号）＝正味ＲＬＵ_{プローブＭ}×（ｐｍｏｌプローブＵ／ＲＬＵ_{プローブＭ}）×比因子×効率因子
式中、「プローブＵ」および「プローブＭ」は、それぞれ、非改質および改質単位複製配列を標的化する。

両方の計算値がダイナミックレンジの重複領域内にある場合、好ましい実施形態において、それらの数値を比較してそれらが許容される程互いに近接しているかどうかが決定される。それらの数値が所定の許容量より大きく異なる場合、それらを組み合わせて、全単位複製配列量の最善の推定値を生成する。一般に、２つの値を足して２で除することにより、平均値が決定される。

一般に、生成された単位複製配列の量が重複範囲を超える場合、プローブＭからの信号を使用して単位複製配列の全量を計算する。この場合、プローブＵからの信号は飽和していると推定される。生成された単位複製配列の量が重複範囲を下回る場合、プローブＵからの信号を使用して単位複製配列の全量を計算する。この場合、プローブＭからの信号は、プローブＵからの信号より少ないと推定される。どれ程少ないかは、比因子、効率因子および２つのプローブの特定の比活性度、ならびに標的の量に依存する。

次いで、試験試料中の標的核酸配列の量が、既知の標的核酸配列濃度の標準試料の組から同じ反応条件下で生成される全単位複製配列の数値と比較して決定される。

上述の例において、２つの区別可能な生成物が生成され、試験試料中の標的核酸配列の量が、増幅反応において生成された２つの単位複製配列のそれぞれの量に基づいて計算された。所望のダイナミックレンジを達成するために必要に応じて追加のプライマーを使用して（例えば、Ｐ_３、Ｐ_４等）、増幅反応におけるさらなる数の区別可能な単位複製配列を作製することにより、アッセイのダイナミックレンジのさらなる増加が達成され得ることが、当業者に認識される。それぞれの新たな単位複製配列は、他から区別可能であるべきであり、適切な比活性度をもってプローブにハイブリダイズする際に検出機器の範囲内の信号を生成する量で作製されるべきである。それぞれの特定単位複製配列を生成するために使用されるプライマーの量は、ダイナミックレンジの拡張に寄与する生成物の量をもたらさなければならない。具体的実施形態において、２つの区別可能な単位複製配列が使用される場合について前述したように、新たなプライマーがない場合に存在した限界を超えてダイナミックレンジを拡張するために、各追加されたプライマーから生成される生成物の量は、他のプライマーのいずれかにより生成された生成物の検出範囲に、完全ではなく部分的に重複する検出範囲内に収まる。

好ましい実施形態において、プローブの比活性度は、同様または同一であり、ダイナミックレンジは、作製されるそれぞれの区別可能な生成物の量の差異により広がりを有する。しかしながら、他の実施形態において、作製される区別可能な生成物の量およびそれらを検出するために使用されるプローブの比活性度の両方が、ダイナミックレンジをさらに拡張するために、または単に便宜上変動され得る。各プローブの比活性度（すなわち、プローブのモル量当たりの信号の量）は、生成されるそれぞれの区別可能な単位複製配列の量を計算するための上記等式の項である。実際には、プローブを標識化する際に同様または同一の比活性度を達成するのは困難となり得るため、比活性度におけるいくらかの変動性に対応する本発明の能力が貴重となる場合が多い。

上述のように、改質プライマーは、１つ以上の塩基置換を含有し得る。これらは、プライマー内の異なる場所に位置して非置換塩基が介在し得るか、または、単一の領域に局所化し得る。十分な数の核酸塩基が置換されて、プライマーが標的核酸配列にハイブリダイズする際に外れる領域を形成してもよい。プライミングおよび増幅の効率を実質的に改変しない限り、多数の改質のいずれも可能である。「実質的に改変しない」とは、それらから生成される生成物の量が、本明細書における教示による意図されるダイナミックレンジにわたるために必要なレベルを下回るように、または、それらから合成される生成物の量を、反応条件下で、標的核酸配列および使用される試験試料の種類により過度に変動性とするように、塩基置換が増幅の効率を変化させないことを意味する。「過度に変動性」とは、生成される単位複製配列の量が、アッセイがその意図される用途に適用される際に必要とされる性能の所望の範囲内に維持され得ないことを意味する。患者の血液試料中のウイルス量の測定を意図するアッセイの場合、アッセイの変動係数は、一般に約２５％以下、好ましくは約１０％未満であるべきである。

改質および非改質単位複製配列は、２つの形態を区別し得るプローブを使用して検出され得るか、または、２種を区別する酵素を使用して差別化の達成を補助し得る。例えば、改質塩基がメチル化塩基である場合、メチル化配列を認識しない制限酵素が使用されてもよい。あるいは、例えば、改質塩基がメチル化塩基である場合、メチル化配列を認識する制限酵素が使用されてもよい。あるいは、改質塩基の存在により、異なる塩基が次の複製周期に単位複製配列内に挿入されることがもたらされてもよい。この場合、塩基は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよい。生成される改質配列は、それぞれ２つの形態のうちの１つのみにハイブリダイズする２つの区別可能なプローブを使用して、非改質配列から弁別され得る。

５’不対塩基を有するプライマーを使用して作製される区別可能な生成物
区別可能な単位複製配列を提供するための別の方法は、５’不対塩基を有する同じ方向の増幅オリゴマーの使用を含む。例えば、２つのプライマーは、それぞれ、その５’末端またはその近くに１つ以上の元の不対塩基を含有し得るが、１つの増幅オリゴマーの不対塩基は、他の増幅オリゴマーの不対塩基とは異なる。「元の不対」とは、プライマーが試験試料中の標的核酸配列にアニールする際にこれらの塩基がハイブリダイズされないことを意味する。増幅反応が進行する際にプライマーおよびその５’不対塩基が単位複製配列に組み込まれると、各プライマーは、同じプライマー配列から得られるそれらの単位複製配列分子に完全に相補的となるが、他のプライマー配列から得られるそれらの単位複製配列分子に完全に相補的とはならない。プライマーのこれらの２つの形態は、増幅に関して同様の動態を有する可能性が高い。

置換ヌクレオチドを使用して作製される区別可能な生成物
方法の別の実施形態において、増幅反応において存在するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の１つは、単位複製配列内に組み込まれると、異なるハイブリダイゼーションまたは他の認識特性を有する改質ＮＴＰ類似体と部分的に置き換えられる。改質ＮＴＰは、例えば、改質ＮＴＰの数の約１／１０００で存在する。単位複製配列が生成されると、検出プローブと相補的な配列は、平均的に、組み込まれた１０００ヌクレオチド当たり、特定部分において非改質塩基の代わりに改質塩基を有する分子を１つ含有する。改質塩基は、２つの形態を区別し得るプローブを使用して検出され得るか、または、２種を区別する酵素を使用して差別化の達成を補助し得る。例えば、改質塩基がメチル化塩基である場合、メチル化配列を認識しない制限酵素が使用されてもよい。あるいは、単位複製配列の断片内に組み込まれる改質ヌクレオチドに相補的であるが、その部分に組み込まれる他のヌクレオチドには相補的でない位置に、改質ヌクレオチドを有し得る。改質ヌクレオチド、および改質ヌクレオチド三リン酸の酵素組み込みは、当技術分野において知られている（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２１）：４９７５−４９８２（１９９８）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（８）：４４６９−４４７３（２００３）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５（３３）：９９７０−９９８２（２００３）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（４）：１１０２−１１０９（２００４）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（４３）：１５０７１−１５０８２（２００５））。あるいは、改質塩基の存在により、異なる塩基が次の複製周期に単位複製配列内に挿入されることがもたらされてもよい。この場合、塩基は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよい。生成される改質配列は、それぞれ２つの形態のうちの１つのみにハイブリダイズする２つの区別可能なプローブを使用して、非改質配列から弁別され得る。

区別可能なＤＮＡおよびＲＮＡ標的
ある特定の増幅システムは、本質的に、増幅プロセスの一部として、異なる量の区別可能な単位複製配列を生成する。方法の一実施形態において、これらの増幅反応の最終および中間生成物の差別的検出を使用して、ダイナミックレンジが拡張される。例えば、ＴＭＡの一般的に実践される変形例において、最も豊富な単位複製配列は、標的核酸に相補的なＲＮＡである。二本鎖ＤＮＡもまた、はるかに少ない量で、一般に約１００倍から１０００倍少ないレベルで生成される。プローブは、マイナス鎖ＲＮＡ単位複製配列種、および、ＤＮＡ単位複製配列種の一方または両方の鎖を検出するように作製され得る。したがって、本発明の一般原則、すなわち、ダイナミックレンジを拡大するために実質的に異なる数で存在する複数形態の単位複製配列の検出は、プラス鎖ＤＮＡ単位複製配列に対するマイナス鎖ＲＮＡ単位複製配列の比が、ＴＭＡ反応を実行するために使用される条件下で一定である場合に適用することができる。ＲＮＡおよびＴＭＡ反応において生成される二本鎖ＤＮＡ生成物の相対量は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１３）：５４１３−５４３２（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２１）：８７８３−８７９８（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（１０）：２５１７−２５２４（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１８）：３６５９−３６６０（１９９６）、Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１５：４３３−４４３（２０１０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１１）：３５８６−３５９５（２００２）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（４９）：４０７０７−４０７１３（２００５）に記載のように、使用されるプロモーターの配列を変えることにより変更することができる。また、転写効率はリボヌクレオチドの濃度に依存するため、これらの反応成分の全濃度および４つのリボヌクレオチドのそれぞれの相対量の両方を変えることにより、転写効率を変更することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４６）：２０９２−２０９７（１９９７）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１（５）：７７７−７９２（１９９８））。反応においてＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型の両方を複製する上での逆転写酵素の活性は、同様に、デオキシリボヌクレオチドの濃度および４つのデオキシリボヌクレオチドのそれぞれの相対量を変えることにより変更することができる。４つ全てのデオキシリボヌクレオチドの濃度の低下は、ＲＮＡポリメラーゼ反応と相対的に、逆転写酵素ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制する。特定の標的領域に対し、反応のＤＮＡおよびＲＮＡ成分における各塩基の割合の分析を使用して、転写されたＲＮＡまたは二重鎖ＤＮＡの合成の速度を増加または減少させる各塩基の濃度を選択することができる。例えば、ある単位複製配列が、別の単位複製配列と相対的に、高い割合のシトシンヌクレオチドを含有する場合、反応混合物中のシトシン濃度の低下を使用して、その特定の単位複製配列の合成を抑制することができる。また、例えば米国特許第５，７０５，３６５号および米国特許第５，７１０，０２９号に記載のような他の反応パラメータの変更を使用して、転写されたＲＮＡおよび二重鎖ＤＮＡ生成物の合成比に差別的に作用させることができる。プラス鎖ＤＮＡの検出は、実質的に大量の競合するマイナス鎖ＲＮＡ単位複製配列の存在の可能性により複雑化し得るため、マイナス鎖ＤＮＡが好ましい標的となり得る。ＴＭＡにおけるＤＮＡ単位複製配列は、プロモーター配列を含有するため、容易に検出可能なプロモーター−プライマーの改質が好ましくなり得る。プローブを使用して、プロモーター領域、隣接プライマー領域、および単位複製配列内の所望の標的配列の一部の存在を確認することができる。これらの３つの配列は、反応におけるＤＮＡ中間体内で一列となってのみ存在する。

同様に、ＴＭＡの一般的に実践される別の変形例である、米国特許第７，３７４，８８５号に記載の単一プライマーにおいて、最も豊富な単位複製配列は、標的核酸と同じ向きのＲＮＡである。マイナス鎖ＤＮＡもまた、はるかに少ない量で生成される。プローブは、ダイナミックレンジを拡大するために、プラス鎖ＲＮＡおよびマイナス鎖ＤＮＡを検出するように作製され得る。

異なる標的捕捉に基づく区別可能な生成物
方法の別の実施形態において、プライマー部位の１つに相補的または部分的に相補的であり、所望のプローブ結合部位の一部に延長する好適な標的捕捉オリゴヌクレオチドが作製される。これらの標的捕捉オリゴマーは、標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび同じ方向の増幅オリゴマーの両方として機能し得る。これらの標的捕捉オリゴヌクレオチドの低い割合において、区別可能な単位複製配列は、標的捕捉においても機能しないプライマーについて上述したのと同じ様式でプローブ結合領域において生成されるように変更される。標的捕捉、および非結合捕捉プローブを含む不要な材料を除去するための洗浄の後、増幅反応の残りの成分が添加され、増幅プロセスを開始させる。標的捕捉オリゴヌクレオチドの延長により生成される初期ＤＮＡ：ＲＮＡ（元の標的ＲＮＡ）またはＤＮＡ：ＤＮＡ（元の標的ＤＮＡ）二本鎖は、既知の割合の分子に改質配列を含有する。その後２つの標的配列が一貫した比で増幅すると仮定すると、２つの種を区別するプローブを使用して、上述のようなより広い範囲にわたり、元の標的を定量化することができる。

半ネスト化プライマーを使用して作製される区別可能な生成物
方法のさらに別の実施形態において、半ネスト化プライマーが増幅反応に異なる濃度で提供される。例えば、少なくとも２つのプライマーは、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーを含む。第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーは、共に順方向プライマーであるか、または共に逆方向プライマーである。反応混合物は、第１のインナープライマーおよび第２のアウタープライマーの方向とは反対の方向に作用する、単一のプロモーターベースの増幅オリゴマーをさらに含み得る。したがって、これらのプライマーから生成される少なくとも２つの単位複製配列は、第１のインナープライマーから生成される第１の単位複製配列および第２のアウタープライマーから生成される第２の単位複製配列を含む。第１のインナープライマーは低濃度で提供され、第２の逆方向アウタープライマーは、より高濃度で提供される。標的核酸配列が反応に含まれる場合、プロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第１のインナープライマーからより短い単位複製配列が合成され、プロモーターベースの増幅オリゴマーおよび第２のアウタープライマーからより長い単位複製配列が合成される。より長い単位複製配列は、より長いまたはより短い単位複製配列のさらなる合成のための鋳型として機能し得る。異なる逆方向プライマー濃度を選択することにより、差別的な量のより長いおよびより短い単位複製配列が、単一の反応において合成される。より短い単位複製配列は、より長い単位複製配列と共通する配列を含む。より長い単位複製配列は、より短い単位複製配列と共通する配列、およびより短い単位複製配列における配列とは異なる配列を含む。差別的な量のより長いおよびより短い単位複製配列が単一の反応において合成されるため、より長いおよびより短い単位複製配列の量の定量化により、２つの重複する範囲を得ることができ、検出のダイナミックレンジを効果的に拡張することができる。異なる量の単位複製配列の定量化は、さらに、プローブの比活性度を調節することにより、検出システムのダイナミックレンジに適用することができる。

異なる濃度での半ネスト化増幅オリゴマーの代替構成は、異なる濃度での増幅反応において可能である。例えば、単一の逆方向プライマーとは反対に、順方向インナープライマーは低濃度で提供され、順方向アウタープライマーがより高濃度で提供される。標的核酸配列が反応に含まれる場合、逆方向プライマーおよび順方向インナープライマーからより短い単位複製配列が合成され、逆方向プライマーおよび順方向アウタープライマーからより長い単位複製配列が合成される。より長い単位複製配列は、より長いまたはより短い単位複製配列のさらなる合成のための鋳型として機能し得る。このプロセスから、差別的な量のより長いおよびより短い単位複製配列が、単一の反応において合成される。異なる順方向プライマー濃度を選択することにより、単位複製配列のこれらの差別的な量を変更することができる。より短い単位複製配列は、より長い単位複製配列と共通する配列を含む。より長い単位複製配列は、より短い単位複製配列と共通する配列、およびより短い単位複製配列における配列とは異なる配列を含む。差別的な量のより長いおよびより短い単位複製配列が単一の反応において合成されるため、より長いおよびより短い単位複製配列の量の定量化により、２つの重複する範囲を得ることができ、検出のダイナミックレンジを効果的に拡張することができる。異なる量の単位複製配列の定量化は、さらに、プローブの比活性度を調節することにより、検出システムのダイナミックレンジに適用することができる。

以下の実施例は、本方法をさらに例示するために提供されるものであり、それを限定することを意図しない。

実施例１〜３および５のための増幅組成物
・ ０．２μｍ 濾過水（Ｈ_２Ｏ）
・ ４Ｘ 増幅試薬：１６０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ塩基）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７０ｍＭ ＫＣｌ、１６ｍＭ ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびｒＵＴＰの各々、４ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々、２０％ ポリビニルピロリドン、０．３％ エチルアルコール、０．０２％
メチル パラベン、０．０１％ プロピル パラベン、ｐＨ ７．５
・ ４Ｘ 酵素試薬：８ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ遊離酸）、１４０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、７０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１．０４ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．０４ｍＭ 酢酸亜鉛、１０％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ（登録商標）−１０２、８０ｍＭ トレハロース、２０％ グリセロール、８０単位／μＬ Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）、８０単位／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）、ｐＨ ８．０
・ シリコーン油試薬：ポリジメチルシロキサン、トリメチルシロキシ終端型
・ プライマー：
○ ４Ｘ（プロモータープライマー、またはＰｒ−プライマー（水中３００ｎＭ）
５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号１）
○ ４Ｘ プライマー１（水中１５ｎＭ）
５’−ＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２）
○ ４Ｘ プライマー２（水中２８５ｎＭ）
５’−ＡＴＴＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＡ−３’（配列番号３）
・ 標的配列−ＲＮＡ、１，０１６ｎｔ、体外転写（ＩＶＴ）；ＩＶＴの５’部分からの５１ｎｔは、Ｔ７プロモーターおよびクローニングベクターからのものである；残りの９６５ｎｔは、ＨＩＶ−１サブタイプＢ ｐｏｌ遺伝子の３’部分、恐らく、誰が水中の遺伝子の分裂を割り当てたかに依存して、後続遺伝子の５’部分を含む。
５’−ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＣＡＵＧＣＣＵＧＣＡＧＧＵＣＧＡＣＵＣＵＡＧＡＧＧＡＵＣＣＣＣＧＧＧＵＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＵＵＧＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡＡＣＡＡＧＵＡＧＡＵＡＡＡＵＵＡＧＵＣＡＧＵＧＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＧＡＡＡＡＵＡＣＵＡＵＵＵＵＵＡＧＡＵＧＧＡＡＵＡＧＡＵＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＵＧＡＡＣＡＵＧＡＧＡＡＡＵＡＵＣＡＣＡＧＵＡＡＵＵＧＧＡＧＡＧＣＡＡＵＧＧＣＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＡＡＣＣＵＧＣＣＡＣＣＵＧＵＡＧＵＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＵＡＧＵＡＧＣＣＡＧＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＵＧＵＣＡＧＣＵＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＵＧＣＡＵＧＧＡＣＡＡＧＵＡＧＡＣＵＧＵＡＧＵＣＣＡＧＧＡＡＵＡＵＧＧＣＡＡＣＵＡＧＡＵＵＧＵＡＣＡＣＡＵＵＵＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＵＵＡＵＣＣＵＧＧＵＡＧＣＡＧＵＵＣＡＵＧＵＡＧＣＣＡＧＵＧＧＡＵＡＵＡＵＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＵＵＡＵＵＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＣＡＧＵＡＡＡＡＡＣＡＡＵＡＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＵＧＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＡＣＣＡＧＵＧＣＵＡＣＧＧＵＵＡＡＧＧＣＣＧＣＣＵＧＵＵＧＧＵＧＧＧＣＧＧＧＡＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣＣＣＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＡＡＡＧＵＣＡＡＧＧＡＧＵＡＧＵＡＧＡＡＵＣＵＡＵＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＵＵＡＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＵＡＧＧＡＣＡＧＧＵＡＡＧＡＧＡＵＣＡＧＧＣＵＧＡＡＣＡＵＣＵＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＵＡＣＡＡＡＵＧＧＣＡＧＵＡＵＵＣＡＵＣＣＡＣＡＡＵＵＵＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＵＵＧＧＧＧＧＧＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＵＡＧＵＡＧＡＣＡＵＡＡＵＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＵＡＣＡＡＡＣＵＡＡＡＧＡＡＵＵＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＵＵＡＣＡＡＡＡＡＵＵＣＡＡＡＡＵＵＵＵＣＧＧＧＵＵＵＡＵＵＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＵＣＣＡＣＵＵＵＧＧＡＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＵＣＣＵＣＵＧＧＡＡＡＧＧＵＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＵＡＧＵＡＡＵＡＣＡＡＧＡＵＡＡＵＡＧＵＧＡＣＡＵＡＡＡＡＧＵＡＧＵＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＵＣＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＵＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＵＧＧＣＡＧＧＵＧＡＵＧＡＵＵＧＵＧＵＧＧＣＡＡＧＵＡＧＡＣＡＧＧＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＡＵＧＧＡＡＡＡＧＵＵＵＡＧＵＡＡＡＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番号４）

実施例１〜３および５のための検出組成物
・ ハイブリダイゼーション試薬：１００ｍＭ コハク酸、２％（ｗ／ｖ） ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２３０ｍＭ ＬｉＯＨ、１５ｍＭ アルドリチオール−２、１．２ Ｍ ＬｉＣｌ、２０ｍＭ エチレングリコール−ｂｉｓ（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３％（ｖ／ｖ） エチルアルコール、ｐＨ ４．７
・ ハイブリダイゼーション希釈剤：０．１％（ｗ／ｖ） ＬＬＳ、１０ｍＭ コハク酸、ｐＨ ５
・ アルカリ性試薬：６００ｍＭ ホウ酸、１８２ｍＭ ＮａＯＨ、１％ ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ（登録商標）−１００、ｐＨ ８．５
・ ＴＭＡ分離懸濁試薬：０．２５μｇ／μＬ 磁気粒子（ＢｉｏＭａｇ Ｍ４１００）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０８％（ｗ／ｖ） ＬＬＳ、８ｍＭ コハク酸、ｐＨ ５・ 分離試薬：１．２５μｇ／μＬ 磁気粒子ｓ（ＢｉｏＭａｇ Ｍ４１００）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ
・ 読み取り試薬：１２５ｍＭ ＬｉＯＨ、１．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、９５ｍＭ コハク酸、８．５％（ｗ／ｖ） ＬＬＳ、ｐＨ ５．２
・ 検出試薬
○ 検出試薬１：３２ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、１ｍＭ ＨＮＯ_３
○ 検出試薬２：１．５ Ｍ ＮａＯＨ
○ 検出試薬３：２４０ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、１ｍＭ ＨＮＯ_３
○ 検出試薬４：２ Ｍ Ｔｒｉｓ 塩基、ｐＨ ９．０ ｗｉｔｈ ＨＣｌ
○ 検出試薬５：１ｍＭ ＨＮＯ_３
・ プローブ：
○ アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識化直線オリゴヌクレオチドプローブ １
５’−ＣＣＡＣＡＡＵＵＵＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号５）
○ ＡＥ標識化直線オリゴヌクレオチドプローブ２
５’−ＡＧＡＡＡＡＵＵＡＵＡＧＧＡＣＡＧＧＵＡＡＧ−３’（配列番号６）
○ 非標識化オリゴヌクレオチドプローブ３
５’−ＣＣＡＣＡＡＵＵＵＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号５）
○ 非標識化オリゴヌクレオチドプローブ４
５’−ＡＧＡＡＡＡＵＵＡＵＡＧＧＡＣＡＧＧＵＡＡＧ−３’（配列番号６）
○ ５’−ＡＥおよび３’−［４−（ｄｉメチルアミノ）アゾベンゼン−４′−カルボン酸］（ダブシル）部分を有する、ＡＥ標識化、ハイブリダイゼーション誘導化学発光シグナル（ＨＩＣＳ）プローブ５
５’−Ｃ６アミン（ＬｉＡＥ）−ＣＵＣＧＵＣＣＡＣＡＡＵＵＵＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧＡＧ−Ｄ−３’
（配列番号７）
○ ＡＥ標識化、波長シフトハイブリダイゼーション誘導化学発光シグナル（ｗｓＨＩＣＳ）プローブ６ ｗｉｔｈ ａ ５’−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、５’−最終前ＡＥおよび３’−ダブシル部分
５’−ＴＡＭＲＡ−ｒｘｌ（ＬｉＡＥ）−ＣＣＵＣＵＡＧＡＡＡＡＵＵＡＵＡＧＧＡＣＡＧＧＵＡＡＧＡＧＡＧＧ−Ｄ−３’
（配列番号８）

実施例のための増幅方法
反復試験ＴＭＡ反応を、実施例１〜３および５において以下のとおりに実行した。：２５μＬ容量 ４Ｘ増幅試薬、水中プライマー、および水中ＲＮＡ転写産物の各々、ならびに１００μＬ容量のシリコーン油試薬を混合し、６０℃で１０分間、次いで、４２℃で５分間インキュベートした。；２５μＬ容量の４Ｘ酵素試薬を溶液に添加し、溶液を混合し、次いで、４２℃で９０分間インキュベートした。ＲＮＡ転写産物上のＰｒ−プライマーならびにプライマー１および２の相対的配置と、結果として得られた単位複製配列とを、図１および４に図式的に示す。異なる濃度のプライマー１および２を使用したため、異なる量のそれぞれの単位複製配列およびプローブ結合領域を、単一の反応において合成した。

実施例１：別個の反応チャンバにおける、ダイナミックレンジにわたるＡＥプローブによる単位複製配列の定量的検出
本実施例は、別個の反応管における、標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを、増幅反応混合物に添加し、これを混合し、６０℃で１５分間インキュベートして、合成された単位複製配列における相補的配列に対して特異的なプローブのハイブリダイゼーションを行った。使用されたプローブは、：（ａ）配列番号５（１ｎＭ）のＡＥ標識化プローブ、および配列番号５（５０ｎＭ）の非標識化プローブ（標識化プローブの比活性度を減弱させるために使用）；または（ｂ）配列番号６（１ｎＭ）のＡＥ標識化プローブ、および配列番号６（２００ｎＭ）の非標識化プローブ（標識化プローブの比活性度を減弱させるために使用）。区別可能な単位複製配列上のプローブの相対的配置を、図１に図式的に示す。本実施例において、配列番号５のＡＥ標識化プローブは、両方の単位複製配列を検出することができるが、配列番号６のＡＥ標識化プローブは、より長い単位複製配列のみを検出することができる。

配列番号５および配列番号６のＡＥ標識化プローブに関する初期比活性度は、それぞれ、約１．１×１０^８および１．６×１０^８ＲＬＵ／ｐｍｏｌであった。比活性度は、プローブおよび単位複製配列出力のダイナミックレンジを均衡化するように、標識化プローブと同じ配列の種々の量の非標識化オリゴヌクレオチドを添加することによって、調節された。増幅反応の終了時までに生成された単位複製配列の量は、単位複製配列出力の最高量が、総プローブ量よりも若干少なくなるまで、そのそれぞれのプローブで各検出領域を滴定すること、および非標識化プローブの量を増加することによって、実験的に測定した。配列番号６のプローブに関して、１０^９の複製入力からの単位複製配列を上回るためには、２０ｐｍｏｌ 総プローブ／１００μＬ ハイブリダイゼーション試薬（比活性度＝８×１０^５ＲＬＵ／ｐｍｏｌの２００ｎＭ）が必要であった。配列番号５のプローブに関して、１０^５の複製入力からの単位複製配列を上回るためには、５ｐｍｏｌ 総プローブ／１００μＬ ハイブリダイゼーション試薬（比活性度＝２．２×１０^６ＲＬＵ／ｐｍｏｌの５０ｎＭ）が必要であった。

ハイブリダイゼーション反応の完了時、３００μＬ容量のアルカリ性試薬を、ハイブリダイゼーション反応物に添加し、結果として得られた混合物を、６０℃で２０分間インキュベートして、相補的単位複製配列にハイブリダイズされなかったＡＥ標識化プローブを選択的に加水分解した。

これらの反応物からの化学発光を、２００μＬ 検出試薬１を添加し、２００μＬ 検出試薬２の添加の前に２秒の中断し、０．０４秒の中断し、次いで、間隔間の遅延を伴うことなく５０×０．０４秒の間隔を取得して、ＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋照度計において開始した。これらの間隔からの相対発光量（ＲＬＵ）の化学発光出力を合計し、反復試験からの平均値を計算した（表１および２）。

ゼロＲＮＡ転写入力からの平均ＲＬＵ（各表内の最初のエントリ）は、背景（「ｂｋｇｄ」）測定値として使用され、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、および１０^９複製ＲＮＡ転写入力を含む、実験の結果から減算された（平均ＲＬＵマイナスｂｋｇｄ）。平均の背景を減算した値（平均ＲＬＵ-ｂｋｇｄ）は、ＡＥを有しな
い直線プローブの超過倍数で乗算することによって、直線ＡＥ標識化プローブの比活性度を説明するように調節され、比活性度を調節した平均の背景を減算した値（比活性度を調節した平均ＲＬＵ-ｂｋｇｄ）をもたらす。別個の管から測定された２つのプローブに対
する、比活性度を調節した平均の背景を減算した値を加算し、合計した比活性度を調節した平均の背景を減算した値（表３、比活性度を調節した平均ＲＬＵ−ｂｋｇｄ）を導いた。

各プローブに関する比活性度を調節した平均の背景を減算した値、および合計したプローブの値の反復試験の各々を図２に示す。配列番号５のＡＥ標識化プローブ、および配列番号５の非標識化プローブからの化学発光は、ＲＮＡ転写入力の反応につき約１０^３から１０^５の複製のＲＬＵの直線的増加を実証した。配列番号６のＡＥ標識化プローブ、および配列番号６の非標識化プローブからの化学発光は、ＲＮＡ転写入力の反応につき約１０^５から１０^９の複製のＲＬＵの直線的増加を実証した。２組のプローブからの応答の勾配は、ほぼ共線的であった。それらの合計したＲＬＵ値は、反応につき約１０^３から１０^５の複製、および反応につき約１０^４から１０^９の複製のＲＬＵの２つの非連続的な直線的増加を実証した。しかしながら、配列番号６のＡＥ標識化プローブ、および配列番号６の非標識化プローブからのＲＬＵ値を、定数（ｋ）、この場合、４６．６で乗算することによって、変換することは、反応につき約１０^３から１０^９複製のこれらの２組のプローブからの検出の連続的な直線的ダイナミックレンジを実証した（表２および３、図３）。定数（ｋ）は、共通のｘ切片への両方の直線回帰の勾配を調節するように使用される視覚化ツールであるが、単位複製配列の２つの領域の定量化に必要ではない。定数（ｋ）は、第１のプローブからの平均ＲＬＵ値を、ｂｙ ｔｈｅ両方のプローブからのＲＬＵ値が、同じ直線回帰の一部である、標的入力濃度で採用される、第２のプローブからの平均ＲＬＵ値で除算することによって算出した。値は、少なくともプライマー濃度、プローブ比活性度、および増幅効率に依存して変動する。

実施例２：同じ反応チャンバにおけるダイナミックレンジにわたる、ＡＥ−ＨＩＣＳプローブでの単位複製配列の定量的検出
本実施例は、同じ反応チャンバにおける、標的入力の１０^６から１０^１０の複製のダイナミックレンジにわたる、単位複製配列の定量的検出を提供する、実施形態を実証する。

ＴＭＡ反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬を添加し、混合し、室温で２０分間インキュベートした。ＴＭＡ分離懸濁試薬（２５０μＬ）を添加し、混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。上の溶液を含有する管を、室温で５分間、磁気分離ラック上に配置し、液相を除去し、１００μＬの半強度ハイブリダイゼーション試薬中のプローブを添加し、結果として得られた混合物を、６０℃で３０分間、および室温で５分間インキュベートした。使用されたプローブは、（ａ）１０ｎＭ 配列番号７の自己消光ＡＥ標識化ＨＩＣＳプローブ、（ｂ）１００ｎＭ 配列番号８の自己消光、波長シフトしたＡＥ標識化ｗｓＨＩＣＳプローブ、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）に示される濃度の両方のプローブであった。区別可能な単位複製配列上のプローブの相対的配置を、図４に図式的に示す。配列番号７の標識化プローブは、両方の単位複製配列を検出するが、配列番号８の標識化プローブは、より長い単位複製配列のみを検出する。

ハイブリダイゼーション反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション希釈剤を、ハイブリダイゼーション反応に添加し、結果として得られた混合物を、６０℃で１０分間インキュベートした。上の溶液を含有する管を、室温で５分間、磁気分離ラック上に配置し、液相を除去し、１００μＬ容量の読み取り試薬を添加し、混合した。

これらの反応からの化学発光は、反対側に２つの高計数光電子増倍モジュール（ＰＭＴ；直径２８ｍｍ、ヘッドオン、バイアルカリカソード；Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、日本国浜松市）を具備し、２つの試薬ポンプからの注入管を装着する不透光性検出チャンバに方向付けられた、修正された照度計において開始された。フィルタ（直径２５．４ｍｍ；Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）からの４３０ＡＦ６０、およびＮｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）からのＯＧ５５０）を、２つのプローブからの放出の区別を可能にするように、ＰＭＴと検出チャンバとの間に装着した。同様の多波長照度計は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，４４７，６８７号、およびＣｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ２９（９）、１６０４−１６０８（１９８３））。これらの反応からの化学発光は、２００μＬ 検出試薬３を添加し、２００μＬ 検出試薬４の添加前に２秒中断し、次いで、間隔間の遅延を伴うことなく、両方のチャネルからの時間分解された化学発光データの１００×０．４秒の間隔を同時に取得することによって開始された。

これらの間隔からのＲＬＵにおける化学発光出力を、表４および５に報告する。各表内の最後の列は、個々の結果の合計を反映する。

ゼロＲＮＡ転写入力からの平均ＲＬＵ（各表内の最初のエントリ）は、背景（「ｂｋｇｄ」）測定値として使用され、（ａ）配列番号７のＡＥ標識化プローブに対して、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、および１０^７の複製ＲＮＡ転写入力、（ｂ）配列番号^８のＡＥ標識化プローブに対して、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０の複製ＲＮＡ転写入力、または（ｃ）両方のプローブに対して、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０の複製ＲＮＡ転写入力（表４および５、図５および６）を含有する、実験の結果から減算された。

図５は、配列番号７のＡＥ標識化プローブからの低波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ１によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^６から１０^７の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号８のＡＥ標識化プローブと呼応して使用された時と非常に類似しているということを実証する。

図６は、配列番号８のＡＥ標識化プローブからの高波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ２によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^７から１０^９の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号７のＡＥ標識化プローブと呼応して使用された時と非常に類似しているということを実証する。

図７は、各反応が、両方のプローブで同時に処理される時、単一の管から取得される化学発光データが、フィルタされたＰＭＴ１およびフィルタされたＰＭＴ２によって、低および高波長放出に分離されたことを実証する。図７は、単一の管におけるこれらの２組の放出からのＲＬＵが、ＲＮＡ転写入力の反応につき約１０^６から１０^１０の複製の単位複製配列の直線的定量的検出を可能にすることを明瞭に実証する。

実施例３：同じ反応チャンバにおけるダイナミックレンジにわたる、ＡＥ−ＨＩＣＳプローブでの単位複製配列の定量的検出
本実施例同じ反応チャンバにおける標的入力の１０^４から１０^１０の複製のダイナミックレンジにわたる、単位複製配列の定量的検出を提供する、実施形態を実証する。

ＴＭＡ反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬を添加し、混合した。分離試薬（５０μＬ）を添加し、結果として得られた混合物を、６０℃で１０分間、および室温で１０分間インキュベートした。上の溶液を含有する管を、室温で５分間、磁気分離ラック上に配置し、液相を除去し、１００μＬのハイブリダイゼーション試薬中のプローブを添加し、混合し、６０℃で１５分間、および室温で５分間インキュベートした。実施例２と同じプローブ、プローブの組み合わせ、および濃度を使用した。

ハイブリダイゼーション反応の完了時、上の溶液を含有する管を、室温で５分間、磁気分離ラック上に配置し、液相を除去した。次に、１００μＬのハイブリダイゼーション試薬を添加し、混合し、室温で５分間、磁気分離ラック上に配置し、液相を除去した。最後に、１００μＬ容量の読み取り試薬を添加し、混合した。

これらの反応からの化学発光は、実施例２のように取得した。これらの間隔からのＲＬＵにおける化学発光出力を、表６および７に報告する。各表内の最後の列は、個々の結果の合計を反映する。

ゼロＲＮＡ転写入力からの平均ＲＬＵ（各表内の最初のエントリ）は、背景（「ｂｋｇｄ」）測定値として使用され、（ａ）配列番号７のＡＥ標識化プローブに対して、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、および１０^７の複製ＲＮＡ転写入力、（ｂ）配列番号８のＡＥ標識化プローブに対して、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０の複製ＲＮＡ転写、または（ｃ）両方のプローブに対して、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０の複製ＲＮＡ転写（表６および７、図８および９）を含有する、実験の結果から減算された。

図８は、配列番号７のＡＥ標識化プローブからの低波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ１によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^４から１０^６の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号８のＡＥ標識化プローブと呼応して使用されることにかかわらず、非常に類似しているということを実証する。

図９は、配列番号８のＡＥ標識化プローブからの高波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ２によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^７から１０^１０の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号７のＡＥ標識化プローブと呼応して使用されることにかかわらず、非常に類似しているということを実証する。

図１０は、各反応が、両方のプローブで同時に処理される時、単一の管から取得される化学発光データが、フィルタされたＰＭＴ１およびフィルタされたＰＭＴ２によって、低および高波長放出に分離されたことを実証する。図１０は、単一の管におけるこれらの２組の放出からのＲＬＵが、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^４から１０^１０の複製の単位複製配列の直線的定量的検出を可能にすることを明瞭に実証する。

実施例４：同じ反応チャンバにおけるダイナミックレンジにわたる、ＡＥ−フルオロフォアプローブでの単位複製配列の定量的検出
本実施例は、同じ反応チャンバにおける入力標的核酸の広範なダイナミックレンジにわたる、増幅産物の検出のためのステップを説明する。

ＴＭＡ反応は、上の「増幅方法」の項に説明するとおりに実行される。ハイブリダイゼーション精密検査およびプローブ選択は、実施例２または３のように実行される。プローブは、先の実施例におけるものと同様の、すなわち、合成される単位複製配列の範囲に及ぶように、および検出装置に十分な総濃度で存在する。プローブのうちの一方は、実施例１のように、オリゴヌクレオチドに結合された、標準タイプのＡＥを有する。他方のプローブは、米国特許第６，１６５，８００号に説明されるローダミンおよびＴｅｘａｓ ＲｅｄとのＡＥ共役体（図１Ｂおよび１Ｃの放出スペクトル）に類似する、フルオロフォアに連結されたＡＥの共役体を有し、ＡＥフルオロフォア部分はオリゴヌクレオチドに結合されている。

発光プローブは、先の実施例、特に実施例１において説明されるものと類似する、適切な化学物質の添加および混合による開始後、各プローブによって放出される電磁放射の異なる波長範囲によって互いから区別可能である。より長い、およびより短い単位複製配列の両方を含有する単一の検出容器からの出力放出は、実施例２に記載されるものと同様に、例えば、多波長照度計で、同時に回収され、それらのそれぞれの波長範囲へ分離される。第１の波長範囲からの出力は、両方の単位複製配列にハイブリダイズされる第１のプローブに対応し、第２の波長範囲からの出力は、単位複製配列のうちの１つのみにハイブリダイズされる第２のプローブに対応する。代替として、第２の波長範囲からの出力は、両方の単位複製配列にハイブリダイズされる第１のプローブに対応し、第１の波長範囲からの出力は、単位複製配列のうちの１つのみにハイブリダイズされる第２のプローブに対応する。ハイブリダイズされていないプローブは、先の実施例における設計により、特に、実施例１のようにアルカリ性試薬での処理により、低放出をもたらす。

ゼロＲＮＡ転写入力（背景またはｂｋｇｄ）からの平均ＲＬＵは、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、および１０^９の複製ＲＮＡ転写入力を含有する実験の結果から減算される。背景を減算した第１のプローブからの化学発光は、ＲＮＡ転写入力の反応につき、約１０^２から約１０^６の複製のＲＬＵにおける直線的増加を実証し、第２のプローブからの背景を減算した化学発光は、ＲＮＡ転写入力の反応につき、約１０^５から約１０^９の複製のＲＬＵにおける直線的増加を実証する。代替として、第２のプローブからの背景を減算した化学発光は、ＲＮＡ転写入力の反応につき、約１０^２から約１０^６の複製のＲＬＵにおける直線的増加を実証し、第１のプローブからの背景を減算した化学発光は、約１０^５から約１０^９の複製のＲＬＵにおける直線的増加を実証する。２組のプローブからの応答の勾配は、共直線的である。これらの２つのプローブからの直線的出力応答は、重複する。しかしながら、共に、これらの２つのプローブからの出力は、ＲＮＡ転写入力の反応につき、約１０^２から約１０^９の複製の単位複製配列の定量的検出を実証する。

実施例５：同じ反応チャンバにおけるダイナミックレンジにわたるＡＥ−ＨＩＣＳプローブでの単位複製配列の定量的検出
本実施例は、同じ反応チャンバにおける入力標的核酸の約１０^２から１０^９の複製からのダイナミックレンジにわたる、標的核酸に起因する、増幅された核酸配列の定量的検出を示す方法を実証する。

ＴＭＡ反応の完了時、試料は、実施例２および３に説明されるものと実質的に類似の方法を使用して処理された。使用されるプローブは、（ａ）１０ｎＭ 配列番号７の自己消光ＡＥ標識化プローブ、（ｂ）１００ｎＭ 配列番号８の自己消光、波長シフトしたＡＥ標識化プローブ、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の個々のプローブに適応された濃度の両方のプローブであった。区別可能な単位複製配列上のプローブの相対的配置を、図４に図式的に示す。配列番号７のＡＥ標識化プローブは、両方の単位複製配列を検出することができるが、配列番号８のＡＥ標識化プローブは、単位複製配列のうちの１つのみをを検出することができる。

これらの反応からの化学発光は、プローブを前処理し、次いで、検出反応を、検出試薬３の代わりに２００μＬの検出試薬５の添加、続いて、２００μＬ 検出試薬４の添加によって開始したことを除き、実施例２および３のように取得した。これらの間隔からのＲＬＵにおける化学発光出力を、表８および９に報告する。各表内の最後の列は、個々のプローブ出力の合計を反映する。

ゼロＲＮＡ転写入力からの平均ＲＬＵ（各表内の最初のエントリ）は、背景（「ｂｋｇｄ」）測定値として使用され、配列番号７、配列番号８、または両方のプローブのＡＥ標識化プローブに対する１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０の複製ＲＮＡ転写入力を含有する、実験の結果から減算された（表８および９、図１１および１２）。

図１１は、配列番号７のＡＥ標識化プローブからの低波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ１によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約１０^２から１０^７の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号８のＡＥ標識化プローブと呼応して使用されることにかかわらず、非常に類似しているということを実証する。

図１２は、配列番号８のＡＥ標識化プローブからの高波長ＲＬＵ（フィルタしたＰＭＴ２によって捕捉）応答が、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約約１０^７から１０^９の複製に直線的に対応するということ、およびこの応答が、プローブが単独で、または配列番号７のＡＥ標識化プローブと呼応して使用されることにかかわらず、非常に類似しているということを実証する。

図１３は、各反応が、両方のプローブで同時に処理される時、単一の管から取得される化学発光データが、フィルタされたＰＭＴ１およびフィルタされたＰＭＴ２によって、低および高波長放出に分離されたことを実証する。図１３は、単一の管におけるこれらの２組の放出からのＲＬＵが、ＲＮＡ転写入力の反応につき少なくとも約約１０^２から１０^９の複製の単位複製配列の直線的定量的検出を可能にすることを明瞭に実証する。

実施例６：修飾および未修飾プライマーを使用して作製される区別可能な単位複製配列の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる単位複製配列の定量的検出 を実証する。増幅オリゴヌクレオチドは、第１のプロモーター供与物、および第２のプロモーター供与物であり、２つのプロモーター供与物は、２つのプロモーター供与物のうちの少なくとも一方が、他方のプロモーター供与物によって産生されるものに対して、区別可能な単位複製配列を産生するように、修飾されることを除き、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。第１および第２のプロモーター供与物はまた、弁別可能な割合のそれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、異なる濃度のＴＭＡ反応において存在する。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、第１のプロモーター供与物は、配列番号１であり、第２のプロモーター供与物は、標的ハイブリダイズ配列が、修飾核酸塩基を含有することを除き、配列番号１と実質的に同一である。第１のプロモーター供与物は、第２のプロモーター供与物に関する濃度の１０００倍超過の濃度で増幅反応物に存在する。加えて、配列番号２は、第１および第２のプロモーター供与物の両方と併せて、増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）第２のプロモーター供与物を使用して産生される単位複製配列ではない、第１のプロモーター供与物を使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）第１のプロモーター供与物を使用して産生される単位複製配列ではない、第２のプロモーター供与物を使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、第２のプロモーター供与物に存在するが、第１のプロモーター供与物には存在しない修飾によって表される、区別可能な位置を含む位置で、それらのそれぞれの単位複製配列にハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。反応は、検出試薬３の代わりに、２００μＬ 検出試薬５の添加によって開始することができる。

実施例７：それらのプロモーター配列の３’末端と、それらの標的ハイブリダイズ配列の５’末端との間に提供される、５’不対塩基（１つまたは複数）を有する、プロモーターベースの増幅オリゴマーを使用して作製される、区別可能な生成物の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。増幅オリゴヌクレオチドは、第１のプロモーター増幅オリゴヌクレオチド、および第２のプロモーターオリゴヌクレオチドであり、２つのプロモーター増幅オリゴヌクレオチドは、２つのプロモーター増幅オリゴヌクレオチドの各々が、他方のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドによって産生されるものに対して、区別可能な単位複製配列を生成するように、それらの標的ハイブリダイズ配列の５’末端と、それらのプロモーター配列の３’末端との間に、少なくとも１つの別個に固有の不対塩基を含むことを除き、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。第１および第２のプロモーターオリゴヌクレオチドはまた、弁別可能な割合のそれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、異なる濃度のＴＭＡ反応において存在する。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、第１のプロモーターオリゴヌクレオチドは、５’不対塩基をさらに含む、配列番号１（５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（Ｘ）ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号１の５’不対塩基Ｘ型であり、Ｘは、１つ以上の不対塩基を表す））であり、第２のプロモーターオリゴヌクレオチドもまた、第１のプロモーターオリゴヌクレオチド上に存在するものから区別可能である、５’不対塩基をさらに含む、配列番号１（５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（Ｙ）ＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号１の５’不対塩基Ｙ型であり、Ｙは、１つ以上の不対塩基を表し、連続したヌクレオチド配列Ｙは、連続したヌクレオチド配列Ｘと同じではない））である。第１のプロモーターオリゴヌクレオチドは、第２のプロモーターオリゴヌクレオチドに関する濃度の１０００倍超過の濃度で増幅反応物に存在する。加えて、配列番号２は、第１および第２のプロモーターオリゴヌクレオチドの両方と併せて、増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）第２のプロモーターオリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第１のプロモーターオリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）第１のプロモーターオリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第２のプロモーターオリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、第２のプロモーターオリゴヌクレオチドに存在するが、第１のプロモーターオリゴヌクレオチドには存在しない修飾によって表される、区別可能な位置を含む位置で、それらのそれぞれの単位複製配列にハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

実施例８：５’不対塩基を有する増幅オリゴヌクレオチドを使用して作製される、区別可能な生成物の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。増幅オリゴヌクレオチは、第１の増幅オリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドであり、２つの増幅オリゴヌクレオチドは、２つの増幅オリゴヌクレオチドの各々が、他方の増幅オリゴヌクレオチドによって産生されるものに対して、区別可能な単位複製配列を生成するように、別個に固有の５’不対塩基を含むことを除き、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドはまた、弁別可能な割合のそれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、異なる濃度のＴＭＡ反応物において存在する。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、５’不対塩基をさらに含む、配列番号２（５’−（Ｘ）ＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２の５’不対塩基Ｘ型であり、Ｘは、１つ以上の不対塩基を表す））であり、第２の増幅オリゴヌクレオチドもまた、第１のプロモーターオリゴヌクレオチド上に存在するものから区別可能である、５’不対塩基をさらに含む、配列番号２（５’−（Ｙ）ＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２の５’不対塩基Ｙ型であり、Ｙは、１つ以上の不対塩基を表し、連続したヌクレオチド配列Ｙは、連続したヌクレオチド配列Ｘと同じではない））である。本実施例において、Ｘは、５核酸塩基長である、連続した核酸配列であり、Ｙは、５核酸塩基長である、連続した核酸配列であり、ＸおよびＹの連続した核酸配列は、異種であり、このため、各後続単位複製配列種を別個に検出および区別することを可能にする。第１の増幅オリゴヌクレオチドは、第２の増幅オリゴヌクレオチドに関する濃度の１０００倍超過の濃度で増幅反応物に存在する。加えて、配列番号１は、第１および第２の増幅オリゴヌクレオチドの両方と併せて、プロモーター増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）第２の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第１の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）第１の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第２の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、第２のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドに存在するが、第１のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドには存在しない修飾によって表される、区別可能な位置を含む位置で、それらのそれぞれの単位複製配列にハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

実施例９：異なるプロモーター配列を有するプロモーター増幅オリゴヌクレオチドを使用して作製される、区別可能な生成物の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。増幅オリゴヌクレオチドは、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチド、および第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドであり、２つのプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドは、２つのプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方が、他方のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドによって産生されるものに対して、区別可能な単位複製配列を生成するように（例えば、実施例６のように）修飾されることを除き、実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。第１および第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドは、類似の濃度でＴＭＡ反応物において存在する。第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドのプロモーター配列は、弁別可能な割合のそれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドのプロモーター配列に対して修飾される。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号１であり、第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイズ配列が修飾核酸塩基を含有することを除き、配列番号１と実質的に同一である。加えて、第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドは、そのプロモーター配列への変更（例えば、修飾核酸塩基、欠損核酸塩基、追加核酸塩基、または非デオキシリボヌクレオチド核酸塩基、例えば、リボヌクレオチド核酸塩基）を含有する。第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドのプロモーター配列は、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドの未修飾プロモーター配列よりも、ＲＮＡ転写産物を合成する上で、約１０００倍非効率的である。加えて、配列番号２は、第１および第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドの両方と併せて、増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ではない、第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、第２のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドに存在するが、第１のプロモーターベースの増幅オリゴヌクレオチドには存在しない修飾によって表される、区別可能な位置を含む位置で、それらのそれぞれの単位複製配列にハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

実施例１０：区別可能なＤＮＡおよびＲＮＡ生成物
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。ここで使用される増幅オリゴヌクレオチドは、単一のプライマーおよび単一のプロモーター供与物である。区別可能な増幅産物は、（ｉ）ＴＭＡ反応のステップのうちの一部の間に作製されるＤＮＡ単位複製配列、および（ｉｉ）ＴＭＡ反応のステップのうちの一部の間に作製されるＲＮＡ転写物である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、ＲＮＡ増幅産物が、弁別可能な割合のこれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、ＤＮＡ増幅産物と比較して超過するように、ＴＭＡにおいて生成される。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２であり、配列番号１は、プロモーター増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）ＤＮＡ単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）ＲＮＡ単位複製配列にハイブリダイズするＡＥ標識化プローブである。ＤＮＡ単位複製配列にハイブリダイズするプローブは、好ましくはＲＮＡ単位複製配列にアンチセンスである鎖にハイブリダイズする。これらのＡＥ標識化プローブは、区別可能である位置で、それらのそれぞれの単位複製配列をハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

実施例１１：区別可能なヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を使用して作製される区別可能な生成物の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。ここで使用される増幅オリゴヌクレオチドは、単一の増幅オリゴヌクレオチド、および単一のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドである。第５のＮＴＰは、増幅組成物に含まれる。次いで、ＮＴＰ混合物は、Ａ、Ｔ、Ｇ、ならびにある割合のＣおよびＩｓｏＣであり、Ｃの量は、ＩｓｏＣの量を上回る。単位複製配列種は、増幅反応物に提供される不等な割合のＣ：ＩｓｏＣにほぼ等しい、不等な割合のＩｓｏＣのＣを組み込む。したがって、各単位複製配列種上のプローブ結合部位は、ＣまたはＩｓｏＣのいずれかを有し、これは、不等な量で弁別可能な単位複製配列種を提供する（例えば、（ｉ）プローブ結合部位に組み込まれる、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧを有するＲＮＡ単位複製配列種、ならびに（ｉｉ）プローブ結合部位に組み込まれる、Ａ、ＩｓｏＣ、Ｔ、およびＧを有するＲＮＡ単位複製配列種）。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２であり、配列番号１は、プロモーター増幅オリゴヌクレオチドメンバーとして使用される。ＮＴＰ混合物は、Ａ、Ｔ、Ｇ、および１０００：１の割合のＣ：ＩｓｏＣである。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）１２−ｎｔ長であり、プローブが、天然Ｃ残基をそれらのプライマー 結合部位に組み込む、より豊富な単位複製配列種をハイブリダイズする、および検出するように、天然ＮＴＰでできている連続したヌクレオチド配列を含む、ＡＥ標識化プローブ、ならびに（ｂ）１２−ｎｔ長であり、プローブが、ＩｓｏＣ残基をそれらのプライマー結合部位に組み込む、あまり豊富ではない単位複製配列種をハイブリダイズする、および検出するように、天然Ａ、Ｔ、およびＣ残基、ならびにＩｓｏＧ残基でできている連続したヌクレオチド配列を含む、ＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、区別可能である位置で、それらのそれぞれの単位複製配列をハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

実施例１２：重複しない単位複製配列を合成する、２つの対の増幅オリゴヌクレオチドを使用して作製される区別可能な生成物の検出
本実施例は、同じ反応管における標的核酸の１０^３から１０^９の複製の範囲にわたる、単位複製配列の定量的検出を実証する。増幅オリゴヌクレオチドは、第１の増幅オリゴヌクレオチドおよび第１のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドを含む、第１の組、ならびに第２の増幅オリゴヌクレオチドおよび第２のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドを含む、第２の組であり、２組の増幅オリゴヌクレオチドは、２組の増幅オリゴヌクレオチドの各々が、他方の増幅オリゴヌクレオチドによって産生されるものに対して、区別可能な単位複製配列を産生するように、実質的に非重複標的結合部位を含む。第１および第２の組の増幅オリゴヌクレオチドはまた、弁別可能な割合のそれらのそれぞれの単位複製配列を生成するように、異なる濃度でＴＭＡ反応物内に存在する。

上に説明される例解的な増幅システムを使用して、第１の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２であり、第１のプロモーター増幅オリゴヌクレオチドは配列番号１であり、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号３であり、第２のプロモーター増幅オリゴマーは、配列番号２と配列番号３との間の標的配列に相補的であり、配列番号２に相補的な標的配列の近傍にある標的結合配列を有する。第１の増幅オリゴヌクレオチドは、第２の増幅オリゴヌクレオチドに関する濃度を１０００倍超過する濃度で増幅反応物中に存在する。等温増幅が実行される。

ＴＭＡ増幅反応の完了時、１００μＬ容量のハイブリダイゼーション試薬中のプローブを増幅反応混合物に添加し、これを、混合し、６０℃で１５分間インキュベートし、これに、合成された単位複製配列における、相補的配列に特異的なプローブのハイブリダイゼーションをさせる。プローブは、（ａ）第１の組の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にハイブリダイズするが、第２の組の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にはハイブリダイズしない、ＡＥ標識化プローブ、および（ｂ）第２の組の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列ハイブリダイズするが、第１の組の増幅オリゴヌクレオチドを使用して産生される単位複製配列にはハイブリダイズしない、ＡＥ標識化プローブである。これらのＡＥ標識化プローブは、第１の組の増幅オリゴヌクレオチド間、または第２の組の増幅オリゴヌクレオチド間で合成される、固有の配列によって表される、区別可能な位置を含む位置で、それらのそれぞれの単位複製配列にハイブリダイズする。

これらの反応からの化学発光は、本質的に実施例５のように取得される。

配列番号１は、５０−ヌクレオチドプロモータープライマーの配列である。それは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜２７は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の１つの鎖であり、ヌクレオチド２７〜５０は、配列番号４の領域に相補的である。配列番号２は、１９−ヌクレオチドプライマーの配列である。それは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜１９は、配列番号４の領域の相補的配列に相補的である。配列番号３は、２４−ヌクレオチドプライマーの配列である。それは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜２４は、配列番号４の領域の相補的配列に相補的である。配列番号４は、１，０１６ヌクレオチドＲＮＡ体外転写物（ＩＶＴ）の配列である。ヌクレオチド１〜５１は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列およびクローニングベクターからのものであり、ヌクレオチド５２〜１，０１６は、ＨＩＶ−１サブタイプＢ ｐｏｌ遺伝子の３’領域を含むＨＩＶ−１ゲノムからのものである。

配列番号５は、２２−ヌクレオチドプローブの配列である。それは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜２２は、配列番号９および１０の領域に相補的である。それは、結合した、検出可能な標識を有してもよい。結合した検出可能な標識は、アクリジニウムエステルであってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，８４０，８７３号に説明されるように、フェニル環のオルト位置のフルオロ部分を含む、組成であってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，５８５，４８１号に説明されるもの等のヌクレオチジル間リンカー中間体から誘導されるもの等のリンカーに結合されてもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，１８５，４３９号に説明されるように、実質的にアクリジニウムエステルのＣ９位の方向からリンカーに結合されてもよい。リンカーは、配列番号５の２つのヌクレオチド間に挿入されてもよい。リンカーは、配列番号５のヌクレオチド１０と１１との間に挿入されてもよい。配列番号６は、２２−ヌクレオチドプローブの配列である。それは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜２２は、配列番号１０の領域に相補的である。それは、結合した、検出可能な標識を有してもよい。結合した検出可能な標識は、アクリジニウムエステルであってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，８４０，８７３号に説明されるように、アクリジニウム環系の２位のメチル部分を含む、組成であってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，５８５，４８１号に説明されるもの等のヌクレオチジル間リンカー中間体から誘導されるもの等のリンカーに結合されてもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，１８５，４３９号に説明されるように、実質的にアクリジニウムエステルのＣ９位の方向からリンカーに結合されてもよい。リンカーは、配列番号６の２つのヌクレオチド間に挿入されてもよい。リンカーは、配列番号６のヌクレオチド８と９との間に挿入されてもよい。配列番号７は、３２−ヌクレオチドプローブの配列である。それは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド５〜２７は、配列番号９および１０の領域に相補的であり、ヌクレオチド１〜７および２６〜３２は、互いに相補的である。それは、結合した、検出可能な標識を有してもよい。結合した検出可能な標識は、アクリジニウムエステルであってもよい。アクリジニウムエステルは、米国公開特許出願第ＵＳ ２００７−０１６６７５９ Ａ１に説明されるような組成であってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ５，５８５，４８１号に説明されるもの等のヌクレオチジル間リンカー中間体、またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａの５’−アミノ−修飾因子Ｃ６（部品番号 １０−１９０６−９０）もしくは３’−アミノ−修飾因子Ｃ７ ＣＰＧ（部品番号 ２０−２９５８−０１）等の末端リンカー中間体から誘導されるもの等のリンカーに結合されてもよい。アクリジニウムエステルは、米国公開特許出願第ＵＳ ２００７−０１６６７５９ Ａ１号に説明されるように、実質的にアクリジニウムエステルのＮ１０位の方向からリンカーに結合されてもよい。リンカーは、２つのヌクレオチド間、または配列番号７の末端のうちの一方に挿入されてもよい。リンカーは、配列番号７の５’末端にあってもよい。プローブはまた、アクリジニウムエステルからエネルギーを受容するが、エネルギーを光として再放出しない、結合したクエンチャ部分を有してもよい。クエンチャは、アクリジニウムエステルに関して使用されるものの代替として、ヌクレオチジル間または末端リンカーを介して、ヌクレオチド塩基上、または専用のホスホラミダイトとしてのリンカーを介して、結合されてもよい。クエンチャは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａの前駆体３’−ＢＨＱ−２ ＣＰＧ（部品番号２０−５９３２−０１）もしくは３’−ダブシルＣＰＧ（部品番号２０−５９１２−０１）からのものであってもよい。クエンチャは、配列番号７の３’末端にあってもよい。配列番号８は、３２ヌクレオチドプローブの配列である。それは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド６〜３０は、配列番号１０の領域に相補的であり、ヌクレオチド１〜５および２８〜３２は、互いに相補的である。それは、結合した、検出可能な標識を有してもよい。結合した検出可能な標識は、アクリジニウムエステルであってもよい。アクリジニウムエステルは、米国公開特許出願第ＵＳ ２００７−０１６６７５９ Ａ１に開示されるような組成であってもよい。アクリジニウムエステルは、特許第ＵＳ ５，５８５，４８１号に説明されるもの等のヌクレオチジル間リンカー中間体、またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａの５’−アミノ−修飾因子Ｃ６（部品番号１０−１９０６−９０）もしくは３’−アミノ−修飾因子Ｃ７ ＣＰＧ（部品番号２０−２９５８−０１）等の末端リンカー中間体から誘導されるもの等のリンカーに結合されてもよい。アクリジニウムエステルは、米国公開特許出願第ＵＳ ２００７−０１６６７５９ Ａ１号に説明されるように、実質的にアクリジニウムエステルのＮ１０位の方向からリンカーに結合されてもよい。リンカーは、２つのヌクレオチド間、または配列番号８の末端のうちの一方に挿入されてもよい。リンカーは、配列番号８の５’末端に対して最終前位置にあってもよい。アクリジニウムエステルからのエネルギーの受容、および検出可能な形態のエネルギー（例えば、「光」）の再放出、好ましくは、アクリジニウムエステルの光放出（例えば、アクリジニウムエステルとは異なる波長の光）から区別することができる、検出可能な形態のエネルギーの再放出が可能なエネルギー受容体部分は、アクリジニウムエステル近傍のプローブに結合されてもよい。ここで説明したエネルギー受容体は、フルオロフォア部分であってもよい。ここで説明したエネルギー受容体は、配列番号８の５’末端にあってもよい。ここで説明したエネルギー受容体は、アクリジニウムエステルに関して使用されるものの代替として、ヌクレオチジル間または末端リンカーを介して、ヌクレオチド塩基上、または専用のホスホラミダイトとしてのリンカーを介して、結合されてもよい。フルオロフォアは、テトラフルオレセインまたはテトラメチルローダミン部分であってもよい。プローブはまた、アクリジニウムエステルから、および／またはアクリジニウムエステル近傍に結合されるエネルギー受容体からのエネルギーを受容するが、エネルギーを光として放出しない、結合したクエンチャ部分を有してもよい。クエンチャは、アクリジニウムエステルまたは上に説明されるエネルギー受容体に関して使用されるものの代替として、ヌクレオチジル間または末端リンカーを介して、ヌクレオチド塩基上、または専用のホスホラミダイトとしてのリンカーを介して、結合されてもよい。クエンチャは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａの前駆体３’−ＢＨＱ−２ ＣＰＧ（部品番号２０−５９３２−０１）または３’−ダブシルＣＰＧ（部品番号２０−５９１２−０１）からのものであってもよい。クエンチャは、配列番号８の３’末端にあってもよい。

配列番号９は、１１６−ヌクレオチド単位複製配列の配列である。それは、１つ以上のリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜５は、ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーター配列からのものであり、ヌクレオチド６〜１１６は、配列番号４の領域に相補的である。配列番号５および７のプローブは、配列番号９の領域に少なくとも部分的に相補的である。配列番号１０は、２１５−ヌクレオチド単位複製配列の配列である。それは、１つ以上のリボヌクレオチドから成ってもよい。ヌクレオチド１〜５は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列からのものであり、ヌクレオチド６〜２１５は、配列番号４の領域に相補的である。ヌクレオチド１〜１１６の配列は、配列番号９と共有される。配列番号５および７のプローブは、配列番号１０の領域に少なくとも部分的に相補的であり、配列番号６および８のプローブは、配列番号１０の異なる領域に少なくとも部分的に相補的である。

上の明細書において言及される全ての公開物および特許は、何であろうと全ての目的で、それらの全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる。本発明の説明される方法およびシステムの種々の修飾および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態と併せて説明してきたが、特許請求される本発明は、かかる具体的な実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際、関連技術分野における当業者には明らかである、説明される本発明を実施するための形態の種々の修飾は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。